摘 要：肉苁蓉作为一种保健食品原料越来越被人们所认可和接受，对其特性的研究和产品的开发被更多的专业人士和研究团队所关注。本文从肉苁蓉的资源特征，营养和功能特性，加工和应用等方面较全面的阐述了肉苁蓉的相关特性，可为下一步研究和开发打下一定基础。关键词：肉苁蓉；资源特征；营养保健特性肉苁蓉（Cistanche deserticola Y. C. Ma）属多年生寄生草本植物。别名苁蓉、地精、疆芸、大芸、寸芸或金笋等。具有提高免疫力、抗衰老、改善阳痿早泄、抗疲劳、保护肝脏、保护心脑血管、润肠排毒等作用。药用价值极高，是我国传统的名贵中药材。此外，肉苁蓉也具有极高的保健价值，而且越来越受到人们的关注和政府的重视，使肉苁蓉开始由药品向保健食品及食品的领域发展。2010 年，具有缓解疲劳保健功能的肉苁蓉黄精茶被国家食品药品监督管理局批准认证，批准文号为国食健字G20090540；2016 年，国家食品安全风险评估中心（CFSA）专家评审委员会依照法定程序审查认为，根据肉苁蓉样品的卫生学和毒理学试验及相关安全性资料，阿拉善荒漠肉苁蓉符合食品安全要求，肉苁蓉从此进入食品领域，并开启了肉苁蓉在食品加工行业的开发和应用。1 肉苁蓉的资源特征肉苁蓉作为荒漠地区的多年生寄生性草本植物,其寄主因地区和植物种而异，主要为沙漠、荒漠固沙植物梭梭属、柽柳属植物等，肉苁蓉在保护干旱荒漠地区的生态环境方面起到了重要作用。从20 世纪末开始，由于肉苁蓉寄生生长繁殖的特殊性，加上药用价值较高而被人为滥挖，其寄主梭梭树被大批砍伐破坏，使肉苁蓉的资源急剧减少，部分地区已将其列入珍稀植物保护物种，其中荒漠肉苁蓉已被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》。近年来，新疆、内蒙古等地方政府建立了较大面积的以保护肉苁蓉为重点的梭梭保护区，严禁砍伐梭梭，积极发展肉苁蓉经济，牧民通过保护梭梭林、科学采挖野生肉苁蓉获取经济收益，使保护生态环境成为人类的自觉行为。同时，积极进行人工繁殖，扩大其分布区。内蒙古自治区的乌兰布和沙漠已经退耕还林建立保护区约133 333.33 hm2，人造林地26 666.67 hm2，以专门种植肉苁蓉。使肉苁蓉种植成为一种荒漠经济产业，为其开发提供充分的原料资源。1.1 肉苁蓉的资源分布目前全世界的肉苁蓉多分布于北半球的温暖干燥地区，自欧洲的伊比利亚半岛，经非洲北部、亚洲的阿拉伯半岛、伊朗、阿富汗、巴基斯坦、印度北部、中亚地区及蒙古到我国的西北部地区等均有分布。我国肉苁蓉属植物主要分布在内蒙古自治区、新疆维吾尔自治区、宁夏回族自治区、陕西省、甘肃省及青海省等西北沙漠、荒漠地区。途经乌兰布和沙漠、腾格里沙漠、巴丹吉林沙漠、河西走廊沙地、塔克拉玛干沙漠和古尔班通古特沙漠6 个沙漠地带[1]。由于其主要生长在沙漠地带，因此被称为“沙漠人参”。内蒙古肉苁蓉产地范围为内蒙古自治区阿拉善盟、乌海市、巴彦淖尔市及鄂尔多斯市4 个盟市现辖行政区域。2015 年12 月29 日，原国家质检总局批准了对“内蒙古肉苁蓉”实施地理标志产品保护。2016 年，内蒙古肉苁蓉产量质量均居中国第一，其中阿拉善有适宜接种肉苁蓉的天然梭梭林9 666 666.67 hm2，新建梭梭肉苁蓉产业基地33 733.33 hm2，肉苁蓉年产量达1 000 多t。1.2 肉苁蓉品种分类目前，全世界约22 个肉苁蓉品种。根据中国高等植物科属检索表记载，目前我国存在肉苁蓉属植物应有5 种。分别为荒漠肉苁蓉、德赢vwin登录 、盐生肉苁蓉、沙苁蓉和兰州肉苁蓉。另外，国内大多数研究表明，国内肉苁蓉属植物有4 种和1 变种[2]，包括肉苁蓉、德赢vwin登录 、盐生肉苁蓉、沙苁蓉及盐生肉苁蓉的1个变种——白花盐苁蓉。（1）荒漠肉苁蓉（Cistanche deserticola）。寄主为梭梭属（Haloxylon）植物，顾名思义，主要生长在荒漠沙丘，且海拔在200 ～ 1 000 m 的地区。主要分布在内蒙古自治区阿拉善盟和巴彦淖尔市，宁夏回族自治区的中卫市、张掖市、嘉峪关，8 个甘肃省内地区及新疆北部的沙漠地带[3-4]。（2）盐生肉苁蓉（Cistanche salsa）。主要寄生在盐爪爪、珍珠柴、芨芨草等植物上。此品种有一变种：白花盐苁蓉。多集中在荒漠草原地区、荒漠地区的湖盆低地地带及重盐碱地区，较沙苁蓉的生存海拔范围广，约为700 ～ 2 500 多米。主要分布于内蒙古、新疆、甘肃和宁夏地区[3-6]。（3）沙苁蓉（Cistanche sinensis）。寄主为红沙（Reaumuria soongaria）。此类植物是中国特有品种，主要产地为我国内蒙古自治区、甘肃省及宁夏回族自治区[7]。主要生存在荒漠草原地区及荒漠区中的沙地、砾石或丘陵，海拔在1 000 ～ 2 000 m 的地带中。（4）德赢vwin登录 （Cistanche tubulosa）。寄主为柽柳属（Tamarix）植物红柳。主要发现于新疆维吾尔自治区南部地区如塔里木盆地等，多寄生在柽柳属植物根部。（4）兰州肉苁蓉（Cistanche lanzhouensis）。寄主为红沙（Reaumuria soongaria）。首次发现于兰州市，其标本植物保存于兰州大学。主要分布在甘肃省兰州市，生长于山坡，有学者建议将兰州肉苁蓉归为沙肉苁蓉[8-9]。2 肉苁蓉营养价值和功能特征2.1 营养特征肉苁蓉的营养成分包括脂肪、糖水化合物、维生素和矿物质等，其中含有18 种氨基酸、多种多不饱和脂肪酸、维生素。肉苁蓉矿物元素中钾、钠、铁含量较高（见表1），同时含有丰富的硒[10]。2.2 保健功效2.2.1 延缓衰老作用肉苁蓉是一味名贵的补益中药，其抗衰老、延年益寿的作用仅次于人参，居第2 位。研究发现，肉苁蓉延缓衰老的作用与其多种活性成分有密切关系，其中肉苁蓉的乙醇抽提物能显著提高小鼠体内的SOD 活性[11]。2.2.2 调节肠道作用中医认为肉苁蓉具有很好的润燥通便的疗效。肉苁蓉类药物的水煎剂可改善小肠蠕动，抑制大肠水分吸收，缩短排便时间。研究发现，肉苁蓉生品的通便作用强于制品[12]。2.2.3 抗疲劳作用肉苁蓉对阳虚患者具有明显的增强体力和抗疲劳作用。观察喂服肉苁蓉水煎液的小鼠发现，阳虚小鼠体重、自主活动次数均增加，并延长了游泳时间，同时降低了运动后的血乳酸、尿素酸的累积，血清尿素氮含量显著降低，结果说明肉苁蓉具有增强体力和抗疲劳之功效[13]。2.2.4 补肾益精作用肉苁蓉具有补肾阳、益精血的功效。肉苁蓉提取物可影响下丘脑单胺类神经递质的代谢，以此直接或间接参与调解下丘脑—垂体—性腺的功能，这可能是肉苁蓉具有补肾壮阳作用的机理[14]。2.2.5 其它作用研究发现，肉苁蓉除具有上述功能外，肉苁蓉颗粒对帕金森病大鼠模型的黑质和纹状体的多巴胺能神经元具有保护作用[15]，即具有神经保护作用；肉苁蓉提取物可增强ATP 酶活性，维持细胞线粒体膜电位，提高肝脏的抗氧化作用，减少脂质过氧化产物，保护肝细胞[16]，起到了保护肝脏的作用。研究发现，肉苁蓉多糖可明显改善小鼠巩固性记忆障碍及再现记忆性障碍，其机制与促进脑内蛋白质合成有关[17]。因此，肉苁蓉多糖也有改善再现性记忆障碍的作用。2.3 医用价值肉苁蓉为用药最广的中草药之一。肉苁蓉粗提取药物，味甘咸、微辛酸和微温。临床上多用于肾阳不足、精血亏虚所致的阳痿、不孕、腰膝酸软、筋骨不力及肠燥便秘等。3 肉苁蓉的加工和应用3.1 应用发展过程早东汉时期的《神农本草经》中，肉苁蓉被列为上品，用于治疗或作为补药，有补中、滋阴补肾、入肝和通便润肠之功能。其后古典《本草经疏》《本草汇言》《月华子本草》等多有记载。据记载史册显示，肉苁蓉的入药史已有1 000 多年。据魏晋时期的《吴普本草》记载，盐生肉苁蓉个体较小，产于人烟稀少的干旱或半干旱地区，同时一年中大部分时间都在地下生长，仅在生殖生长期出土，古代人民也多在野生肉苁蓉开花期（公历4 月—6 月）寻觅到这种植物，并挖取其肉质茎入药。南北朝陶弘景的《本草经集注》首次描述了肉苁蓉属植物的特征性形态，认为肉苁蓉是野马交配时精液掉在地上而生长起来的，这一说法虽然荒谬，但却道出了这种植物不同于大多数植物的无根、寄生生长特性，该书还记载了此物生长在西北多马的荒漠地带。陶弘景所记载的肉苁蓉应是荒漠肉苁蓉和盐生肉苁蓉，且认为前者质地更好。唐代《本草拾遗》中记载：“肉苁蓉三钱，三煎一制，热饮服之，阳物终身不衰”。现代医学也证明肉苁蓉中含有大量氨基酸、胱氨酸、维生素和矿物质珍稀营养滋补成分，对男性肾、睾丸、阴茎和海绵体等性器官都有极大的补益效果，可提高精子活力及质量。宋代《本草图经》对肉苁蓉也作了较为详细的描述，已认识到抽茎开花时的肉苁蓉肉质稍减而燥，功力大减，应在肉质茎刚出土的3 月采收。从20 世纪80 年代开始，国内外对肉苁蓉的成分进行了大量研究，其中日本起步较早，随着分离提取和检测技术的飞速发展，目前已分离出多种类型的物质，其中苯乙醇总苷是肉苁蓉中主要的活性成分，具有提高男性性功能、治疗女人宫寒不孕、抗氧化、抗衰老、提高免疫力和增强记忆力等功能。1993 年，在国际医学会日内瓦年会上爆出中国阿拉善盟查干希热跻身世界长寿之乡，人均寿命为87.5岁。中外专家组调查研究发现，这与当地居民的饮食结构有关，主要是当地居民有食用肉苁蓉的习惯。如在炖羊肉中放入肉苁蓉，饮自制苁蓉酒等，引起了医学界对肉苁蓉的广泛关注[18]。进入21 世纪以来，肉苁蓉被国家和相关人士高度重视，不断开发肉苁蓉及肉苁蓉产品。3.2 肉苁蓉应用现状作为蒙药、维吾尔族药、中药的肉苁蓉具有提高免疫力、抗衰老、改善阳痿早泄、抗疲劳、保护肝脏、保护心脑血管和润肠排毒等作用，主要在医疗领域研究使用。肉苁蓉的传统炮制方法包括浸、焙、熬、剉、煮、蒸、薄切及趁鲜用等。其中浸泡辅料以酒居多，也有用水及米泔水浸者，切片基本是薄切。炮制所用的辅料多为酒，酒的种类有清酒、烧酒、无灰酒等，炮制时间有酒浸一宿、酒浸一日夜、酒浸三日、酒拌蒸从午至酉及煮烂等。肉苁蓉炮制的显著特点就是以酒炮制，历版药典也收载了酒制法，说明酒肉苁蓉临床应用广泛，具有提高疗效之作用。近年来，随着人工种植产量的增加，对肉苁蓉的研究更加深入，在化学成分和药理作用方面均作了大量研究。截至目前，从肉苁蓉中分离提纯到34 种苯乙醇苷类成分，其中包括22 种双糖苷、10 种三糖苷、2种单糖苷[18]。目前已开发出流通于市场的产品有苁蓉酒、苁蓉养生液、养肾液、苁蓉口服液、苁蓉茶、苁蓉胶囊、苁蓉片、苁蓉颗粒和肉苁蓉煎丸等药品、保健品。肉苁蓉也常作为食品、保健品出现在人们的饮食中，较为常见的有肉苁蓉粥、苁蓉麻子仁膏、肉苁蓉酒、肉苁蓉枸杞酒和苁蓉菟丝酒等。同时，在食品加工方面，也有肉苁蓉饮等产品，但开发利用的较少。4 肉苁蓉的前景及展望肉苁蓉作为国家二级保护植物，具有极高的药用和保健价值，是我国西北部地区著名的中药材之一。近年来对肉苁蓉的人工种植、化学成分及药理作用研究都取得了可喜成绩。肉苁蓉的药用价值很高，但目前只限于基础研究，在新药、保健品、食品和饮品等领域中的开发、应用比较欠缺。随着科技的发展和人们对肉苁蓉认识的加深，今后应在药用基础上，进行更广泛和更深层的研究，扩大肉苁蓉的应用范围，使肉苁蓉这一宝贵资源有更可观的发展前景，从而推动肉苁蓉的进一步发展。参考文献：[1] 刘媖心. 中国沙漠植物志[M]. 科学出版社，1985.[2] 屠鹏飞，何燕萍. 肉苁蓉类药源调查与资源保护[J]. 中草药，1994，25（4）：205-208.[3] 李佳政. 沙漠人参——肉苁蓉[J]. 新疆农垦科技，1989（1）：23.[4] 马 强.“沙漠人参”肉苁蓉[J]. 内蒙古农业科技，1995（2）：38.[5] 孙永强，郑兴国，张小芬，等. 新疆肉苁蓉资源及人工种植研究初探[J]. 干旱区资源与环境，2003，17（3）：123-127.[6] 杨昌友，沈观冕，毛祖美. 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摘要目的：为进一步开发利用肉苁蓉提供参考。方法：以“肉苁蓉”“产地加工”“采收加工”“炮制方法”“Cistanche deserticola”“Processing in production place”“Harvesting processing”“Processing methods”等为关键词，在中国知网、万方数据、维普网、PubMed、SpringerLink 等数据库中组合查询2008 年1 月－2018 年9 月发表的相关文献，对肉苁蓉产地采收加工及炮制方法进行论述。结果与结论：共检索到相关文献112 篇，其中有效文献33 篇。目前肉苁蓉多采用先蒸制后晾晒的产地加工方法，而利用冷冻干燥技术、气体射流冲击技术、超声真空干燥技术等干燥新技术，可提高干燥效率，提升药材品质；同时，不同的采收期、蒸制时间、初加工工艺等都会影响肉苁蓉的品质；肉苁蓉的炮制主要以酒制为主，酒的酒精度和种类对肉苁蓉品质的影响极大，常用的辅料酒有米酒、黄酒和白酒，而以米酒炮制的肉苁蓉品质最佳，黄酒次之。目前，肉苁蓉的产地加工研究多集中在蒸制对有效成分的变化上，炮制研究多集中在酒制对4种苯乙醇苷类成分含量的变化上，今后应加强炮制品活性成分的转化及作用机制研究。关键词肉苁蓉；产地加工；采收加工；炮制方法肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉（Cistanche deserticolaY. C. Ma）和德赢vwin登录 [Cistanche tubulosa（Schenk）Wight]的干燥带鳞叶的肉质茎[1]，通常在春、秋季进行采挖。《经史证类备急本草》曰：“五月五日采。五月恐已老不堪，故多三月采之”[2]。有研究表明，肉苁蓉总寡糖、去半乳糖醇总寡糖和半乳糖醇是肉苁蓉发挥通便作用的主要成分[3]。药理学研究结果表明，肉苁蓉具有抗衰老、免疫调节、抗病毒、促进造血、改善脾虚、提高学习记忆能力等多种作用[4-5]；此外，其还可用于治疗良性前列腺增生[6]、急慢性肝损伤及肝纤维化等症[7]。产地采收加工是中药材生产的第一个环节，也是最关键的一步，而炮制是药材成为饮片的最重要一步，合理的产地采收加工及炮制方法是影响药材品质的关键。为此，笔者以“肉苁蓉”“产地加工”“炮制方法”“Cistanche deserticola”“Processingin production place”“Processing methods”等为关键词，在中国知网、万方数据、维普网、PubMed、Springer-Link 等数据库中组合查询2008 年1 月－2018 年9 月发表的相关文献。结果，共检索到相关文献112 篇，其中有效文献33 篇。现对肉苁蓉产地采收加工及炮制方法进行论述，以期为进一步开发利用肉苁蓉提供参考。1 产地采收加工研究进展传统肉苁蓉干燥的过程不仅费时、费力，而且随着时间的推移及二次闷润，使得不少有效成分流失，从而影响了药材的品质。随着肉苁蓉研究的不断深入和一些新技术的不断发展，逐渐出现了产地加工蒸制后干燥、冷冻干燥技术等新的干燥技术，这些技术均在一定程度上提高了肉苁蓉的干燥效率，并保证了有效成分尽可能少的流失[8-10]。如，春天采挖的肉苁蓉通过半埋半露晒干的方式，干燥后即得“甜苁蓉”或“甜大芸”；而秋天采挖的肉苁蓉一般要先将块大者放入盐湖中腌1～3年，干燥后则得“咸苁蓉”或“盐大芸”[11]。在产地采收加工的过程中，任何一个环节的因素，如不同采收期、不同蒸制时间、不同的初加工方式等均会影响药材的品质。1.1 不同采收期对肉苁蓉品质的影响中药的采收季节、采收时间与药材的品质优劣有着密切的关系。有研究表明，在春季采收的肉苁蓉中，松果菊苷和毛蕊花糖苷的总量达到秋季采收者的3 倍，且甜菜碱和2′-乙酰基毛蕊花糖苷的含量也较高；而秋季采收的肉苁蓉中半乳糖醇、可溶性多糖和肉苁蓉苷A的含量较春季采收者更高，但不含2′-乙酰基毛蕊花糖苷，因此该成分可用于区分鉴别春、秋季肉苁蓉[12-13]。春、秋季采收的肉苁蓉药材由于各自所含有效成分含量不同，其应用也有所差异。当需要发挥润肠通便作用时[3]，宜使用秋季采收品种；当需要发挥保肝、降压、保护神经等方面的作用时，则宜使用春季采收品种[14]。庞金虎等[15]研究结果表明，苯乙醇苷类活性成分的含量与生长年限有关，当生长年限≥3 年时，苯乙醇苷类成分含量较高，故在实际用药过程中，选用3 年及3 年以上生的肉苁蓉药材，可有助于更好地保证药材品质。1.2 不同蒸制时间对肉苁蓉品质的影响苯乙醇苷类作为肉苁蓉的主要活性成分，常作为药材品质的评价指标[16]。彭芳等[17]的研究结果表明，蒸制10 min 时，肉苁蓉中多糖的含量居高；当蒸制至20 min，此时苯乙醇苷类成分的含量达到最高，但继续蒸制苯乙醇苷类成分含量下降，而异毛蕊花糖苷的含量却有所升高。范亚楠等[16]的研究结果表明，蒸制时间对药材品质综合评分值（按松果菊苷、毛蕊花糖苷、异类叶升麻苷、甜菜碱的含量换算而得）具有极为显著的影响，以蒸制100 min 为佳。姜勇等[18]的研究结果表明，当蒸制120min 时，松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量达到最高，且比未蒸制者高。产地蒸制加工会大大提高药材有效成分的含量，但不同蒸制时间的药材有效成分含量亦有显著差别，临床药用或制剂制备宜根据具体需要进行加工处理。1.3 不同产地初加工方式对肉苁蓉品质的影响由于肉苁蓉块大，自然干燥往往需要很长时间，而在此过程中不可避免地会造成一些有效成分的损失[19]。李想[8]的研究结果表明，冷冻干燥技术能在很大程度上缩短干燥时间，防止有效成分的流失。杜友等[9]的研究结果表明，经气体射流冲击技术干燥后的肉苁蓉比经烘箱干燥的色泽更好，且半乳糖醇的含量也较自然干燥法和烘箱干燥法更高。蔡鸿等[20]的研究结果表明，肉苁蓉经过热水杀酶处理后，松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量均有所升高，但半乳糖醇的含量却有所下降。巩鹏飞等[10]的研究结果表明，随着温度的增加，水分有效扩散系数增加，药材干燥越容易，但对于活性成分的影响仍有待进一步研究。姜勇等[18]通过正交试验发现，将鲜肉苁蓉蒸制2 h 后，再切成6 mm厚片并置于70 ℃烘箱中烘干，其中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量较其他工艺加工者更高。范亚楠等[16]通过单因素筛选试验发现，鲜肉苁蓉蒸制100 min 后切6 mm厚片，并于80 ℃烘干，其中毛蕊花糖苷、松果菊苷、异类叶升麻苷和甜菜碱的含量均比在其他蒸制时间及烘干温度处理者高；而同一批肉苁蓉药材，蒸制并晒干处理组松果菊苷和毛蕊花糖苷的总含量比直接晒干组提高了4.23 倍，多糖含量提高了1 倍多[21]。药材在新鲜采收后的一段时间是处于应激状态下的，即新鲜采挖的肉苁蓉在最初的几天并未完全死亡，而是利用其储存的水分、营养等物质在体内发生一系列复杂的化学反应，从而使化学成分含量升高。梁淑燕等[22]将新鲜采挖的肉苁蓉进行放置，并每天取样观察，发现该药材在放置第4 天时的苯乙醇苷类含量最高，并在第6 天含量开始下降，此时再采用沸水蒸制10 min，切5 mm厚片，冷冻干燥，得到的药材饮片的品质较自然干燥者更好，有效成分的含量也更高。但上述研究[16，22]只是对单因素进行了直观分析，还需要进行进一步的理论分析予以验证，并得到最优加工工艺。2 炮制方法研究进展明代对肉苁蓉的炮制方法有较为详细的记载，李时珍《本草纲目》曰：“凡使先须清酒浸一宿，至明以棕刷去沙土浮甲，劈破中心，去白膜一重，如竹丝草样”[23]。可见，明代对肉苁蓉的净制已相当考究，其净制方法也是现代肉苁蓉最常用的处理方式。肉苁蓉炮制大多采用的辅料是酒，酒的种类有白酒、黄酒、清酒、烧酒、无灰酒等[24]。2.1 肉苁蓉的现代炮制方法肉苁蓉的炮制品种在2015 年版《中国药典》（一部）正式收载的有两种，即肉苁蓉片和酒苁蓉[1]。此外，还有黑豆复制法和四蒸四晒法[25]。2.2 肉苁蓉的现代炮制研究肉苁蓉经酒浸后苯乙醇苷类成分含量明显提高，且辅料酒的种类对其有很大影响。刘雯霞等[26]的研究结果表明，用不同种类的酒处理肉苁蓉，其中松果菊苷的含量由高到低依次为米酒＞黄酒＞白酒，但由于米酒成本较高，且米酒和黄酒炮制品质差别不大，因此通常采用黄酒炮制。段哲等[27]的研究结果表明，随着黄酒酒精度的增加，肉苁蓉润肠通便的作用亦有所增强，这可能是由于半乳糖醇的含量提高所致。一项关于不同酒蒸时间对苯乙醇苷类成分影响的研究结果表明，随着酒蒸时间的延长，苯乙醇苷类成分含量降低，提示可能存在向其他成分转化的质的变化，但具体机制有待进一步的研究[28]。黄林芳等[29]的研究结果表明，酒炙后肉苁蓉中苯乙醇苷类成分的含量相比生品均有明显增加。范亚楠等[30-32]的研究结果表明，肉苁蓉能明显改善便秘大鼠的便秘症状，增强润肠通便作用，且生品的效果强于酒制品、水提液的效果强于粉末。通过酒制后的肉苁蓉其抗氧化能力及免疫功能明显增强，但具体的机制还有待进一步研究和探讨[33]。3 结语传统肉苁蓉产地干燥主要以自然晾干为主，但该过程可能会导致苯乙醇苷类成分的损失且不卫生，因此科学合理的产地加工方法对肉苁蓉品质及疗效的保证具有重要意义[19]。目前肉苁蓉多采用先蒸制后晾晒的产地加工方法，不仅可起到杀酶、保苷的作用，提高有效成分的含量，同时还有助于缩短肉苁蓉的干燥时间[16]。蒸制时间的不同也会影响肉苁蓉活性成分的含量，故应根据具体需要进行加工处理。此外，结合干燥新技术，如“冷冻干燥技术”[8]、“气体射流冲击技术”[9]、“超声真空干燥技术”[10]也大大提高了干燥效率，提升了药材品质。肉苁蓉的炮制主要以酒制为主，通过酒制可明显提高有效成分的含量，增强其温补肾阳、抗氧化及免疫等功能[33]。但目前的文献研究大都报道酒制对4 种苯乙醇苷类成分的变化影响，较少涉及到其他成分的研究，对于引起质变的成分转化的机制研究尚未见有相关阐述。此外，关于肉苁蓉炮制品的研究，目前多集中在临床前动物研究阶段，对于主要成分的量效及药动关系研究则较少，仍有待进行更深入的临床研究及活性成分的追踪。参考文献[ 1 ] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2015 年版.北京：中国医药科技出版社，2015：135-136.[ 2 ] 唐慎微.经史证类备急本草[M].北京：中国医药科技出版社，2011：203.[ 3 ] 高云佳，姜勇，戴昉，等.肉苁蓉润肠通便的药效物质研究[J].中国现代中药，2015，17（4）：307-310、314.[ 4 ] 高晓霞，陈君，彭艳丽.肉苁蓉多糖药理作用研究概况[J].食品与药品，2015，17（2）：136-139.[ 5 ] 罗兰，吴小川，高惠静，等.肉苁蓉总苷对阿尔茨海默病模型大鼠的保护作用研究[J].中国药房，2013，24（23）：2122-2125.[ 6 ] JEON HJ，CHUNG KS，AN HJ. 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【摘要】目的：研究肉苁蓉苯乙醇总苷(CPhGs)脂质体对大鼠肝星状细胞(HSCs)增殖、凋亡、周期的影响及其相关分子机制。方法：HSCs分为空白对照组和CPhGs脂质体低、中、高浓度(分别为7.36、14.72、29.45 μg/mL)处理组。采用MTT法检测CPhGs脂质体对大鼠肝星状细胞增殖的影响；流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡状况，PI染色法检测大鼠肝星状细胞的周期变化；Western blot检测caspase-3、p27蛋白的表达变化。结果：与空白对照组比较，低、中、高3个剂量的CPhGs脂质体作用于HSCs后，均可抑制细胞的增殖(P<0.05)；3个剂量的CPhGs脂质体均可促使大鼠肝星状细胞发生凋亡，使细胞阻滞在G0/G1期，上调caspase-3及p27蛋白的表达(P<0.05)。结论：CPhGs脂质体对体外培养大鼠肝星状细胞有抑制增殖、促进凋亡、阻滞细胞周期的作用。其机制可能与CPhGs脂质体上调caspase-3和p27蛋白表达有关。【关键词】肉苁蓉苯乙醇总苷；脂质体；大鼠肝星状细胞；增殖；细胞凋亡；细胞周期肝纤维化的发展和结局是一个复杂的过程，涉及实质和非实质肝细胞以及浸润的免疫细胞。由于细胞外基质(extracellular matrix，ECM)蛋白质的产生、沉积增加而形成瘢痕的纤维反应是肝脏结构变化的关键步骤[1]。活化的肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)转为静止状态及其凋亡是逆转肝纤维化的关键因素[2]。肉苁蓉是常见的补益类中药，因其疗效切实，药性温和，自古就被视为强身壮体、滋补的中药，有“沙漠人参”之佳誉。化学及药理作用研究显示肉苁蓉苯乙醇总苷(Cistanche phenylethanoidglycosides，CPhGs)具有抗氧化、抗抑郁、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗菌和免疫调节等多种生物功能，是肉苁蓉发挥药效的主要物质基础之一[3]。本课题组前期实验研究证实，CPhGs对改善肝功能、抗肝纤维化有显著疗效，且随CPhGs浓度的增加，HSCs的凋亡率逐渐增高，呈现一定的剂量依赖关系[4]。目前许多已经被批准临床应用的抗肝纤维化作用药物，对晚期肝纤维化和肝硬化的治疗效果不佳，因此，研发靶向高效、高纯度、高稳定性、低免疫原性的抗肝纤维化药物势在必行。脂质体作为新型药物载体，可以增加药物透过细胞膜的能力，能够迅速到达病灶且主要分布于肝脏，从而降低药物毒性，其缓释性更能够增强药物的作用浓度，延长作用时间，减少药物用量，提高药物疗效[5-6]。因此，本实验以脂质体为药物载体包裹传统中药制成CPhGs脂质体，研究CPhGs脂质体对体外培养大鼠肝星状细胞增殖、凋亡、周期的作用，并初步探讨其相关的分子机制，旨在研究可能为临床所用的抗肝纤维化的靶向药物治疗途径，为进一步药物开发提供实验依据。1 材料与方法1.1 实验材料HSCs，购于上海中乔新舟生物科技有限公司；胎牛血清，购于美国Gibco公司，-20 ℃分装保存；双抗(青霉素、链霉素)、DMEM高糖培养基、0.25%胰酶(1×)，均购于美国Hyclone公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期检测试剂盒，均购于美国BD公司；四甲基偶氮唑盐MTT、DMSO，均购于美国Sigma公司；兔抗β-actin多克隆抗体，购于北京博奥森生物科技有限公司。1.2 实验仪器超净工作台，美国Thermo Scientific公司；CK-40型荧光倒置显微镜，日本Olympus公司；AEL-200型电子天平；TGL-16G型台式低温高速离心机；CO2细胞培养箱，英国NEW BRUNSWICK Galaxy®系列；全波长自动酶联免疫反应检验测试仪， 美国ThermoScientific公司；低温离心机，美国Sigma公司；数显恒温水浴锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；脱色摇床，北京市六一仪器厂；电热恒温培养箱，上海一恒科技有限公司；Western blot使用的电源、电泳装置及转膜装置，美国Bio-Rad 公司；移液器，美国Thermo Scientific公司；FluorChem E化学发光高灵敏凝胶成像仪，美国Protein Simple公司。1.3 CPhGs 脂质体的制备采用薄膜分散法制备CPhGs 脂质体。称取卵磷脂、DPPC、胆固醇(质量比5 mg∶10 mg∶10 mg)，溶于适量氯仿和甲醇混合溶剂中(V 氯仿∶V 甲醇=2∶1)，在49~50 ℃下旋转使成膜状，加入250 μg/mL的苯乙醇总苷不断旋转水化，使磷脂膜转入水中形成脂质体，将所得脂质体放入4 ℃冰箱中备用。所得脂质体用0.45 μm的微孔滤膜挤压4~5次，0.22 μm的微孔滤膜挤压18~20次，即得粒径均匀的苯乙醇总苷脂质体。包封率(38.46±7.85)%；电位45 mV；粒径209nm；载药量(3.71±0.23)%。1.4 细胞培养及分组将复苏的HSCs 常规培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，培养在37 ℃、CO2体积分数为5%的厌氧培养箱中，待细胞贴壁率约为80%时即可传代，复苏后传2~3代，待细胞状态稳定后即可用于实验。将HSCs 分为4 组：空白对照组(未加入受试物，只加培养液)、CPhGs脂质体低、中、高浓度(分别为7.36、14.72、29.45 μg/mL)处理组。1.5 MTT 法检测CPhGs 脂质体对HSCs 增殖的影响选择对数生长期的细胞、弃去培养液，加入500μL 0.25%的胰酶进行消化，制备单细胞悬液，调整细胞浓度为1×105 个/mL 后接种96 孔板，每孔100 μL，12 h贴壁后，吸去上清液，加入含各浓度CPhGs脂质体药物的完全培养基，每孔100 μL，每个浓度设3个复孔。CPhGs 脂质体药物用完全培养基倍比稀释成7.36、14.72、29.45 μg/mL 共3 个浓度。分别于培养24、48、72 h后加入5 mg/mL的MTT 20 μL，4 h后吸去上清加入150 μL DMSO，492 nm处测定吸光度D(492)值，并计算其均值。抑制率=[1-D(492)实验组/D(492)对照组]×100%1.6 流式细胞术检测CPhGs 脂质体对HSCs 凋亡的影响HSCs按1×105个/mL的浓度接种至6孔板，分组情况同1.4，给予受试物24 h后将细胞吸至15 mL离心管，每孔加入500 μL胰酶消化细胞，用对应的完全培养液终止消化，轻轻吹打孔里的细胞混匀，每孔加入2 mL PBS冲洗细胞，将孔里的PBS移至15 mL离心管，尽可能多收集孔里的细胞，1 000 r/min离心5min后弃上清，加5 mL PBS 至15 mL离心管冲洗细胞， 重复1 次。每个样品加入100 μL 1×BindingBuffer，重悬细胞，将细胞移至1.5 mL EP管，各样品加Annexin V、PE双染，混匀避光放置30 min后，分别加入400 μL Binding Buffer，1 h内上机检测细胞凋亡率。1.7 流式细胞术检测CPhGs 脂质体对HSCs 周期的影响HSCs按1×105个/mL的浓度接种至6孔板，细胞分组及处理同1.4。完成后逐滴加入5 mL或更多预冷的75%的乙醇，涡旋以混匀细胞，4 ℃避光过夜(>18h)。1 000 r/min离心10 min后弃上清，清洗细胞2次以去除所有的乙醇。分析前4 ℃避光保存样本，1 h之内采用流式细胞仪检测细胞周期。1.8 CPhGs 脂质体对HSCs 中caspase-3 和p27 蛋白表达的影响HSCs按1×105个/mL的浓度接种至6孔板，分组情况同1.4，给予受试物24 h后收集细胞，提取各组细胞中的总蛋白，上样于聚丙烯酰胺凝胶进行还原性SDS-PAGE 电泳，湿转(PVDF 膜)，200 mA 恒流电转90 min。封闭液(5%脱脂奶粉)封闭PVDF膜过夜，用1×TBST缓冲液充分振荡清洗，TBST稀释抗体，一抗浓度分别为caspase-3 (1∶1 000)、p27 (1∶1 500)、β-actin (1∶5 000)，ECL 显色。FluorChem E 化学发光高灵敏凝胶成像仪上检测条带灰度值。蛋白相对表达量=目的条带灰度值/内参条带β-actin灰度值×100%1.9 统计学方法采用SPSS 19.0 软件进行统计学分析，数据以xˉ±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组样本两两比较采用LSD法，检验水准α=0.05。2 结果2.1 CPhGs 脂质体对HSCs 增殖的影响采用MTT比色法检测CPhGs脂质体对HSCs增殖的影响，结果见图1。与空白对照组相比，CPhGs脂质体低、中、高即7.36、14.72、29.45 μg/mL剂量组的细胞生长速度均明显减慢(P<0.05)。同一时间点，与空白对照组相比较，随着药物浓度升高，抑制细胞增殖作用增加(P<0.05)；同一浓度组，随时间延长，细胞活力不断降低；且随着时间以及药物浓度的增加，抑制HSCs增殖能力不断上升。提示CPhGs脂质体具有抑制HSCs增殖的作用。2.2 CPhGs 脂质体对HSCs 凋亡的影响7.36、14.72、29.45 μg/mL 的CPhGs 脂质体作用于HSCs 24 h后，早期凋亡与晚期凋亡的细胞总和分别为(18.5±2.7)%、(26.6±2.3)%、(31.6±1.9)%，与空白对照组的(5.0±0.9)%相比，差异均有统计学意义(P<0.05)，结果见表1和图2。分析表明CPhGs脂质体3个剂量组均可明显诱导HSCs的早、晚期凋亡(与空白对照组比较，P<0.05)，提示CPhGs 脂质体可通过诱导HSCs凋亡，从而抑制HSCs的激活及肝纤维化的发生。2.3 CPhGs 脂质体对HSCs 细胞周期的影响细胞周期分析结果(表2和图3)显示，CPhGs脂质体各剂量组处理的HSCs，与空白对照组相比，G0/G1期的细胞比例均明显增多(P<0.05)，而S期细胞比例明显减少(P<0.05)，G2/M期细胞比例明显减少(P<0.05)。提示CPhGs脂质体可通过诱导细胞周期阻滞抑制HSCs增殖，CPhGs脂质体可引起细胞周期明显阻滞。2.4 CPhGs 脂质体对大鼠肝星状细胞caspase-3、p27 蛋白表达水平的影响Western blot 检测结果见图4。与正常对照组比较，CPhGs脂质体(29.45、14.72 μg/mL)组大鼠肝星状细胞caspase-3蛋白的表达水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；其中CPhGs脂质体29.45 μg/mL浓度组上调作用最明显(P<0.05)； 与空白对照组比较，CPhGs脂质体各剂量组p27蛋白的表达水平均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；CPhGs脂质体29.45μg/mL浓度组上调作用最明显(P<0.05)。3 讨论肝纤维化是因ECM合成与降解失衡所致，是各种肝病发展为肝硬化的共同途径。HSCs的激活是肝纤维化形成的中心环节，在肝损伤修复过程中发挥作用。肝损伤后，HSCs受各种致病因子刺激，从静态转化为具增生性、纤维原性和可收缩性的肌成纤维细胞，肌成纤维细胞产生大量ECM沉积于肝脏，最终导致肝纤维化。近年来研究发现，随着肝星状细胞数量的减少，肝纤维化程度可得到明显改善[7-8]。因此，抗肝纤维化的药物研究多数以肝星状细胞为作用点寻找突破，经抑制炎症反应，减少肝损伤因素如酒精药物等，干扰相关细胞因子的活性调节和信号转导的正常进行，以达到抑制肝星状细胞活化及增殖，并诱导其凋亡，减少ECM 生成，寻找能以HSCs 为作用靶点，成为治疗肝纤维化的重要策略[1]。迄今为止，国内外的研究中，抑制HSCs活化并促进其凋亡、调节ECM的合成和降解等方面已取得一些成果，对肝纤维化的临床治疗提供了一些药物和方法，但总体疗效仍不理想。目前多认为，限制抗肝纤维化药物效果的原因，可能与药物无法达到靶细胞、或到达靶细胞但无法在其周围形成有效的药物浓度及半衰期短和药物对其他组织细胞的副作用大过增加剂量带来的疗效等有关[9]。随着肝脏疾病病死率的提高和中医药现代化进程的深入，中药防治肝纤维化的机制研究越来越被人们所关注，可用于肝纤维化防治药物的分子靶点也与日俱增[10]。肉苁蓉(Cistanches Herba)为列当科植物肉苁蓉(Cistanche Deserticola Y. C. Ma)或德赢vwin登录 [C. tubulosa (Schenk) Wight]的干燥带鳞叶的肉质茎，作为滋补类传统中药在中国具有悠久的应用历史化学作用及药理作用[11]。课题组前期研究结果显示，CPhGs 可明显抑制HSC 的增殖，诱导其凋亡。且随CPhGs 浓度的增加，HSCs 的凋亡率逐渐增高，预示其在治疗肝脏疾病中有着广阔的应用前景[12]。因此，研发靶向高效、高纯度、高稳定性、低免疫源性的CPhGs势在必行，同时应加强CPhGs抗肝纤维化机制的深入研究，为进一步可能的临床研究提供最扎实的理论基础。本实验在体外水平研究3种不同剂量的CPhGs脂质体对HSCs增殖、凋亡、周期及相关蛋白表达的影响，探讨CPhGs脂质体的抗肝纤维化机制，以期为肝纤维化的防治奠定基础。MTT检测结果显示，高、中及低剂量组CPhGs脂质体各浓度组24、48及72 h均能抑制HSCs的增殖(P<0.05)。细胞凋亡，又称程序性细胞死亡，细胞调亡是由基因调控的一种主动的细胞死亡过程，在某些生理或病理条件下，对维持机体正常的生理和功能活动具有重要的生物学意义[13]。Caspase蛋白家族成员组成凋亡通路的关键基因，细胞色素C是发现的第一种线粒体释放促凋亡蛋白，是线粒体呼吸链的重要组成部分。细胞色素C 使Apaf1 寡聚化并能使caspase-9 前体聚集，最终导致caspase-9前体水解形成活性酶。随后caspase-9促使其他caspase酶(如caspase-7)的执行者即caspase-3 前体转换为有活性的caspase-3。Caspase-3是细胞凋亡早期一种非常重要的物质，被认为是执行酶中最为重要的一个，能够被所有的起始凋亡蛋白酶活化，并降解细胞主要结构，最终瓦解细胞[14]。本次细胞凋亡检测结果显示，CPhGs脂质体3个剂量组均可明显诱导大鼠肝星状细胞的早、晚期凋亡(与空白对照组比较，P<0.05)。蛋白水平检测结果显示，与正常对照组细胞相比，在CPhGs脂质体(29.45、14.72 μg/mL)处理的细胞中，caspase-3 蛋白水平表达显著上调。这与细胞凋亡分析结果显示的CPhGs脂质体处理的HSCs出现了明显凋亡，证实CPhGs脂质体可能是通过上调caspase-3 基因的表达而抑制细胞的增殖能力，从而诱导HSCs发生凋亡。细胞周期分为分裂间期和分裂期，其中分裂期又可分为：DNA 合成前期(G1 期)、DNA 合成期(S 期)和DNA合成后期(G2期)[15]。细胞周期的正常运行依赖于正、负调节因子的共同参与。正调节因子包括细胞周期蛋白(cyclin)和细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclindependent kinase，CDK)；负调节因子主要是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(cyclin dependent kinaseinhibitor，CKI)。以上3种调控因子在维持细胞有序的增殖、分裂活动中起重要作用，三者相互作用，共同参与细胞周期调控[16]。p27 属于CKI， 可通过抑制cyclin/CDK形成异二聚体结构，使细胞停滞于G1期，从而实现对细胞周期的调控功能[17]。细胞周期检测结果显示，CPhGs脂质体3个剂量组处理的HSCs，与空白对照组相比，G0/G1 期的细胞比例均明显增多(P<0.05)，而S期细胞比例明显减少(P<0.05)，G2/M期细胞比例明显减少(P<0.05)，且呈一定的剂量依赖关系。与正常对照组细胞相比，在CPhGs脂质体(7.36、14.72、29.45 μg/mL)处理的细胞中，p27蛋白水平表达显著上调。这与细胞凋亡分析结果显示的CPhGs脂质体处理的细胞出现明显的G1期阻滞，S期和G2/M期细胞比例显著减少是一致的。说明p27在CPhGs脂质体抑制HSCs增殖中可能具有重要作用。本研究结果显示，在细胞水平上，探讨了CPhGs脂质体对HSCs的影响。将不同剂量的CPhGs脂质体药物对HSC进行处理，CPhGs脂质体3个剂量组均可以抑制HSC的增殖，增加了HSC的凋亡，这一过程可能是通过激活以及caspase-3蛋白表达而引起细胞凋亡。此外，CPhGs脂质体可使HSC细胞周期更多地停滞在S期，可能的作用机制是影响了细胞周期蛋白p27蛋白的表达，从而抑制细胞周期的能力。提示细胞凋亡和细胞周期调节是CPhGs脂质体防治肝纤维化的两个靶点，根据这一结论，可对细胞周期和凋亡相关的信号通道进行更深入的研究，进一步揭示CPhGs脂质体的抗纤维化机制，以达到靶向或抑制肝纤维化的目的。参考文献[1] 胡潇, 胡光荣, 刘思达, 等. 肝纤维化治疗进展[J]. 肝脏,2018, 23(10): 931-933.[2] SUN H, CHEN G, WEN B, et al. 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　［摘要］　目的　探讨肉苁蓉苯乙醇总苷（ＣＰｈＧｓ）脂质体对重组大鼠血小板衍生生长因子－ＢＢ（ｒｒＰＤＧＦＢＢ）诱导的大鼠肝星状细胞（ＨＳＣ）增殖作用的影响及其抗肝纤维化的相关分子机制。方法　取生长状态良好的对数生长期ＨＳＣ用于实验，置于ＣＰｈＧｓ脂质体浓度为１１７．７９、５８．９０、２９．４５、１４．７２、７．３６、３．６８、１．８４、０．９２和０．４６ｍｇ／Ｌ的完全培养液，求出半数抑制浓度（ＩＣ５０）；ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ刺激后，采用四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ）法测定２９．４５、１４．７２、７．３６ｍｇ／Ｌ　ＣＰｈＧｓ脂质体对ＨＳＣ增殖的影响；采用实时荧光定量聚合酶链反应（ｑＲＴ－ＰＣＲ）检测α－平滑肌肌动蛋白（α－ＳＭＡ）、Ⅰ型胶原、ＡＴＦ－２ｍＲＮＡ的表达水平；采用Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法检测ＣＰｈＧｓ脂质体对ｐ－ｐ３８蛋白表达的影响。结果　（１）对细胞增殖的影响：对不同时间点结果分析显示，与Ｎｏｒｍａｌ组比较，细胞培养４８ｈ时，ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组ＨＳＣ细胞明显增多；ＣＰｈＧｓ脂质体各剂量组抑制ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ诱导的ＨＳＣ增殖作用，培养４８ｈ效率最高；对不同浓度结果分析显示，与ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组比较，不同浓度ＣＰｈＧｓ脂质体组均可抑制ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ诱导的ＨＳＣ－Ｔ６的增殖。（２）ｑＲＴ－ＰＣＲ结果：ＣＰｈＧｓ脂质体各剂量组间比较，随ＣＰｈＧｓ脂质体药物浓度增大，α－ＳＭＡ、Ⅰ型胶原和ＡＴＦ－２ｍＲＮＡ 水平显著下降，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５），其中以ＣＰｈＧｓ脂质体２９．４５ｍｇ／Ｌ组抑制效果最明显。（３）Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ分析结果：ｐ－ｐ３８蛋白的表达水平在ＣＰｈＧｓ脂质体不同浓度组表达均下降，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；ＣＰｈＧｓ脂质体各剂量组间比较，ｐ－Ｐ３８蛋白随ＣＰｈＧｓ脂质体干预剂量增大，表达水平显著下降（Ｐ＜０．０５）。结论　ＣＰｈＧｓ脂质体能抑制ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ诱导的大鼠ＨＳＣ增殖，从而起到抗肝纤维化的作用。［关键词］　肝星状细胞；肝纤维化；重组大鼠血小板衍生生长因子－ＢＢ；肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体肝纤维化（ｈｅｐａｔｉｃ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ，ＨＦ）是一种常见的慢性肝损伤过程，许多与肝损伤相关的因素都可以导致ＨＦ［１］。在ＨＦ病理过程中常出现以下症状：肝细胞坏死、结缔组织异常增生、肝循环紊乱等，最终导致肝硬化继而引发肝衰竭［２］。之前的研究报道指出，ＨＦ是一种可逆的病理现象，早期预防或治疗ＨＦ对慢性肝病的治疗有重要意义［３］。目前研究的重点是寻找疗效确切、不良反应小的药物，以延缓、抑制甚至逆转ＨＦ的进程［４］。一些临床实践和试验研究证明，中医药通过多成分、多路径、多层次、多目标的综合药理作用能减缓ＨＦ的进程［５－７］。肉苁蓉是名贵的补益类中药，分布于中国北部的干旱地区和沙漠地区［８］。脂质体作为载体在临床应用中具有安全性好、生物相容性好、载药及靶向效果明确的优点，也是最早用于靶向给药的载体［９］。本研究旨在探讨肉苁蓉苯乙醇总苷（ＣＰｈＧｓ）脂质体对重组大鼠血小板衍生生长因子（ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ）诱导的肝星状细胞（ｈｅｐａｔｉｃ　ｓｔｅｌｌａｔｅｃｅｌｌ，ＨＳＣ）增殖的作用，为肝纤维化的治疗提供依据。１　材料与方法１．１　材料　用薄膜分散二次包封法制备ｐＰＢ修饰的肉苁蓉总苷靶向脂质体，其粒径为２１２．７ｎｍ，电位３５～５０ｍＶ，包封率（３８．４６±７．８５）％，由本实验室保存。ＨＳＣ（中乔新舟），胎牛血清（美国Ｇｉｂｃｏ公司），青霉素（美国Ｈｙｃｌｏｎｅ公司），链霉素（美国Ｈｙｃｌｏｎｅ公司），ＤＭＥＭ 高糖培养基（美国Ｈｙｃｌｏｎｅ公司），四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ，美国Ｓｉｇｍａ公司），二甲基亚砜（ＤＭＳＯ，美国Ｓｉｇｍａ公司），磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ，ＢＩ公司），０．２５％胰酶（美国Ｈｙｃｌｏｎｅ公司），ＴＲＩｚｏｌ　Ｒｅａｇｅｎｔ（赛默飞公司），ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ　Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（赛默飞公司），ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　ＴａｑＴＭⅡ（ＴａＫａＲａ公司），ＰＩＰＡ裂解液（赛默飞公司），蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（ＰＭＳＦ，博士德生物），蛋白定量试剂盒（ＢｉｏＭＩＧＡ公司），十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）凝胶制备试剂盒（北京索莱宝公司），５×Ｔｒｉｓ－甘氨酸电泳缓冲液（北京索莱宝公司），１０×电转液（北京索莱宝公司），１０×ＴＢＳＴ（北京索莱宝公司），无水乙醇（天津大茂化学试剂厂），异丙醇（天津富宇精细化工有限公司），氯仿（天津大茂化学试剂厂），甲醇（天津市大茂化学试剂厂），辣根过氧化物酶标记山羊抗兔ＩｇＧ（中杉金桥），ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ（Ｒ＆Ｄ公司），４×蛋白上样缓冲液（北京索莱宝公司），兔抗β－ａｃｔｉｎ多克隆抗体（北京博奥森生物科技有限公司），兔抗ｐ３８丝裂原活化蛋白激酶（ＭＡＰＫ）多克隆抗体（北京博奥森生物科技有限公司），兔抗ｐ－ｐ３８ＭＡＰＫ多克隆抗体（北京博奥森生物科技有限公司）。１．２　方法１．２．１　细胞培养与传代　大鼠ＨＳＣ 在含有１００Ｕ／ｍＬ青霉素、１００ｍｇ／Ｌ链霉素和１０％胎牛血清的高糖ＤＭＥＭ 细胞培养液，于３７℃、５％ ＣＯ２培养箱中培养。细胞隔日换液，待生长融合至８０％～９０％时，使用０．２５％胰蛋白酶消化收集细胞，按１∶２进行传代培养，实验均采用对数生长期细胞。１．２．２　抑制率为５０％时的药物浓度计算　实验设９个ＣＰｈＧｓ脂质体系列浓度组和１个空白对照组，共１０组，每组３个复孔。ＣＰｈＧｓ脂质体系列浓度组剂量分别为１１７．７９、５８．９０、２９．４５、１４．７２、７．３６、３．６８、１．８４、０．９２和０．４６ｍｇ／Ｌ。将处于对数生长期，浓度为５×１０４／ｍＬ的ＨＳＣ－Ｔ６细胞悬液接种于９６孔板，每孔添加量为１００μＬ，每组设３个复孔，于３７℃、５％ＣＯ２培养箱中培养２４ｈ后，观察细胞生长状态，若贴壁则弃上清液，根据分组设计分别更换含１１７．７９、５８．９０、２９．４５、１４．７２、７．３６、３．６８、１．８４、０．９２和０．４６ｍｇ／ＬＣＰｈＧｓ脂质体的完全培养液和空白完全培养液。加药后轻晃混匀，放至培养箱继续培养４８ｈ，镜下观察细胞状态，拿至工作台，避光，每孔加浓度为５ｍｇ／ｍＬ的ＭＴＴ　２０μＬ，放至培养箱，４ｈ后，吸去孔里的液体，每孔加入ＤＭＳＯ　１５０μＬ，于摇床轻晃１０ｍｉｎ，用酶标仪于４９２ｎｍ 波长测定，记录吸光度（Ａ）值。计算各复孔Ａ 值能平均值，计算抑制率，以此找寻ＣｐｈＧｓ脂质体的最佳作用浓度。抑制率（％）＝（１－各浓度的平均Ａ 值）／空白组平均Ａ 值×１００％）；以ＣＰｈＧｓ脂质体作用浓度为横轴，细胞生长抑制率为纵轴，绘制ＣＰｈＧｓ脂质体作用于ＨＳＣ－Ｔ６的量效反应曲线，采用Ｐｒｏｂｉｔ分析计算５０％ 存活率的ＣＰｈＧｓ脂质体浓度，即为半数抑制浓度（ＩＣ５０）。１．２．３　细胞分组　（１）Ｎｏｒｍａｌ组；（２）ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组；（３）ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ＋２９．４５ｍｇ／Ｌ　ＣＰｈＧｓ脂质体组；（４）ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ＋１４．７２ｍｇ／Ｌ　ＣＰｈＧｓ脂质体组；（５）ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ＋７．３６ｍｇ／Ｌ　ＣＰｈＧｓ脂质体组。各组细胞均培养２４ｈ后进行后续实验。１．２．４　不同浓度ＣＰｈＧｓ脂质体对ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ诱导的ＨＳＣ增殖的影响　大鼠ＨＳＣ以１×１０５／ｍＬ密度接种至９６孔板，待细胞贴壁后进行分组干预，每组设３个复孔。分别培养２４、４８和７２ｈ，每孔加入２０μＬ的ＭＴＴ溶液，培养箱内３７℃培养４ｈ后，弃去ＭＴＴ溶液，再向各孔内加入１５０μＬ的ＤＭＳＯ，置于摇床室温摇动１０ｍｉｎ，待结晶充分溶解后，于酶标仪４９２ｎｍ波长处测定Ａ 值。抑制率＝［（模型组－空白组）－（用药组－空白组）］／（模型组－空白组）×１００％。１．２．５　实时荧光定量聚合酶链反应（ｑＲＴ－ＰＣＲ）检测α－平滑肌肌动蛋白（α－ＳＭＡ）、Ⅰ型胶原和ＡＴＦ－２的ｍＲＮＡ 的表达　Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒提取大鼠ＨＳＣ 总ＲＮＡ，经纯度及完整性鉴定后反转录反应生成ｃＤＮＡ。按照ｑＲＴ－ＰＣＲ 试剂盒说明书建立ｑＲＴ－ＰＣＲ反应体系，使用ｑＲＴ－ＰＣＲ 检测仪进行检测。ｑＲＴＰＣＲ热循环参数：９５℃预变性３０ｓ，９５ ℃变性５ｓ，６０℃退火３０ｓ，７２℃延伸４５ｓ，共４０个循环。结果分析以β－ａｃｔｉｎ为内参基因，确定每个样品、每个基因扩增的循环阈值（ＣＴ），按照２－△△ＣＴ计算目的基因的相对表达水平，所用引物序列见表１。１．２．６　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法分析ｐ－ｐ３８蛋白表达水平　收集细胞，运用ＲＩＰＡ 裂解液提取各组细胞总蛋白，ＢＣＡ法测定蛋白浓度，取相同质量的蛋白上样，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ转移至硝酸纤维素膜，５％的脱脂奶粉室温封闭１ｈ，一抗（１∶１　０００兔抗ｐ－ｐ３８多克隆抗体；１∶１　０００兔抗ｐ３８多克隆抗体）４ ℃摇床孵育过夜，ＴＢＳＴ漂洗３次，二抗（１∶２５　０００辣根过氧化物酶标记山羊抗兔ＩｇＧ）室温避光孵育１ｈ，ＴＢＳＴ漂洗３次后，电化学发光（ＥＣＬ）显影试剂盒曝光显影。利用图像分析软件Ｉｍａｇｅ　Ｊ对条带进行灰度值的测定，计算分析各组蛋白相对表达水平，以ｐ－ｐ３８与ｐ３８条带信号强度的比值表示ｐ－ｐ３８蛋白表达水平。１．３　统计学处理　采用ＳＰＳＳ　１７．０软件进行统计学分析。计量资料以ｘ±ｓ表示，两组间计量资料比较采用两独立样本ｔ检验，多组间计量资料比较采用单因素方差分析，以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。２　结　　果２．１　ＧＰｈＧｓ脂质体对ＨＳＣ的ＩＣ５０　由于ＣＰｈＧｓ脂质体药物浓度的递增，ＨＳＣ 的抑制率随之增加，当ＣＰｈＧｓ脂质体药物浓度为１１７．７９ｍｇ／Ｌ时，抑制率为（６９．０９±１．０６）％，经过Ｐｒｏｂｉｔ分析，ＣＰｈＧｓ脂质体药物的ＩＣ５０为２９．０６ｍｇ／Ｌ，见图１。２．２　不同时间、不同浓度ＧＰｈＧｓ脂质体对ｒｒＰＤＧＦＢＢ诱导的ＨＳＣ增殖的影响　ＭＴＴ实验结果显示在２４ｈ时，与Ｎｏｒｍａｌ组比较，ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组和不同浓度ＣＰｈＧｓ脂质体组Ａ 值显著升高，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；与ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组比较，除７．３６ｍｇ／ＬＣＰｈＧｓ脂质体组外，其余浓度ＣＰｈＧｓ脂质体组Ａ 值显著下降，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。在４８ｈ和７２ｈ时，与Ｎｏｍａｌ组比较，ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组和不同浓度ＣＰｈＧｓ脂质体组Ａ 值显著升高，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；与ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组比较，不同浓度ＣＰｈＧｓ脂质体组Ａ 值显著下降，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５），见表２。２．３　不同时间、不同浓度ＧＰｈＧｓ脂质体对ｒｒＰＤＧＦ － ＢＢ诱导的ＨＳＣ 增殖抑制的影响　在２４ｈ时，与２９．４５ｍｇ／Ｌ和１４．７２ｍｇ／Ｌ　ＣＰｈＧｓ脂质体组比较，７．３６ｍｇ／Ｌ　ＣＰｈＧｓ脂质体组抑制率显著降低，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。在４８ｈ和７２ｈ与２９．４５ｍｇ／Ｌ　ＣＰｈＧｓ脂质体组比较，１４．７２ｍｇ／Ｌ 和７．３６ｍｇ／Ｌ　ＣＰｈＧｓ脂质体组抑制率显著降低，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；与１４．７２ｍｇ／Ｌ　ＣＰｈＧｓ脂质体组比较，７．３６ｍｇ／Ｌ　ＣＰｈＧｓ脂质体组抑制率显著降低，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５），见表３。２．４　ＧＰｈＧｓ脂质体对ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ诱导的ＨＳＣα－ＳＭＡ、Ⅰ型胶原、ＡＴＦ－２ｍＲＮＡ 表达的影响　ｑＲＴＰＣＲ实验结果显示，与Ｎｏｒｍａｌ组比较，α－ＳＭＡ 和Ⅰ型胶原基因在ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组、１４．７２ｍｇ／Ｌ和７．３６ｍｇ／Ｌ　ＣＰｈＧｓ脂质体组表达显著增加，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；与ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组比较，α－ＳＭＡ和Ⅰ型胶原基因在不同浓度ＣＰｈＧｓ脂质体组表达下降，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。与Ｎｏｒｍａｌ组比较，ＡＴＦ－２基因在ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组和不同浓度ＣＰｈＧｓ脂质体组表达显著升高，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；与ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ 组比较，ＡＴＦ－２ 基因在不同浓度ＣＰｈＧｓ脂质体组表达下降，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５），见图２。２．５　ＧＰｈＧｓ脂质体对ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ诱导的ＨＳＣ　ｐｐ３８蛋白表达的影响　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ实验结果显示，与Ｎｏｒｍａｌ组比较，ｐ－ｐ３８蛋白在ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组和不同浓度ＣＰｈＧｓ脂质体组表达显著增加，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；与ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组比较，ｐ－ｐ３８蛋白在不同浓度ＣＰｈＧｓ脂质体组表达下降，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５），见图３。３　讨　　论　　ＨＦ是世界范围内的健康问题，５０％的肝癌患者死于ＨＦ［１０］。尽管ＨＦ发病率高，但目前尚无有效的治疗方法。目前抗ＨＦ的治疗策略的主要目的是抑制ＨＳＣ活化和增殖。血小板生长因子（ＰＤＧＦ）－ＢＢ存在于肝脏中，对ＨＳＣ的增殖有着较强的促进作用，能促进ＨＳＣ活化增殖及胶原分泌，是一个高度有效的ＨＳＣ促有丝分裂原，ＰＤＧＦ与其受体ＰＤＧＦＲ结合形成二聚体后，激活ＭＡＰＫ 信号通路，诱导ＨＳＣ持续活化；促进ＨＳＣ迁移、增殖的同时抑制其凋亡［１１］。ＰＤＧＦ信号中断，通过其受体阻断ＭＡＰＫ信号通路，ＨＳＣ的增殖和胶原的分泌受到抑制。有学者在研究羟基红花黄色素Ａ（ＨＳＹＡ）对ＨＦ的作用时发现，ＨＳＹＡ 对ＰＤＧＦ－ＢＢ诱导的ＨＳＣ的增殖有明显的抑制作用［１２］。本研究用５０μｇ／Ｌ的ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ刺激ＨＳＣ，所有实验分组在同一刺激因子作用下进行。ＭＴＴ实验结果显示：ＣＰｈＧｓ 脂质体作用２４ ｈ 抑制率为１０．７７％～３２．４５％，且抑制率与实验时间和药物浓度呈线性增加关系，４８ｈ抑制率为２６．５０％～５０．７３％，７２ｈ抑制率为２０．７５％～５４．６８％。从实验结果可以看出，实验时间的延长并没有使抑制率发生较大的改变，作者认为４８ｈ是药物的最佳反应时间。研究结果表明，不同浓度的ＣＰｈＧｓ脂质体均能抑制ＨＳＣ 的增殖。任何病因的肝损伤最终都会导致ＨＳＣ的活化、肌成纤维细胞分化转为ＨＦ。也就是说，肌成纤维细胞来自活化和增殖的ＨＳＣ，且被视为是ＨＦ形成的中介［１３］。而ＨＳＣ的活化则是ＨＦ的主要过程［１４］。活化的ＨＳＣ通过积累产生ＥＣＭ，分泌细胞因子，增强趋化能力进而促进肝上皮细胞的再生［１５］。在慢性肝病中，ＨＳＣ的反复激活导致肝纤维化，其特征是广泛的瘢痕形成和干扰肝脏正常结构与功能。最近的临床试验提示，ＨＦ在清除潜在病原体过程中是可逆的［１６］。肝损伤后ＨＳＣ经历一个复杂的从静止状态向肌成纤维细胞转换或激活过程，其中α－ＳＭＡ 在肌成纤维细胞分化中起作用。α－ＳＭＡ降低了收缩力和Ⅰ型胶原合成并抑制伤口收缩。Ⅰ型胶原和α－ＳＭＡ被认为是肝纤维化中诱导ＨＳＣ活化的标志物。在四氯化碳（ＣＣｌ４）所致的ＨＦ研究中发现，ＨＳＣ活化过程中α－ＳＭＡ 和Ⅰ型胶原表达上调［１７］。而最近的研究表明，ＨＳＣ的活化可以由几个促有丝分裂原推动，包括ＰＤＧＦ、胰岛素样生长因子－１（ＩＧＦ－１）［１８］和结缔组织生长因子（ＣＴＧＦ）［１９］。在关于ＴＲＰＭ７ 通道调节ＰＤＧＦ－ＢＢ诱导的ＨＳＣ 增殖的研究数据表明，ＴＲＰＭ７可降低α－ＳＭＡ和Ⅰ型胶原的表达，抑制ＨＦ［２０］。ＡＴＦ－２参与多条信号通路的传导，同时在肝组织表达的ＡＴＦ－２的碱基在ｐ３８磷酸化后出现转录活性和ＤＮＡ结合的增加。本研究探讨不同浓度ＣＰｈＧｓ脂质体对ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ诱导的ＨＳＣ增殖的影响。ｑＲＴＰＣＲ扩增检测α－ＳＭＡ、Ⅰ型胶原、ＡＴＦ－２ｍＲＮＡ 结果提示，与Ｎｏｒｍａｌ组相比，ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组α－ＳＭＡ、Ⅰ型胶原、ＡＴＦ－２ｍＲＮＡ表达明显增高；与ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组相比，不同浓度的ＣＰｈＧｓ脂质体均可不同程度下调α－ＳＭＡ、Ⅰ型胶原、ＡＴＦ－２ｍＲＮＡ表达，其中２９．４５ｍｇ／Ｌ　ＣＰｈＧｓ脂质体组下调作用最明显，α－ＳＭＡ，Ⅰ型胶原ｍＲＮＡ 与Ｎｏｒｍａｌ组比较，差异无统计学差异，作者认为产生这种现象的原因在于浓度越高，其对ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ引起的ＨＳＣ增殖的抑制效果越明显，越趋近于正常。作者认为ＣＰｈＧｓ脂质体能有效抑制ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ刺激的ＨＳＣ中Ⅰ型胶原和ＡＴＦ－２ｍＲＮＡ表达、下调α－ＳＭＡ　ｍＲＮＡ表达，进而减少ＥＣＭ合成与分泌，阻止ＨＦ的形成。此外，ＭＡＰＫ信号转导途径及其子系统ｐ３８通路参与ＨＳＣ的活化，因而可能成为治疗ＨＦ的靶点。ｐ３８ＭＡＰＫ是ＭＡＰＫ 家族成员之一，ｐ３８是由各种刺激引起的许多细胞的传感器，且在调节棕色脂肪细胞、肌肉细胞和肝细胞的能量平衡过程中起着重要的作用，ｐ３８ＭＡＰＫ也被认为在调节炎性因子方面扮演重要角色。因此，ｐ３８ＭＡＰＫ激活可能在ＨＳＣ损伤与炎症过程中发挥作用。研究证明ＰＤＧＦ－ＢＢ可通过ＭＡＰＫ信号通路诱导ＨＳＣ细胞活化与增殖［２１］。栀子苷可抑制ｐ－ｐ３８蛋白的表达从而起到抑制ＨＦ的作用［２２］。本研究结果显示，与Ｎｏｒｍａｌ组比较，ｒｒＰＤＧＦＢＢ组ｐ－ｐ３８的蛋白表达水平明显增高，表明ｒｒＰＤＧＦＢＢ可通过影响ＭＡＰＫ信号而使ＨＳＣ活化增殖。不同浓度的ＣＰｈＧｓ脂质体组，ｐ－ｐ３８的蛋白表达水平随着药物浓度的升高逐渐降低，且将不同浓度的ＣＰｈＧｓ脂质体组ｐ－ｐ３８的蛋白表达水平与ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组比较，差异均有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。由此可见，ＣＰｈＧｓ脂质体可在一定程度上抑制ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ诱导的ＨＳＣ增殖与活化，从而抑制ＨＦ的形成。当前，对ＨＦ的了解较少，全新的方法及技术手段将会对ＨＦ进行深入研究，从而对干预、早期诊断和治疗ＨＦ提供全新的治疗策略。参考文献［１］ ＺＯＩＳ　Ｃ　Ｄ，ＢＡＬＴＡＹＩＡＮＮＩＳ　Ｇ　Ｈ，ＫＡＲＡＹＩＡＮＮＩＳ　Ｐ，ｅｔａｌ．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ｒｅｖｉｅｗ：ｈｅｐａｔｉｃ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ－ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］．Ａｌｉｍｅｎｔ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｔｈｅｒ，２００８，２８（１０）：１１７５－１１８７．［２］ 周光德，赵景民．不同病因致肝纤维化／肝硬化的病理特点［Ｊ］．临床肝胆病杂志，２０１６，３２（６）：１０８６－１０９１．［３］ 盛婷，傅念，阳学风，等．肝纤维化发病机制中细胞和分子机制的研究进展［Ｊ］．现代生物医学进展，２０１５，１５（１２）：２３５８－２３６２．［４］ ＬＩ　Ｙ，ＳＨＩ　Ｙ，ＳＵＮ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｈｙｄｒｏｘｙｓａｆｆｌｏｒ　ｙｅｌｌｏｗ　Ａ　ｏｎ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ａｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｃａｒｂｏｎｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｉｄｅ［Ｊ］．Ｍｏｌ　Ｍｅｄ　Ｒｅｐ，２０１７，１５（１）：４７－５６．［５］ ＳＰＥＮＧＬＥＲ　Ｕ．Ｈｅｐａｔｉｃ　ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ：ａ　ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｂｕｔ　ｎｅｇｌｅｃｔｅｄｆａｃｔｏｒ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｏｕｔｃｏｍｅ　ｏｆ　ｖｉｒａｌ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｈｅｐａｔｏｌ，２００９，５０（３）：６３１－６３３．［６］ ＬＩＵ　Ｙ　Ｗ，ＣＨＩＵ　Ｙ　Ｔ，ＦＵ　Ｓ　Ｌ，ｅｔ　ａｌ．Ｏｓｔｈｏｌｅ　ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓｈｅｐａｔｉｃ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｉｎｈｉｂｉｔｓ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｓｔｅｌｌａｔｅ　ｃｅｌｌ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｍｅｄ　Ｓｃｉ，２０１５，２２（１）：６３．［７］ ＹＡＮＧ　Ｆ　Ｒ，ＷＥＮ　Ｄ　Ｓ，ＦＡＮＧ　Ｂ　Ｗ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　ｏｆｅｘｔｒａｃｔ　ｆｒｏｍ　ｃｉｓｔａｎｃｈｅ　ｓａｌｓａ　ｏｎ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙＣａｒｂｏｎ　ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｉｎ　ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈｅｒｂａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ，２０１３，５（３）：１９９－２０４．［８］ 屠鹏飞，姜勇，郭玉海，等．发展肉苁蓉生态产业推进西部荒漠地区生态文明［Ｊ］．中国现代中药，２０１５，１７（４）：２９７－３０１．［９］ ＳＥＲＣＯＭＢＥ　Ｌ，ＶＥＥＲＡＴＩ　Ｔ，ＭＯＨＥＩＭＡＮＩ　Ｆ，ｅｔ　ａｌ．Ａｄｖａｎｃｅｓ　ａｎｄ　ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ　ｏｆ　ｌｉｐｏｓｏｍｅ　ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｄｒｕｇ　ｄｅｌｉｖｒｙ［Ｊ］．Ｆｒｏｎｔ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２０１５，６（３）：２８６．［１０］ＬＥＥ　Ｙ　Ａ，ＷＡＬＬＡＣＥ　Ｍ　Ｃ，ＦＲＩＥＤＭＡＮ　Ｓ　Ｌ．Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｌｉｖｅｒ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ：ａ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　ｓｕｃｃｅｓｓ　ｓｔｏｒｙ［Ｊ］．Ｇｕｔ，２０１５，６４（５）：８３０－８４１．［１１］ＷＡＮＧ　Ｙ，ＧＡＯ　Ｊ　Ｃ，ＺＨＡＮＧ　Ｄ　Ｉ，ｅｔ　ａｌ．Ｎｅｗ　ｉｎｓｉｇｈｔｓ　ｉｎｔｏｔｈｅ　ａｎｔｉｆｉｂｒｏｔｉｃ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｓｏｒａｆｅｎｉｂ　ｏｎ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｓｔｅｌｌａｔｅ　ｃｅｌｌｓａｎｄ　ｌｉｖｅｒ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｈｅｐａｔｏｌ，２０１０，５３（１）：１３２－１４４．［１２］ＬＩ　Ｙ，ＳＨＩ　Ｙ，ＳＵＮ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｈｙｄｒｏｘｙｓａｆｆｌｏｒｙｅｌｌｏｗ　Ａ　ｏｎ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ａｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　Ｃａｒｂｏｎｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｉｄｅ［Ｊ］．Ｍｏｌ　Ｍｅｄ　Ｒｅｐ，２０１７，１５（１）：４７－５６．［１３］孔德松，郑仕中，陆茵，等．肝内肌成纤维细胞的来源及其在肝纤维化中作用的研究［Ｊ］．中国药理学通报，２０１１，２７（３）：２９７－３００．［１４］ＳＣＨＵＰＰＡＮ　Ｄ，ＫＩＭ　Ｙ　Ｏ．Ｅｖｏｌｖｉｎｇ　ｔｈｅｒａｐｉｅｓ　ｆｏｒ　ｌｉｖｅｒ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ，２０１３，１２３（５）：１８８７－１９０１．［１５］ＦＲＩＥＤＭＡＮ　Ｓ　Ｌ．Ｅｖｏｌｖｉｎｇ　ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ　ｉｎ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ　Ｈｅｐａｔｏｌ，２０１０，７（８）：４２５－４３６．［１６］陈宵瑜，杨长青．肝纤维化发生机制研究新进展［Ｊ］．实用肝脏病杂志，２０１６，１９（１）：１２１－１２４．［１７］冯芹，夏文凯，王现珍，等．连翘苷元对四氯化碳大鼠急性肝损伤的保护作用［Ｊ］．中国药理学通报，２０１５，３１（３）：４２６－４２９．［１８］聂钱，李香丹，许东元，等．ＩＧＦ－１对糖尿病大鼠肝纤维化的作用及其机制［Ｊ］．中国病理生理杂志，２０１５，４１（１０）：１８７８－１８７９．［１９］詹迪迪，李飞龙，张功武，等．转化生长因子－β／ＣＴＧＦ在肝纤维化发生机制中的作用［Ｊ］．肝胆外科杂志，２０１６，２４（３）：２３３－２３７．［２０］ＦＡＮＧ　Ｌ，ＺＨＡＮ　Ｓ　Ｘ，ＨＵＡＮＧ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ．ＴＲＰＭ７Ｃｈａｎｎｅｌｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ＰＤＧＦ－ＢＢ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｓｔｅｌｌａｔｅｃｅｌｌｓ　ｖｉａ　ＰＩ３Ｋａｎｄ　ＥＲＫ　ｐａｔｈｗａｙｓ［Ｊ］．Ｔｏｘｉｃｏｌ　ＡｐｐｌＰｈａｒｍａｃｏｌ，２０１３，２７２（３）：７１３－７２５．［２１］郑娜娜，岳雅伦，郑勇，等．硫化氢通过ｐ３８ＭＡＰＫ信号通路对肝纤维化大鼠肝细胞增殖、凋亡的影响［Ｊ］．世界华人消化杂志，２０１５，２３（６）：９０１－９０６．［２２］孔令娜，占书箱，黄成，等．栀子苷对ＰＤＧＦ诱导的ＨＳＣＴ６增殖活化的影响［Ｊ］．安徽医科大学学报，２０１５，６１（４）：４８１－４８５．

【摘要】目的：比较肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体与未脂质化的肉苁蓉苯乙醇总苷原料药对肝纤维化大鼠肝脏的保护作用。方法：采用真空冷冻干燥法制备肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体，测量其粒径、药物含量及包封率。将肝纤维化模型大鼠随机分组后给予相应受试物，比较空白对照组、模型组、空白脂质体组、肉苁蓉苯乙醇总苷原料药组、肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体组各组大鼠的血清肝功能指标(AST、ALT)、肝脏纤维化指标(LN、H A、PC III、IV-C)，Masson染色观察各组大鼠肝纤维化病变程度，实时荧光定量PCR(qPCR)检测大鼠肝组织Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ mRNA表达，Western blot法检测大鼠肝脏组织α-平滑肌肌动蛋白(α-sma)、Collagen Ⅰ蛋白表达。结果：肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体组大鼠血清AST、ALT、LN、HA、PC III、IV-C等指标总体较肉苁蓉苯乙醇总苷原料药组及空白脂质体组大鼠下降(P<0.01)，肉苁蓉总苷脂质体组、肉苁蓉总苷原料药组大鼠肝组织中胶原纤维明显减少，其中肉苁蓉总苷脂质体组大鼠肝组织结构恢复良好，趋向正常。与肉苁蓉苯乙醇总苷原料药相比，肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体可使大鼠肝脏组织Collagen Ⅰ、Collagen III mRNA表达下降(P<0.01)，α-sma、Collagen Ⅰ蛋白表达下降(P<0.05)。结论：肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体对模型大鼠的肝脏保护优于未脂质体化的肉苁蓉苯乙醇总苷原料药及空白脂质体，其机制可能与减少α-sma、Collagen Ⅰ合成有关。【关键词】肉苁蓉苯乙醇总苷；脂质体；大鼠；肝纤维化近年来，化学及药理学研究显示，肉苁蓉苯乙醇总苷(Cistanche phenylethanoid glycosides，CPhGs)是肉苁蓉发挥药效的主要物质基础之一[1]。CPhGs具有抗氧化、抗抑郁、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗菌和免疫调节等多种生物活性， 本课题组的前期研究发现，CPhGs对牛血清白蛋白诱导的肝纤维化大鼠有一定的预防和治疗作用[2]。有文献报道，CPhGs存在吸收差、口服利用度低等缺点，使其应用受到影响[3]。脂质体药物递送系统具有生物相容性良好，改善药物的稳定性、溶解性，增强药物疗效，降低给药频率的作用，近年来在基础及临床医学领域逐渐受到关注[4]。因此本文以脂质体为药物载体包裹中药成分CPhGs 制成CPhGs 脂质体，然后应用于肝纤维化模型动物考察CPhGs 脂质体对肝纤维化大鼠血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(aspartateaminotransferase， AST)、层粘连蛋白(Laminin， LN)，透明质酸酶(Hyaluronidase， HA)， III 型前胶原(Procollagen III， PC III) 和IV 型胶原(Collagen-IV，IV-C)含量的影响，肝脏组织胶原纤维分布情况的变化，胶原蛋白Ⅰ(Collagen Ⅰ)和胶原蛋白III(CollagenIII)mRNA 表达含量的差异，以及α-平滑肌肌动蛋白(α smooth muscle actin，α-sma)和Collagen Ⅰ蛋白表达水平的差异，阐明其对肝脏的保护作用。1 材料与方法1.1 试剂牛血清白蛋白购于美国Sigma-Aldrich公司；谷丙转氨酶(ALT/GPT)测试盒、谷草转氨酶(AST/GOT)测试盒购自南京建成生物工程研究所；大鼠Hyaluronidase-1(HYAL1) ELISA Kit，大鼠laminin(LN) ELISA Kit 购于武汉华美生物工程有限公司；大鼠PCⅢ(ProcollagenⅢ) ELISA Kit， Rat COL4(Collagen Type Ⅳ) ELISAKit购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；辣根酶标记山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Precision Plus ProteinTM Dual Color Standards购于美国BIO-RAD公司；兔抗β-actin多克隆抗体、兔抗α-SMA多克隆抗体、兔抗Collagen Ⅰ多克隆抗体购于北京博奥森生物科技有限公司。1.2 仪器CK-40 型荧光倒置显微镜购于日本Olympus 公司；全波长自动酶联免疫反应检验测试仪购于美国Thermo Scientific公司；FluorChem E化学发光高灵敏凝胶成像仪购于美国Protein Simple 公司；Zeta sizerNano series ZS90粒径分析仪购于英国Malvern公司。1.3 CPhGs 脂质体的制备采用薄膜分散法制备CPhGs 脂质体。称取卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇(质量比为1∶2∶2)， 溶于适量氯仿和甲醇混合溶剂中(体积比为2∶1)，在49~50 ℃下旋转使其成为膜状，加入250μg/mL的CPhGs不断旋转水化，使磷脂膜转入水中形成脂质体，所得脂质体用0.45 μm的微孔滤膜挤压4~5次，0.22 μm的微孔滤膜挤压18~20次，真空冷冻干燥24 h，即得粒径均匀的苯乙醇总苷脂质体。使用激光粒度分析仪检测其粒径分布，在透射电镜下观察粒子外形，HPLC法测定其载药量及包封率。1.4 实验动物、模型制备和给药SPF级雄性健康SD大鼠，体质量180~220 g，由新疆医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号SCXK(新)2018-0002。SPF环境实验动物使用许可证号SYXK( 新)2018-0003， 饲养受控环境条件为室温25 ℃、光/暗周期12 h，大鼠自由进食与饮水，喂饲标准颗粒饲料，常规适应性饲养3 d后使用。65 只SD 大鼠随机分为2 组，即正常对照组13只，BSA致敏模型组52只。模型组大鼠采用课题组前期[2]建立的方法制备大鼠免疫性肝纤维化模型，造模分为致敏阶段和尾静脉攻击阶段。致敏阶段：大鼠均多点皮下注射sc含BSA 9 g/L弗氏不完全佐剂，每次0.5 mL，共5次。前2次注射间隔为14 d，后3次注射间隔为7 d。末次致敏注射后1周，每只大鼠于眼内眦静脉丛采血，采用双向琼脂扩散法检测大鼠血清抗BSA 抗体。攻击阶段：剔除模型组中4 只未检测到BSA 抗体的大鼠，余48 只大鼠随机分为4 组即模型组、空白脂质体组、肉苁蓉苯乙醇总苷原料药组、肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体组，每组12只，继续尾静脉注射BSA，每周2次，连续5周，注射剂量由每只2 mL逐渐递增至每只4 mL。正常对照组大鼠尾静脉注射生理盐水尾静脉攻击造模同时按设定剂量灌胃给药每日1次，肉苁蓉苯乙醇总苷原料药组、肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体组给予相当于肉苁蓉苯乙醇总苷原料药物量125 mg/kg灌胃受试物(剂量参照文献)[2]，正常对照组和模型组灌胃等体积蒸馏水，空白脂质体组按肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体组脂质体的量给药。造模结束后继续给予受试物4 周，每日1 次，总实验周期共计15周。末次给药后，禁食不禁水，24 h后按3~4 mL/kg用10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉采血，4 ℃放置2 h后以3 000 r/min离心10 min，留取血清待检；处死所有大鼠，迅速剖取肝脏相同部位组织，以生理盐水漂洗后，一部分用作组织病理学Masson染色，另一部分存于冻存管投于液氮并在-80 ℃条件下保存用作实时荧光定量PCR和Western blot检测。1.5 血清生化指标检测取大鼠血清样品采用微板法检测各组大鼠血清中ALT、AST 浓度，ELISA 法检测中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C浓度的变化。1.6 Masson 染色切取肝脏中间部分肝组织(约1 cm3)用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切成4~5 μm 薄片，Masson 染色，在光学显微下观察肝脏组织胶原纤维分布情况。1.7 实时荧光定量PCR 检测大鼠肝组织Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ mRNA 表达的影响分别取每只大鼠肝组织30 mg，经匀浆后用Trizol提取各组肝组织中的总RNA，逆转录后进行实时荧光定量PCR Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ mRNA检测，程序为：预变性95 ℃、30 s；变性95 ℃、3 s，退火60 ℃、30s，总共40个循环。引物由华大基因设计合成。Collagen Ⅰ：上游5′-TGTTGGTCCTGCTGGCAAGAATG-3′， 下游5′-GTCACCTTGTTCGCCTGTCTCAC-3′。Collagen Ⅲ：上游5′-GACACGCTGGTGCTCAAGGAC-3′，下游5′-GTTCGCCTGAAGGACCTCGTTG-3′。目的基因CT值经同一样本的内参基因校正后计算各组间每个基因的ΔCT，通过2-ΔΔCT 计算组间对应基因的表达差异。1.8 Western blot 检测大鼠肝组织α-sma 和Collagen Ⅰ蛋白表达水平分别取每只大鼠肝组织30 mg，经匀浆后用RIPA裂解液及离心处理，提取各组肝组织中的总蛋白，上样于聚丙烯酰胺凝胶进行还原性SDS-PAGE电泳，湿转(PVDF 膜)，200 mA 恒流电转90 min。封闭液(5%脱脂奶粉)封闭PVDF膜过夜，用1×TBST缓冲液充分振荡清洗，TBST稀释抗体，一抗稀释度为：α-sma，1∶ 5 000； Collagen Ⅰ ， 1∶ 5 000； β-actin， 1∶5 000。ECL显色。FluorChem E 化学发光高灵敏凝胶成像仪上检测条带灰度值。蛋白相对表达水平=目的条带灰度/β-actin条带灰度×100%1.9 统计学分析应用SPSS 16.0软件进行统计分析，各组数据结果以xˉ±s 表示，计量资料采用方差分析，组间比较采用LSD法，等级资料采用秩和检验，检验水准α=0.05。2 结果2.1 肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体的物理性质采用前述方法制得的肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体的粒径为(207.7 ± 2.31) nm， Zeta 电位为(-61.5 ± 3.18)mV，图1~3分别为肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体的透射电镜图像、粒度分布、Zeta电位分析图谱，可见表面有厚度均匀的包衣包裹，且粒度分布均匀。肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体载药量为(3.77±0.07)%，包封率为(37.2±0.30)%。2.2 大鼠肝功能生化指标变化大鼠血清肝功能生化指标ALT、AST浓度的变化见表1， 与正常对照组相比较， 模型组大鼠血清ALT、AST浓度显著增加(P<0.05)，且差异具有统计学意义；与模型组相比较，肉苁蓉总苷脂质体组、肉苁蓉总苷原料药组均能显著降低模型大鼠血清ALT、AST浓度(P<0.01)，空白脂质体组ALT、AST浓度下降不明显(P>0.05)；与肉苁蓉总苷脂质体组比较，空白脂质体组、肉苁蓉总苷原料药组ALT、AST浓度显著升高(P<0.01)，差异具有统计学意义。2.3 大鼠血清LN、HA、PC III 和IV-C 浓度比较大鼠血清LN、HA、PC III和IV-C浓度的比较见表2，与正常对照组相比较，模型组大鼠血清中LN、IV-C、HA、PC III浓度显著增加(P<0.05)。与模型组相比较，肉苁蓉总苷脂质体组、肉苁蓉总苷原料药组均能显著降低模型大鼠血清中LN、HA、PC III浓度(P<0.01)，空白脂质体组LN、HA、PC III浓度无明显变化(P>0.05)；与肉苁蓉总苷脂质体组相比较，肉苁蓉总苷原料药组血清中PC III 浓度变化不明显(P>0.05)，HA 浓度显著增加(P<0.01)，LN 水平有所上升(P<0.05)；与模型组相比较，肉苁蓉总苷脂质体组能显著降低大鼠血清中IV-C浓度(P<0.01)，肉苁蓉总苷原料药组能降低大鼠血清中IV-C浓度(P<0.05)；肉苁蓉总苷原料药组大鼠血清中IV-C浓度高于肉苁蓉总苷脂质体组(P<0.01)。2.4 大鼠肝组织Masson 染色结果Masson胶原染色结果见图4，显示正常对照组的大鼠肝组织并无明显的异常，未见炎细胞浸润，肝小叶构造清晰而完整，肝细胞呈条索状分布，未见有不规则血窦，汇管区无扩大，肝脏汇管区有极少量胶原纤维存在，肝小叶间未见纤维组织。与正常对照组相比较，模型组大鼠肝组织中纤维明显增多，分布广泛，可相互连接形成较粗大的纤维间隔，多位于汇管区和血管周围。肉苁蓉总苷脂质体组、肉苁蓉总苷原料药组大鼠肝组织中胶原纤维明显减少，其中肉苁蓉总苷脂质体组组肝组织结构恢复良好，趋向正常，效果优于肉苁蓉总苷原料药组。2.5 大鼠肝组织Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ mRNA表达情况qPCR 检测结果见图5，显示模型组大鼠肝组织ECM调节因子(Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ)mRNA的表达水平较正常对照组大鼠肝组织明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。肉苁蓉总苷脂质体组、肉苁蓉总苷原料药组与模型组相比，Collagen Ⅰ、Collagen ⅢmRNA的表达水平显著降低(P<0.01)，空白脂质体组较模型组无显著性差异；与肉苁蓉总苷脂质体组相比，肉苁蓉总苷原料药组肝组织Collagen Ⅰ、CollagenⅢ mRNA表达水平显著升高(P<0.01)。2.6 各组大鼠肝组织α-sma 和Collagen Ⅰ蛋白表达情况Western blot检测结果见图6，显示与正常对照组相比，模型组大鼠肝组织α-sma和Collagen Ⅰ蛋白的表达水平明显增加(P<0.05)。与模型组相比较，肉苁蓉总苷脂质体组、肉苁蓉总苷原料药组显著降低了肝组织α-sma和Collagen Ⅰ蛋白的表达，空白脂质体组α-sma和Collagen Ⅰ蛋白表达水平较模型组相比无显著性差异；与肉苁蓉总苷脂质体组相比，肉苁蓉总苷原料药组肝组织α-sma和Collagen Ⅰ蛋白的表达水平明显增加(P<0.05)。2.6 各组大鼠肝组织α-sma 和Collagen Ⅰ蛋白表达情况Western blot检测结果见图6，显示与正常对照组相比，模型组大鼠肝组织α-sma和Collagen Ⅰ蛋白的表达水平明显增加(P<0.05)。与模型组相比较，肉苁蓉总苷脂质体组、肉苁蓉总苷原料药组显著降低了肝组织α-sma和Collagen Ⅰ蛋白的表达，空白脂质体组α-sma和Collagen Ⅰ蛋白表达水平较模型组相比无显著性差异；与肉苁蓉总苷脂质体组相比，肉苁蓉总苷原料药组肝组织α-sma和Collagen Ⅰ蛋白的表达水平明显增加(P<0.05)。有研究发现，苯乙醇总苷渗透性差，肠道吸收不良、体内生物利用度低，口服剂量(100 mg/kg)后大鼠血清中松果菊苷水平极低， 绝对生物利用度仅为0.83%[8-9]。脂质体靶向递药系统能在病变局部形成相对较高的药物浓度，而脂质体就是其中一种重要的纳米微粒，可提高药物稳定性，增加药物的溶解度[10]。Zhu[11]等人研究发现，与高良姜素原料药相比，高良姜素脂质体能够更好地在CCl4致小鼠肝毒性方面起到保护作用。本实验Masson染色结果显示，模型组大鼠纤维组织明显增生并向肝小叶内伸展，分布广泛，可相互连接形成较粗大的纤维间隔，肉苁蓉总苷脂质体组大鼠肝组织结构恢复良好，趋向正常，且效果优于肉苁蓉总苷原料药组。实验中损伤模型大鼠的血清AST、ALT均明显升高，肉苁蓉总苷原料药组、肉苁蓉总苷脂质体药物组对大鼠肝功能均有所改善，尤其以肉苁蓉总苷脂质体药物组的改善情况最为理想，较接近于正常组水平。肉苁蓉总苷脂质体组能够更有效的降低肝纤维化指标(LN、HA、PCⅢ、IV-C)，较其他组更接近于正常水平，但肉苁蓉总苷原料药组稍差。提示肉苁蓉总苷脂质体组能够改善肝纤维化大鼠的一般情况及肝功能，缓解肝脏纤维化程度，其作用强于相同剂量的肉苁蓉总苷原料药组，Masson 染色结果也显示，肉苁蓉总苷脂质体组胶原沉积较原料药组有所减轻，说明肉苁蓉总苷脂质体组对抗肝细胞损伤作用比纯药有着明显优势，对肝脏保护，特别是对肝细胞保护有着确切的作用。在肝纤维化初期，ECM主要成分由正常Ⅰ、Ⅳ型胶原为主转变为Ⅰ、Ⅲ型胶原所占比例增大[12]。当HSC被激活后，α-SMA表达大量增加，并附着于假小叶增生的纤维膈内，与HSC的活化、增殖、复制呈正相关，是HSC活化的特有标志物[13]。本实验研究结果显示，与肉苁蓉总苷脂质体组相比，肉苁蓉总苷原料药组大鼠肝组织α-sma和Collagen Ⅰ蛋白表达水平显著升高，提示可能是由于脂质体通过与靶细胞内吞、融合、释放和吸附过程，增加肉苁蓉总苷原料药体内稳定性，从而达到提高保肝作用。综上可见，肉苁蓉总苷脂质体组具有更强的抗肝纤维化作用。能够使肝靶向性显著增强，从而达到更好的保护肝脏细胞的作用。无论从肝功能数据还是病理结果分析均显示肉苁蓉总苷脂质体组均优于肉苁蓉总苷原料药组对肝纤维化大鼠肝脏的保护。参考文献[1] 由淑萍, 赵军, 马龙, 等. 肉苁蓉乙醇提取物抗大鼠免疫性肝纤维化的作用及其机制[J]. 中国药理学与毒理学杂志,2016, 30(5): 504-510.[2] 由淑萍, 赵军, 木克热木·吐地买提, 等. 肉苁蓉苯乙醇苷类成分对BSA诱导的肝纤维化大鼠转化生长因子β1表达的影响[J]. 癌变·畸变·突变, 2015, 27(6): 409-414.[3] 闫暾, 齐海平, 常欣荣, 等. 蒙药肉苁蓉提取物稳定性研究[J]. 中国民族医药杂志, 2018, 24(10): 43-45.[4] 汤晗霄, 赵天文, 郑婷, 等. 脂质体肝靶向递药系统及其在肝脏疾病中的研究进展[J]. 世界华人消化杂志, 2016, 24(31):4238-4246.[5] 张楚焌, 孙天石, 董一昕, 等. 甘参复方对大鼠肝星状细胞增殖和胶原合成的影响[J]. 中医学报, 2019, 34(5): 959-962.[6] SETO W K, LEE C F, LAI C L, et al. 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姚辛敏，周晓洁，周妍妍＊（黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨150040）摘要：肉苁蓉为列当科植物，化学成分多样，含有苯乙醇苷类、环烯醚萜及其苷类、糖类、挥发性成分等。其药理作用丰富，具有抗衰老、抗氧化、抗痴呆、抗疲劳、润肠通便等多种药理作用。系统地总结肉苁蓉的化学成分和药理作用，有利于为肉苁蓉的临床应用和药学研究提供参考。关键词：肉苁蓉；化学成分；药理作用中图分类号：R28    文献标识码：A    文章编号：1002-2392（2021）02-0093-05DOI:10.19664/j.cnki.1002-2392.210045肉苁蓉始载于《神农本草经》，为列当科植物肉苁蓉 Cistanche deserticola Y.C.Ma 或德赢vwin登录 Cistanche tubulosa（Schrenk）Wight的干燥带鳞叶的肉 质茎。其性味甘、咸，温；归肾、大肠经；无毒，有“沙漠人参”的美誉。古代医籍对其作用有所记载，如《本经》提及：“主五劳七伤补中；除茎中寒热痛，养五脏，强阴，益精气，多子；妇人癥瘕”山。《本草备要》提出：“补命门相火，滋润五脏，益髓筋，治五劳七伤，绝阳不兴，绝阴不产，腰膝冷痛，崩带遗精”［2］。本文重点梳理近10年关于肉苁蓉的化学成分和药理作用的相关研究，以期在此基础上对肉苁蓉展开进一步研究。1 肉苁蓉的化学成分1.1 苯乙醇苷类刘晓明等3采用多种色谱方法从肉苁蓉干燥肉质茎70％乙醇提取物中鉴定出12个苯乙醇苷类化合物，分别为毛蕊花糖苷、2＇-乙酰基毛蕊花糖苷、肉苁蓉苷C、肉苁蓉苷D、异毛蕊花糖苷、管花苷B、管花苷E、盐生肉苁蓉苷D、盐生肉苁蓉苷E、plantainosideC、osmanthusideB6（Z／E）和松果菊苷。1.2 木脂素及其苷类南泽东等4 采用NMR、MS等波谱法从肉苁蓉85％乙醇提取物中分离得到11个木脂素类化合物，分别为（＋）-丁香脂素-4＇-0-β-D-吡喃葡萄糖苷、（＋）-isoeucomminA、（＋）-麦奥迪脂素-4＇-0-β-D-吡喃葡萄糖苷、（＋）-松脂素单甲基醚-β-D-葡萄糖苷、落叶松脂醇-4＇-0-β-D-葡萄糖苷、落叶松脂醇-4-0-β-D-葡萄糖苷、coni-caoside、dehydrodiconiferylalcohol4-0-β-D-gluco-pyranoside、dehydrodiconiferylalcoholy -0-β-D-glu-coside、橙皮素A、阿拉善苷A。1.3 糖类龚立冬等5采用毛细管电泳电化学检测法得到5种肉苁蓉单糖，分别为半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、果糖；王鑫彤等6 采用气相色谱法测定出肉苁蓉含有甘露糖。1.4 挥发性成分回瑞华等口 采用蒸馏-萃取法得到肉苁蓉挥发性物质，分别为二乙基二硫化物、苯甲醛、3-甲氧基-苯胺、2,3,4,5-四甲基-2-环戊烯-1-酮、苄醇、苯乙醛、2,3,3a，4,7,7a-六羟基茚-1-酮、薄荷醇、长叶薄荷酮、2-甲基-3-辛烯、丁香酚、1,2-二甲氧基-4-（2-丙烯基）-苯、石竹烯、α-石竹烯、4-己基-2,5-二甲基-3-呋喃乙酸、十氢-1H-环丙［e］甘菊蓝、石竹烯氧化物、喇叭醇、2-甲基-环戊醛、2,3-二甲基-4-甲氧基苯酚、3-二十碳烯、香橙烯氧化物、4,5-二乙基-1,2-二甲基-环己二烯和二十六烷。1.5 其他除上述成分外，肉苁蓉还含有8-表马钱子酸、京尼平苷、芒柄花苷、尿囊素、半乳糖醇3；缬氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、精氨酸等17种氨基酸8］；Li、Mn、Fe、Cu、Zn、Se、Sr、Mo、I和Ca等10种微量元素9］。2 肉苁蓉的药理作用2.1 抗衰老作用通过对皮下注射D-半乳糖致小鼠衰老模型进行实验，发现与模型组比较，各给药组小鼠逃避潜伏期和第1次到达站台时间均明显缩短且穿越站台次数增加，下台潜伏期显著延长，错误次数减少；脑组织超氧化物歧化酶（SOD）活性增强，丙二醛（MDA）含量下降；脑组织海马CA1区神经元数量增加，病理改变减轻；海马区CREB表达水平显著增加。说明肉苁蓉多糖可以改善D半乳糖致衰老模型小鼠的学习记忆能力，其机制可能与上调CREB表达有关。武燕 [11]、玄国东等 [12]使用上述方法进行实验，发现肉苁蓉多糖呈剂量依赖性地提高细胞核内p-CREB水平；增加环腺苷酸（cAMP）及cAMP依赖蛋白激酶（PKA）活性，提高脑源性神经营养因子（BDNF）水平；促进PC12细胞神经递质多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NE）和谷氨酸（Glu）分泌；显著升高脾脏系数，胸腺系数升高不明显。进一步说明肉苁蓉具有抗衰老作用。闫磊等 [13]通过对D-半乳糖致小鼠衰老模型进行实验，结果发现与模型组相比，给药低剂量组和给药高剂量组小鼠负重游泳时间明显增加；BUN、LA水平明显降低；肝糖原及肌糖原含量明显升高；小鼠肝组SOD、GSH-Px活性升高，MDA活性降低。说明肉苁蓉多糖对D-半乳糖致衰老小鼠具有抗疲劳作用，其机制可能与降低血清BUN、LA含量，增加肝糖原、肌糖尿含量有关。2.2 抗痴呆作用罗兰等 [14]通过对雄性SD大鼠结扎双侧颈总动脉建立痴呆模型，实验结果显示，肉苁蓉总苷能提高脑缺血大鼠模型的学习记忆能力；增强模型大鼠脑组织中的SOD、GSH-Px活性，减少其MDA含量，降低乙酰胆碱酯酶（AchE）活性；改善模型大鼠的神经症状；降低模型大鼠脑中神经细胞凋亡率；缩小脑梗死范围。说明肉苁蓉总苷对该痴呆大鼠模型的认知功能障碍有一定的防治作用。罗兰等 [5]采用脑立体定向技术向海马背侧处注射凝聚态β-淀粉样蛋白（Aβ25-35）复制大鼠阿尔茨海默病（AD）模型，实验结果显示，与模型组比较，给药高、中、低剂量组大鼠反应时间显著缩短、错误次数显著减少；海马组织中AchE活性显著减弱；海马CA1区细胞内Ca2＋含量明显降低。结果表明肉苁蓉总苷降低了AD模型大鼠海马组织中 AchE活性和Ca2＋含量，从而维持了脑内乙酰胆碱（Ach）的正常水平，继而提高AD模型大鼠的学习记忆能力。贾建新等 [16]通过对快速老化痴呆小鼠（SAMP8）进行实验，定位航行结果显示，给药组逃避潜伏期、上台前路程均较对照组明显缩短；尼氏染色结果显示，给药组细胞形态相对清晰、完整，可见大量突起，尼氏体呈紫色，核仁深染、清晰、居中，胞核不着色；细胞计数显示，给药组小鼠海马CA1区正常锥体神经元的数量最多；给药组SOD及GSH-Px活性较对照组明显增加。说明肉苁蓉对SAMP8小鼠空间学习记忆具有改善作用。2.3 抗疲劳作用周海涛等 [17]以力竭游泳训练大鼠为模型进行实验，结果显示，各组大鼠体质量均呈上升趋势；力竭游泳导致大鼠心肌线粒体中MDA含量显著升高，但给药组明显低于运动对照组；SOD活性、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性显著下降，但给药组明显高于运动对照组。说明肉苁蓉总苷可以提高大鼠运动能力，增强心肌线粒体抗氧化酶活性，从而减轻大强度力竭运动后自由基损伤心肌线粒体膜和肌浆网膜，以抑制心肌线粒体氧化损伤。实验还以负重游泳训练大鼠为模型进行实验 [17]，结果显示，肉苁蓉总苷可以维持血睾酮在正常生理水平，以减轻受高强度运动后血睾酮的剧烈变化；同时肉苁蓉总苷还能促进蛋白质合成，抑制氨基酸和蛋白质分解，从而提高运动训练大鼠的血红蛋白含量和糖原的储备。说明肉苁蓉具有抗疲劳的能力。龚梦鹃等［18］采用皮下注射氢化可的松致肾阳虚小鼠疲劳模型，实验结果显示，给肉苁蓉水煎液后，肾阳虚小鼠的体质量明显增加，自主活动次数增多，小鼠运动时间显著延长，运动后血乳酸（LAC）、尿素氮（BUN）含量降低。说明肉苁蓉水煎液对肾阳虚小鼠具有明显的抗疲劳作用。2.4 缺血保护作用木胡牙提·吾拉斯汉等［9］通过对 Langendorff 离体大鼠心脏灌流模型进行实验，发现给药各组可明显保护心肌SOD、Se-GSH-Px活性，降低MDA含量；增加再灌注后冠脉流量，降低冠脉阻力，促进心肌收缩力的恢复；明显减轻心肌超微结构损伤。说明肉苁蓉总苷可能是通过清除氧自由基，防止脂质过氧化而保护缺血心肌再灌注损伤。王毓杰［20］等通过对ATCC中人脐静脉内皮细胞EA．hy926培养进行实验，发现与对照组相比给药组细胞表现为核浓染和固缩现象；抗凋亡蛋白Bcl-2的表达降低、促凋亡蛋白Bax的表达增加、BcI-2／Bax值显著降低。说明肉苁蓉苯乙醇苷提取物能够通过诱导血管内皮细胞的凋亡来抑制其增殖。孟新珍等［21］采用结扎小鼠右侧颈总动脉建立脑缺血再灌注模型，实验结果显示，肉苁蓉总苷可使脑缺血再灌注后脑卒中指数、脑梗死范围百分比显著降低；脑组织MDA 含量及一氧化氮合酶（NOS）活性降低，SOD活性升高。说明肉苁蓉总苷对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。2.5 抗骨质疏松作用张跃全等 [22]通过对快速老化骨质疏松小鼠（SAMP6）进行实验发现，给药高剂量组和给药低剂量组小鼠右股骨骨密度（BMD）、BMP-2均高于对照组；给药高剂量组的血清骨钙素（BGP）低于给药低剂量组。说明肉苁蓉对成骨细胞有明显的增殖促进作用。俞立新等［23］通过对切除双侧卵巢致大鼠骨质疏松模型进行实验，发现与模型组相比，给药组大鼠股骨中段骨密度显著增加；骨痂中骨质较多，骨小梁规则厚实，骨痂塑形较好且骨折线不明显；大鼠血清白介素-1β（IL-1β）降低、转化生长因子-β1（TGF-β1）升高。说明肉苁蓉水提物可改善骨丢失，促进骨质疏松性骨折愈合。罗德梅等［24］通过对M-KOOPG骨质疏松小鼠模型进行实验发现，与模型组比较，给药高剂量组和给药低剂量组小鼠骨小梁形态及数目均增加；骨小梁表面的成骨细胞、破骨细胞及骨髓基质细胞的细胞浆表达呈不同程度降低；IL-1β、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）阳性表达细胞数均降低。说明肉苁蓉提取液具有抗骨质疏松的作用。2.6 润肠通便作用王丽卫等［25］采用复方地芬诺酯建立小鼠便秘模型，实验结果显示，给药各剂量组小鼠的小肠活性炭推进率均高于模型组。与模型组比较，给药各剂量组小鼠的首粒黑便排出时间均有所缩短，6h排便粒数均有所增加。说明肉苁蓉膳食纤维具有良好的润肠通便功能。高云佳等 [26]用上述方法进行实验，得到相同结果。范亚楠等［27］采用盐酸洛哌丁胺胶囊（易蒙停）建立大鼠便秘模型，实验结果显示，与模型组比较，各给药组的采食量、排便粒数均有所增加；血清P物质（SP）、神经降压素（NT）、胃泌素（GAS）有所降低；结肠组织胃动素（MTL）、血管活性肠肽（VIP）显著升高。说明肉苁蓉具有较好的润肠通便作用，能有效治疗便秘。2.7 免疫调节作用刘智勤等［28］通过对H22荷瘤小鼠模型进行实验，发现肉苁蓉可以对抗化疗药物5-氟尿嘧啶（5-Fu）所致白细胞（WBC）、血小板（PLT）、骨髓有核细胞和骨髓DNA的下降；提高化疗荷瘤小鼠脾脏指数、胸腺指数、脾脏淋巴细胞增殖能力和自然杀伤细胞（NK）活性。说明肉苁蓉对化疗荷瘤小鼠的造血和免疫功能有保护作用。刘涛等［29］采用雷公藤多苷建立卵巢早衰（POF）大鼠模型，实验结果显示，与模型组比较，给药各组性激素促卵泡激素（FSH）水平降低，雌激素（E2）和抗苗勒管激素（AMH）水平升高；TNF-α、干扰素-γ（IFN-y）、Bax基因表达降低；Bcl-2基因表达明显增加。说明肉苁蓉可以增强卵巢早衰大鼠的免疫功能，以减缓卵巢衰竭速度。许东风等［30］采用X射线照射复制小鼠放射性肺损伤模型，实验结果显示，肉苁蓉苷A能显著抑制放射诱导的凋亡小体的形成，明显升高肺匀浆抗氧化酶GSH-Px、T-Aoc及SOD的浓度，降低氧化产物MDA浓度；显著降低肺匀浆炎症因子IL-6和IL-1β浓度，促进IL-10分泌；显著减少模型小鼠肺组织TGF-β1的阳性表达，降低TGF-β1、VEGF和VEG-FR2的蛋白表达水平。说明肉苁蓉苷A能抑制放射性肺损伤小鼠肺部的氧化应激和炎症反应，其机制与TGF-1β／VEGF通路有关。姚金茜等30采用一次性硬膜外麻醉导管复制气管切开插管留置大鼠模型，实验结果显示，与模型组比较，给药组大鼠肺组织β-防御素-2（rBD2）mRNA表达在第24h降低，在第72、168h明显升高；免疫球蛋白A（sIgA）含量在第72、168h明显升高；IL-2含量从第24h逐渐升高，至第168h达到高峰；外周血IL-6水平从第24h逐渐降低，至第168h达最低值。说明肉苁蓉多糖可以改善气管切开插管留置大鼠肺部免疫功能。2.8 肝脏保护作用王艳芳等 [32]通过对CCl4致小鼠急性肝损伤模型进行实验，发现与模型组比较，给药高剂量组小鼠的血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）显著降低；给药各组MDA含量显著降低、SOD的活性显著升高。说明肉苁蓉多糖对小鼠急性肝损伤具有保护作用。张石蕾等［33］采用牛血清白蛋白（BSA）制备大鼠免疫肝纤维化模型，实验结果显示，肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体可致大鼠血清层粘连蛋白（LN）、透明质酸酶（HA）、III型前胶原（PCIII）等显著降低；胶原纤维明显减少；肝脏组织胶原蛋白I（CollagenI）、胶原蛋白III（CollagenIII）mRNA表达下降，α-平滑肌肌动蛋白（α-sma）、CollagenI蛋白表达下降。说明肉苁蓉苯乙醇总脂质体对大鼠肝脏具有保护作用。由淑萍等 [34]通过对苁蓉苯乙醇总苷脂质体作用于体外培养大鼠肝星状细胞进行实验，发现给药各组均可抑制细胞的增殖；促使大鼠肝星状细胞发生凋亡，使细胞阻滞在GO／G1期；上调 caspase-3及p27蛋白的表达。说明肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体对体外培养大鼠肝星状细胞有抑制增殖、促进凋亡、阻滞细胞周期的作用。2.9 改善生殖作用 3 结论与讨论李刚等 [35]应用FeSO4／H2O2体系产生活性氧（ROS），造成大鼠精子体外氧化应激损伤模型，实验结果显示，与模型组比较，给药各组大鼠的精子存活率显著升高，总超氧化物歧化酶（T-SOD）活力明显升高，MDA含量显著降低。说明肉苁蓉苯乙醇苷对精子体外氧化应激损伤模型大鼠精子膜的脂质过氧化损伤具有较明显的干预作用，对精子膜结构和功能具有一定的保护作用。赵东海等［36采用环磷酰胺复制小鼠生精障碍模型，实验结果显示，给药后各组模型小鼠的精子密度和精子存活率较模型组明显升高，精子畸形率降低，睾丸组织匀浆中睾酮水平有所升高；小鼠睾丸生精上皮层数明显增多，层次分明，排列整齐紧密且规则，管腔内可见精子。说明肉苁蓉苯乙醇苷可能通过升高睾丸组织中睾酮水平，对环磷酰胺所致的小鼠生精障碍发挥了明显的改善作用。梁华伦等［37］采用Fentons 试剂建立体外氧化损伤精子模型，实验结果显示，肉苁蓉苯乙醇苷可抑制Fentons试剂致使人精子细胞核拉曼光谱的强度和峰位移发生的变化，呈一定剂量相关性。与模型组比较，各药物组SOD、GSH-Px活性均显著升高，MDA含量显著减少。说明肉苁蓉苯乙醇苷对氧化损伤人精子DNA具有保护作用。2.10 其他肉苁蓉苯乙醇总苷纳米乳更易被大鼠鼻腔吸收［38］，董翔等39］模拟海拔5000m高原环境72h建立高原脑水肿大鼠模型，实验结果显示，肉苁蓉苯乙醇苷可降低脑组织含水量，降低脑组织AQP4 mRNA和蛋白的表达，改善脑水肿病理改变。说明肉苁蓉苯乙醇苷可能通过抑制AQP4的表达治疗高原脑水肿。陶义存等［40］使用上述方法建立高原肺水肿大鼠模型，实验结果显示，与模型组比较，给药各组肺组织含水量均降低；肺组织匀浆液中TNF-α、IL-6含量降低；肺组织GSH-Px酶活力升高，MDA含量降低；改善肺组织病理改变。说明肉苁蓉苯乙醇苷可能通过抗氧化应激和抗炎防治高原肺水肿。靳春丽等［4］使用上述方法建立高原肺动脉高压模型，实验结果显示，与模型组相比，给药各组中膜厚度比（WT）、中膜面积比（WB）、平均肺动脉压（mPAP）、右心室收缩压（RVSP）、平均动脉压（MAP）、右心肥厚指数（RVHI）均降低；炎性浸润明显改善。说明肉苁蓉苯乙醇苷具有治疗高原肺动脉高压的作用。综上可知，肉苁蓉含有极为丰富的化学成分，其主要成分不仅含有苯乙醇苷类、环烯醚萜及其苷类、糖类、挥发性成分，还含有氨基酸和微量元素等。肉苁蓉的药理作用广泛，在抗衰老、抗痴呆、抗疲劳、润肠通便、免疫调节、肝脏保护、改善生殖等方面具有药理作用，近年来，学者们对肉苁蓉的研究较多，发现肉苁蓉在抑制菌群、护肝保肺等方面也有明显的促进作用。通过对以上药理作用的综述与总结，不难发现在这些作用中较为核心的药理机制是抗氧化与抗炎机制，肉苁蓉中糖类成分的抗氧化作用较为突出，苷类成分的抗衰老作用更为明确，苯乙醇苷类成分的缺血保护、护肝及改善生殖作用尤为显著。综上可见，肉苁蓉的药用价值开发前景可观，系统梳理肉苁蓉的化学成分和药理作用可以为肉苁蓉的临床应用提供参考，丰富肉苁蓉的药物价值和实用价值。

朱效兵，夏美茹＊，徐瑞年，刘帅，付华河套学院农学系（巴彦淖尔015000）摘 要 试验以荒漠肉苁蓉为研究对象，选取聚碳酸酯（PC）、聚酰胺（PA）和玻璃3种包装材料，通过感官评定和褐变度测定试验，对肉苁蓉罐头的包装工艺进行分析。结果显示，PC、PA和玻璃这3种材料真空包装的肉苁蓉罐头均在6批样品中的感官评定和褐变度表现出无显著性差异（p＞0.05）。此外，感官评定和褐变度在3种材料真空包装的肉苁蓉罐头之间也表现出无显著性差异（p＞0.05），但是玻璃材料包装的肉苁蓉罐头的褐变度和感官度在3种材料中的分值最高。关键词 肉苁蓉；罐头；聚碳酸酯；聚酰胺；玻璃；真空包装肉苁蓉属（Cistanche hoffing.Et Link）植物是列当科（Orobanchaceae）的多年生且寄生的草本植物，主要分布在中国西北地区＂，其中内蒙古自治区多分布在阿拉善盟、乌海市、巴彦淖尔市、鄂尔多斯市共4个盟市现辖行政区域。内蒙古肉苁蓉在2015年被原国家质检总局批准实施地理标志产品保护，在2016年，其产量和品质在我国肉苁蓉中位居第一12-41。以往的研究表明，荒漠肉苁蓉有抑制脂质过氧化、提高抗氧化酶活性、增强机体耐受能力、提高记忆力和抗辐射等作用5-9。此外，肉苁蓉亦可作为食品原料，内蒙古阿拉善荒漠肉苁蓉被国家食品安全风险评估中心（CFSA）认定符合食品安全要求4。内蒙古阿拉善荒漠肉苁蓉被国家食品安全风险评估中心（CFSA）认定符合食品安全要求4。2020年，国家卫生健康委员会发布了对肉苁蓉等9种物质开展按照传统既是食品又是中药材的物质管理试点工作的通知。由此可见，肉苁蓉具有较高的药用价值和食用价值，目前国内对肉苁蓉的开发多集中在医药方面，将其作为食品加工原料研究相对较少［13］。因此提高肉苁蓉的保藏技术对保持其药用价值和食用保健价值至关重要。现有的保藏手段多以冷藏或沙藏为主，这些技术手段已不能完全满足市场的需求，且保藏过程中与空气接触较多，更容易加速其品质的降低1-13。因此，以罐头形式对其进行保藏成为一种新的选择，更是一种新的尝试，相关研究较为缺乏。影响罐头包装工艺流程的因素有很多，其中包装材料是影响罐头品质的首要因素。因此，试验以内蒙古西部地区生产的荒漠肉苁蓉为原料，参照软罐头工艺进行加工制作，在罐头工艺及参数研究的基础上，选取聚碳酸酯（PC）、聚酰胺（PA）和玻璃3种物质作为真空包装材料，通过感官评定和褐变度测定试验，分析其对肉苁蓉罐头品质及包装工艺的影响，进而确定适宜的肉苁蓉罐头包装材料。1 试验材料与方法1.1 试验材料1.1.1 原料及辅料从内蒙古自治区巴彦淖尔等地区采集的新鲜荒漠肉苁蓉，进行清洗处理保存。辅料为糖、食盐、抗坏血酸钠、柠檬酸等，均为市售。1.1.2 仪器与设备1.2 试验方法1.2.1 肉苁蓉罐头制流程的初步设计参考软罐头制作常规流程，依据前期试验结果，确定肉苁蓉罐头工艺：原料采集→选择和处理→清洗→去皮、护色保脆→切块→包装→排气→密封→杀菌、冷却→贮藏。1.2.2 感官测定根据肉苁蓉罐头感官检测内容和要求，选择24位感官鉴定人员，人员信息如表2所示。主要测定组织形态、色泽、滋味和气味等感官指标4。表1 仪器设备及产地仪器设备产地电子称德国电热恒温鼓风干燥箱中国粗纤维测定仪美国数显恒温水浴锅中国高速冷冻离心机美国UV-2450PC紫外分光光度计日本冰箱中国表2 感官鉴定人员信息组别人数／人性别（n（男）：n（女））20-24岁85:330-35岁73:456-61岁94:51.2.3 肉苁蓉罐头褐变度测定5在肉苁蓉完成高温高压杀菌、色差与感官评价后，将待测肉苁蓉罐头内容物取样，加入5倍体积的缓冲液，然后进行液氮研磨，转入离心管中，以12000r／min离心10min，收集上清液，利用分光光度计测定波长在450nm处的吸光度，结果OD值表示褐变度。1.2.4 数据分析与处理采用SPSS 21.0单因素方差分析（One-way ANOVA）和多重比较（LSD）进行显著性水平检验（p＜0.05）。采用Excel 2010绘图。2 结果与分析2.1 PA材料真空包装对肉苁蓉罐头包装工艺的影响由图1可知，在各组样品之间肉苁蓉罐头褐变度无显著性差异；同时由图2可知，在各批样品之间肉苁蓉罐头感官分值无显著性差异。因此，认为PA包装材料是稳定的。2.2 PC材料真空包装对肉苁蓉罐头包装工艺的影响由图3可知，在各组样品之间肉苁蓉罐头褐变度无显著性差异；同时由图4可知，在各批样品之间肉苁蓉罐头感官分值无显著性差异。因此，认为PA包装材料是稳定的。图1 PA材料包装肉苁蓉罐头褐变度测定结果分析图2 PA材料包装肉苁蓉罐头感官度测定结果2.3 玻璃材料真空包装对肉苁蓉罐头包装工艺的影响由图5可知，在各组样品之间肉苁蓉罐头褐变度无显著性差异；同时由图6可知，在各批样品之间肉苁蓉罐头感官分值无显著性差异。因此，认为玻璃包装材料是稳定的。2.4 不同材料之间对肉苁蓉罐头包装工艺影响的差异性分析以上结果显示，褐变度幅度、感官度在以PA、PC和玻璃真空包装的各组肉苁蓉罐头样品之间均表研究探3 结论与讨论此次试验分析了聚碳酸酯（PC）、聚酰胺（PA）和玻璃3种材料真空包装肉苁蓉罐头的品质。结果发现，3种材料均可以稳定地保证肉苁蓉罐头的褐变度和感官度，但是这2个指标在3种材料之间并无显著性的差异。这可能是因为影响肉苁蓉罐头品质因素很多，包括原料的成熟度、采收季节等因素，还包括切分、护色、硬化等前处理因素，以及操作工艺中各参数等。对比分析发现，与PC和PA材料相比，玻璃材料真空包装后的肉苁蓉罐头的褐变度和感官度分值最高。这可能与感官评定的人员或者消费者群体对于传统玻璃材料包装的罐头更于倾向有关。因此，针对市场需求和消费需要选择优质原料、科学合理的预处理方法和工艺参数，是优质肉苁蓉罐头的质量保证。制作优质的肉苁蓉罐头还需要对各部分工艺参数做进一步深入研究。

徐双华1,2，吴清1＊（1．北京中医药大学中药学院，北京 102488；2．北京中京丰创科技有限公司，北京 100070）摘要：目的 研究肉苁蓉复方颗粒对大鼠骨质疏松症的治疗作用，为治疗骨质疏松提供药效依据。方法 将肉苁蓉、菊粉与硫酸软骨素组成复方制剂，作用于去卵巢所致骨质疏松大鼠。结果 通过肉苁蓉复方颗粒进行治疗后，可使大鼠体重增长缓慢，显著提高股骨干质量、骨密度，降低血清中碱性磷酸酶、骨钙素、组织蛋白酶K和脱氧吡啶啉含量，抑制白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α的表达，促进骨形态发生蛋白-2的表达。结论 肉苁蓉复方颗粒可以显著改善去卵巢大鼠骨质疏松的状态，抑制骨量的继续丢失。关键词：肉苁蓉；骨质疏松；骨量；白细胞介素-6；骨形态发生蛋白-2中图分类号：R284     文献标识码：A     文章编号：1672-2981（2021）09-1854-05doi:10.7539/j.issn.1672-2981.2021.09.015骨质疏松症是一种内分泌、营养、免疫、遗传多种复合因素引起的代谢性疾病，大部分患者属于原发性骨质疏松，主要是因年龄增加所致，在老年人、绝经后妇女和恶性肿瘤患者中发生率较高。因此，研究防治骨质疏松的药物极为重要。研究表明，肉苁蓉能提高性激素水平［1-2］、促进骨形成［3-5］、抑制骨吸收；菊粉可以增加钙结合蛋白的表达与磷的生物利用度、提高钙吸收与全身骨骼矿物质参数［7-8］；硫酸软骨素能促进成骨细胞增生和新骨形成。本研究将肉苁蓉、菊粉与硫酸软骨素组成复方制剂，研究以去卵巢所致骨质疏松大鼠为对象，观察由上述复方制剂增加动物骨密度及相关蛋白表达的效果，为治疗和预防骨质疏松的作用提供依据。1 材料肉苁蓉（经北京中医药大学鉴定为肉苁蓉Cistanche deserticola Y.C.Ma），菊粉（比利时BE-NEO ORAFTI），硫酸软骨素钠片（四川省尚善堂制药有限公司），注射用青霉素钠（华北制药股份有限公司），戊酸雌二醇（拜耳医药保健有限公司广州分公司），骨钙素（BGP）试剂盒（上海联硕生物科技有限公司），碱性磷酸酶（ALP）ELISA试剂盒（上海联硕生物科技有限公司），BMP-2抗体（北京四正柏生物科技有限公司，4AK201716F），组织蛋白酶K（CK）试剂盒（上海远慕生物科技有限公司），脱氧吡啶啉（DPD）ELISA检测试剂盒（上海研域仪器设备有限公司），白细胞介素-6（IL-6）检测试剂盒、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）检测试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司），戊巴比妥钠（德国默克公司，批号：20160411），甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（上海颖心实验室，批号：TX20149）。NORLAND-Stratec周围型双能X线骨密度仪（北京迈尔思瀛海威医疗技术有限公司）；离心机（北京京立离心机有限公司）；电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）。Wistar大鼠［北京维通利华动物技术有限公司提供，SPF级健康雌性大鼠，实验单位使用许可证号：SYXK（京）2010-0025］，体质量（300±20）g。所有动物均放置于恒温、清洁的环境中。温度（22±2）℃，相对湿度（65±5）℃，光照12h，黑暗12h，动物自由摄食、摄水。2 方法2.1 肉苁蓉复方颗粒的制备肉苁蓉200g，粉碎，按照料液比1：20加入提取液（70％乙醇），在50℃条件下，提取时间为50min，重复提取两次，提取液回收溶剂并浓缩，烘干得到肉苁蓉浸膏，与300g菊粉、硫酸软骨素25g混合均匀后，通过传统的湿法制粒制成颗粒。2.1 大鼠骨质疏松模型的建立将大鼠按体质量随机分为6个组，每组10只，分别为假手术组（0.5％CMC-Na，10mL·kg），去卵巢模型组（0.5％CMC-Na，10mL·kg），戊酸雌二醇阳性对照组（1mg·kg＇），肉苁蓉复方颗粒高、中、低剂量组1100、550、275mg·kg（给药剂量分别为处方剂量的2倍、1倍、0.5倍）。手术前称重，按照30mg·kg剂量，经腹腔注射戊巴比妥钠溶液实施麻醉，待大鼠麻醉起效后，腹位固定后于腹中线距阴道口3～4cm除去毛，分别用碘酒和酒精消毒，待稍干后切开皮肤和腹肌约2～3cm，切口视野可见白色脂肪，拨开脂肪层找到子宫后，轻轻将一侧子宫角拉出，在其末端可见被脂肪团包裹的卵巢，然后将卵巢下端输卵管用丝线结扎，切除双侧卵巢，顺势将子宫角送回腹腔中，同法剪除另侧卵巢。其中假手术组仅仅切除卵巢附近的部分脂肪组织，不结扎输卵管、不切除卵巢，缝合切口，再次消毒，术后腹腔注射青霉素钠，1次·d＇，连续3d，防止术后感染。术后大鼠的活动正常。术后观察7d，然后开始每日下午灌胃给予对应药物，每周称重一次，12周后大鼠灌胃结束。2.2 检测指标2.2.1 体质量 每周测定大鼠体质量一次，据此调整灌胃量。2.2.2 股骨干质量测定 大鼠喂养12周后处死，剥离出左、右股骨。取左侧股骨于105℃烤箱中烤至恒重，称定股骨干质量。2.2.3 骨密度测定 用美国NORLAND-Stratec周围型双能X线骨密度仪（PDEXA）测定右侧股骨重点及股骨远心端的BMD值（g·cm-2）。2.2.4 大鼠血清中ALP、BGP、CK、DPD、IL-6和TNF-α的测定 给药12周后，麻醉大鼠，腹部下部开口，暴露腹主动脉，使用一次性采血针与配套的采血管，与腹主动脉下部Y字岔口处进针取血，每只大鼠约取5mL全血。室温静置4h，使血液完全凝固，3500r·min离心10min，取血清。按照试剂盒说明，测定血清中ALP、BGP、CK、DPD、IL-6和TNF-α水平。2.2.5 BMP-2表达的测定 留取完整的右股骨段，并迅速投入液氮中，后转移至-80℃保存，用于提取蛋白；用裂解液超声提取总蛋白后，Western blot法测定BMP-2表达。2.3 统计学分析采用SPSS 20.0软件进行统计分析，计量资料采用方差分析方法，均以x±s表示，P＜0.05为差异有统计学意义。3 结果3.1 大鼠体质量及骨参数变化如表1所示，相比较于模型组，肉苁蓉复方颗粒高剂量组、中剂量组（P＜0.01，P＜0.05）大鼠体质量增加量显著降低，表明肉苁蓉复方颗粒高、中剂量组对雌激素缺失导致骨髓间质细胞转化为脂肪细胞，具有良好的抑制作用，其中肉苁蓉复方颗粒高、中剂量组股骨干质量、BMD显著高于模型组（P＜0.05，P＜0.01），表明肉苁蓉复方颗粒高、中剂量组具有提高大鼠BMD及股骨干质量的作用。3.2 大鼠血清指标变化3.2.1 血清中ALP、BGP水平 如表2所示，与假手术组比较，模型组大鼠由于雌激素的缺失会代偿性增加ALP和BGP的分泌，其在血清中含量明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，肉苁蓉复方颗粒高、中剂量组大鼠血清ALP和BGP水平显著降低（P＜0.05，P＜0.01），表明高、中表1 肉苁蓉复方颗粒对骨参数的影响Tab 1 Effect of cistanche compound granules on the bone  parameters组别体质量增加量/g 股骨干质量/gBMD/(g·cm-2)假手术组19.40±2.240.64±0.027.36±0.11模型组84.34±4.71#0.51±0.01#3.37±0.19#阳性对照组25.16±1.870.62±0.02**7.24±0.09高剂量组71.11±2.85**0.62±0.01"5.63±0.15中剂量组68.76±5.970.60±0.015.32±0.20低剂量组81.73±2.950.52±0.013.50±0.09注：与假手术组比较，“P＜0.05；＃p＜0.01；与模型组比较，P<0.05,"P<0.01。Note: vs the sham operated group,#P<0.05,##P<0.01;vs the model group,'P<0.05,“P<0.01.剂量肉苁蓉给药组能够有效地逆转ALP和BGP升高的趋势，起到治疗骨质疏松的作用。阳性对照组大鼠的ALP（P＜0.05）和BGP显著降低(P<0.01)。表2 肉苁蓉复方颗粒对血清ALP、BGP的影响Tab 2 Effect of cistanche compound granules on serum ALP and   BGP组别ALP/(U·L-)BGP/(U·L-')假手术组2.837±0.05121.689±0.627模型组3.523±0.032##36.127±2.621#阳性对照组3.278±0.04123.765±3.131"高剂量组3.361±0.022**29.627±5.021中剂量组3.296±0.01330.516±3.522低剂量组3.510±0.02934.627±2.953注：与假手术组比较，＃P＜0.01；与模型组比较，P＜0.05，"P<0.01。Note: vs the sham operated group,##P <0.01; vs the model group,'P<0.05,"P<0.01.3.2.2 血清中CK和DPD含量变化 如图1所示，与模型组比较，阳性对照组、肉苁蓉复方颗粒高、中剂量组的CK和DPD酶活力水平显著性降低（P＜0.05，P＜0.01），肉苁蓉复方颗粒通过抑制CK和DPD酶的活力，从而抑制骨收。3.2.3 血清中IL-6和TNF-α含量变化 如图2所示，与模型组比较，肉苁蓉复方颗粒高、中剂量组的IL-6、TNF-a水平减少（P＜0.01），抑制水平接近阳性对照组，表明肉苁蓉复方颗粒通过调节IL-6、TNF-α的表达，降低破骨细胞增殖，抑制骨吸收。3.3 大鼠BMP-2蛋白表达如图3所示，骨组织中可检测到BMP-2蛋白表达，模型组的蛋白条明显低于假手术组，说明去势大鼠的BMP-2表达减少，肉苁蓉复方颗粒高、中剂量组BMP-2蛋白表达高于模型组，接近图1 肉苁蓉复方颗粒对组织蛋白酶（A）和DPD（B）的影响Fig 1 Effect of cistanche compound granules on serum CK(A)and DPD(B)注：与假手术组比较，“P＜0.05；＃P＜0.01；与模型组比较，P<0.05,"P<0.01。Note: vs the sham operated group,"P<0.05,##P<0.01;vs the model group,'P<0.05,"P<0.01.图2 肉苁蓉复方颗粒对IL-6（A）及TNF-α（B）的影响Fig 2 Effect of cistanche compound granules on serum IL-6(A)and TNF-a(B)注：与假手术组比较，＂P＜0.05；＃P＜0.01；与模型组比较，P<0.05,"P<0.01。Note: vs the sham operated group, "P<0.05,#P<0.01;vs the model group,'P<0.05,"P<0.01.阳性对照组，说明肉苁蓉复方颗粒可增强BMP-2蛋白表达，其中中剂量组的效果最好。假手术组  模型组  阳性对照组  高剂量组   中剂量组     低剂量组图3 各组大鼠骨组织中BMP-2蛋白表达图Fig 3 Expression of BMP-2 protein in the bone tissues of rats in different groups4 讨论去势大鼠骨质疏松模型是研究动物骨质疏松采用的一种模型，去卵巢大鼠是研究绝经后妇女骨质疏松的一个常用动物模型，具有手术简单，重复性、稳定性好等优点［0］。因此，采用此模型能比较客观地评价肉苁蓉复方颗粒对骨质疏松症的治疗作用。在肉苁蓉复方颗粒对骨参数的影响实验中，模型组大鼠骨密度明显下降，破骨细胞和成骨细胞无法保持平衡，骨量快速丢失。通过肉苁蓉复方颗粒进行治疗后，可显著提高骨密度、股骨干质量，改善去卵巢大鼠骨质疏松的状态，抑制骨量的继续丢失。ALP作为成骨细胞分泌物，其与血液中的钙离子相互作用，促进骨质的合成，可反映成骨细胞的活性，ALP促进有机磷酸化合物分解为无机磷酸离子，使磷酸离子与钙离子结合沉淀于骨内，BGP也是由成骨细胞分泌，是骨形成和骨重建的反映指标之一［12-13］，两者均可反映成骨细胞的活性［4-15］，ALP和BGP水平越高，说明体内越缺钙［6。本研究中，通过手术去卵巢处理，构建骨质疏松大鼠模型，发现模型组大鼠ALP和BGP含量升高，而肉苁蓉复方颗粒高、中剂量组可显著降低其含量，说明肉苁蓉复方颗粒高、中剂量可以有效调节骨代谢平衡，抑制骨吸收，治疗骨质疏松。BMP2／Smad信号通路可以调控成骨细胞的全部过程，其功能障碍会引起骨量降低和骨形成减少，导致骨质疏松症发生7。BMP2是经典BMPs／Smad通路的重要配体［18-20］，BMP2是BMPs家族中非常重要的一个亚型，其可以刺激间充质干细胞分化为成骨细胞，促进成骨细胞转化为骨细胞，是促进骨形成和诱导成骨细胞分化的重要的信号分子之一［21-23］。本研究中，发现模型组大鼠的BMP-2蛋白表达明显降低，说明BMP2／Smad通路的信号传递减弱，影响成骨细胞分化，进而影响骨密度水平，肉苁蓉复方颗粒高、中剂量组可以上调BMP-2蛋白水平，蛋白表达水平接近阳性对照组，进而调节BMP2／Smad通路的信号传递，促进成骨细胞分化，起到治疗骨质疏松的作用。CK是组织蛋白酶溶酶体蛋白酶家族的半胱氨酸蛋白酶成员。它被认为可降解骨基质蛋白，骨桥蛋白和骨粘连蛋白［24］，血清中的CK是骨吸收的典型标志物［125］，其过度表达会增加松质骨转换，阻止CK表达可抑制骨吸收，有利于骨基质的稳定性［26］。DPD也是典型的骨吸收标志物［27-28］，当骨吸收作用增强，成熟的I型骨胶原分解，DPD作为降解产物被释放到血液中，DPD具有组织特异性，不受饮食影响，其只在骨吸收及骨溶解时才被释放入血。因此，血清DPD水平升高，说明骨吸收增强［29］，本研究发现，发现模型组大鼠的CK和DPD含量升高，说明骨吸收增强，肉苁蓉复方颗粒高、中剂量组可以显著性降低CK和DPD含量，接近阳性对照组，抑制骨吸收，从而有效对抗骨质疏松的发生。细胞因子IL-6、TNF-α是调节骨吸收的关键因素［30］，IL-6作为一种生物活性因子，可通过多种方式参与到成骨细胞和破骨细胞的功能调控，是促进破骨细胞增殖分化的重要因子31］，IL-6可以通过SHP2／P13K／Akt2和SHP2／MEK／ ERK通路抑制成骨细胞分化，TNF-α是促进骨吸收的细胞因子B2］，可作用于前体破骨细胞，使其分化为破骨细胞，促进破骨细胞生成，增强骨吸收。TNF-α还可通过影响 OPG／RANKL／RANK 信号系统，以旁分泌的方式调节破骨细胞活化，刺激骨吸收［6］。本研究发现，模型组大鼠的IL-6、TNF-a水平显著升高，说明模型组大鼠骨吸收增强，骨质遭到破坏，而肉苁蓉复方颗粒高、中剂量组可显著降低的IL-6、TNF-a水平，接近阳性对照组水平，说明肉苁蓉复方颗粒高、中剂量可以抑制大鼠体内IL-6、TNF-α的表达，通过影响 SHP2／MEK／ERK、SHP2／P13K／Akt2和OPG／ RANKL／RANK通路，降低破骨细胞增殖，抑制骨吸收，有效治疗骨质疏松。近年来，许多研究证明补肾类中药在治疗老年性骨质疏松症的研究中取得了较满意的结果，本方针对中老年人全身性骨量减少，骨密度损失及骨组织的微观结构退化所致的骨脆性增加、骨密度降低、骨折危险性增加的特点，选用具有补肾壮阳、补精益髓功效的肉苁蓉，辅以具有促进钙和矿质吸收，降低骨代谢过程作用的菊粉及促进成骨细胞增生和新骨形成的硫酸软骨素，有效改善了去卵巢大鼠骨质疏松的状态，为治疗和预防骨质疏松的作用提供依据。

谢乾，宋佳，万鹏，王清鹤，芦梓楠，孟馥芬＾新疆医科大学附属肿瘤医院麻醉科新疆乌鲁木齐 830000［摘要］目的 研究肉苁蓉总苷（GCs）对脂多糖（LPS）诱导的BV2细胞炎症反应的机制。方法 采用小鼠小胶质细胞BV2细胞株作为研究对象。将BV2细胞随机分为对照组、LPS组和GCs组。对照组正常培养。LPS组用 LPS诱导BV2细胞建立炎症模型。GCs组加入不同浓度GCs与LPS共培养。CCK8检测各组细胞活性。qRT-PCR检测各组炎症因子IL-1β、COX-2 mRNA的表达，WB检测SIRT1、NF-KB蛋白水平的变化。结果 CCK8结果显示，GCs各组细胞活性与对照组之间无差异（P＞0.05），LPS组细胞活性显著低于对照组和GCs各组（P＜0.05）。qRT-PCR结果显示，LPS组IL-1β、COX-2 mRNA表达水平显著高于对照组和GCs与LPS共孵育组（P＜0.05）。WB结果表明与对照组和GCs各组相比，LPS组SIRT1表达下调（P＜0.05），磷酸化p65的表达上调（P＜0.05）。结论 GCs能够抑制LPS诱导的BV2细胞的炎症反应，其机制可能与SIRT1／NF-KB信号通路相关。［关键词］肉苁蓉总苷；脂多糖；BV2细胞；SIRT1／NF-KBDOI:10.19668/j.cnki.issn1674-0491.2021.S1.0053围术期神经认知紊乱（perioperative neurocognitive disorders，PND）与神经 炎症反应密切相关，高龄、手术创伤应激、麻醉药物等均可能诱发神经炎症反应，小胶质细胞活化是其重要的推进过程，在PND的发生和发展中发挥重要的作用。肉苁蓉总苷（general cistanosides，GCs）的化学成分主要包括苯乙醇苷类、环烯醚萜类、木脂素类等，具有明确的抗氧化和神经保护作用2,3］。本实验以LPS诱导的BV2细胞炎症反应模型为基础，采用GCs干预，通过检测IL-1β、COX-2、SIRT1、NF-KB-p65的变化，研究GCs对围术期神经炎症的影响，为肉苁蓉的进一步开发应用提供理论和实验依据。1 材料与方法1.1 材料小鼠小胶质细胞株（BV2）由上海复旦大学附属肿瘤医院朱敏敏教授惠1.2 实验方法1.2.1 细胞培养及分组BV2细胞以高糖DMEM＋10％FBS为细胞培养基，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。BV2 细胞随机分为对照组、LPS 组和不同浓度 GCs组。将LPS加到96孔板中，使其终浓度为1ug／mL，依据分组加入不同浓度的GCs，与LPS共培养。1.2.2 CCK8检测细胞活性细胞接种于96孔板，待贴壁后更换培养基，不同浓度GCs（5ug／mL、25 ug／mL、50ug／mL、75 ug／mL）和终浓度为1ug／mLLPS共培养，加入CCK8，酶标仪测定吸光度值并计算细胞活性。1.2.3 qRT-PCR检测各组炎症因子IL-1β、COX-2的mRNA表达1.2.4 WB 检测各组SIRT1、NF-KB-p65蛋白表达情况按照说明书提取蛋白，电泳，转膜，一抗孵育，加入二抗，采用化学发光法进行显影，运用ImageJ软件分析灰度值。1.3 统计学方法采用 SPSS19.0 软件进行统计分析，计量资料采用均数加减标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析。2 结果2.1 GCs对BV2细胞活性的影响同对照组相比，不同浓度的GCs对BV2细胞的活性未见明显的影响。结果见图1。 图1 GCs对BV2细胞活性的影响2.2 GCs对LPS诱导的BV2细胞活性的影响结果表明，与对照组相比，LPS组细胞活性明显降低（P＜0.01）；与LPS组相比，GCs组的细胞活性明显升高（P＜0.05）。结果见图2。 与对照组相比＊P＜0.05；与LPS组相比＃P＜0.05。图2 GCs和LPS对BV2细胞活性的影响2.3 GCs对LPS诱导BV2细胞炎症因子IL-1β，COX-2mRNA表达的影响qRT-PCR结果表明，与对照组相比，LPS组中IL-1β，COX-2的mRNA表达明显提高（P＜0.05）。GCs与LPS共孵育各组炎症因子的mRNA的表达显著下降（P＜0.05）。结果见图3。PND是常见的中枢神经系统并发症。目前认为神经系统炎症是PND的主要发生机制之一。手术应激、全麻药物、衰老等可诱发神经系统炎症触发并加重 PND。因此，围术期神经保护、神经系统炎症管理可能有助于改善PND。目前研究表明，GCs中的松果菊苷、毛蕊花糖苷等成分具有明确的抗氧化及神经保护的作用，但具体机制尚不明确。本研究以BV2为研究对象，在细胞水平探讨了GCs对NF-kB信号通路的影响。实验结果表明，本实验采用的GCs浓度对细胞活性没有影响，LPS组细胞活性降低及炎症因子增加表明神经炎症造模成功，LPS与GCs共同孵育的结果表明GCs可以改善炎症状态下的细胞活性。SIRT1 是一种进化高度保守的NAD＋依赖性蛋白去乙酰化酶，与炎症反应密切相关。2004年Yeung 等人的研究［4］首次证实SIRT1可与NF-KB的RelA／p65 亚基相结合影响 NF-KB的转录活性，抑制 NF-KB 介导的炎症信号通路。本研究结果发现 LPS 诱导的 BV2 细胞中 SIRT1 表达降低，NF-kBp-65的磷酸化水平升高，下游炎症因子的表达增加。GCs与LPS共孵育组细胞内SIRT1表达上调，NF-kBP65的磷酸化水平下降，下游炎症因子的表达减少。结合上述实验结果，我们推测GCs可能通过激活BV2细胞中的SIRT1／NF-KB信号通路来抑制炎症因子的表达。本实验的不足之处是未研究GCs对经SIRT1抑制剂处理后的细胞中的炎症介质产生的影响。这有待于我们下一步进行探究。综上，我们的研究表明：GCs可能通过激活SIRT1／NF-KB信号通路，进而抑制LPS诱导的BV2小胶质细胞炎症反应，为后期开发肉苁蓉在神经炎症相关疾病的应用提供了参考。

许伟＇，丁聚贤2”，谢兴文，李鼎鹏，李宁2，柳 博2，苏积亮2，李建国＇，宋学文2（1．甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050：2．甘肃中医药大学，甘肃兰州 730000；3．西北民族大学附属医院，甘肃兰州 730000）摘要：目的 探索肉苁蓉含药血清对人骨内瘤化疗耐药MG-63细胞的逆转作用及对多药耐药蛋白1（MRP1）和P53蛋自表达的影响。方法 通过内苁蒙水溶液灌胃SD大鼠获得高、中、低制量组的含药血清及空白组血清。粘壁培养法培养MG-63细胞，MTT法检测药物干预前MTX的C。值，将MG-63细胞分为高制量组（A）、中剂量组（B）、低剂量组（C）、空白组（N），采用ICm浓度的MTX分别干预各组贴壁细胞，24h后A、B、C组加入相应的内苁蒙含药血清，空白组加入对照组血清，持续干预至盐水组细胞在IC。浓度的MTX中稳定生长各组停止干预。MTT法检测各组细胞对MTX的对药倍数，流式细胞仪检测MRP1的表达，Westem blot检测P53蛋白的表达。结果 干预后A、B．C．N四组细胞耐药指数（RI）依次为：1.80.2.55、2.84、3.74；肉苁蒙含药血清干预后各组细胞MRPI的表达均下调，与空白组相比较有明显统计学差异（P＜0.001）；相比较于空白组，药物干预后各组P53蛋白表率达均下调，各组比较有统计学意义（P＜0.01）。结论 内苁蓉能有效逆转化疗耐药骨内瘤MG-63细胞的耐药性，其机制可能与下调MRPI及P53蛋白的表达有关。关键词：骨肉瘤；化疗耐药；多药耐药相关蛋白1；P53蛋白；MG-63；肉苁蓉骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）是临床最多见的原发恶性骨肿瘤，起源于间叶组织，多见于青少年，好发于股骨远端和胫骨近端，病死率高。Rown在1978年首次提出了辅助化疗联合手术切除的理念，近年来由于新辅助化疗理念的不断完善已将 OS患者5年生存率从20％提升至70％。OS治疗的成败需综合手术完整的切除与化疗敏感性综合评估，术前化疗可有利于瘤体完整的切除，肿瘤细胞对化疗药的耐药是导致术后局部复发与转移的最常见原因，因此，化疗的高敏感性对OS患者的预后及生存期有着重要的临床意义，而耐药是OS患者化疗失败最常见且 分析后得到IC值。最难解决的问题之一。近年来，中药因其低毒、多通路协同抗肿瘤的优势，研究者们对于中医药逆转肿瘤耐药性的研究了大量开拓性的研究，且部（N）组。取对数生长期的人骨肉瘤MG-63 细胞，胰酶消化后制分研究得到了佐证。大多扶正类药物如人参、黄芪等中药，备成悬液·调整密度为5x10°个，接种4小时后4组均加入含不仅可以提高自身免疫功能，同时也可以逆转肿瘤细胞的多药耐药，肉苁蓉可改善肿瘤化疗后造血和免疫功能低下，有增效减毒之效。06化疗抵抗的患者往往表现为免疫功能及造血功能的 培养至N组细胞可以在含MTX的培养液中稳定生长以后，各组低下，因此，本研究在体外试验的水平上，通过观察肉苁蓉含药血清对人骨肉瘤MG-63／MTX耐药细胞P糖蛋白（P-glycopo-2.4 MTT法检测药物干预后MG-63细胞对MTX的耐药指数tein，P-g）及多药耐药相关蛋白1（MDR-aswciated petein1．MRPI）的影响，初步探索肉苁蓉逆转骨肉瘤化疗耐药的分子机制。1 材料与仪器1.1 细胞株 MG-63细胞，购自上海中科院细胞研究所。1.2 动物 SPF级SD大鼠D10周龄，体重（270±30）g］88只．购自甘肃中医药大学实验动物中心，动物合格证号：62001000000427.1.3 试剂 胎牛血清-0.25％ Trypsin-EDTA、高糖 DMEM培养基（Cellmas 公司，批号分别为：20161213.20171102、20170919）； 甲氨蝶呤（大连美仑生物技术有限公司，批号：15475-56-6）：肉苁蓉（甘肃天力士中天药业有限责任公司，批号：1802025），由甘肃数字草本检验中心有限公司鉴定；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（大连美仑生物技术有限公司，货号：MA0198）：兔单克隆抗体P53抗体（abcam公司，批号：ab32389）：山羊抗兔（hiowasy 公司，批号：BE0101）：鼠抗人单克隆抗体 MRPI 抗体（Biolegend公司，批号：370104）。1.4 仪器 MCO-5AC型细胞培育箱（日本三洋电机公司）：RT-6100型酶标仪（深圳雷社生命科学股份有限公司）：SW-CJ-1FD型超净台（苏州净化股份有限公司）：LMQ型高压蒸汽灭菌机（山东新华医疗器械有限公司）：TDZA-WS型低速离心机（长沙平凡仪器有限公司）；XK96-3型微量振荡器（姜堰市医疗器械有限公司）：PowaPo型凝胶电泳仪（美国Bo-ral公司）：ChemiDoeTM型凝胶成像分析仪（美国Bio-ad公司）。物学功能有关，分为野生型和突变型［，野生型P53可将细胞周期阻滞到C。期·最终导致细胞的程序性死亡0，但因其不稳定的性质，极易突变，其半衰期仅20-30min，故不易被检测。突变后的P53基因的稳定性增加，同时半衰期延长到了2-12小时，容易被检测口。突变后的P53基因不但会导致肿瘤细胞的过度增殖，诱发肿瘤新生，而且会抑制正常的细胞色素C的释放［3．。在OS中，秦晓飞发现O5组织P53蛋白阳性表达率升高，与患者化疗敏感性降低及预后不良有关。Zhang ZF等认为OS细胞的迁移与恶性增殖度与P53密切相关，沉默P53基因可降低OS细胞的增殖与迁移率。MRP1基因与P-gp的功能相似，可借助耦合物谷胱甘肽、谷胱甘肽转移酶耦将化疗药物泵出胞外。已有的研究发现MRPI蛋白的表达率与多种肿瘤细胞的耐药性相关，与患者的预后相关，MRPI的表达与骨肉瘤的恶性程度及耐药性产生过程有着密切的关联，如屠重棋等通过对比正常骨组织和OS组织中 MRPI的表达，发现MRPI在OS中存在表达，且与恶性程度呈正相关。TmY等发现与人骨肉瘤MG63和HOS 耐药细胞中 CD133．MRPI．MDRI 均呈高表达。张洪泉等发现肉苁蓉多糖可以增强小鼠Lewis肺癌和小鼠S180肉瘤的抑制率。刘智勤发现肉苁蓉对抗环磷酰胺化疗S180小鼠有增效减毒之效。最新研究发现肉苁蓉苯乙醇苷可通过诱导细胞调亡和细胞周期阻滞提高黑色素瘤荷瘤小鼠生存期，提高了肿瘤小鼠的存活率。现代研究表明，肉苁蓉具有提高免疫力、抗氧化、抗衰老，保肝、保护心肌、抗肿瘤等作用，本次研究发现肉苁蓉在体外水平具有有逆转人骨肉瘤化疗MG-6细胞对MTX的耐药作用，机制可能与肉苁蓉下调MRPI及P53蛋白的表达水平有关，且下调水平与药物浓度呈正相关。但参与05产生化疗抵抗的机制较多，如DNA损伤修复学说-酶系统介导的耐药、自噬等·因此肉苁蓉逆转化疗MG-63细胞的耐药性是否与其他机制参与有待进一步研究。3.1 各组细胞MTX药敏测定 与正常MG-63细胞相比，各组药物干预后的耐药细胞对MTX的IC均升高（表1）；与N组相比，药物干预后的三组细胞对MTX的C。降低，A组明显低于空白组。各组耐药指数（RD分别为：1.80、2.55、2.84、3.74。表1各组人骨内瘤MG-63细胞IC50测定（ょ）组别C/ag*ml-RIMG-632.48±0.11-A组4.60±0.141.80B组6.32±0.302.55C组7.04±0.142.84N组9.28±0.183.742.2 药物于预前MTT法测定MTX对MG-63细胞的IC。MG-63细胞在25c㎡的透气培养瓶贴壁培养·隔48b用含10％FBS的H-DMEM培养基换液，5％CO，37℃恒温培养箱中培养。取处对数生长期的MG-63细胞，胰酶消化，调整密度至4x10／ml的单细胞悬液，按照MTX的梯度浓度（20,5,0.5，0.05,0.005.0）pg＊ml接种6组细胞到96孔板，每个浓度设5复孔，每孔180μl．4h后依次加入各浓度的MTX，48小时后各孔加入20μl MTT（5mg＊L-＇）．4h后弃孔内废液，各孔加入200μl DMSO，摇床上震荡．10min后96孔板于全自动酶标仪上检测各孔560mm的吸光度，重复3次。计算各浓度下 比较有统计学差异（P＜0.01）。见图1，表2．MTX对MG-63细胞的抑制率，以药物浓度和抑制率做回归 3.3 各组细胞P53蛋白的表达结果 与空白组相比，肉苁蓉含药3.2 各级细胞MRPI蛋白的表达结果 与空白组相比，肉苁蓉含药血清干预后各组MG-63细胞中 MRPI 蛋白表达率明显降低，有显著统计学差异（P＜0.001）；同时，MRPI蛋白的表达与肉苁蓉含药血清浓度呈负相关，A组MRPI的表达最低，与B组，C组物学功能有关，分为野生型和突变型［，野生型P53可将细胞周期阻滞到C。期·最终导致细胞的程序性死亡0，但因其不稳定的性质，极易突变，其半衰期仅20-30min，故不易被检测。突变后的P53基因的稳定性增加，同时半衰期延长到了2-12小时，容易被检测口。突变后的P53基因不但会导致肿瘤细胞的过度增殖，诱发肿瘤新生，而且会抑制正常的细胞色素C的释放［3．。在OS中，秦晓飞发现O5组织P53蛋白阳性表达率升高，与患者化疗敏感性降低及预后不良有关。Zhang ZF等认为OS细胞的迁移与恶性增殖度与P53密切相关，沉默P53基因可降低OS细胞的增殖与迁移率。MRP1基因与P-gp的功能相似，可借助耦合物谷胱甘肽、谷胱甘肽转移酶耦将化疗药物泵出胞外。已有的研究发现MRPI蛋白的表达率与多种肿瘤细胞的耐药性相关，与患者的预后相关，MRPI的表达与骨肉瘤的恶性程度及耐药性产生过程有着密切的关联，如屠重棋等通过对比正常骨组织和OS组织中 MRPI的表达，发现MRPI在OS中存在表达，且与恶性程度呈正相关。TmY等发现与人骨肉瘤MG63和HOS 耐药细胞中 CD133．MRPI．MDRI 均呈高表达。张洪泉等发现肉苁蓉多糖可以增强小鼠Lewis肺癌和小鼠S180肉瘤的抑制率。刘智勤发现肉苁蓉对抗环磷酰胺化疗S180小鼠有增效减毒之效。最新研究发现肉苁蓉苯乙醇苷可通过诱导细胞调亡和细胞周期阻滞提高黑色素瘤荷瘤小鼠生存期，提高了肿瘤小鼠的存活率。现代研究表明，肉苁蓉具有提高免疫力、抗氧化、抗衰老，保肝、保护心肌、抗肿瘤等作用，本次研究发现肉苁蓉在体外水平具有有逆转人骨肉瘤化疗MG-6细胞对MTX的耐药作用，机制可能与肉苁蓉下调MRPI及P53蛋白的表达水平有关，且下调水平与药物浓度呈正相关。但参与05产生化疗抵抗的机制较多，如DNA损伤修复学说-酶系统介导的耐药、自噬等·因此肉苁蓉逆转化疗MG-63细胞的耐药性是否与其他机制参与有待进一步研究。