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  • 3. 4 Western-blot 检测结果Western-blot 法检测小鼠海马Aβ1-40、Aβ1-42蛋白的表达,结果表明,模型组小鼠海马Aβ1-40、Aβ1-42的蛋白表达较正常组明显上调,有显著性差异( P <0. 05) 。肉苁蓉苯乙醇苷各剂量干预组和毛蕊花糖苷干预组小鼠海马Aβ1-40、Aβ1-42蛋白表达较模型组小鼠均显著下调( P < 0. 01) ,具有显著性差异( P <0. 01) ,见图4。4 结论AD 主要发生在中枢神经系统,由多因素诱导产生,到目前为止其发病机制尚不明了,但研究核心仍然围绕Aβ 展开。作为脑内APP 分泌的主要多肽,Aβ1-42和Aβ1-40的异常沉积并不能直接引起神经元的变性,从病源的角度来讲,Aβ1-42产生的可溶性寡聚体ADDLs 才是导致脑内神经元变性的真正诱因。但对这两种蛋白表达的考察也可以实时反映AD 脑内病变程度,间接显示可溶性寡聚体ADDLs的表达情况,进而从源头动态监测脑内神经元损伤状况,为疾病防治提供参考。也鉴于此,Aβ1-42和Aβ1-40已成为AD 发病机制研究中的关键靶标。海马作为脑内评价学习记忆能力优劣的主要作用部位,其神经元的损伤是AD 产生认知功能障碍的主导诱因,而海马CA1 区是AD 病理损伤的主要部位之一,本部分实验采用HE 染色法,结果发现正常组海马CA1 区神经元细胞排列整齐紧密,分布较为均匀,层次清晰。而模型组小鼠海马CA1 区因损伤出现神经元细胞凋亡等退行性改变,经肉苁蓉苯乙醇苷不同剂量组干预后,其海马CA1 区细胞形态均有不同程度的改善,提示肉苁蓉苯乙醇苷可能具有保护神经元、抑制其凋亡的作用,但由于HE 染色对于细胞凋亡和神经元丢失并无特异性,后期仍需要针对凋亡特异分子标志物进行相关检测。HE 染色法是组织病理学考察的经典方法,对待测组织的前处理直接关系到染色结果。实验中作者发现,由于转基因小鼠海马位于端脑颞叶的内侧深部,体积较小,组织分离难度较大,稍有不慎就会对其造成机械损伤,从而无法有效观察其病理改变。同时,因转基因小鼠价格昂贵,且实验给药周期较长,样本一旦损失可能影响研究的整体进度。因此,当小鼠完成心脏灌注后,全脑取出使用多聚甲醛固定,手术刀片除去嗅球部分,其余脑组织全部进行脱水、包埋步骤,切片厚度控制在3 ~ 5 μm,在保证海马体完整的前提下优化了操作流程,提高了研究效率。在Western-blot 检测中作者发现,由于Aβ1-42和Aβ1-40蛋白分子量较小,使表达条带不易印迹,因而需要对其SDS-PAGE 凝胶浓度、电泳时间和转膜时间进行筛选。分离胶浓度过小会导致电泳泳道迁移,蛋白激活不完全; 电泳时间过长会导致条带偏移出凝胶层; 相应的转膜时间过久则会使蛋白印迹模糊,从而影响一抗孵育和二抗结合。鉴于此,本研究经预实验摸索,最终选择15%分离胶,电泳和转膜2 小时对Aβ1-42和Aβ1-40进行蛋白印迹,考察其表达情况。目前在对蛋白调控所采用的技术手段中,Western-blot 法主要进行定量,考察相关蛋白具体表达量。而免疫组化法则从定性角度出发,一方面更直观的展现蛋白与抗体特异性结合程度,另一方面佐证定量结果。因免疫组化法是通过抗体与组织病理切片上的抗原位点结合来检测蛋白表达情况,所以组织病理切片的制作显得尤为重要。切片不易过厚,切片完成后应注意保存,避免组织切面受到外界损伤; 处理前应进行充分的脱蜡,时间不宜少于2 小时; 选择条件温和、附带损伤较小的柠檬酸缓冲液对抗原进行修复,去除过氧化氢酶,充分暴露抗原位点,使一抗与位点完全契合。以上两种方法作为分子生物学常用检测手段,相辅相成,为蛋白的调控研究提供了技术保障。本研究借助HE 等方法对脑内海马病变情况、Aβ 相关蛋白表达进行了考察,结果显示,经肉苁蓉苯乙醇苷干预后,AD 模型小鼠脑内海马CA1 区细胞形态均有不同程度的改善,Aβ1-42和Aβ1-40的表达量明显下调,此外通过研究还发现毛蕊花糖苷干预组保护神经元作用优于苯乙醇总苷组,提示毛蕊花糖苷作为肉苁蓉苯乙醇苷代表性单体,相较于肉苁蓉苯乙醇总苷,其改善AD 模型鼠脑区病理改变进而发挥拮抗AD 作用潜能巨大,具体作用机制有待后续进一步研究。本研究完善肉苁蓉从Aβ 角度拮抗AD 作用机制的研究资料的同时,为后期进一步阐明肉苁蓉有效组分或活性单体抗AD 作用机制奠定研究基础。参考文献1 Mark EJ,M Da,Lori AE, et al. Alzheimer disease[J]. MayoClin Proc, 2016, 91: 117-118.2 Morley JE,Farr SA,Nguyen AD. Alzheimer disease[J]. ClinGeriatr Med, 2018, 34: 591-601.3 Ian F. Alzheimer disease: Epigenetics links ageing withAlzheimer disease[J]. Nat Rev Neurol, 2018, 14: 254.4 Saeed E,Leila A,Mehdi M. Serum concentration of beta amyloidpeptide and the activity of angiotensin converting enzymein Alzheimer's disease patients: search for a potentialbiomarker[J]. J Int Med Res, 2016,4: 421-427.5 Younkin SG. The role of Abeta 42 in Alzheimer’s disease[J]. J Physiol Paris, 1998, 92: 289-292.6 Folch J,Ettcheto M,Petrov D, et al. Review of the advancesin treatment for Alzheimer disease: strategies for combatingβ-amyloid protein[J]. Neurologia, 2018, 33( 1) : 47-58.7 Charlotte R. Alzheimer disease: blood amyloid-β successfullysignals AD[J]. Nat Rev Neurol, 2018, 14: 195.8 Yu JT,Zhang C. Pathogenesis and therapeutic strategies inAlzheimer’s disease: from brain to periphery[J]. NeurotoxRes, 2016, 29: 197-200.9 Kwakowsky A,Calvo-Flores GB,Pandya M, et al. GABAA receptorsubunit expression changes in the human Alzheimer'sdisease hippocampus, subiculum, entorhinal cortex and superiortemporal gyrus[J]. J Neurochem, 2018, 145: 374-392.10 Seong GJ,Yong JK,Kyoung AK, et al. Visualization of alteredhippocampal connectivity in an animal model of Alzheimer’sdisease[J]. Mol Neurobiol, 2018, 55: 7886-7899.11 Chen J,Zhou SN,Zhang YM,et al. Glycosides of cistancheimprove learning and memory in the rat model of vascular dementia[J]. Eur Rev Med Pharmaco, 2015, 19: 1234-1240.12 Xian WB,Qian H,Geng ZC,et al. Comparative study ofHPLC fingerprints of Cistanche desticola harvested in differentseasons[J]. Nat Prod Res Dev ( 天然产物研究与开发) , 2017, 29: 86-90.13 Jia JX,Yan XS,Cai ZP,et al. The effects of phenylethanoidglycosides,derived from Herba cistanche,on cognitive deficitsand antioxidant activities in male SAMP8 mice[J]. JToxicol Environ Health A, 2017, 80: 1180-1186.14 Jia JX,Yan XS,Song W, et al. The protective mechanism underlyingphenylethanoid glycosides( PHG) actions on synapticplasticity in rat Alzheimer’s disease model induced bybeta amyloid 1-42[J]. J Toxicol Environ Health A,2018,81: 1098-1107.15 Li N,Bai HY,Lou JY. Protective effect of Cistanche deserticolapreparation on brain of patients with Alzheimerundefinedsdisease[J]. China Health Stan Manag( 中国卫生标准管理) , 2015,6: 115-116.16 Zhang YM,Chen J,Wu W, et al. Effects of GCs on behaviorand expression of tau protein P-tau protein and Aβ amyloidprotein in hippocampus of VD Rats[J]. J Stroke and Neuropat(中风与神经疾病杂志) , 2015, 32: 494-496.17 Peng XM,Gao L,Huo SX. The mechanism of memory enhancementof acteoside ( verbascoside ) in the senescentmouse model induced by a combination of D-gal and AlCl3[J]. Phytother Res, 2015, 29: 1137-1144.18 Wu CR,Lin HC,Su MH. Reversal by aqueous extracts ofCistanche tubulosa from behavioral deficits in Alzheimer’sdisease-like rat model: relevance for amyloid deposition andcentral neurotransmitter function[J]. BMC Complem AlternM, 2014, 14: 202-203.19 Din H,Chen H, Jiang Y, et al. Effect of pyramidin on neurotransmittersin hippocampus and cortex of rats with Alzheimerundefineds disease[J]. Chin Pharmacol Bull( 中国药理学通报) , 2014, 30: 1564-1569.20 Liu YJ,Liu XL,Liu XM, et al. Effect of pyramidin on excitatoryamino acids in brain of Alzheimerundefineds disease rats[J]. Lishizhen Med Mater Med Res ( 时珍国医国药) ,2015, 26: 1830-1832.
  • 摘要: 为研究肉苁蓉苯乙醇苷对阿尔茨海默病模型小鼠海马β 淀粉样蛋白表达的影响。实验选用6 月龄APP/PS1双转基因AD 模型小鼠60 只,随机分为模型组、多奈哌齐组( 0. 65 mg /kg) 、肉苁蓉苯乙醇总苷剂量组( 250, 125, 62. 5mg /kg) 、肉苁蓉毛蕊花糖苷组( 125 mg /kg) ,正常组为同窝非转基因小鼠10 只,分别给予药物和蒸馏水灌胃3 个月,于9 月龄时通过Morris 水迷宫法检测行为学改变,采用HE 染色法观察小鼠脑部海马病变,采用免疫组化法和Western-blot 法考察海马Aβ1-42和Aβ1-40蛋白表达。实验结果发现肉苁蓉苯乙醇苷明显改善小鼠学习与记忆能力和脑部海马神经元的损伤,减少Aβ1-42、Aβ1-40阳性细胞数,并下调蛋白表达。肉苁蓉苯乙醇苷通过下调小鼠海马脑区Aβ1-42、Aβ1-40蛋白表达,从而影响Aβ 级联反应以保护神经元,发挥拮抗AD 作用。本研究明确了苯乙醇苷是肉苁蓉发挥抗AD 活性的主要药效物质基础,为后续将其开发为抗AD 新药提供了理论支撑。关键词: 肉苁蓉; 苯乙醇苷; 阿尔茨海默病; APP/PS1 双转基因小鼠; β 淀粉样蛋白阿尔茨海默病( Alzheimer disease,AD) 是一种以进行性记忆减退、认知功能障碍为主要临床特征的中枢神经系统退行性疾病[1-3]。目前较为公认的β 淀粉样蛋白( Aβ) 级联反应假说认为,生理状态下的正常代谢产物Aβ1-42和Aβ1-40单体本无神经毒性,但当其遇到APP 外源介质影响导致异常沉积后,积聚的Aβ1-42形成可溶性Aβ 寡聚体( ADDLs) ,阻止单体产生保护活性从而引起神经元变性、突触丢失和轴突损伤,最终引发脑内神经元凋亡致痴呆,因此考察其关键靶标Aβ1-42和Aβ1-40蛋白在脑内表达情况对于肉苁蓉苯乙醇苷防治的AD 研究具有重要的意义[4-7]。同时,研究AD 动物模型脑内特征性病变部位海马各分区的组织病理学检测可从宏观上真实反映药物对其脑内病变部位的改善情况[8-10]。我国传统中医药认为补肾益精类中药肉苁蓉具有抗老防衰、改善记忆的功效[11-14]。大量前期研究已证实,肉苁蓉苯乙醇总苷及苯乙醇苷代表性单体-毛蕊花糖苷在传统方法构建的AD 在体或离体模型中均表现出明显的拮抗AD 作用,具有一定的防治神经退行性疾病的潜能[15-20]。但未见肉苁蓉苯乙醇苷应用APP /PS1 双转基因模型从β 淀粉样蛋白角度开展防治AD 作用研究。综上所述,本研究基于AD 发病机制研究中经典假说—Aβ 级联反应假说,借助理想、可靠的AD动物模型APP /PS1 双转基因小鼠作为体内研究平台,采用Morris 水迷宫、HE 染色法、Western-blot、免疫组化等先进技术手段,从动物行为学、组织病理学角度、分子生物学层面考察肉苁蓉苯乙醇苷对APP /PS1 双转基因小鼠脑部海马区β 淀粉样蛋白表达的影响,以期寻找AD 防治新靶点,为肉苁蓉苯乙醇苷防治AD 具体作用机制的研究提供参考依据。1 试药与仪器1. 1 试药肉苁蓉苯乙醇总苷( 课题组自制,苯乙醇总苷含量达87. 6%) ; 毛蕊花糖苷( 批号111530-200505,中检所) ; 二氧化钛( 批号20161025,上海染料研究所有限公司) ; HE 染色试剂盒( 批号20160902,凯基生物公司) ; 中性树胶( 批号20161208,上海懿详公司) ; SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒( 批号1043721,北京索莱宝公司) ; BCA 蛋白定量试剂盒( 批号20150323,南京凯基生物公司) ; Aβ1-40( 批号20161012,美国CST 公司) ; Aβ1-42( 批号20161014,美国CST 公司) ; β-actin( 批号20161012,美国CST公司) ; 碱磷酶标记兔抗山羊IgG ( H + L) ( 批号20162308,北京中杉金桥公司) ; 4 × 蛋白上样缓冲液含β-巯基乙醇( 批号2010662,北京索莱宝公司) ; 10× TBST( 批号20160611,北京索莱宝公司; PVDF 膜( 批号03010040001,瑞士罗氏公司) ; SDS ( 批号20160930,北京索莱宝公司) ; Tris ( 批号WXBB4339V,美国VETEC 公司) ; 甘氨酸( 批号GB10466,北京索莱宝公司) ; 脱脂奶粉( 批号WB20361,美国BD 公司) ; BCIP /NBT Kit( 美国invitrogen公司) ; 二抗( 批号15922207,北京中杉金桥公司) ; 吐温20( 批号WXRC6526N,美国VETEC 公司) 。1. 2 动物6 月龄APP /PS1 双转基因AD 模型小鼠60 只及同窝阴性小鼠10 只,雌雄对半,体质量20 ± 10 g,中国江苏南京模式动物研究所,许可证号[SCXK( 苏) 2015-0001],实验过程中动物自由摄食和饮水。1. 3 仪器MT-100 Morris 水迷宫( 成都泰盟科技有限公司) ; 凝胶成像仪( 美国BIO-RAD 公司) ; RM2016 病理切片机( 德国Leica 公司) ; SIM-F124 型制冰机( 日本SANYO 公司) ; 凝胶电泳及转膜设备( 美国BIO-RAD 公司) ; 全波长酶标仪( 美国Thermo Scientific公司) ; CO2恒温培养箱( 美国Thermo 公司) ; 4°C 和-20°C 冰箱( 青岛海尔公司) ; 67120 超纯水仪( 美国Millipore 公司) ; TP-114 电子天平( 北京Sartorius公司) ; 低温冷冻高速离心机( 美国Thermo Scientific公司) ; DVKW-D-2 数显电热恒温水浴锅( 北京市永光明医疗仪器厂) ; 超声波细胞破碎仪( 宁波新芝公司) ; WD-9405A 型脱色摇床( 北京六一仪器厂) ; 可调式恒压恒流电源( 美国BIO-RAD 公司) ;DM4000 荧光倒置显微镜( 德国Leica 公司) 。2 方法2. 1 动物分组与给药依据SPSS18. 0 统计软件产生的随机数字,将AD 模型小鼠随机分为模型组、多奈哌齐组( 每日灌胃剂量为0. 65 mg /kg) 、肉苁蓉苯乙醇总苷( PhGs)高、中、低剂量组( 每日灌胃剂量分别为250、125、62. 5 mg /kg) 、肉苁蓉毛蕊花糖苷干预组( 125 mg /kg) ,每组10 只。于6 月龄时开始对小鼠按组别实施灌胃治疗,连续3 个月,每日灌胃1 次。正常组为同窝非转基因小鼠,模型组和正常组给予等体积蒸馏水灌胃。2. 2 Morris 水迷宫实验采用经典的Morris 水迷宫测试小鼠空间学习及记忆能力。第1、2 天训练小鼠熟悉平台位置,练习寻找平台,第3 ~ 5 天进行正式测试,观察各组小鼠训练后寻找平台的情况,第6 天撤去平台,观察小鼠的游泳轨迹。实验过程中,摄像头会同步记录小鼠寻找平台花费时间( 即逃避潜伏期) 及游泳轨迹的距离。若小鼠在设定的时间范围内未找到平台( 一般设定为60 s 或120 s,本实验采用60 s) ,则将该小鼠的逃避潜伏期记为设定值,且由工作人员将其置于平台上停留数秒( 本实验釆用10 s) ,助其加深平台记忆。实验结束后,记录小鼠从入水开始直至找到平台的游泳时间。在实验的最后一天,撤去平台,设定时间内需要记录的内容主要有小鼠穿越平台次数、目标象限的停留时间等,分析每个实验动物的搜索策略。2. 3 脑组织取材及石蜡包埋给药结束后称重小鼠,使用10% 水合氯醛麻醉小鼠。将麻醉后的小鼠仰放在操作台上固定四肢。4%多聚甲醛内灌注固定后处死动物,剔除小脑等多余的脑组织,沿大脑半球末尾,除去整个小脑和大脑中部冠状面前半部分。4%多聚甲醛中固定24 h,超纯水清洗10 分钟后依次放入30% 乙醇( 1 h) →40%乙醇( 1 h) →50% 乙醇( 1 h) →75% 乙醇( 1 h)→90%乙醇( 1 h) →95%乙醇( 1 h) →无水乙醇I( 1h) →无水乙醇II( 1 h) →二甲苯I( 15 min) →二甲苯II( 15 min) 。浸入石蜡2 h,组织包埋后在小鼠脑部海马CA1 区连续冠状切片。于60 ℃烘箱内干燥48h 后常温保存。2. 4 HE 染色将每组选取的切片于60 ° C 烘箱内烤片40min,然后依次将其放入二甲苯I( 5 min) →二甲苯II( 10 min) →无水乙醇( 5 s) →95% 乙醇I ( 5 s) →95%乙醇II( 5 s) →80%乙醇( 5 s) →蒸馏水冲洗多次,使用HE 染色试剂盒染色后中性树胶封片。2. 5 免疫组织化学染色将制备完成的切片按照脱蜡、抗原修复、阻断内源性过氧化氢酶、血清封闭、一抗孵育、二抗孵育、DAB 显色、脱水、封片的标准步骤进行免疫组化染色。每组选取适宜6 张切片,电镜下观察神经元细胞形态、着色,使用Image J 软件计数海马阳性细胞数值。2. 6 Western blot 分析蛋白表达情况吸取组织上清液按照BCA 蛋白定量法测定从脑组织海马中提取的蛋白含量。与4 × 蛋白上样缓冲液按照4: 1 的比例混匀, 95 °C 加热10 min,自然冷却后于-20 °C 冰箱内保存。制备SDS-PAGE 凝胶,加入电泳液后依次加入正常组、药物干预组等各组蛋白,两侧胶孔加入蛋白Marker。冰浴盒中电泳至分离胶底部终止电泳。转膜液平衡后依据胶大小剪取PVDF 膜、滤纸。在转膜夹中按照黑色纤维垫→3 层滤纸→凝胶→PVDF 膜→3 层滤纸→黑色纤维垫组装,清除气泡后80 V 恒压转膜。转膜完成后脱脂牛奶封闭2 h。稀释抗体加入对应膜中孵育过夜。二抗孵育2 h 后加入BCIP /NBT 显色液直至显色。BIO-RAD 凝胶成像仪采图。用Image J 软件定量分析目的蛋白条带,以IOD 表示蛋白条带的相对强弱。结果以目的蛋白与对照蛋白β-actin 的积分光密度值的比值表示。结果以( 目标蛋白ID/内参ID) × 100%表示。2. 7 数据统计学分析采用SPSS18. 0 进行数据的统计分析,数据以( 珋x ± s ) 表示,组间数据比较采用单因素方差分析( One-Way ANOVA) 检验分析,数据间的多重比较采用LSD-t 检验( least significant difference,LSD) ,以P< 0. 05 或P < 0. 01 表示差异有统计学意义。3 实验结果3. 1 Morris 水迷宫检测结果随着训练时间的不断增加,各组小鼠到达平台的时间( 逃避潜伏期) 明显缩短。第1,2 天为训练时间,第3 天模型组与正常对照组小鼠相比逃避潜伏期显著延长( P < 0. 01) ; 第4 天、第5 天模型组小鼠逃避潜伏期与正常对照组小鼠相比明显延长( P< 0. 05) ; 第3 天多奈哌齐组小鼠逃避潜伏期与模型组相比显著缩短( P < 0. 05) ; 与模型组相比,肉苁蓉苯乙醇总苷各剂量组、毛蕊花糖苷组随着剂量的增加,小鼠逃避潜伏期明显缩短,具有显著差异( P <0. 05) ( 见表1) 。水迷宫实验第6 天撤去平台进行空间探索实验,记录60 s 内各组小鼠穿越平台位置的次数。由结果可得,模型组小鼠在设定时间内穿越平台次数与正常组小鼠相比显著减少( P < 0. 01) ; 与模型组相比,肉苁蓉苯乙醇总苷各剂量组及毛蕊花糖苷组穿越平台次数明显增加( P < 0. 05) ,具有显著性差异( 见表2) 。上述研究结果均暗示肉苁蓉苯乙醇苷可以显著改善APP /PS1 双转基因AD 小鼠的学习记忆能力,并且具有一定的剂量依赖性。3. 2 病理组织染色观察结果结果可知,正常组海马CA1 区神经元细胞排列整齐紧密,分布较为均匀,层次清晰,椎体细胞核较大且性状近似圆形。而模型组小鼠海马CA1 区由于受到损伤,导致神经元细胞和形态发生明显改变,排列疏松混乱,无明显层次,细胞之间的连接松散,部分细胞核出现固缩、凋亡,使染色偏深。肉苁蓉苯乙醇苷不同剂量干预组、多奈哌齐组和毛蕊花糖苷干预组海马CA1 区细胞均有不同程度的改善,固缩、深染的神经元细胞较模型组明显减少,但仍可看到较大的细胞间隙( 见图1) 。3. 3 免疫组化实验结果肉苁蓉苯乙醇苷治疗后,取9 月龄的APP /PS1双转基因小鼠脑部组织切片,对其海马CA1 区进行Aβ1-40免疫组化染色,结果显示: 视野内可见阳性细胞多呈圆形,大部分是胞膜着棕黄色,与正常组比较,模型组小鼠海马CA1 区Aβ1-40阳性细胞数明显增加( P < 0. 01) ; 与模型组比较,肉苁蓉苯乙醇总苷高、中剂量组和毛蕊花糖苷组阳性细胞数显著减少( P < 0. 01) ,多奈哌齐组和肉苁蓉苯乙醇总苷低剂量组Aβ1-40阳性细胞数明显减少( P < 0. 05) ,具有显著性差异( 见表3,图2) 。经肉苁蓉苯乙醇苷干预后,取9 月龄的APP /PS1 双转基因小鼠脑组织切片,对其海马CA1 区进行Aβ1-42免疫组化染色,结果显示: 与模型组比较,肉苁蓉苯乙醇总苷各剂量组和毛蕊花糖苷组阳性细胞数显著减少,具有显著性差异( P < 0. 01) ( 见表4,图3) 。
  • 摘要:肉苁蓉是中国西北荒漠特有的名贵补益类中药材,被誉为“沙漠人参”。现代医学中,肉苁蓉被广泛应用到临床处方、中成药和保健品,具有较高的经济价值。肉苁蓉及梭梭树的种植既能保护野生资源、也可以治理沙漠,改善生态环境。肉苁蓉产业的发展具有良好的生态效益、经济效益和社会效益。关键词:肉苁蓉;临床;种植1 本草记载及资源分布肉苁蓉由于生长在干旱沙漠环境中,被美誉为“沙漠人参”。该植物寄生于沙漠地区梭梭树的根部,茎高40cm-160cm 或更长,密布鳞叶,花密集,多呈黄色。盐生肉苁蓉C. salsa , 多生于荒漠草原及荒漠区盆低地;多呈丛生状,花较少,花冠淡紫色。肉苁蓉最早出现于《神农本草经》记载,被列为上品 , 为常用补肾壮阳药 , 其功效确切, 来源稀少,一直被视为药中珍品。据《吴普本草》记载,最早记载产地为甘肃河西,最早集散地为山西北部(内蒙古产肉苁蓉在此交易)。唐代之后产地不断扩大。据《千金翼方》记载,产地出现在甘肃各地、宁夏。《郡县志》记载在甘肃东南部、陕西志丹县北、河北保定西南等皆土产。《太平寰宇记》有记载,山西朔州附近有土产。元《一统志》记载,在甘肃附近土产。根据《名医别录》记载,肉苁蓉出产于甘肃、陕西及内蒙古西部等地,一般在农历五月采,地下部分入药。据陶弘景在《本草经集注》中记载,盐生肉苁蓉在山西、陕西、甘肃、内蒙古都有分布,且指出内蒙古的肉苁蓉产量大。历代本草记载[1-3] 的肉苁蓉基本一致,原植物为盐生肉苁蓉C.salsa(C.A.Mey.)G.Beck 和荒漠肉苁蓉C.deserticola Ma,且认为荒漠肉苁蓉质量较佳。而德赢vwin登录 仅自然分布在新疆南疆地区。沙苁蓉由于资源稀少,成分含量与其他3 种肉苁蓉有较大差异,仅在部分区域流通。目前由于大量采挖和生态环境的变化,陕西基本上不产肉苁蓉,现今的主要产地为内蒙古、甘肃、青海及新疆等。所以,对肉苁蓉属植物的保护应引起人们的重视。2 临床应用及其他价值据本草记载[3],《神农本草经》将肉苁蓉列为上品药,味甘,微温,具有补五脏、强阴益精气、益髓补中之功,广泛应用于肾阳不足,精血亏虚等引起的多种疾病。《名医别录》指出肉苁蓉“味酸、咸,无毒”。对于《重修政和经史证类备用本草》、《汤液本草》《本草蒙筌》以及《本草纲目》等均明确指出肉苁蓉“无毒”。。民间食用肉苁蓉已有两千多年历史,其食用方法有: 炖肉、煲汤、熬粥、泡酒、泡茶等。据各本草统计,肉苁蓉是历代补肾壮阳处方中使用频度最高的药物;在抗衰老类方剂中,出现频率位居第二,仅次于人参。近30 年来国内外对肉苁蓉的研究一直都备受关注[4-5]。对生殖系统的作用:具有强肝肾益精血、补肾壮阳、强筋骨的作用,用于阳痿、不孕、痛经等,该作用主要与肉苁蓉中苯乙醇苷类成分有关。对消化系统的作用:主要体现在通便作用,可能与活性成分总寡糖和半乳糖醇有关,肉苁蓉另一种成分松果菊苷可能对肠道上皮细胞有修复作用。对神经系统的作用:对于老年痴呆、帕金森病、抗疲劳都有良好效果,可能与苯乙醇总苷、松果菊苷等成分有关。除此外,多项研究还表明肉苁蓉还具有保护肝脏、保护心肌、抗衰老、免疫调节、促进骨骼生成等作用。3 人工种植3.1 内蒙古自治区肉苁蓉种植情况由于肉苁蓉在临床、保健、饮食上的应用广泛,但是药源比较短缺,野生植物开采严重。现代,国内内蒙古、新疆都有植物种植肉苁蓉,但是由于缺乏优质品种选择标准,栽培植物的生产质量参差不齐。种植草药的高品质是临床供应的必要条件,为了保证优质品种,在植物生长初期要保证有植物生物活性[6]。对于我国内蒙古种植肉苁蓉情况,主要在阿拉善。内蒙古阿拉善及其周边是荒漠肉苁蓉的道地产区,拥有“世界苁蓉之乡”的美誉,所产肉苁蓉质量上乘,个大、肉厚、富含胶质、鞣质等。产量占内蒙古自治区总产量的90% 以上,占全国总产量70% 以上。阿拉善地区的天然梭梭林66.7 万hm2, 人工梭梭林33.3 万hm2,为肉苁蓉种植提供了前提和保障。目前该地区肉苁蓉人工种植面积约6 万亩,年产量约1000t[7]。而且该地区不使用化肥农药,人为干预少,主要以野生抚育或野生栽培模式,具有巨大的经济和生态价值。3.2 锡林郭勒盟肉苁蓉种植情况2019 年锡林郭勒盟蒙医医院承担锡林浩特市、二连浩特市、苏尼特左旗的中药普查活动,过程中发现在我盟苏尼特左旗、二连浩特市均普查到大量野生盐生肉苁蓉。但是采集到的野生肉苁蓉均属于个人牧场,且数量有限,为保护野生药用植物考虑,只采集到做标本和药材的数量。不过这也说明,我盟地区的气候、土壤等自然条件均是适合肉苁蓉的生长,尤其是盐生肉苁蓉。而且锡林郭勒盟与阿拉善盟在海拔、气候、降水量、土壤等自然条件都差不多,所以梭梭林、肉苁蓉也能在我盟生长。早在2011 年[8],我盟阿巴嘎旗查干淖镇乌兰托雅嘎查、正镶白旗乌兰察布苏木两面井嘎查两地均试种梭梭树、接种肉苁蓉获得成功,成活率达到90%。在我盟人工种植梭梭树、接种肉苁蓉是可行的。梭梭肉苁蓉产业是一项既能治理沙漠、又使农牧民增收的生态经济产业,目前已经有人作出了成功的探索,我们更应该大胆地继续尝试。4 肉苁蓉的经济收益人工种植梭梭树接种肉苁蓉的重大意义:能有效推进沙地生态环境的改善;能有效推动沙区经济的发展。大面积推广种植梭梭树、接种肉苁蓉,必将成为地方经济新的增长点。肉苁蓉经济效益的产生,有一个比较漫长的过程,要有较好的梭梭根系是前提条件,一般而言梭梭栽植2 年以后,方可接种肉苁蓉,接种后第2 年有极少量产出,3 年后逐步进入盛产期,才会有肉苁蓉经济效益产生。主要是前期工作的比较漫长,从栽植梭梭算起4-5 年才有产出肉苁蓉,而4-5 年以后只要有较少的管护和采挖投入,就可连续采挖5 年左右的肉苁蓉。因此接近实际的效益分析,可以10 年为计算周期[9]。5 小结发展中蒙药生态种植产业符合我国宏观产业政策,是我国实施环保政策的必然选择,也是中蒙药发展的需要。梭梭肉苁蓉的种植使人们认识到沙地荒漠化是可以改造的,是可以利用的,是可以大有作为的。在我盟积极调动农牧民栽植梭梭和嫁接肉苁蓉,并提供专业技术指导。我们要通过发展肉苁蓉产业,探索出一条优化治理沙漠、使百姓致富的新途径,走出一条具有特色的治沙新路,实现生态、经济效益兼赢,培育新的经济增长点,以此带动锡林郭勒盟经济发展。言。所谓太阳与阳明合病,是指太阳表证和阳明表证同时出现。《医宗金鉴》中关于阳明表病脉证的论述有“葛根浮长表阳明,缘缘面赤额头疼,发热恶寒而无汗,目痛鼻干卧不宁。”“表阳明”是指阳明经表证。阳明病有经证、热证和腑证之分,阳明经证是阳明经脉感受外来风寒邪气,侵袭阳明经脉,使阳明经脉阳气郁而化热。“额头痛”、“目痛”、“鼻干”与变应性鼻炎的症状所符,变应性鼻炎的患儿夜间平躺时鼻涕倒流,刺激咽部,会出现咳嗽,或者鼻塞均会影响患儿睡眠质量,会出现“卧不宁”。手阳明大肠经脉循行:起于鼻旁,上行鼻根,与足太阳经脉相汇合,再沿鼻的外侧下行,入上齿龈中……阳明经脉受邪,会出现鼻部症状。周朋副教授结合多年临床经验,运用葛根汤加减,疗效显著,该方由葛根、桂枝、白芍、石膏、地龙、细辛、五味子、辛夷、柴胡、黄芩组成。葛根解表,桂枝、白芍调和营卫,石膏清里热透郁热,地龙通络,辛夷通鼻窍,辛温之细辛,温肺化饮,五味子收敛,散中有收,柴胡、黄芩解郁清热。3 典型病例患儿,男,5 岁,2019 年9 月12 日以“鼻塞、流涕1 月余,加重3 天”为主诉就诊于我院门诊,患儿1 个多月来,反复鼻塞、流涕与冷空气后症状加重。现患儿症见:流浊涕,鼻塞,晨起打喷嚏,鼻痒,自觉鼻干,晨起或睡前出现咳嗽,有痰不能咯出,无热,时恶心呕吐,头痛,眼痒,无其他不适,纳可,眠欠安,二便,间断服用西药(具体药物不详)口服,服用期间症状缓解,停用药物后或调。查体:心肺(-),双侧鼻甲肥大。舌质淡红,苔白偏厚,脉浮。诊断:中医诊断:鼻鼽(阳明经表证)西医诊断:变应性鼻炎。治以发汗疏经,解阳明郁热。方选葛根汤加减。整方如下:葛根18g 桂枝9g 白芍12g 石膏24g 地龙 9g 五味子 6g 细辛 3g 辛夷 9g(包煎)柴胡12g 黄芩 9g 炒莱菔子12g,7 付,日1 付,水煎服。2019 年9月19 日复诊,患儿鼻塞、流涕症状减轻,无头痛,基本不咳,遂予原方7 付继服。近年来随着社会生活水平的提高及生活环境的变化,尤其是雾霾天气增多,患儿体质变化,变应性鼻炎发病率逐年增加[10]。多数医家认为外邪侵袭,正气不足,肺脾肾三脏内虚是儿童变应性鼻炎的病因病机。治疗上多补肺健脾。周朋副教授结合多年临床经验,从阳明经表证论述变应性鼻炎,治疗以发汗疏经,解阳明郁热为主,方选葛根汤加减,治疗效果显著。参考文献[1]  中华耳鼻咽喉头颈外科杂志编集委员会鼻科组, 中华医学会耳鼻咽喉头颈外科学分会鼻科学组. 变应性鼻炎诊断和治疗指南(2015 年,天津). 中华耳鼻咽喉头颈外科杂,2016,51(1):1-18.[2]  Jan P. Vandenbroucke,Erik von Elm,Douglas G. Altman,et al. Strengtheningthe Reporting of Observational Studies in Epidemiology (STROBE):Explanation and elaboration[J]. International Journal of Surgery,2014,12(12).[3]  宋芬乐, 成焕吉, 李艳春, 等. 支气管哮喘儿童哮喘控制与治疗现状的临床观察[J]. 中国妇幼保健,2016,31(09):1891-1893.[4]  Hamida Hammad,Bart N. Lambrecht. Barrier Epithelial Cells and the Controlof Type 2 Immunity[J]. Immunity,2015,43(1).[5]  续珊, 陈始明, 焦沃尔, 等. 变应性鼻炎发病机制研究的新进展[J]. 现代生物医学进展,2019,19(06):1180-1183.[6]  何珊, 李幼瑾, 陈洁. 中西医结合治疗儿童变应性鼻炎的临床研究[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2014,28(23):1888-1890.[7]  魏肖云, 李萌, 汪受传, 等. 汪受传教授以消风法为主治疗小儿变应性鼻炎的经验[J]. 时珍国医国药,2015,26(01):214-215.[8]  张红卫, 沈祖法, 金晶, 等. 从痰饮论治变应性鼻炎30 例临床观察[J].中医药导报,2013,19(06):27-29.[9]  王道涵. 安效先治疗小儿过敏性鼻炎验案3 则[J]. 辽宁中医杂志,2010,37(04):737-738.[10]  马俊海. 儿童过敏性鼻炎中西医治疗进展[J]. 宁夏医学杂志,2017,39(07):664-667.
  • 摘要:德赢vwin登录 产于新疆全疆,但以南疆的民丰分布较集中,生于水分较充足的柽柳丛中及沙丘地,属列当科肉苁蓉属多年生草本寄生植物,常寄生于柽柳属植物的根上。广泛分布于非洲北部、阿拉伯半岛、巴基斯坦、印度及前苏联中亚地区,是药典收载的肉苁蓉药材的主要基源植物,为满足市场对肉苁蓉的需求,更好地实现“以药养林”的目的,本文结合柽柳林的成功栽植,对栽培德赢vwin登录 技术进行了初步探讨,供读者参考。关键词:柽柳林;德赢vwin登录 ;方法德赢vwin登录 (Cistanche tubulosa(Schenk)Wight)属列当科肉苁蓉属多年生草本寄生植物,是药典收载的肉苁蓉药材的主要基源植物,全草可入药,味甘、咸,性温,无毒,有补精血、益肾壮阳、润肠通便的功效。为满足市场对肉苁蓉的需求,更好地实现“以药养林”的目的,结合黄河三角洲区域柽柳林的成功栽植,对栽培德赢vwin登录 技术进行了初步探讨,供读者参考。1 适宜种植的自然条件德赢vwin登录 适应性较强,在冬季低温不低于10℃、年降水量低于100mm(在降水量大的区域,要做好排水工作)、年均相对湿度要在50%左右的气候条件下均可生长。德赢vwin登录 适于在通透性、渗水性良好(含水量3%~18%)、pH8.0~9.5 的沙土中生长,对土壤中有机质的含量要求不高,黏重土壤不适宜种植。2 种子的筛选具备采收条件的可以自行采收,也可以到市场上采购。市场上德赢vwin登录 的种子质量参差不齐,无论是自行采收还是采购,为提高种子萌发率和接种率,要筛选粒大(直径大于0.5mm的为佳)、饱满、有光泽和成熟度较高的种子进行播种。3 种子处理种子处理可供选择的方法比较多,可以采取化学药剂、植物生长调节剂、低温沙藏及热水、暴晒、丸粒化等处理方法。在种植生产中,如果要当年播种,至少要将采收或采购的种子经过10℃左右的低温冷藏处理30d左右。最简便的方法:在北方将种子放置在室外或无供暖的室内,经过冬季自然低温保存后,次年即可用于种植。4 栽培管理德赢vwin登录 为寄生植物,其寄主为柽柳属植物。种植德赢vwin登录 必须要选择条件适宜的柽柳林。在北方尤其是黄河三角洲区域,有大面积人工栽植的柽柳林即可用于种植德赢vwin登录 ,种植户也可以先按照柽柳造林技术栽植柽柳,柽柳定植一年后再种植德赢vwin登录 。德赢vwin登录 栽培分为规范化栽培、仿野生栽培等方式。在柽柳林面积大、立地条件差的区域,适于采用仿野生栽培模式;在面积小、立地条件和管理条件好的地区可以选择规范化栽培模式。在干旱区域用接种纸膜效果好,在非干旱区可以不用接种纸膜。4.1 播种除冬季土壤结冻后至春季土壤解冻前的季节外均可播种,但最佳播种期是3~6 月,也可以在秋季边采挖边播种。秋季播种的种子一般会到第2 年春季才能成功萌发。播种可采用沟播和穴播,有灌溉条件的采用沟播,没有灌溉条件的可采用穴播。4.1.1 穴播在距离柽柳主干50cm左右处挖1~2个深50cm左右的穴,将10~20 粒处理过的德赢vwin登录 种子直接撒播于穴底,用沙土回填至穴深一半后灌水,待水完全渗透后,再将余土回填踩实。4.1.2 沟播在距离柽柳主干30cm处开挖宽30cm、深50cm的接种沟,将德赢vwin登录 种子按照4kg/hm2 的接种量撒播于沟中,回填土踩实后灌溉。无论是穴播还是沟播,可以事先用生根剂或生根粉水溶液喷洒柽柳毛根及周围沙土,然后将种子与适量沙土和有机肥混匀,撒播于沟内,再回填土、灌水、覆土踩实,这样可以提高接种率。4.2 田间管理4.2.1 浇水春季接种后,需要及时灌溉浇水,降雨少的月份每月灌溉1 次,最迟9 月中旬再灌溉1 次,之后为防止冻害不宜再浇水。由于德赢vwin登录 接种后有当年接种出土和二三年后接种出土的,可以视情况在2~3 年后继续参照上述方法补种,但是补种的接种沟最好与第一次接种时挖的沟保持20~30cm的距离,以保持连续不断地产出德赢vwin登录 。4.2.2 施肥为提高德赢vwin登录 的品质,应尽可能给柽柳施用厩肥等有机肥,尽量不使用化肥。4.2.3 除草可结合柽柳林管理,及时清除林间杂草及杂灌木等。4.2.4 病虫害防治除了要加强柽柳的病虫害防治外,还要注意种蝇及老鼠等对德赢vwin登录 的直接危害。4.2.5 人工授粉由于德赢vwin登录 是异花受粉植物,自然受粉率较低,在德赢vwin登录 开花季节,应当进行人工辅助授粉或放养蜜蜂等传粉昆虫。留作采种的植株,为提高种子质量在初花期可以人工摘除花序顶端4~5 层花。5 种子和德赢vwin登录 的采收5.1 种子的采收可以选择果序饱满的果实留种。德赢vwin登录 果实变黑、剥开果实后种子呈现黑褐色说明已经成熟,应及时采收。在黄河三角洲区域一般在6 月底至7月底这个阶段成熟,要经常对果序进行观察,发现成熟的可立即采收。采收时用刀从果序的基部砍断,将收集到的果序集中置于阳光下曝晒,待果实自然开裂,碾压或用木棍敲打出种子,去除杂质,再将种子集中晾晒至干保存。5.2 德赢vwin登录 的采收与种子采收时间不同,一般待德赢vwin登录 出土开花后第3 年的春季或秋季当有花序顶出地面时采收,采完种子的德赢vwin登录 一样可以整株采收。人工采挖时,在接种区外侧50cm向接种区刨挖,但是一定注意保护好接种盘。如果不留接种盘,可以采取机械采收,直接将寄主根切断,翻出德赢vwin登录 。6 德赢vwin登录 的加工将采收的德赢vwin登录 除去泥沙等杂质后,若顶头变色须去除变色部分,整株曝晒或机械干燥。干燥过程中,要注意将茎尖部分除去以防生长开花降低质量,同时也要注意防霉腐烂。由于德赢vwin登录 体积较大,整株干燥困难,可以将整株用切片机切成6mm左右的切片,再干燥包装。
  • [摘要] 目的:观察加减苁蓉菟丝子丸联合氯米芬治疗肾虚型排卵障碍性不孕的临床疗效。方法:将60 例患者分为2 组,加减苁蓉菟丝子丸联合氯米芬(中西医结合组) 30例,单用氯米芬(西医组) 30 例,疗程均为3 月,比较治疗前后内分泌激素、基础体温、B 超监测排卵、子宫内膜的变化及妊娠情况。结果:中西医结合组排卵率为68.62%,西药组排卵率为61.64%。2 组排卵率比较,差异无统计学意义(P > 0.05)。中西医结合组妊娠率46.67%,西医组20.00%,2 组比较,差异有统计学意义(P <0.05)。中西医结合组自然流产率14.29%,西医组66.67%,2 组比较,差异有统计学意义(P < 0.05)。2 组治疗前后性激素比较,差异均有统计学意义(P < 0.01)。2组治疗后睾酮(T)、雌二醇(E2) 比较,差异有统计学意义(P < 0.01,P < 0.05)。2 组治疗后优势卵泡直径、排卵日子宫内膜厚度均较前改善(P < 0.01)。2 组治疗后排卵日子宫内膜厚度比较,差异有统计学意义(P <0.01)。全部病例在服药期间未出现不良反应。结论:加减苁蓉菟丝子丸联合氯米芬能够促进排卵,并改善子宫内膜容受性,促排卵后能有效提高妊娠率,降低流产率,且安全性较好。[关键词]不孕;排卵障碍;加减苁蓉菟丝子丸;氯米芬;中西医结合疗法不孕症为临床常见病,其指在有正常的性生活且未避孕的情况下未成功受孕而妊娠达1年以上。其中排卵障碍而导致不孕者,约占25%~35%[1]。本研究运用加减苁蓉菟丝子丸联合氯米芬治疗肾虚型排卵障碍性不孕患者,取得良好疗效,现将结果报道如下。1 临床资料1.1 一般资料病例来自2016 年3 月—2017 年3 月浙江省诸暨市人民医院门诊诊断为肾虚型排卵障碍性不孕患者60 例。随机分为2 组各30 例,中西医结合组平均年龄(29.20±4.97)岁,平均病程(3.77±1.38)年。西医组平均年龄(29.37±4.29)岁,平均病程(3.23±1.34)年。2 组年龄、病程等一般临床资料经统计学处理,差异无统计学意义(P > 0.05),具有可比性。1.2 纳入标准西医诊断标准参照《妇产科学》[1]中符合排卵障碍性不孕的诊断。中医辨证分型属于肾虚型不孕者,参照张玉珍主编《中医妇科学》[2]和《中药新药临床研究指导原则》[3]的标准:周期延后,量少,色暗淡,质清稀,或带下清稀;腰骶酸痛,头晕耳鸣,性欲减退,面色晦暗,或面部暗斑;舌淡、苔薄白,脉沉细。年龄20~45 岁。1.3 排除标准先天性生殖器官缺陷的。3 月内使用过激素类药物,如促排卵药或糖皮质激素等。合并有心血管、肝、肾和造血系统等严重疾病、精神病患者。未按照规定用药,无法判断疗效或数据不全者。2 治疗方法2.1 西医组单用氯米芬,从月经周期的第5 天开始口服氯米芬50~100 mg,每天1 次,连用5 天。3 月经周期为1 疗程,连用1~2 疗程。2.2 中西医结合组给予加减苁蓉菟丝子丸联合氯米芬。从月经周期的第5 天开始口服加减苁蓉菟丝子丸,每天1 剂,早晚分服,经期停药,处方:肉苁蓉10 g,菟丝子、熟地黄、覆盆子、枸杞子、当归各12 g,桑寄生15 g,艾叶9 g。辨证加减:若气虚乏力加黄芪15 g,白术12 g;脾肾阳虚加炮姜3 g;食少便溏加陈皮12 g,佛手10 g;心悸失眠加夜交藤12 g,远志6 g。氯米芬用法用量同西医组。3 月经周期为1 疗程,连用1~2 疗程。3 观察指标与统计学方法3.1 观察指标①性激素测定:治疗前后各测1 次黄体生成激素(LH)、促卵泡成熟激素(FSH)、催乳激素(PRL)、孕酮(P)、睾酮(T)、雌二醇(E2)值。于月经第2~3 天或B超示无1.0 cm以上发育卵泡和双层子宫内膜厚径<0.5 cm时,测FSH、LH、PRL、E2、T值。P 的测定,无排卵者于月经第20~25 天进行,有排卵者在基础体温(BBT)高温相上升第7 天进行。②B超检查[1]:于月经第10 天开始监测卵泡排卵、子宫内膜情况,2 天1 次,当卵泡直径达到15 mm时每天1 次,直至排卵。③治疗前后排卵率及妊娠情况。④安全性观察,记录治疗前后心、肝、肾功能检查;血、尿、大便常规化验;观察用药期间有无不良反应:如胃肠道反应,过敏反应等。若出现不良反应则立即停药,并退出本研究。3.2 统计学方法采用SPSS19.0 统计软件处理数据,计量资料以(x±s)表示,采用t 检验。计数资料采用χ2检验。P < 0.05为差异有统计学意义。4 治疗结果4.1 2 组排卵情况比较见表1。中西医结合组排卵率为68.62%,西药组排卵率为61.64%。2 组排卵率比较,差异无统计学意义(P > 0.05)。4.2 2 组临床妊娠疗效比较见表2。中西医结合组妊娠率46.67%,西医组20.00%,2 组比较,差异有统计学意义(P <0.05)。4.3 2组自然流产率比较见表3。中西医结合组自然流产率14.29%,西医组66.67%,2 组比较,差异有统计学意义(P <0.05)。4.4 2 组治疗前后性激素比较见表4。2 组治疗前后性激素比较,差异均有统计学意义(P < 0.01)。2 组治疗后E2、T比较,差异有统计学意义(P < 0.01,P < 0.05)。4.5 2 组治疗前后优势卵泡直径及排卵日子宫内膜厚度比较见表5。2 组治疗后优势卵泡直径、排卵日子宫内膜厚度均较前改善(P < 0.01)。2 组治疗后排卵日子宫内膜厚度比较,差异有统计学意义(P < 0.01)。4.6 安全性观察全部病例在服药期间未出现不良反应,如胃肠道反应,过敏反应等。血、尿、大便常规及心、肝、肾功能等2 组治疗前后均未出现异常。5 讨论中医学认为肾为先天之本、元气之根,肾藏精,主生殖,为天癸之源,冲任之本,是人体生长、发育和生殖的根本。而女子受孕的前提是肾气充盛,天癸成熟,冲任二脉功能协调,月经能按时来潮, 《女科正宗·广嗣总论》云:“男精壮而女经调,有子之道也。”针对这一特点,本研究以肉苁蓉、菟丝子、覆盆子温补肾气,熟地黄滋肾益阴,艾叶温经逐寒,枸杞子、桑寄生补肝肾,以调整肾- 天癸- 冲任- 胞宫轴来兴奋下丘脑- 垂体- 性腺系统,促使卵泡成熟。当归补血活血,改善卵巢周围血液循环,促使成熟的卵泡排出。本方以补肾为主,兼以补血活血,使子宫卵巢血流通畅,血供充足,组织血量充盈,有助于卵泡和内膜的生长发育和局部组织微环境状态的调整,有利于卵母细胞的成熟、排放,使瘀血状态得到改善,达到肾气盛,任通冲盛,月经调,使其摄精成孕。除外氯米芬具有双向调节作用,一方面通过下丘脑反馈,增加FSH内源性分泌水平,促进排卵;另一方面可对下丘脑- 垂体产生负反馈作用,促进促性腺激素释放而增加排卵作用[4]。中西医结合组在服用氯米芬同时,均连续加用补肾填精活血中药,由于补肾中药弱雌激素样作用,一方面改善了由氯米芬所导致宫颈黏液状不良,从而相应增加了精子穿透宫颈黏液的活力和数量;另一方面,排卵与子宫内膜发育同步,着床日子宫内膜容受性达最高水平,所以中西医结合组排卵后临床妊娠率明显高于西药组,流产率明显低于对照组,同时改善下丘脑垂体的机能,调节内分泌水平。中西医结合治疗不易产生耐药性,避免了单用促排卵西药妊娠率低、流产率高、容易产生卵巢过度刺激征、不宜长期服用等缺点,安全性较好,值得推广。[参考文献][1] 乐杰.妇产科学[M].7 版.北京:人民卫生出版社,2008:351.[2] 张玉珍.中医妇科学[M].2 版.北京:中国中医药出版社,2007:77- 83.[3] 中华人民共和国卫生部.中药新药临床研究指导原则:第1 辑[S].1993:276- 280.[4] 李友云.重组人促卵泡激素联合氯米芬治疗多囊卵巢综合征的临床研究[J],现代药物与临床,2018,33 (2):321- 324.
  • 1.3.4 苏木素-伊红(HE)染色 小鼠取血完毕后立即处死小鼠,立即取出睾丸和附睾,将其分别精确称重。小鼠睾丸组织取材后,石蜡包埋切片,再用苏木精染液染色2min使细胞核呈蓝色.0.1%伊红染液染色2min,使细1.3.5 统计分析 数据以平均值±标准误差(X±S)表示,显著性标准为P<0.05,极显著性指标为P<0.01.组间差异的统计学意义采用ANOVA(单因素方差分析)中的LSD(最小显著差法)和Duncan(多范围检验法),数据用SPSS22.0软件处理。各组数据取试剂盒灵敏度范围内的,超出范围部分的数据应舍去。2 结果与分析2.1 肉苁蓉醇提物对雄性肾虚小鼠的影响2.1.1 小鼠体重的变化 由图1可知,在注射氢化可的松造模后,模型组MO的体重增长小于空白组CO,提示雄性小鼠肾虚模型建造成功,为以后的实验打下基础。给药组在10周龄之后体重出现增长,低剂量组M1的体重增长1.54g,高剂量组M2的体重增长1.09g,而空白组CO增长0.95g,提示肉苁蓉提取物可能有促进雄性肾虚小鼠体重增加的作用,但是各组之间差异不显著。 图1 雄性小鼠体重变化情况2.1.2 条酮(T)检测结果 与模型组相比,本试验小鼠睾酮组间差异显著性为p>0.05,没有统计学意义。由图2可知,模型组M0小鼠睾酮水平与CO相比没有太大变化,与MO相比,低剂量组M1小鼠睾酮降低,高剂量组M2小鼠睾酮水平均值(2.71ng/mL)将近M0的3倍(1.07ng/ml),说明高剂量的肉苁蓉提取物对雄性小鼠的睾酮具升高作用,对肾虚小鼠的雄性激素有促进分泌的作用,面低剂量的肉苁蓉提取物却呈现对小鼠雄性激素的分泌有抑制的拮抗作用。 图2 小鼠睾酮的误差2.1.3 促性腺激素释放激素(GnRH)检测结果 小鼠促性腺激素释放激素各组间差异显著性为p=0.342>0.05.即本次试验小鼠各组间促性腺激素释放激素无显著性差异,不具有统计学意义。由表1和图3可知,与模型对照组MO相比,肉苁蓉提取物使给药组小鼠M1、M2的促性腺激素释放激素升高,提示肉苁蓉提取物可能促进肾虚小鼠释放促性腺激素释放激素,促进雄性激素分泌,且高剂量组M2的促进效果更强。表1 不同处理雄性小鼠睾酮GaRH的浓度(±S)组别CDMOM1M2浓度(pg/ml)366.36±102.0 262.6+17.8 298.37+27.6 378.3*54.1 图3 小鼠GnRH的误差2.1.4 丙二醛(MDA)检测结果 经SPSS差异显著性分析得出,各组间差异显著性p>0.05,不具有统计学意义。由由表2和图4可知,模型对照组MO的丙二醛含量比空白组CO的更高,即肾虚小鼠的丙二醛含量升高,说明机体的膜脂过氧化程度升高,组织抗氧化程度降低。与M0相比,给药组M1,M2的MDA含量降低,说明肉苁蓉提取物能清除脂质氧化反应的终产物丙二醛,使膜系统得到一定程度的恢复。表2 不同处理对雄性小鼠MDA的含量(zS)组别CDMOMIM2MDA(pg/mL) 32.31:6.4139.75*4.9633.28±4.8934.80=4.51 图4 小鼠MDA的误差2.1.5 超氧化物歧化酶(SOD)检测结果 SOD各组间差异显著性为p<0.01。由图5和表3可知,模型组MO与低剂量组M1的差异显著性为p<0.05,C0组与各组间差异显著
  • 官霞郑丽圆い 郁琳2 卢必乔王羽菲'王磊孙兆贵”(1上海商学院食品系,上海 200235:2上海市生物医药技术研究院,国家卫生健康委员会计划生育药具重点实验室,上海 200032;3阿拉善盟尚容源生物科技股份有限公司,内蒙古巴彦浩特 750300;4上海理工大学医疗器械与食品学院,上海 200082)摘 要:现代药理研究表明,内苁蓉具有抗疲劳、抗衰老、调节分法代谢等作用。肉苁蓉醇提物对肾虚小鼠的作用研究多集中表现在激素水平,但未见对小鼠糖代谢的研究报道。为探究苁蓉醇提物对小鼠肾虚和糖代谢水平的影响,建立肾虚小鼠和糖尿病小鼠模型,连续灌胃21d后,检测肾虚小鼠血清激素水平,测定酶活力,取睾九组织进行石蜡包埋切片和HE染色,观察其病理学状态。检测糖尿病小鼠体重、空腹血糖和总蛋白变化情况。结果表明:醇提物可使肾虚小鼠的体重增加,灌胃给药组超氧化物歧化酶(SOD)活力降低,显示醇提物有调节清除自由基的作用(p<0.001);组织切片显示,肉苁蓉灌胃给药组的生精小管内精子数增多,表示醇提物使肾虚小鼠的生精能力提高。低剂量醇提物可显著降低雌性糖尿病小鼠的血糖水平(p<0.05),醇提物可调节糖尿病造成的总蛋白水平异常(p<0.05)。因此,肉苁蓉醇水提取物对雄性肾虚小鼠模型具有生殖改善作用,同时对糖尿病小鼠模型的血糖水平有一定的影响。关键词:荒漠肉苁蓉;氢化可的松;肾虚;降血糖中图分类号 R285.5    文献标识码 A 文章编号 1007-7731(2021)13-0023-06肉苁蓉产自我国西部地区沙漠地带,是一种特殊的寄生植物,含有多种活性成分,如苯乙醇苷类、环烯醚萜类、木脂素类、多糖、氨基酸、生物碱、微量元素(~等。相关研究显示,肉苁蓉除了具有调节内分泌国、抗疲劳、润肠通便、神经保护等作用之外,还可以起到雄性激素的作用”。目前,关于肉苁蓉醇提物对肾虚小鼠的作用研究主要集中于激素水平,且国内外未见研究醇提物对小鼠血糖水平的影响,只有少数研究报道包含肉苁蓉的复方药剂具有降糖作用。2018年4月,国家卫计委将肉苁蓉(荒漠)列为药食同源的物质,大大增加了其市场与临床应用的潜力,但目前市场上关于肉苁蓉的功能产品还不是非常知名,人们对于肉苁蓉的认识并不多,主要产品仍为肉苁蓉酒、茶包一类。随着中医不断被国人所重视,中药的相关基础研究也显得尤为迫切。肉苁蓉作为我国传统的名贵中药,具有广泛的研究价值和开发应用的潜力。本研究拟建立氢化可的松诱导的雄性肾阳虚小鼠,记录小鼠自灌胃肉苁蓉后的体重变化,测定血清激素水平和组织酶活力,对小鼠睾丸组织进行病理研究来探究肉苁蓉对肾虚小鼠的影响。建立链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠模型,检测小鼠自灌胃肉苁蓉后的体重和空腹血糖变化,以及血浆总蛋白含量,以探究肉苁蓉对小鼠糖代谢的影响,以期为肉苁蓉这一药食两用的植物资源的研究开发提供试验依据。1 材料与方法1.1 材料与试剂 C57BL/6J雄性小鼠和ICR小鼠,购自上海西普尔-必凯实验动物有限责任公司;链脲佐菌素,上海源叶生物公司;氢化可的松,上海源叶生物公司;野生荒漠肉苁蓉,内蒙古自治区阿拉善地区;戊巴比妥钠,Sigma公司;小鼠游离血清睾酮(T)酶联免疫试剂盒、小鼠血清促性腺激素释放激素(GnRH)试剂盒和丙二醛(MDA)酶联免疫吸附测定试剂盒,均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒,南京建成有限公司;伊红溶液(B液),上海虹桥乐翔医用试剂技术有限公司:苏木素溶液,上海虹桥乐翔医用试剂技术有限公司;通用型组织固定液,武汉赛维尔生物科技有限公司;食用乙醇,江苏省华兴生物科技有限公司。1.2 仪器与设备 MS32000LE电子天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;TDL-5-A离心机,上海安亭科学仪器厂;HH-S恒温水浴锅,江苏国胜实验仪器厂;RE-5299旋转蒸发仪,上海况胜实业发展有限公司;-80℃低温冰箱,HARRIS公司:酶标仪(MR3),赛默飞世尔(上海)仪器有限公司;欧姆龙血糖仪HGM-121,苏州尔达医疗设备有限公司。1.3 方法1.3.1 肉苁蓉提取物的制备 挑选新鲜的肉苁蓉,切片,取100g粉碎,粉碎时以料液比1:2加入蒸馏水,打成糊状匀浆,置于冰箱冷冻存放备用。将肉苁蓉匀浆和52%的食用酒精按1:16的比例混合,65℃水浴加热46min,8000r/mm离心5mm后将滤渣加入同第1次等量的酒精水溶液。同等条件再次水浴加热,2次加入的乙醇水溶液共计10000mL,将2次离心出的上清液进行浓缩,使乙醇蒸发出来,浓缩条件为旋转蒸发仪85℃加热50min,得到2200mL浓缩液,即为肉苁蓉醇提取液。1.3.2 动物模型建造及分组1.3.2.1 肾虚小鼠动物模型 6周龄的C57BL/6J雄性小鼠引进后适应性饲养7d,随机选取5只小鼠作为空白对照组,每天进行灭菌生理盐水皮下注射,0.1ml/只,1d1次,连续10d。其余26只小鼠用氢化可的松皮下注射造模,按照25mg/kg BW(体重)的剂量连续注射10d]。小鼠如果有拱背蜷缩、肢尾冷、精神不振等肾虚症状,则认为氢化可的松诱导雄性小鼠肾虚模型造模成功。肾阳虚小鼠模型建造成功后,空白组和模型组给予等体积的蒸馏水灌胃,低剂量组和高剂量组分别按药物临床用药量的1倍,2倍计算.1d灌胃1次,连续灌胃21d。具体分组情况为:CO空白组(5只),以0.4ml/(kg·BW)的灌胃剂量灌服纯水;MO模型组(8只):以0.4ml/(kg·BW)的灌胃剂量灌服纯水;M1低剂量组(9只),灌胃剂量为1.6ml/(kg·BW)的肉苁蓉醇提取液;M2高剂量组(9只),灌胃剂量为3.2ml/(kg·BW)的肉苁蓉醇提取液。1.3.2.2 糖尿病小鼠模型 8周龄ICR雌性小鼠20只,雄性小鼠21只。雌雄小鼠分别随机分为:空白组(CO),模型组(MO),肉苁蓉低剂量组(M1),肉苁蓉高剂量组(M2),每组各5只或6只,每组灌胃剂量同肾虚组。除空白组(CO)外,其余小鼠8周龄开始每日喂高脂饲料,喂28d后(11周龄)注射链脲佐菌素[120mg/(kg·BW),造模前将ICR小鼠禁食12h。72h后采血测定空腹血糖(前一晚动物禁食)。第1次测血糖未达标,12周龄重复1次实验(注射时间点、剂量均一致),空腹血糖>11.1mmol/L视为糖尿病动物模型造模成功。1.3.3 主要检测指标的测定 每周测量小鼠的体重,每周对ICR小鼠剪尾取血,用血糖检测系统测定空腹血糖水平,并比较各组差异。灌胃实验结束后,心脏采血,血液以3500r/min离心15min。血清分离后,用ELISA法检测C57BL/6J小鼠血清中睾酮(T)、促性腺激素释放激素(GnRH)的激素水平。小鼠断头处死后,速取睾丸组织,称重,以组织重:生理盐水(mgmL)=1:0.9.离心15min,组织上清液冷冻保存备用,酶联免疫吸附测定睾丸组织丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)酶活力,操作均严格按照试剂盒说明进行。ICR小鼠每组抽取3~4个样品取其血浆送往上海实验动物研究中心,对总蛋白水平(TP)进行检测。
  • 2.3 肉苁蓉饮片标准汤剂评价特征参数的测定2.3.1 出膏率:将21.1项下制得的肉苁蓉标准汤剂进行摇匀,精密吸取100mL.置已恒重的蒸发皿(重量为m)中进行水浴蒸干,蒸干后在105℃的烘箱中干燥3h,取出后放置于干燥器中冷却干燥30min,称定重量,记录其重量为m,药材重量为M,按公式“出膏率=(m2-m)x500/(100xM)x100%“计算出膏率,每份样品均平行2份后取平均值。结果(见表2)。2.3.2 转移率:根据以上松果菊苷和毛蕊花糖苷成分含量测定结果,按照转移率的公式分别计算松果菊苷和毛蕊花糖苷成分转移率(转移率=肉苁蓉标准汤剂中指标成分质量/饮片中指标成分质量x100%),每份样品平行2份。结果(见表2)。2.3.3 pH值:将2.1.1项下制得的肉苁蓉标准汤剂进行摇匀·取适量,用pH计测定pH值后取平均值,每份样品平行2份。结果(见表2)。表2 肉苁蓉饮片及其标准汤剂的质量分析结果(n=2)<td width="56" valign="center" style="padding: 0px 1px; border-left-width: 1px; border-left-color: window序号样品松果菊苷/%转移率/%毛裁花苷/%转移率/%出膏率/%pH值肉苁蓉饮片标准汤剂肉苁蓉饮片标准汤剂1GH3.8530.63816.560.8970.11112.3732.664.972GH-26.6761.47422.081.1340.17715.6133.184.643GH-33.3291.48444.580.7260.16823.1427.664.844GH-41.7170.42724.870.3630.04712.9525.074.975GH-52.2980.68129.630.5870.15826.9231.954.696RCR40.3870.04912.660.0250.00624.0055.664.837RCR20.2920.06321.580.0310.00516.1356.645.128RCR20.4580.16435.810.2080.03516.8349.054.989RCR40.6470.07311.280.0870.01314.9450.645.1510RCR40.3990.05112.780.0840.01011.9046.715.0211RCR40.4750.16033.680.1220.01613.1152.744.8612RCR70.3780.10226.980.0290.00620.6947.154.7913RCR81.5190.27818.300.2980.05016.7836.364.3014RCR41.6450.18211.060.5170.07213.93
  • 梁渐崧,潘英杰,陈紫颖,张 英”,吴孟华,曹晖,马志国”1.暨南大学药学院,广东广州510632:2.广东一方制药有限公司,广东佛山528244:3.暨南大学岭南传统中药研究中心,广东广州 510632;4.广东省中药配方颗粒企业重点实验室,广东佛山528244摘要:目的 制备内其学标准汤剂并为其质量控制提供可富方法。方法 依照标准汤刻的制备要水,制备14批肉苁蒙标准汤剂,采用HPLC法测定标准汤制中松果菊苷和毛葛花糖苷含量,计算其转移率,测定汤制的出青车和plH位,并建立内苁蒙标准汤制的UPLC指纹图语。结果14批肉苁蓉标准汤剂中松果菊苷和毛萬花糖普平均转移车分别是22.99%、17.09%,出骨率范围为25.1%~56.6%,plH值范围为4.30~5.15.指纹图语中有6个共有峰,相认了其中的1号峰为松果莉苷3号峰为管花苷A、4号峰为毛蒸花糖苷.5号峰为异毛蒸花糖苷,对14批内苁蓉标准汤制进行相似度评价,其相似度范围在0.789-0.999之间,结论 内苁蓉标准汤刺制备规范,整体均一性良好,质量可控,测定方法精密度、稳定性和重复性良好,相纹图谱相似度高,可为内苁蓉标准汤制的质量控制提供参考。关键词:内苁蓉;标准汤制;松果葡苷:毛其花储苷;指丝图谱;质量评价肉苁蓉为列当科肉苁蓉属植物肉苁蓉 Citanche desertico-la Y.C.Ma 或德赢vwin登录 Cistanche ubaloa(Schenk) R.Wight的干燥带鳞叶的肉质茎”,具有补肾阳,益精血,润肠通便的作用,广泛应用于阳痿,不孕,腰膝酸软,筋骨无力,肠燥便秘等症”。主要含有苯乙醇苷类、苯甲醇苷类、环烯醚萜及其苷类、木质素及其苷类、其他类化合物等”。其中,苯乙醇苷类化合物被认为是肉苁蓉中的主要有效成中药饮片标准汤剂(即标准煎液)是以中医理论为指导、临床应用为基础,参考现代提取方法,经标准化工艺制备而成的单味饮片水煎液。由于标准汤剂没有辅料干扰,没有经过干燥过程,保持与临床应用传统汤剂的一致,且标准汤剂易于通过饮片或提取液的调配试验各种理想浓度。因此中药饮片标准汤剂,作为经典明方制剂的质量基准和衡量中药配方颗粒的标准参照物,以期实现临床疗效的一致性,是目前保障中药安全、有效、稳定的有效形式。目前,暂无关于肉苁饮片标准汤剂研究的文献报道。本实验对14批肉苁蓉制备相应的标准汤剂,并进行肉苁蓉标准汤剂研究,以期建立肉苁蓉质量标志物的核心标本,为肉苁蓉配方颗粒的开发提供实验依据。1 仪器与材料1.1 仪器及设备 Waene2695 高效液相色谱仪(沃特世公司):ME204E万分之一天平(梅特勒-托利多公司):XP26百万分之一天平(梅特勒-托利多公司):Waters Acpity UPLC超高效液相色谱仪(沃特世公司):KQ500E超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。1.2 试剂与材料 松果菊苷对照品(批号:S-003-90403)、管花苷A对照品(批号:G066-81216)、毛蕊花糖苷对照品(批号:M011-81106)、异毛蕊花糖苷对照品(批号:¥473-170325)均购自成都瑞芬思生物科技有限公司,纯度均大于98.0%。色谱纯甲酸,天津市科密欧化学试剂有限公司:色谱纯甲醇,默克股份有限公司:实验用水为实验室超纯水系统,默克股份有限公司:其它试剂均为分析纯。本研究共收集市售14批肉苁蓉饮片,经暨南大学马志国教授鉴定为列当科肉苁蓉属植物肉苁蓉 Cistanche deserticolaY.C.Ma 或德赢vwin登录 C tubalosa(Schrenk)Wight的干燥带鳞叶的肉质茎。样品信息(见表1)。2 方法与结果2.1 标准汤剂和供试品溶液制备2.1.1 肉苁蓉标准汤剂的制备:根据《医疗机构中药煎药室管理规范、《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》、《中药饮片标准汤剂》规定,取肉苁蓉饮片100g·置电陶瓷壶中,加水煎煮两次,第一次煎煮加水9倍,浸泡30min,武火(500W)加热煮沸后,改文火(200W)保持微沸,继续煎煮60min,煎液经350目筛网趁热过滤。第二次加水7倍量,武火加热煮沸后,改文火保持微沸,继续煎煮40min,煎液用350目筛网趁热过滤,合并两次煎液。将煎液转移至2000ml圆底烧瓶中,采用旋转蒸发仪减压低温浓缩(温度:60℃:真空度:-0.10MPa)定容至500ml,摇匀。表1 肉苁蓉饮片样品信息序号饮片基原产地购白批号编号1GH4管花新新疆达泽红花180907肉苁蓉药业有限公司2GH-2管花新新疆达泽红花180511肉苁蓉药业有限公司3CH3管花新疆新疆达泽红花180401肉苁蓉药业有限公司4CH4管花新疆达泽红花601061肉苁蓉药业有限公司5CH-5管花新疆达泽红花190302肉苁蓉药业有限公司6RCR4肉苁蓉内蒙古广州清平药材市场201807557RCR-2肉苁蓉内蒙古广州清平药材市场201901218RCR-3肉苁蓉内蒙古广州清平药材市场1902029RCR4肉苁蓉内蒙古广州清平药材市场2018120710RCR-5肉苁蓉 内蒙古广西仁济堂中药66011060饮片有限公司11RCR-6 肉苁蓉内蒙古佛山仁参缘药店201118012RCR-7肉苁蓉内蒙古佛山祈福药店18091513RCR-8肉苁蓉 内蒙古佛山捷康药店181000714RCR-9肉苁蓉内蒙古广东省药材公司08120332.1.2 肉苁蓉饮片供试品溶液的制备:取肉苁蓉饮片粉末(过四号筛)约1g,精密称定,置100mL棕色量瓶中,精密加入50%甲醇50mL,密塞,摇匀,称定重量,浸泡30min,超声处理40min(功率250W,频率35kHz),放冷,再称定重量,加50%甲醇补足减失的重量,摇匀,静置,取上清液,以0.22μm微孔滤膜滤过,即得。2.1.3 肉苁蓉标准汤剂供试品溶液的制备:取肉苁蓉标准汤剂·摇匀,精密量取5ml至50ml量瓶中,加无水乙醇稀释至刻度,摇匀,以0.22μm微孔滤膜滤过,即得。2.1.4 对照品溶液的制备:取松果菊苷对照品、毛蕊花糖苷对照品适量,精密称定,置10ml.棕色量瓶中,用50%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,配制成上述2个成分浓度分别为0.0200.0.02100mg*ml-的溶液,即得混合对照品溶液。2.2 松果菊苷和毛蕊花糖苷成分的含量测定 按照《中国药典》2015年版一部肉苁蓉项下含量测定方法,采用 AgilentZORBAXSB-C,色谱柱(4.6x150mm.5μm),以甲醇为流动相A,以0.1%甲酸溶液为流动相B.梯度洗脱(0~17min。26.5% A:17-20 min,26.5%→29.5% A:20-27 min.29.5% A):流速1.0mL·min;柱温30℃;检测波长330mm;理论板数按松果菊苷峰计算应不低于3000。测定肉苁蓉饮片及其标准汤剂中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量,结果(见表2)。
  • 马正文,樊琼玲,俞金秀,伊力孜热·伊力哈木,由淑萍(新疆医科大学护理学院,乌鲁木齐830011)摘要:目的探讨肉苁蓉苯乙醇总苷(CPhGs)对腹主动脉缩窄术(AAC)后心肌肥厚大鼠的作用及其作用机制。方法 将70只实验大鼠分为7组:正常对照组、模型组、假手米组、缬沙坦阳性药物组(8.3mg/kg)、模型+CPhGs低剂量组(125mg/kg)、模型+CPhGs中剂量组(250mg/kg)、模型+CPhGs高剂量组(500mg/kg),各组10只。对模型组大鼠行AAC术,使大鼠腹主动脉管腔环形缩窄,构建心肌肥厚模型,术后每天灌胃给药1次,持续6周。各组以超声心动图检测大鼠心率(HR)、收缩期间隔厚度(IVSs)、左室收缩末期内径(LVESD)左室厚壁舒张期厚度(LVPWd)、射血分数(EF),碱水解法测量羟脯氨酸(HYP),苏木精-伊红(HE)染色观察心肌细胞的表型、数目、排列方式并进行比较。结果与正常对照组相比,模型组大鼠HR、IVSs、LVPWd、HYP均有不同程度增加(P均<0.05),LVESD均有不同程度的降低(P均<0.05)。与模型组相比,模型+CPhGs低、中、高组大鼠HR、IVSs、LVPWd、HYP均有不同程度下降(P均<0.05),LVESD、EF均有不同程度的升高(P均<0.05),模型+CPhGs高剂量组与缬沙坦阳性药物组各项指标差异均无统计学意义。结论 CPhGs可以抑制AAC术后心肌肥厚的发生,起到保护心肌的作用。关键词:肉苁蓉苯乙醇总苷;心肌肥厚;羟脯氨酸心肌肥厚是多种病理性刺激因素引起的适应性改变四,表现为心肌总量增加、心肌收缩力加强、心室壁厚度增厚等,作为高血压的严重并发症之一,如不对其进行及时干预,则会进一步发展为心率失常、心力衰竭甚至影响到生命。心肌肥厚已成为诱发脑卒中、冠心病等疾病的首要危险因素”。心肌肥厚的预防与治疗至关重要。肉苁蓉主要生长于新疆沙漠地区,因为药效切实被列为中国传统的中药材之中,且有“沙漠人参”之称叫,其主要化学成分有肉苁蓉苯乙醇总苷(cistanche phenylethanoid glycosides,CPhGs)、木 脂素类、生物碱、多糖等。肉苁蓉发挥药性作用的基础为CPhGs的生物活性作用,且CPhGs具有抗衰老、免疫调剂、促进体液分泌和降低心肌细胞损伤的功能。本课题组对大鼠行腹主动脉缩窄术(abdom-inal aortic constriction,AAC)构建心肌肥厚模型,研究CPhGs对AAC术后心肌肥厚大鼠射血分数(EF)、心率(HR)、收缩期间隔厚度(IVSs)、左室收缩末期内径(LVESD)、左室厚壁舒张期厚度(LVPWd)、羟脯氨酸(HYP)及心肌细胞的影响,旨在为心肌肥厚防治领域的发展提供新依据。1 材料与方法1.1 动物 SPF级SD大鼠,健康状况良好,体重180~220g,购于新疆医科大学动物实验室中心,动物生产许可证号:SYSK(新)2016-0003。1.2 主要仪器 电子秤ACS-1.5A(上海友声衡器有限公司)、电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司);飞利浦HD 11 XE超生诊断仪(德国Philips公司);酶联免疫反应检测仪(美国Therom Scientific公司);电子显微镜(上海比目仪器有限公司)。1.3 实验试剂 德赢vwin登录 提取物(购自win德赢官方 ),经高效液相色谱法(HPLC)法检测.CPhGs含量高达92.0%以上;缬沙坦(北京诺华制药有限公司);戊巴比妥钠(德国Meck公司);HYP试剂盒(南京建成生物工程研究所);CMC-Na(西安正天药用辅料有限公司);苏木素(Sigma公司)。1.4 方法1.4.1 分组 将大鼠分为7组:正常对照组、模型组、假手术组、缬沙坦阳性药物组(8.3mg/kg)、模型+CPhGs低剂量组(125mg/kg)、模型+CPhGs中剂量组(250mg/kg)、模型+CPhGs高剂量组(500mg/kg).每组10只。1.4.2 心肌肥厚模型的建立 参照文献[7-9]对模型组大鼠行AAC术构建模型,以2.5%戊巴比妥钠2ml/100g腹腔注射麻醉大鼠,在无菌环境下于剑突下2-3cm处,腹正中切口切开皮肤,暴露腹腔,将腹部脏器一并推向右侧,在右肾动脉上方1.5cm处用两只弯镊剥离并充分暴露腹主动脉,取出置于生理盐水的7号针头,将针头与大鼠腹主动脉平行放置,再用4-0手术线一并结扎,随后抽出7号针头,剪去过长的手术缝线,手术后所有大鼠腹腔注射5000U青霉素防止感染,关闭腹腔。假手术组大鼠在手术时仅将腹主动脉分离,正常对照组不做任何处理。1.4.3 实验受试物干预 手术次日后开始对大鼠进行药物干预,缬沙坦阳性药物组(8.3mg/kg)、模型+CPhGs低剂量组(125mg/kg)、模型+CPhGs中剂量组(250mg/kg)、模型+CPhGs高剂量组(500mg/kg),灌胃给药,每天给药1次,持续6周。1.4.4 超声心动图检查 末次给药24h后,麻醉大鼠后,于前胸及上腹部处备皮,打开超声诊断仪测定各组大鼠心功能指标:HR、IVSs、LVESD、LVPWd、EF。1.4.5 标本的采集与制备 完成超声心动图检测后,处死大鼠,取出心脏,随机取样制成心肌匀浆测定羟脯氨酸(HYP)的含量;将采集好的心尖组织经固定、脱水、透析、HE染色后,把切片置于显微镜下观察。1.4.6 各组大鼠心肌匀浆中HYP的含量检测 腹主动脉采血出处死大鼠后,打开胸腔,取出心脏,立刻使用清水冲洗心脏表面,直到冲洗干净后,擦干表面水分,取心尖组织部位,制成心肌匀浆测定HYP的含量,操作过程严格按照HYP试剂盒说明书操作。1.4.7 显微镜下观察心肌肥厚细胞的病理学变化从4%多聚甲醛中取出固定好的心尖组织,用生理盐水冲洗除去固定液,洗净后逐级脱水处理,脱水后对其进行逐级透明,接着浸入纯石蜡中,等切片平坦后,用擦拭干净的载玻片从水中捞取,矫正位置,擦干多余的水分,HE染色后进行观察,心肌肥厚参照文献[10],分为3级:1级,伴有部分心肌细胞数目减少、排列不规则不整齐;II级,心肌细胞形以肥大为主,绝大部分心肌细胞受损且排列散乱;皿级,单位视野内可见心肌细胞明显增大,排列散乱无序,严重者可出现心肌纤维化。1.5 统计学方法 SPSS21.0软件进行统计学分析,计量指标用均数±标准差以(±)表示;通过单因素方差分析两两比较各组数据,组间比较采用LSD方法检验,检验水准α=0.05。2 结果2.1 CPhGs对心肌肥厚大鼠HR的影响 模型组大鼠HR[(525.9±35.9)次/min]高于正常对照组[(394.1±22.1)次/min]、假手术组[(401.9±19.0)次/min](P均<0.05);模型+CPhGs低、中、高剂量组HR[(499.5±38.2)、(469.7±41.6)、(428.0±36.1)次/min]明显低于模型组[(525.9±35.9)次/min](P均<0.05)。模型+CPGs高剂量组HR与缬沙坦阳性药物组HR[(424.5±29.6)次/min]比较差异无统计学意义。2.2 CPhGs对各组大鼠的心脏彩超指标的影响 与正常对照组和假手术组相比,模型组大鼠的1VSs、LVPWd升高,LVESD、EF降低(P<0.05),与模型组相比,模型+CPhGs各剂量组大鼠的IVSs、LVPWd降低.LVESD、EF升高,随着CPhGs剂量的增加各项指标越接近缬沙坦阳性药物组,其中模型+CPhGs高剂量组与缬沙坦阳性药物组各指标比较差异无统计学意义。见图1、表1。表1 CPhGs对心肌肥厚大鼠的心脏彩超指标的影响组别IVS/mmLVESD/mmLVPWd/mm EF/%正常对照组3.50±0.314.26±0.593.410.25 77.30±8.09假手术组3.45m0.284.38m0.503.45m0.28 78,5214.93模型组4.44=0.384.14-0.5943420.38 68.53x9.40缬沙坦阳性4.10=0.284.19=0.43*3.72-0.38 75,59±7.08药物组模型+CPhGs4.21±0.394.1410.584.270.31* 70.8819.76低剂量组模型+CPhG3.96±0.294.130.394.0410.38* 75.90±4.53中制量组模型+CP%Gs3.91±037 4.22*0.293.71±0.36* 76.38±3.83高剂量组注:与假手术组比较,”P<0.05;与模型组比较,“P<0.05。模型+CPLGs中剂量组模型+CPhGs低剂量组                  模型+CPbGs高制量组图1 各组大鼠超声心动图2.3 CPhGs对心肌肥厚大鼠心肌匀浆HYP含量的影响 模型组大鼠的心肌匀浆中HYP的含量明显高于正常对照组[(0.14±0.014)μg/mgl与假手术组[(0.15±0.013)μg/mg](P均<0.05);阳性药物组大鼠心肌匀浆HYP的含量相对模型组明显下降(P<0.05);模型+CPhGs低、中、高组各组大鼠心肌匀浆中HYP水平[(0.22±0.013)、(0.19±0.020)、(0.18±0.016)μg/ mg]与模型组(0.25±0.014)μg/mg相比均有不同程度下降,且随CPhGs剂量的增加心肌匀浆中HYP的含量下降越明显,其中模型+CPhGs中、高剂量组HYP的含量明显减少,与阳性药物组[(0.17±0.011)μg/mg]差异均无统计学意义。2.4 心肌组织病理学观察结果 模型组心肌组织切片镜下表现:心肌细胞数量明显减少,细胞表型为肥大,且细胞的排列方式杂乱无序;与模型组相比模型+CPhGs低、中、高剂量组细胞数目有不同程度的增加,且细胞排列整齐,其中模型+CPhGs中、高剂量组与缬沙坦阳性药物组差异均无统计学意义。见图2。  正常对照组                                      假手术组                                             模型组                   顺沙坦阳性药物组模型+CPhGs低剂量组    模型+CPhGs中剂量组    模型+CPhG-高剂量组图2 各组大鼠心肌组织病理学观察(HE染色20x10)3 讨论心肌肥厚的早期是代偿性和适应性的,但长期进展会导致心肌及周围血管的纤维化,发生失代偿,使心率衰竭和猝死的发生率增加。肉苁蓉中的CPhGs具有抗衰老、免疫调剂、促进体液分泌和降低心肌细胞损伤的功能。本实验以AAC术构建心肌肥厚大鼠模型,使用CPhGs对模型组大鼠进行干预,研究CPhGs逆转心肌肥厚的作用机制。HR是心脏功能的重要参数,是反映心脏基础功能的指标,具有测量方式简单且易行的优点。本研究结果显示,与模型组相比,模型+CPhGs各剂量组中大鼠HR有不同程度的下降,且本实验发现CPhGs高剂量组大鼠HR变化最显著,这与既往研究结果相似”。这可能与在建模后期,鼠发展为失代偿性心力衰竭有关。研究报道,建模4周即可发生心肌肥厚叫,本研究在建模后进行了时长6周的干预。AAC术,是一种压力超负荷模型构建方法,其通过缩窄腹主动脉,增加心脏后负荷,使心肌发生代偿性肥厚、心室容积增加和心脏扩大。模型后期出现失代偿,发生心力衰竭。CPhGs在一定程度上能起到改善心肌表面硬度和张力的作用,能够有效减缓心肌肥厚的发生。IVSS.LVESD.LVPWd、EF等是超声心动图指标,是反映心肌肥厚、心功能的敏感指标,对心肌肥厚大鼠心脏泵血能力、心腔容量、心肌厚度的判断具有重要的临床意义,相关文献表明IVSs、LVPWd的增加和LVESD、EF的降低,提示心室壁增厚,心腔内径缩小,常发生在心肌纤维化合并心功能严重损失等情况。本实验发现,与正常对照组相比,模型组大鼠的IVSs、LVPWd显著升高.LVESD、EF明显下降,则表明大鼠心腔容量缩小、心肌厚度增加。与模型组相比,模型+CPhGs各剂量组中大鼠IVSs、LVPWd明显降低,LVESD、EF明显升高,其中,CPhGs高剂量组大鼠IVSs,LVPWd下降和LVESD、EF上升最为显著,提示CPhGs能起到改善心功能、心腔容量和心肌组织的功能。目前国内外广泛使用HYP含量表示胶原组织的代谢程度。本实验发现,与正常对照组相比,模型组大鼠HYP的含量明显增多;与模型组相比,模型+CPhGs各剂量组中大鼠HYP含量均有不同程度的降低,CPhGs高剂量大鼠HYP含量减少的最为明显,提示CPhGS能有效降低大鼠心肌组织HYP的含量,起到减轻心脏负荷的作用。心肌细胞数目、表型、排列方式是病理学观察的主要指标。本实验显示,与模型组相比,模型+CPhGs各剂量组大鼠切片中细胞数目均有不同程度的增加,排列有序,且心肌纤维化的程度均有不同程度的降低,其中模型+CPhGs(500mg/kg)剂量组基本看不到纤维化的心肌组织,提示CPhGs能起到保护心肌细胞、维持细胞正常形态、减轻心肌纤维化的功能。综上所述,CPhGs能降低AAC术后大鼠的HR、IVSs、LVPWd、HYP,增加LVESD、EF。随着CPhGs剂 量的变化,逆转心肌肥厚的效果随之发生改变,呈现出剂量与效果正相关的关系,其中模型+CPhGs(500mg/kg)剂量组与阳性药组相比,各项指标接近。提示CPhGs可以抑制AAC术后心肌肥厚的发生,起到保护心肌的作用。

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