摘要通过调查研究，从生产环境、生产技术、产量质量、加工销售、成本效益等方面归纳总结了和田地区德赢vwin登录 生产发展现状，从区位、政策、市场、产业链和宣传方面分析了肉苁蓉产业发展存在的问题，并对今后肉苁蓉产业发展提出了建议，以期为和田地区肉苁蓉产业发展提供参考。关键词德赢vwin登录 ；发展情况；对策；新疆和田肉苁蓉又名大芸（西北地区俗称）、寸芸、苁蓉，为列当科肉苁蓉属一种多年生全寄生植物，其寄主为优良防沙固沙植物梭梭、红柳等。肉苁蓉是我国传统名贵中药材，素有“沙漠人参”之美誉，具有治疗老年痴呆、益智、抗疲劳、调节免疫功能、保肝、通便、补肾壮阳的功效[1-2]。和田地处塔克拉玛干大沙漠南沿，南依高山、北临大漠，独特的气候资源条件使和田成为是肉苁蓉人工栽培的理想区域。近年来，和田地区充分利用丰富的沙漠源，以科技为依托，大面积发展德赢vwin登录 ，德赢vwin登录 产业已成为既能保护生态环境，又能增加农民收入，带动和田第二、三产业发展的特色支柱产业，实现了生态效益、经济效益和社会效益三盈，使和田广阔的沙漠变废为宝[3]。1 产业发展情况1.1 生产环境德赢vwin登录 适宜生长温度为15~25 ℃，适宜生长在pH值8.0~9.5、通透性强、渗水性良好的沙质碱性土中[4]。南疆地区塔克拉玛干沙漠及周边地区和有柽柳属植物分布的荒漠地区，适宜德赢vwin登录 生长[5]。该区域属极端干旱荒漠气候区，海拔800~1 400 m，光热资源丰富，日照时间长，年平均气温11.6~12.4 ℃，年降水量13~48 mm，年蒸发量2 400~2 800 mm，为德赢vwin登录 的种植提供了得天独厚的自然条件，德赢vwin登录 生育期长、无需施化肥、无病虫害。1.2 生产技术德赢vwin登录 肉质茎出土后，即分化花芽、开花、结实，完成其生命周期。种子由春季开花结实后采集分选而来。一般待定植的红柳苗成活后，第2 年即可进行人工接种，宽行行距4 m，窄行行距1~2 m，株距1 m。挖开红柳一侧沙土，采取撒播方式将种子播在红柳毛细根部，覆土即可[6]。生长期间滴灌3~4 次，全生育期按照绿色标准生产。采收2 次，主要集中于春、秋季，一般一丛红柳寄生一窝肉苁蓉。肉苁蓉长至10~20 cm 即可采收，采取采大留小的方式，主要通过人工收获。收获后摊平晾干，以便于保存。1.3 产量和质量和田地区德赢vwin登录 在不同土地上（农田、沙地等）种植，产量有较大差异，一般为4 500~30 000 kg/hm2。科学研究表明，和田地区独特的气候特点造就了德赢vwin登录 中含有的 2 种有效物质———毛蕊花糖苷和松果菊苷，分别较梭梭大芸高7 倍和2 倍。同时，德赢vwin登录 也已经列入2005 年版《中国药典》，市场需求量大大增加。1.4 加工和销售收购企业主要为和田地区当地的帝辰医药生物科技有限公司、天力沙生药物开发有限公司等。企业收购鲜品后进行灭霉灭菌处理，晾晒后加工成切片、泡酒等产品，大部分以原料及初级产品的形式运出。此外，还有药材收购商批量收购干肉苁蓉，运往江浙、河北、安徽、广东以及韩国等地的药材市场销售。市场价格主要依赖国内外市场及龙头企业，波动性较大，低时3~4 元/kg、高时7~8 元/kg。1.5 成本效益通过调研，德赢vwin登录 种植用种量为750 g/hm2，加上水费、播种、人工采挖费用等，成本共计7 500 元/hm2；德赢vwin登录 平均产量为7 500 kg/hm2，市场销售价5 元/kg，平均收入可达到3.75 万元/hm2；扣除成本，平均纯收入在3 万元/hm2左右，已成为当地农民增收的重要途径之一。2 存在的问题2.1 区位上不具优势和田地区深居内陆，相较于内蒙，距药材市场、主要消费区域远，运输、加工成本较高。2.2 政策因素制约产业发展国家正在开展将德赢vwin登录 列入药食同源目录的前期研究论证，现阶段加工企业还无法开发更多品类的保健食品，只能单一提取有效成分，添加人参等材料制作保健药物，价格高昂，普通消费者没有能力消费。同时，在种植环节、收购贷款、税收等方面的扶持政策有限，也是造成产业不能快速发展壮大的原因。2.3 市场发育不健全，缺乏有实力的龙头企业和田地区现有加工企业少，缺乏农民专业合作社，组织化程度较低，导致产品价格容易波动，影响农民种植积极性。缺乏规范的交易市场，交易形式主要是收购商上门收购和种植户主动交售给企业。2.4 产业链短，附加值较低日本、韩国等国家利用和田德赢vwin登录 提取物生产化妆品、生发剂等众多品类产品，具有很好的市场反响。但目前和田现有的加工企业还缺乏各具功能的下游产品，对产品推广、市场开拓造成影响。2.5 宣传力度不够，认知度不足目前，红柳大芸在江苏、浙江、湖北、广东等注重养生的地区深受欢迎；但就全国而言，宣传力度不足、认知度不高，无法与和田的大枣、核桃等产品相提并论。3 发展建议3.1 加快推进药食同源认证进度积极协调食品药品监督部门、卫生部门，进一步加快将德赢vwin登录 列入药食同源目录的步伐，开展德赢vwin登录 新食品原料申报工作，推动产业向纵深发展。3.2 吸引一批大型龙头企业进驻通过招商引资方式，吸引一批大型企业进入和田德赢vwin登录 产业领域；研究给予种植基地、税收减免、贷款贴息等优惠政策，培育和扶持企业做大做强。3.3 多渠道筹措资金，形成产业发展合力积极争取国家、援疆省市、社会资金，加大对德赢vwin登录 种植（接种、滴灌）、人员培训以及产品精深加工等环节的支持力度[7]。3.4 建立新型市场主体鼓励和支持成立德赢vwin登录 农民专业合作社，实行订单生产、保护价收购，确保种植户利益以及在市场上的话语权。3.5 加强与国内外的交流合作给予优惠政策，从国内外引进专业技术团队，帮助指导和发展德赢vwin登录 种植、深加工研究等工作[8]。3.6 加大宣传力度积极开展绿色、有机认证及原产地保护认证、地理标志产品认证等工作；通过展会、电子商务平台等方式推介一批和田德赢vwin登录 产业品牌，努力形成和田德赢vwin登录 的区域公用品牌，进一步扩大市场认知度和占有率。4 参考文献[1] 屠鹏飞，姜勇，郭玉海.发展肉苁蓉生态产业推进西部荒漠地区生态文明[J].中国现代中药，2015（4）：298-301.[2] 张博文，石瑾.加大内蒙古肉苁蓉的种植开发力度[J].湿地科学与管理，2004（1）：44-45.[3] 何军.打造30 万亩德赢vwin登录 产业推动和田生态与经济全面腾飞[C]//中国药学会，中国中药协会，和田地委，行署.第六届肉苁蓉暨沙生药用植物学术研讨会论文集.和田：中国药学会，2011.[4] 古丽努尔，玉米提·哈力克，艾尔肯·买提肉孜，等.德赢vwin登录 高产稳产栽培技术研究[J].安徽农业科学，2012，40（2）：755-757.[5] 贾晓光，倪慧，张娟，等.德赢vwin登录 研究及产业发展现状[J].新疆医科大学学报，2012（7）：878-880.[6] 窦长保，濮文成，石文华，等.河西地区肉苁蓉可持续开发利用研究[J].甘肃科技，2011（24）：20-22.[7] 达世彩.张掖市肉苁蓉产业发展现状及对策建议[J].现代园艺，2014（7）：33.[8] 巴哈尔古丽·阿尤甫，郭泉水，徐亚勇，等.德赢vwin登录 发展现状、存在问题和发展建议[J].防护林科技，2010（6）：103-105.

摘要：目的　测定德赢vwin登录 药渣中多糖含量及其抗氧化活性。方法　采用水提醇沉法提取德赢vwin登录 药渣中多糖成分，采用蒽酮硫酸法测定含量，利用二苯代苦味酰基（ＤＰＰＨ）、羟自由基（·ＯＨ）以及铜离子还原能力清除实验综合评价德赢vwin登录 药渣中多糖的体外抗氧化活性，通过红外光谱对多糖进行初步结构鉴定。结果　德赢vwin登录 药渣中多糖含量为０．０２５ ｍｇ／ｇ，当多糖浓度为０．０４ｍｇ／ｍＬ 时，对ＤＰＰＨ 自由基清除率为５９％，Ｖｃ的清除率为８９％，当多糖浓度为０．０３μｇ／ｍＬ时，对铜离子还原能力为６４％，Ｖｃ的还原能力为８８％，当多糖浓度为０．０１５ ｍｇ／ｍＬ时，多糖对羟自由基清除率为７０％，Ｖｃ的清除率为７０％。红外光谱分析表明德赢vwin登录 药渣中多糖提取物中含有α多糖。结论　德赢vwin登录 药渣中多糖含量较高，具有抗氧化活性。关键词：德赢vwin登录 ；多糖；红外光谱；抗氧化活性管花肉从蓉［犆犻狊狋犪狀犮犺犲狋狌犫狌犾狅狊犪（犛犮犺犲狀犽）犚．犠狉犻犵犺狋］为列当科（犗狉狅犫犪狀犮犺犪犮犲犪犲） 肉苁蓉属（犆犻狊狋犪狀犮犺犲犎狅犳犳犻狀犵．犲狋犔犻狀犽）植物，主产于我国新疆，在于田、民丰县有大面积栽培，具有补肾精、益精血、润肠道的功效［１－３］。研究表明德赢vwin登录 中含有苯乙醇苷类、环烯醚萜类、木质素类、多糖类及生物碱类等多种生物活性成分［４］，具有抗氧化、增强机体免疫力、保护肝脏、改善大脑记忆力等药理作用［５－９］。本研究采用水提醇沉法提取德赢vwin登录 药渣中的多糖成分，采用蒽酮硫酸法测其多糖含量，运用红外光谱技术对多糖结构进行初步鉴定，通过３种抗氧化模型测定多糖的抗氧化活性，现报道如下。１　材料与方法１．１　仪器　ＦＡ１００４型分析天平（上海友声衡器有限公司），Ｔ６新世纪型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），ｔｉｇｅ２１ 型红外分光光度计（日本岛津公司）。１．２　试剂　无水葡萄糖（天津市永大化学试剂有限公司，批号：２０１３０２２５），９５％ 乙醇（天津市富宇精细化工有限公司），蒽酮（国药集团化学试剂有限公司，批号：２０１７０４２０），浓硫酸，二苯代苦味酰基（ＤＰＰＨ，上海梯希爱化成工业发展有限公司），新亚铜（上海梯希爱化成工业发展有限公司），醋酸铵（天津市盛奥化学试剂有限公司，批号：２０１３０４１２），硫酸铜（天津市盛奥化学试剂有限公司，批号：２０１４１１０３），氢氧化钠（天津永晟精细化工有限公司），过氧化氢（天津市盛奥化学试剂有限公司），试剂均为分析纯。１．３　药材　德赢vwin登录 药渣２０１８年５月购买于新疆金骏阳光生物科技有限公司。１．４　方法１．４．１　德赢vwin登录 中药渣中多糖提取方法　将德赢vwin登录 药渣粉碎，用９５％乙醇回流脱脂，在８０℃的条件下按照料液比（１∶１０）回流提取２ 次，每次２ｈ，在８０℃的条件下合并滤液浓缩，用９５％乙醇醇沉，４℃过夜。１．４．２　多糖含量测定方法　称取葡萄糖样品２０．０ｍｇ于５０ｍＬ 容量瓶中，制成０．４ ｍｇ／ｍＬ 的葡萄糖标准溶液，分别吸取３、４、５、６、７ ｍＬ 置于５０ｍＬ容量瓶，定容至刻度，分别吸取各个浓度梯度的葡萄糖溶液２．０ ｍＬ 于试管中，另取等量蒸馏水作空白对照，在各管加入０．２％硫酸蒽酮（称取０．１ｇ蒽酮加入５０ ｍＬ 浓硫酸）４．０ ｍＬ，用沸水加热１５ｍｉｎ，取出用冷水冷却至室温，在６２０ｎｍ 处测其吸光度值，以吸光度（犃）为纵坐标（犢），葡萄糖浓度（犆）为横坐标（犡），绘制标准曲线，得回归方程犢＝１６．４５犡－０．２０２４（犚２＝０．９９１１）。吸取德赢vwin登录 药渣中粗多糖溶液２．０ ｍＬ 于１０ ｍＬ 具塞试管中，按上述方法测定样品溶液中多糖含量。１．４．３　红外光谱分析　将多糖与溴化钾按１∶１００的比例均匀混合，充分研磨，取适量用压片机压片，在４０００～４００ｃｍ－１范围内进行红外光谱扫描，对多糖结构进行初步鉴定。１．４．４　德赢vwin登录 药渣中多糖的抗氧化活性研究１．４．４．１　ＤＰＰＨ 自由基清除能力测定　称取４０ ｍｇＤＰＰＨ 试剂，用无水乙醇溶解定容于２５０ ｍＬ 容量瓶内，配置成浓度为２×１０－４ ｍｏｌ／Ｌ 的溶液。取５支具塞试管依次加入不同浓度的样品溶液各２ ｍＬ及２×１０－４ ｍｏｌ／Ｌ 的ＤＰＰＨ 溶液，加入１ ｍＬ 无水乙醇使反应总体积为５ｍＬ，摇匀，避光放置３０ｍｉｎ，在５１７ｎｍ 处测定吸光度（Ａｉ），按公式ＤＰＰＨ 清除率／％＝Ａ０－（Ａｉ－Ａｊ）／Ａ０×１００％（式中：Ａ０ 为无水乙醇２ ｍＬ＋ＤＰＰＨ２ ｍＬ＋ 无水乙醇１ ｍＬ 时的吸光度值；Ａｊ 为无水乙醇２ｍＬ＋待测样品２ ｍＬ＋无水乙醇１ｍＬ 时的吸光度值；Ａｉ 为待测样品２ｍＬ＋ＤＰＰＨ２ｍＬ＋无水乙醇１ ｍＬ 时的吸光度值）计算清除率，以Ｖｃ为阳性对照，每组实验重复３ 次，求平均值。１．４．４．２　铜离子还原能力测定　取０．５ｍＬ 不同浓度的样品液，分别加入０．０１ｍｏｌ／ＬＣｕＳＯ４ 和７．５ｍｍｏｌ／Ｌ新亚铜试剂各０．１２５ｍＬ混合，再加入０．２ｍｏｌ／ＬｐＨ值为７．０的ＮＨ４Ａｃ缓冲液至总体积为１．０ ｍＬ，摇匀，静置３０ｍｉｎ，在４５０ｎｍ 波长处测定吸光度，按公式相对总还原百分率／％＝（Ａ－Ａ０）／（Ａｍａｘ－Ａ０）×１００％ （式中：Ａ０为不加样品时的吸光度值；Ａｍａｘ为在系列样品溶液中溶液浓度最高时的吸光度值；Ａ 为样品在４５０ｎｍ 处的吸光度值）计算还原百分率。以Ｖｃ为阳性对照，每组实验重复３ 次，求平均值。１．４．４．３　羟自由基清除能力测定　取５支具塞试管依次向其中加入２．０ ｍｍｏｌ／Ｌ 的ＦｅＳＯ４ 溶液２．０ｍＬ，１．０ ｍｍｏｌ／Ｌ 的Ｈ２Ｏ２２．０ ｍＬ，振荡，摇匀，再加入６．０ ｍｍｏｌ／Ｌ 水杨酸３．０ ｍＬ，摇匀，于３７℃水浴加热１５ｍｉｎ，在５１０ｎｍ 处测定吸光度（Ａ０），然后分别向５ 支试管中加入待测样品０．２、０．４、０．６、０．８、１．０ ｍＬ，再分别加入超纯水０．８、０．６、０．４、０．２、０ｍＬ，摇匀，３７℃下水浴加热１５ ｍｉｎ，在５１０ｎｍ 处测定吸光度（ＡＸ），按公式·ＯＨ 自由基清除率／％＝（Ａ０－ＡＸ）／Ａ０×１００％ 计算清除率。以Ｖｃ为阳性对照，每组实验重复３次，求其平均值。２　结果２．１　德赢vwin登录 药渣中多糖的含量　按“１．４．２”项下方法测定德赢vwin登录 药渣中多糖含量为０．０２５ｍｇ／ｇ。２．２　德赢vwin登录 药渣中多糖结构分析　在４０００～６５０ｃｍ－１有多糖类物质的特征吸收峰，在３５００～３２００ｃｍ－１处有１ 个强和宽的吸收峰，为多糖上·ＯＨ的吸收峰。在２９１０ｃｍ－１处出现的峰为ＣＨ的变角振动，和ＣＨ 伸缩振动形成的糖类特征吸收峰。在１６０４ｃｍ－１ 处出现的峰为ＣＯ 吸收峰，在８４０ｃｍ－１处出现的峰为α型糖苷键的特征吸收峰，说明提取物为α多糖。以波数为横坐标（犡），透过率为纵坐标（犢）绘制红外光谱图，见图１。２．３　德赢vwin登录 药渣中多糖体外抗氧化活性　当多糖浓度为０．０４ｍｇ／ｍＬ 时，对ＤＰＰＨ 自由基清除率为５９％，相同浓度阳性对照品Ｖｃ 的清除率为８９％；当多糖浓度为０．０３μｇ／ｍＬ 时，对铜离子总还原百分率为６４％，相同浓度阳性对照Ｖｃ的还原率为８８％；当多糖浓度为０．０１５ ｍｇ／ｍＬ，对·ＯＨ 自由基清除率为６０％，相同浓度阳性对照Ｖｃ的清除率为７０％，见图２－４。３　讨论目前对德赢vwin登录 的研究主要集中在其醇提物的化学成分及药理作用方面，如苯乙醇苷类在体外对黑色素瘤细胞抑制率达到９０％以上，对人体内黑色素瘤生长的抑制率达到５０％以上，对德赢vwin登录 水提物的研究主要在多糖成分的提取和含量测定［１０－１４］。本研究对德赢vwin登录 药渣进行二次利用，从药渣中提取多糖类成分，提高了德赢vwin登录 药材的利用率，通过３种抗氧化模型研究德赢vwin登录 药渣中多糖成分的抗氧化活性，为更好地开发利用德赢vwin登录 多糖的生物活性打下了实验基础。参考文献：［１］　王鑫彤，王未，吴慧玉，等．肉苁蓉多糖水解产物单糖组分的气相色谱法测定［Ｊ］．江苏大学学报（医学版），２０１６，２６（３）：２５４２５７．［２］　蒋媛，李玉婷，周振华，等．德赢vwin登录 中的苯乙醇苷的提取工艺的优化［Ｊ］．饮食保健，２０１７，４（１６）：４５４６．［３］　吴至久，唐学贵，何德才．补中益气汤加味治疗直肠粘膜内脱３０例临床观察［Ｊ］．川北医学院学报，２００４，１９（４）：１０２１０３．［４］　龚立冬，曹玉华，侯建霞，等．毛细管电泳电化学检测法研究肉苁蓉多糖的单糖组成［Ｊ］．中国中药杂志，２００７，（１９）：２０７３２０７５．［５］　宋志宏，屠鹏飞，赵玉英，等．德赢vwin登录 的苯乙醇苷类成分［Ｊ］．中草药，２０００，３１（１１）：８０８８１０．［６］　王虎，李文伟，蔡定芳，等．肉苁蓉提取物对帕金森病细胞损伤模型的保护作用［Ｊ］．中西医结合学报，２００７，４（４）：４０７４１１．［７］　张杰，赵天翼，李鸿钰，等．德赢vwin登录 提取物中化学成分研究［Ｊ］．海峡药学，２０１６，２８（１０）：３９４１．［８］　李媛，宋媛媛，张洪泉．肉苁蓉的化学成分及药理作用研究进展［Ｊ］．中国野生植物资源，２０１０，２８（１）：７１１．［９］　蔡鸿，鲍忠，姜勇，等．不同产地德赢vwin登录 中有效成分的定量分析［Ｊ］．中草药，２００７，３８（３）：４５２４５５．［１０］　杨太新，张喜焕，蔡景竹．德赢vwin登录 松果菊苷次生代谢部位研究［Ｊ］．中国中药杂志，２００７，５２（２４）：２５９１２５９４．［１１］　任璐，顾小红，汤坚，等．栽培德赢vwin登录 中苯乙醇苷的乙醇提取工艺［Ｊ］．食品与生物技术学报，２００６，２４（３）：３３３６．［１２］　陈敏，肖苏萍，崔光红，等．德赢vwin登录 中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量测定［Ｊ］．中国中药杂志，２００５，５０（１１）：８３９８４１．［１３］　李莉，曹进．分光光度法测定肉苁蓉多糖含量［Ｊ］．食品安全质量检测学报，２０１７，８（７）：２４１９２４２３．［１４］　刘国库，屠鹏飞，杨太新，等．德赢vwin登录 的生物学研究进展［Ｊ］．中国现代中药，２０１５，１７（４）：３９９４０５．

［摘要］ 目的: 建立德赢vwin登录 提取物正丁醇残留量的检测方法，优选残留正丁醇的最佳去除工艺。方法: 以正丁醇残留量为考察指标，运用气相色谱法测定正丁醇残留量，采用正交试验方法，优选最佳的残留正丁醇去除工艺。结果: 正丁醇残留量检测方法平均回收率为100. 5%，ＲSD 值为1. 83%。德赢vwin登录 提取物残留正丁醇最佳去除工艺为每次加水0. 8 倍，80 ℃旋转蒸发3 次，测得正丁醇残留量符合《中华人民共和国药典》规定限量标准。结论: 本正交设计试验所得的正丁醇残留量检测方法准确可靠，优选的正丁醇去除工艺简便、可行，为后续研究提供参考。［关键词］ 德赢vwin登录 提取物; 正丁醇; 残留量; 气相色谱法德赢vwin登录 Cistanche tubulosa( Schenk) Ｒ. Wight为列当科植物，具有壮阳补肾、益精血、润肠通便等功效［1］。主要分布于新疆南疆的塔克拉玛干沙漠及其周围地区，是新疆特色植物资源，主产于塔里木盆地，资源较丰富，栽培技术成熟［2］。目前已收载于《中华人民共和国药典》。目前从德赢vwin登录 中分离得到的化合物主要有苯乙醇苷类、木脂素类、环烯醚萜苷类化合物等。现代药理研究表明，德赢vwin登录 中苯乙醇苷类化合物具有补益［3］、抗氧化、保肝和神经保护作用［4-5］。朱乃亮等［6］研究表明，德赢vwin登录 中苯乙醇苷类成分含量明显高于其他肉苁蓉，且苯乙醇苷类成分含量明显高于环烯醚萜苷类成分。王毓杰［7］采用大孔树脂从德赢vwin登录 中制备出苯乙醇苷化合物，筛选出稳定可行的纯化工艺。李承花等［8］采用反相高效液相色谱法( ＲP-HPLC) 同时测定了德赢vwin登录 中4 种苯乙醇苷的含量。近年来研究发现，德赢vwin登录 中苯乙醇苷类成分在神经保护和抗神经退行性疾病方面，尤其是在抗老年痴呆方面具有良好的应用前景，已成为人们研究的热点。课题组前期通过体内外药效筛选表明，德赢vwin登录 中的苯乙醇苷类化合物毛蕊花糖苷对冈田酸诱导的Alzheimer 病细胞模型具有保护作用、对东莨菪碱诱导的小鼠记忆功能障碍模型具有拮抗作用、对D-半乳糖制备衰老模型具有拮抗作用，并从整体动物、细胞以及分子生物学水平开展了毛蕊花糖苷抗AD 作用机制的研究。目前已对其制备工艺进行系统研究，其中正丁醇萃取德赢vwin登录 ，从而获得纯度较高的中间品是关键的环节，正丁醇萃取后，减压浓缩得到含量较高的含毛蕊花糖苷萃取物。然而， 《中华人民共和国药典》中将正丁醇列为第三类溶剂，虽然毒性低，但是正丁醇大量残留会对皮肤和呼吸系统造成刺激，还会引起全身不适。因此，为控制最终产品的质量，保障药物的用药安全，完善德赢vwin登录 有效成分毛蕊花糖苷的富集工艺，使其萃取物中正丁醇的残留量不超过《中华人民共和国药典》规定的限度。1 材料1. 1 仪器GC-2010 高效气相色谱仪( 日本岛津公司) ;BS224S 电子天平( 赛多利斯科学仪器北京有限公司) ; S2840HP 超声波清洗器( 上海亚荣科导超声仪器有限公司) ; DHG-9123A 电热恒温鼓风干燥箱( 上海精密试验设备有限公司) ; N-1200B 旋转蒸发仪( 上海爱朗仪器有限公司) ; SHZ-24 水浴恒温振荡器( 上海梅香仪器有限公司) 。1. 2 试药德赢vwin登录 购自新疆麦迪森维药有限公司( 批号: 20161211) ; 德赢vwin登录 提取物由新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所药剂研究室制备( 德赢vwin登录 经65%乙醇提取后，提取液减压浓缩、干燥制备得到干浸膏，批号: 20170603，干浸膏水溶解混悬后，正丁醇萃取，收集正丁醇层，浓缩干燥即得) ; 正丁醇、甲醇( 天津市富宇精细化工有限公司，色谱纯) ; 其他试剂为分析纯; 去离子水。2 方法与结果2. 1 正丁醇去除工艺本工艺采用共沸法对德赢vwin登录 提取物中残留的正丁醇进行去除，即在德赢vwin登录 提取物中加入水为夹带剂，与正丁醇形成水-正丁醇共沸物，降低沸点，从而使德赢vwin登录 提取物中残留正丁醇能够被带出［9］，使药液中正丁醇尽量去除。2. 2 因素与水平选取旋蒸温度( A) 、加水量( B) ( 以德赢vwin登录 提取物的体积倍数计) 及加水次数( C) 作为本试验考察因素，以去除后的残留正丁醇残的量为考察指标，采取正交试验设计，优选得到最佳的去除残留正丁醇的工艺。2. 3 正交试验方法根据正交设计试验中因素及水平，将100 mL 德赢vwin登录 提取物减压蒸出正丁醇-水混合液，观察少有或没有溶剂蒸出时，视为正丁醇去除效果能够满足要求，用甲醇将所得的浓缩物溶解至100 mL 容量瓶中并定容，测定其中正丁醇的含量。2. 4 正丁醇残留量测定2. 4. 1 色谱条件Agilent DB-WAX 色谱柱( 30 m ×0. 32 mm，0. 5 μm) ，FID 检测器; 进样口温度:220 ℃; 检测口温度: 240 ℃; 恒温程序: 温度35 ℃，保持15 min，进样量1 μL，进样方式为不分流进样。2. 4. 2 对照品溶液的制备取50 mg 正丁醇溶液，精密称定，置于100 mL 量瓶中，用色谱甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。2. 4. 3 供试品溶液的制备取所制溶液约1. 0 g，精密称定，置于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。2. 4. 4 线性关系考察精密量取2. 4. 2 项下配置的正丁醇对照品溶液适量，分置于10 mL 量瓶中，配制成质量浓度分别为0. 05、0. 5、5、50、100、150 μg·mL －1的待测样，甲醇定容，摇匀，依次精密吸取1 μL，注入气相色谱仪，以峰面积为纵坐标，以对照品质量浓度为横坐标，进行线性回归，得线性方程Y =13 609X + 13 095 ( r = 0. 999 5 ) ，表明正丁醇在0. 05 ～ 150 μg·mL － 1线性关系良好。2. 4. 5 精密度试验精密吸取同一对照品溶液按照2. 4. 1 项下色谱条件进行分析，连续进样6 次，得正丁醇峰面积的ＲSD 为1. 74%，表明仪器精密度良好。2. 4. 6 稳定性试验取正交试验1 号样品母液，依据2. 4. 1 项下色谱条件，分别在0、2、4、6、8、10 h进样检测，计算ＲSD 为1. 48%，表明其在10 h 内稳定性良好。2. 4. 7 重复性试验精密称取正交试验1 号样品母液6 份各1. 0 g，依据2. 4. 1 项下色谱条件进样，计算ＲSD 为1. 51%，表明方法重复性良好。2. 4. 8 加样回收率试验精密吸取9 份正交试验1 号样品母液约0. 5 g，精密称定，精密加入100 μg·mL － 1的对照品溶液2. 25 mL，置10 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，按照2. 4. 1 项下色谱方法进样测定，得平均回收率为100. 5%，ＲSD 为1. 83%，表明方法准确、可靠。2. 4. 9 最低检出限及定量限采用逐步稀释法进行测定，以信噪比约为3∶1 时计算最低检出限，以信噪比约为10∶1 时计算定量限，结果正丁醇的最低检出限为25 ng·mL － 1，定量限为40 ng·mL － 1。2. 4. 10 正交试验样品测定依次在2. 4. 1 色谱条件下重复2 次测定正交试验制备得到的样品，以峰面积和2. 4. 4 中的线性方程计算出供试品浓度，由公式( 1) 可计算出正交试验样品中的正丁醇含量，并得到最佳的德赢vwin登录 提取物残留正丁醇去除工艺。由方差分析结果可知，旋蒸温度、加水量和旋蒸次数均显著影响德赢vwin登录 提取物中残留正丁醇的去除。直观分析结果表明，各因素对德赢vwin登录 提取物中正丁醇残留量影响顺序为C ＞ A ＞ B。因此，确定去除德赢vwin登录 提取物中残留正丁醇的最佳工艺为A2B3C3，即80 ℃减压浓缩3 次，每次加水量为0. 8 倍，见表1 ～ 2。2. 4. 11 最佳工艺验证实验取德赢vwin登录 提取物3 份，按最佳工艺操作，正丁醇质量分数分别为0. 000 5%、0. 000 5%、0. 000 9%，平均值约0. 000 6%。3 讨论3. 1 正丁醇去除方法的选择目前药物制剂中残留有机溶剂的去除工艺常用的有生物膜萃取法、共沸法以及超临界二氧化碳萃取法等［10-12］。其中共沸法是通过加入蒸馏水，在加热的条件下，蒸馏水与提取物中残留的正丁醇形成水-正丁醇共沸物，新形成的共沸物的挥发性明显比水和正丁醇的挥发性好，因新的共沸物与原来的溶液中的各组分完全不同，它的挥发不影响原溶液的质量; 同时共沸法对设备要求不高，简单的蒸馏装置即可完成，操作简便、效率高，对共沸试剂的质量要求也不高，可同时分离多组分化合物，达到去除有机试剂的目的，尤其是对难分离、沸点相近的物质，也能够实现很好的分离，可操作性强［13］。共沸法作为有效的分离手段主要应用在醇类脱水、稀酸回收、酯类生产等实际生产过程中。目前已有研究报道采用共沸法去除天舒滴丸、六味生物制剂制备过程中残留的正丁醇溶剂［14-15］。德赢vwin登录 有效成分的提取过程中用到了大量的水饱和正丁醇，因此，本研究采用共沸法去除德赢vwin登录 提取物中残留正丁醇并进行工艺优化，以最大限度的去除残留正丁醇，达到《中华人民共和国药典》要求标准。3. 2 色谱条件的选择本研究对气相色谱条件进行了考察，在选择气相色谱柱时，首要考虑的是固定相在待分析供试品和固定相功能团之间有不同的相互作用关系，因此应该尽量多了解色谱柱和待分析的供试品的特点。色谱柱的选择应按照“相似相溶”的基本原理，如被分离的供试品中既有极性物质，又有非极性物质，则沸点相近的极性物质先被分离出来; 被分离的供试品如水、醇等，能够形成氢键，供试品中各组分与色谱柱之间主要是氢键作用力，各组分则按照与色谱柱形成的氢键能力的大小而被先后分离出来，这种供试品则可以选择氢键型色谱柱。如被分离的供试品是极性物质，一般选择极性色谱柱，极性小的先被分离。正丁醇为极性大的有机溶剂，因此本研究中选用极性色谱柱。另外，柱温对分离效能和分析速度影响也很大，是气相色谱法检测中很关键的参数。提高色谱柱的柱温可缩短分析时间，保留时间提前; 降低色谱柱的柱温，则色谱柱对分离的化合物柱选择性更大，有利于提高供试品中各组分的分离度，检测结果的稳定性也得到了提高，延长色谱柱的使用寿命。一般采用色谱柱的柱温考虑等于或高于待测物的平均沸点10 ℃左右。本研究中通过改变柱温，以调节正丁醇色谱峰的保留时间、峰形和分离度，最终采用恒温程序35 ℃。进样方式选择上，一般分流进样适合于可挥发性的供试品，不分流进样的灵敏度明显高于分流进样，但由于气相色谱进样口的温度、色谱柱的初始温度等参数都与溶剂的沸点有直接的关系，不分流进样对供试品溶剂要求较为严格，一般溶剂色谱峰的峰较大，易覆盖供试品色谱峰，只有溶剂的极性与供试品的极性相匹配，才能保证溶剂在被测供试品出峰之前就出峰，而选择高沸点溶剂比低沸点溶剂更有利于分析供试品，本研究中的测定对象，正丁醇的沸点是117. 7 ℃，沸点较高，采用不分流进样方式，适当改变初始温度，实现固定相聚焦，有利于获得可靠、可信的分析结果，还能够缩短分析时间，因此本研究中选择不分流进样方式。4 结论与展望实验结果表明，各因素对德赢vwin登录 提取物中正丁醇残留量影响顺序为C ＞ A ＞ B，提取物经优选的最佳去除工艺为A2B3C3，即80 ℃减压浓缩3次，每次加水量为0. 8 倍，经处理后，验证实验结果测得残留正丁醇平均质量分数为0. 006 6‰，远低于《中华人民共和国药典》规定的限度。因此，本研究所优选的德赢vwin登录 提取物中萃取后残留有机溶剂去除工艺及正丁醇残留量检测方法可应用于生产的内控质量标准，具有成本较低，操作简便，安全等特点，实际应用价值较大。中药所含成分复杂，在满足其中的有效成分能都够提取的同时保证有机试剂的残留量低于《中华人民共和国药典》限度，从而保证药物使用的安全性。目前有机溶剂萃取法被越来越多地应用于中药中化合物提取与分离，而残留溶剂的去除与残留量检测是当前新药研发及其质量控制中必须要解决的问题，也是提高中药有效成分提取物质量标准的关键。本实验优选的去除德赢vwin登录 有效部位提取物中正丁醇的方法，也为其他同类工艺研究提供参考。参考文献［1］ 国家药典委员会． 中华人民共和国药典: 一部［M］．北京: 中国医药科技出版社，2015: 135．［2］ 巴哈尔古丽·阿尤甫，徐业勇，郭泉水，等． 德赢vwin登录 资源、贸易与人工培植的调查与分析［J］． 中国野生植物资源，2013，32( 2) : 47-50．［3］ 杨建华，胡君萍，热娜卡·斯木，等． 肉苁蓉苯乙醇总苷对酪氨酸酶活性的抑制作用［J］． 华西药学杂志，2010，25( 5) : 533-535．［4］ 宋光西，马玲云，魏峰，等． 苯乙醇苷的分布及药理活性研究进展［J］． 亚太传统医药，2011，7( 4) : 169-171．［5］ ZHAO Q，GAO J P，LI W W，et al． Neurotrophic and neurorescueeffects of echinacoside in the subacute MPTP mousemodel of Parkinson’s disease［J］． Brain Ｒes，2010，1346:224-236．［6］ 朱乃亮，徐荣，吴海峰，等． 荒漠肉苁蓉和德赢vwin登录 指纹图谱比较研究［J］． 中国药学杂志，2016，51( 13) : 1116-1119．［7］ 王毓杰． 德赢vwin登录 中苯乙醇苷的提取和大孔吸附树脂纯化工艺研究［J］． 中草药，2014，45( 16) : 2344-2347．［8］ 李承花，刘婧慧，徐珍霞． ＲP-HPLC 同时测定德赢vwin登录 中4 种苯乙醇苷的含量［J］． 药物分析杂志，2010，30( 6) : 1003-1006．［9］ ZHU H J，ＲEN X Y，WANG J X，et al． Integrated OMICSguided engineering of bio-fuel butanol-tolerance in photosyntheticSynechocystissp． PCC 6803［J］． Biotechnol biofuels，2013，6( 106) : 14．［10］ 李小兵，钟运斌，龚红梅，等． 粗粒盐酸土霉素生产中正丁醇的回收利用［J］． 江西中医学院学报，2005，17( 4) : 59．［11］ 曹永民，陈玉奎． 一种去除原料中有机溶剂残留的方法:CN201510749659． 1［P］． 2016-02-24．［12］ 胡忠． 利用膜分离技术回收正丁醇/水混合液的工艺研究［J］． 广西化工，1998，27( 3) : 12-15．［13］ 李志卓，姜占坤，张善鹤． 共沸精馏技术研究及应用进展［J］． 山东化工，2015，44( 3) : 33-39．［14］ 王锦玉，张旭，仝燕，等． 天舒滴丸正丁醇去除工艺优选及正丁醇残留量检测［J］． 中国实验方剂学杂志，2011，17( 10) : 15-17．［15］ 杨霞，郭丽冰，翁志平，等． 六味生物制剂有效部位残留正丁醇去除工艺优选及正丁醇残留量检测［J］． 中药新药与临床药理，2014，25( 1) : 82-85．

摘要：目的：制备德赢vwin登录 提取物，分析主要成分，研究其通便作用。方法：测定德赢vwin登录 提取物中水分、灰分、总蛋白、多糖、总黄酮及总苷的含量；采用斑马鱼肠道染色荧光模型，观察德赢vwin登录 对斑马鱼肠蠕动的促进作用。结果：德赢vwin登录 提取物中的多糖是主要成分，含量为40.27%，总苷和总黄酮总含量近25%，另外含有少量的蛋白成分（7.61%），水分和灰分总含量不高于8%；德赢vwin登录 提取物在浓度为200μg/mL、667μg/mL 和2000μg/mL 时对斑马鱼肠蠕动均有促进作用，呈现浓度依赖性，最高促进率可达23.26%，且在所有浓度下没有对斑马鱼造成死亡。结论：此提取物安全无毒，并且保证药效，可开发成预防或治疗便秘的保健食品或者药品。关键词：德赢vwin登录 主要成分润肠通便斑马鱼尼罗红随着饮食结构的改变及精神心理和社会因素的影响，便秘发病率有增加趋势，困扰越来越多的人[1， 2]。据统计，便秘在人群中的患病率高达27%，且有增加趋势[3]。便秘患者除会感到身体不适外，还有可能伴有失眠、焦虑、抑郁等心理障碍，严重者会出现腹痛、贫血和消瘦等症状[4]。便秘是临床上常见的慢性消化道疾病，通常以排便间隔延长、大便干结、艰涩不畅为主要症状，严重者可导致电解质和酸碱平衡紊乱，引起痔疮、下肢静脉曲张等疾病[5]。长期便秘则可导致肠道细菌发酵产生致癌物质，刺激肠黏膜上皮细胞，产生异形增生，易诱发癌变[6]。因便秘发病率高、病因复杂，患者常有许多苦恼，便秘严重时会影响生活质量[7]。因此，预防和治疗便秘是保证人类健康并提高生活质量的一个重要方面。德赢vwin登录 为列当科植物德赢vwin登录 Cistanche tubulosa（Sehrenk）R. Wight 的干燥带鳞叶的肉质茎，俗称红柳大芸，寄生于怪柳属植物红柳的根上，主要分布于我国新疆北部的和田、奇台、吉木萨尔县以及新疆南部的塔克拉玛干沙漠周围地区，以和田地区的民丰县和于田县产量最大[8， 9]。德赢vwin登录 具有益精血、补肾助阳、延缓衰老等功能，是我国稀有的名贵中药材，在《神农本草经》中被列为上品，为中医常用的补肾壮阳药物，被人们誉为“沙漠人参”[10]。其主要活性成分为苯乙醇总苷类物质，代表成分为松果菊苷和毛蕊花糖苷，《中国药典》（2005 年版）正式收录[11]。近年来，国内外学者对于德赢vwin登录 的研究非常活跃，主要集中于德赢vwin登录 的免疫调节、神经保护、抗衰老、清除自由基、保肝等功效方面[12]。目前，对于德赢vwin登录 润肠通便药效的研究也有报道，但研究较少。屠鹏飞等对市场上常见的三种肉苁蓉类生药进行了润肠通便的药效比较，结果表明德赢vwin登录 药材的水煎剂可以促进肠蠕动、抑制大肠水分吸收和缩短排便时间[13]。张勇等通过肉苁蓉类药材及其炮制品通便作用比较研究认为，德赢vwin登录 药材的酒制品能增加小鼠小肠的推进度，缩短通便时间[14]。可见，目前对于德赢vwin登录 润肠通便的研究主要停留在对其原药材的方面，而对于德赢vwin登录 提取物用于预防和治疗便秘等疾病的研究尚未见报道。本文将德赢vwin登录 药材煎煮浓缩后，再经醇沉、干燥等工序制备提取物，并经斑马鱼体内实验验证其润肠通便生物活性，为德赢vwin登录 药材开发利用提供理论基础。1 仪器与材料1.1 仪器与试剂：R-210 型旋转蒸发仪和V-700 型真空隔膜泵（美国步琪公司），Milli-Q Reference 纯水机（美国Millipore 公司），XS-205 型1/10 万电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司），FreeZone 型冷冻干燥机（美国Labconco 公司），SMZ645 型解剖显微镜（日本Nikon 公司），AZ100 型电动聚焦连续变倍荧光显微镜（日本Nikon 公司）。乙醇为食品级，水为超纯水，其余试剂为分析纯。1.2 药材：德赢vwin登录 药材购自新疆和田天力沙生药物开发有限责任公司，经台湾“国防”医学院林汉钦教授鉴定为列当科肉苁蓉属植物德赢vwin登录 Cistanche tubulosa（Sehrenk）R. Wight 干燥的肉质茎，符合2015 版《中国药典》一部下规定，样品编号为20151106，储存于杏辉天力（杭州）药业有限公司研究所。1.3 实验动物：斑马鱼胚胎的繁殖以自然成对交配的方式进行，每次交配准备4～5 对成年斑马鱼。在受精6h 和24h 后对胚胎进行清理（移除已死亡胚胎），并根据胚胎的发育阶段挑选合适的胚胎。在温度为28℃条件下，用养鱼用水孵育胚胎（养鱼用水水质：每1L 反渗透水中加入200mg 速溶海盐，电导率为480～510μS/cm；pH 值为6.9～7.2；硬度为53.7～71.6mg/L CaCO3）。因为胚胎可以从卵黄囊中获取营养物质，所以在受精后9d 内不需要喂食。实验完成后，用三卡因甲磺酸对各个发育阶段的斑马鱼进行过度暴露处理，从而将斑马鱼麻醉处死。麻醉处死的操作步骤符合美国兽医协会（AVMA）对动物麻醉处死的规范要求。2 实验方法2.1 德赢vwin登录 提取物的制备：称取100kg 德赢vwin登录 药材，经清洗、浸润60min 后，切片（厚度5~8mm），再加入1000mL 纯化水回流提取3h，提取3 次，合并以上提取液，离心、过滤。滤液用旋转蒸发仪浓缩至密度为1.10g/mL 时停止浓缩，冷却至温度40℃，边搅拌边加入体积浓度为95%的乙醇，以调至醇的体积浓度约为65%。静置过夜，离心、去除上清液，沉淀物经真空干燥得到11.2kg 德赢vwin登录 提取物。2.2 德赢vwin登录 提取物成分测定方法：水分含量测定按照GB/T5009.3-2016[15]；灰分测定按照GB/T 5009.4-2016[16]；蛋白含量测定按照GB 5009.5-2016 中的凯氏定氮法[17]；多糖含量测定采用苯酚-硫酸法[18]；总黄酮含量测定采用硝酸铝比色法[19]；总苷含量测定采用苯乙苷类测定法[20]。2.3 最大非致死浓度（MNLC）的确定：将德赢vwin登录 提取物用养鱼水配制5 个浓度，分别为100μg/mL、211μg/mL、447μg/mL、946μg/mL 和2000μg/mL，同时设空白对照组。每个浓度均处理30 尾斑马鱼，处理期间，记录并统计每组斑马鱼死亡数量并及时移除。处理6h 后，统计各实验组斑马鱼死亡数量，绘制最佳的浓度效应曲线，并使用Origin 统计学软件计算MNLC 值。2.4 对斑马鱼肠蠕动影响的评价：根据“2.3”项下确定的MNLC值，以浓度为MNLC/10、MNLC/3 和MNLC 的3 种浓度的德赢vwin登录 提取物处理经尼罗红喂养的斑马鱼，并设模型组和阳性对照组（多潘立酮），每组浓度（包括模型组和阳性对照组）均处理30 尾斑马鱼。处理6h 后，在荧光显微镜下拍照，每组随机拍摄数量为15 尾，利用NIS-Elements D 3.10 高级图像处理软件分析斑马鱼肠道总荧光信号（S，Total fluorescent signal），肠蠕动促进率=（1-S 药物/ S 模型）×100%。统计学分析采用方差分析和Dunnett s t–检验，P<0.05 表示差异显著。3 结果与分析3.1 德赢vwin登录 提取物的化学成分分析：德赢vwin登录 提取物的化学成分见表1。由表1 可知，多糖是德赢vwin登录 提取物的主要成分，含量为40.27%，总苷和总黄酮总含量近25%，另外含有少量的蛋白成分。3.2 通便实验：斑马鱼是源自印度、巴基斯坦淡水河的一种小型热带淡水鱼，属于鲤科，与人类基因同源性高达85%，其信号传导通路与人类基本近似，生物结构和生理功能与哺乳动物高度相似，现已被美国国立卫生研究院列为继人和小鼠之后的第三大模式生物，近年来广泛被用于疾病模型建立和药物开发[21]。斑马鱼的个体小、易于饲养、胚胎透明易于观察和操作、样品用量少、试验周期短和可实现高通量筛选等优点，且肠道组成与人类非常相似，均由内皮细胞、结缔组织、环状肌和外纵肌组成，可用斑马鱼研究胃肠道生理功能[22]。尼罗红（9-二乙基氨基-5H-苯并[α]吩恶嗪-5-酮）是一种荧光染料，可以标记活体细胞培养中的巨噬细胞、平滑肌细胞中的脂滴，因其无毒性，尼罗红染料在脂肪代谢疾病模型中广泛应用于活体染料[23]。当斑马鱼卵暴露于尼罗红溶液中，富含脂肪的组织卵黄囊能被结合，在荧光显微镜下清晰显示。当斑马鱼5～6d 时，大部分卵黄囊被吸收，斑马鱼开始自发肠蠕动摄食，可以观察到肠道中尼罗红的充盈情况，而不被其他组织吸收[24]。当斑马鱼摄入有助于促进肠蠕动的药物或者食物时，肠道荧光强度会减弱，可根据斑马鱼肠道蠕动情况来评价促进肠动力药物的药效。3.2.1 斑马鱼肠蠕动实验测定浓度的确定：德赢vwin登录 提取物用养鱼水配制的100μg/mL、211μg/mL、447μg/mL、946μg/mL 和2000μg/mL 这五个浓度，处理斑马鱼6 h 后，统计斑马鱼死亡数量，如表2 所示。从表2 的实验数据可以看出，斑马鱼在德赢vwin登录 提取物五个浓度下，均没有诱发斑马鱼死亡，可见德赢vwin登录 安全无毒，MNLC 浓度即为2000μg/mL。基于此实验结果，确定斑马鱼肠蠕动实验的三个测定浓度，分别为200μg/mL、667μg/mL 和2000μg/mL。3.2.2 斑马鱼肠蠕动实验结果的分析：将发育至第5 天的斑马鱼幼鱼置于浓度为200μg/mL、667μg/mL 和2000μg/mL 的德赢vwin登录 提取物溶液中，并设置模型组和阳性对照组（多潘立酮：2000μg/mL）。处理6 h 后，观察并在荧光显微镜下拍照，实验结果如图1 所示。肠道呈现强度较高的荧光，说明肠道染色成功。而经浓度为2000μg/mL 多潘立酮处理后的斑马鱼肠道呈现很弱的荧光强度，初步证实造模成功。再经浓度为200μg/mL、667μg/mL 和2000μg/mL 的德赢vwin登录 提取物作用后的斑马鱼肠道的荧光强度信号值也呈现一定的变化，肠道荧光强度信号值如图2A 所示。由图2A 可知，经多潘立酮作用后，荧光强度信号值较低，也验证了阳性对照多潘立酮具有促进肠道蠕动作用。经三种浓度的德赢vwin登录 提取物作用后，荧光强度信号值随着浓度的提高而降低。根据荧光强度信号值，计算德赢vwin登录 提取物对斑马鱼肠道蠕动的促进作用，结果如图2B 所示。从图2B 可以看出，德赢vwin登录 提取物对斑马鱼肠道蠕动具有明显的促进作用，随着浓度的提高，促进作用明显增强，呈现浓度依赖性，在浓度为2000μg/mL 时，促进作用达到了23.26%。由此可见，德赢vwin登录 提取物可以通过促进肠道蠕动，达到润肠通便的目的，也恰好印证了民间对于德赢vwin登录 的功效评价。综上所述，德赢vwin登录 提取物具有较好的润肠通便作用，可以作为较好的润肠通便保健食品或者药品进行开发。对于促进肠道蠕动的机制尚不清楚，因此对其作用机制有待实验研究。此外，人类每天有不同程度的体力和脑力消耗且需要应对各种压力，这种情况下德赢vwin登录 提取物能否表现出润肠通便效果还需探讨。4 结论本文对德赢vwin登录 提取物进行了化学成分分析，结果表明多糖类化合物是德赢vwin登录 提取物的主要成分，含量在40%左右，总黄酮和总苷总含量近25%，还有少量蛋白类成分（7.61%）。斑马鱼体内实验结果显示德赢vwin登录 提取物在浓度为200～2000μg/mL 时均没有诱发斑马鱼死亡，说明德赢vwin登录 安全无毒。此外，斑马鱼肠蠕动实验表明德赢vwin登录 提取物可明显促进肠蠕动，并呈现浓度依赖性，在浓度为2000μg/mL 时，促进率可达23.26%。由此可以证实德赢vwin登录 提取物具有增强肠蠕动和促进排便的作用，但对于德赢vwin登录 提取物的作用机制尚不清楚，有待实验研究。德赢vwin登录 与荒漠肉苁蓉虽是不同种植物，但这两种植物均为列当科肉苁蓉属植物，同科同属植物具有类似的药理活性。据文献报道，荒漠肉苁蓉多糖具有清除自由基、免疫调节、抗衰老、改善脾虚、抗病毒、抗肿瘤、促进造血等多方面的药理活性，也有报道指出荒漠肉苁蓉的胶质多糖可以显著提高小肠推进度，缩短通便时间，有效地对抗阿托品的抑制排便作用，抑制大肠中水分的吸收[25-26]。而多糖也是德赢vwin登录 提取物的主要成分，可以推测多糖是德赢vwin登录 提取物的主要活性成分。对于德赢vwin登录 多糖进一步的成分研究和药理活性探讨正在进行。参考文献[1]刘佃温，刘翔.中西医结合治疗混合型便秘的疗效观察[J].中国中西医结合杂志，2016，36（2）：244-245.[2]邝宁子.功能性便秘中医证型的研究进展[J].新中医，2009，41（6）：121-122.[3]李迪夫.结肠次全切除术与结肠全切除术治疗慢传输型便秘的疗效比较[D].长春：吉林大学硕士学位论文，2016.[4]白玉强，马雁平，高广春，等.失眠症患者的焦虑抑郁状态研究[J].中国现代医药杂志，2001，3（6）：24-25.[5]赵金凤，曲佳乐，皮子凤，等.植物酵素润肠通便保健功能研究[J].食品与发酵科技，2012，48（3）：54-56.[6]叶国英，孙秀琴.大肠水疗治疗便秘的护理[J].当代护士（中旬刊），2002，6：29-30.[7]晓牧.看食物中的防便秘“高手”[J].糖尿病新世界，2013，12：60-61.[8]蔡鸿，鲍忠，姜勇，等.鲜德赢vwin登录 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鲜品化学成分及生物活性的研究[D].沈阳：沈阳药科大学博士学位论文，2011.[12]于连云.肉苁蓉的药理作用及临床应用[J].内蒙古中医药，2016，35（4）：87-88.[13]屠鹏飞，李顺戊，李志新，等.肉苁蓉类润肠通便药效比较[J].天然产物研究与开发，1997，11（1）：48-51.[14]张勇，吴焕，王顺年，等.肉苁蓉类药材及其炮制品通便作用的比较研究[J].中成药，1993，15（5）：20-21.[15]中华人民共和国卫生部、中国国家标准化管理委员会.食品中水分的测定，GB/T5009[S].3-2016.[16]中华人民共和国卫生部、中国国家标准化管理委员会.食品中灰分的测定，GB/T5009[S].4-2016.[17]中华人民共和国卫生部、中国国家标准化管理委员会.食品中蛋白质的测定，GB/T5009[S].5-2016.[18]杨勇杰，姜瑞芝，陈英红，等.苯酚硫酸法测定杂多糖含量的研究[J].中成药，2005，27（6）：706-708.[19]尉芹，王冬梅，马希汉，等.杜仲叶总黄酮含量测定方法研究[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2001，29（5）：119-123.[20]张雷红，堵年生，王青.紫外分光光度法测定肉苁蓉总苷胶囊中苯乙醇苷类的含量[J].新疆医科大学学报，2002，25（4）：407-408.[21]刘敬弢，佟侃，崔景荣.斑马鱼在肿瘤药理学研究中的应用[J].中国药学杂志，2010，45（23）：1800-1804.[22]侯海荣，张姗姗，孙晨，等.低聚果糖和低聚异麦芽糖促进斑马鱼肠道蠕动作用的研究[J].山东科学，2016，29（6）：56-61.[23]石玉新，穆迪，武洪庆，等.微藻油脂含量的几种快速测定方法[J].安徽农业科学，2012，40（21）：11067-11069.[24]周娟，郭胜亚，李春启.建立斑马鱼肠蠕动模型及筛选促胃肠动力药物的方法：中国专利，CN103301480A[P].2013-05-15.[25]高晓霞，陈君，彭艳丽.肉苁蓉多糖药理作用研究概况[J].食品与药品，2015，17（2）：136-139.[26]任璐.栽培德赢vwin登录 中苯乙醇苷的提取与纯化研究[D].无锡：江南大学硕士学位论文，2006.

［摘要］ 探究德赢vwin登录 醇提取物( CTEE) 对缺氧/缺糖再灌注( OGD/Ｒ) 所致的PC12 细胞损伤的抑制作用及潜在机制。实验以OGD/Ｒ 诱导PC12 细胞作为损伤模型，通过MTT 法检测细胞存活率、通过AO/EB 与Hoechst 33258 染色法考察细胞凋亡、通过JC-1 染色法考察线粒体膜电位变化、通过MitoSOX 染色法考察线粒体氧化应激反应，通过Western blot 法考察凋亡相关蛋白( PAＲP， cleaved PAＲP， caspase-3， cleavd caspase-3，Bax，Bcl-2) 的表达，研究了CTEE( 12. 5， 25， 50 mg·L－1 ) 对神经细胞的保护作用。结果显示，CTEE 可以有效保护OGD/Ｒ 诱导的PC12 细胞损伤，并提高PC12 细胞存活率，AO/EB 与Hoechst 33258染色法显示CTEE 可以有效抑制细胞凋亡。此外， JC-1 与MitoSOX 染色法显示CTEE 可显著降低细胞中线粒体的氧化应激及线粒体膜电位的失调，且呈剂量依赖性。同时，CTEE 可明显抑制线粒体凋亡信号通路中关键蛋白caspase-3 和PAＲP 的激活，且明显抑制Bax 的升高和Bcl-2 的下调。以上结果表明，德赢vwin登录 醇提取物对OGD/Ｒ 所致的PC12 细胞损伤具有较好的保护作用，其潜在机制可能是通过抑制线粒体氧化应激及相关凋亡信号通路实现的。［关键词］ 神经损伤; 缺氧/缺糖再灌注; 德赢vwin登录 ; 醇提取物; 线粒体通路缺血性脑中风( ischemic stroke) 是现代社会威胁老年群体的重要致死性疾病，也是当前药物研发的热点领域［1-2］。脑是人体中对氧需求量最高的器官，因此脑缺血常常对脑组织造成十分严重的损伤，并引发脑死亡甚至危及生命。现代研究发现，缺血性脑中风最主要的特点是缺氧状态所诱发的神经细胞内的氧化应激反应，该过程中生成的氧自由基会损伤神经细胞内的线粒体，增加线粒体膜通透性，进而激活下游凋亡信号通路，诱导神经细胞凋亡［3-4］。此外，由于线粒体是合成细胞能量的源头，其功能受损必然会影响到神经细胞功能的发挥，并引起脑功能损伤。因此，以线粒体为靶向的神经保护剂的研发是治疗缺血性脑中风的一个关键方向［5-6］。德赢vwin登录 Cistanche tubulosa ( Schenk ) Ｒ．Wight 是传统中药之一，具有补肾阳、益精血、润肠通便的药理功效。现代药理学研究发现，德赢vwin登录 具有抗氧化、抗衰老、抗凋亡、抗辐射和改善学习记忆等作用［7-9］，特别是对于脑缺血再灌注有很好的保护作用，相关药品苁蓉总苷胶囊主要在临床上用于治疗轻中度血管性痴呆并得到广泛应用［10］。但是关于德赢vwin登录 治疗脑缺血和发挥神经保护的分子药理机制目前还尚不清楚，亟待揭示。因此，本研究旨在探讨德赢vwin登录 醇提取物对缺氧/缺糖再灌注所致的神经细胞损伤的保护作用，特别是探究了德赢vwin登录 发挥神经细胞保护作用的线粒体调控机制，最终为缺血性脑中风的创新药物研发提供全新候选药物及干预策略。1 材料PC12 细胞系购自中国医学科学院细胞中心。德赢vwin登录 95%乙醇提取物由北京大学中医药现代研究中心制备; AO/EB 双染色试剂盒( CA1140)购自北京索莱宝科技有限公司; Hoechst 33258 染色液( C0021) 购自北京索莱宝科技有限公司; 线粒体膜电位染色试剂盒( JC-1) ( C0026) 购自南京碧云天生物技术公司; 结晶紫染色液( DZ0056) 购自北京雷根( Leagene) 生物技术有限公司; MitoSOX 染色试剂盒( S0033) 购自南京碧云天生物技术公司; DMEM 培养基( CM15019) 购自北京中科迈晨( Macgene) 科技有限公司; 胎牛血清购自PAN-Biotech 上海斯信生物科技有限公司( 德国) ; 溴化噻唑蓝四氮唑( MTT) ( Amresco0793) 购自北京中科科奥公司; 蛋白抗体购自CellSignaling Technology 公司( 美国) ; Tanon-5200 Multi凝胶成像分体系统购自上海天能; Sunrise-Basic 酶标仪购自TECAN 公司( 美国) ; 倒置荧光显微镜( IX73)购自OLYMPUS 公司( 日本) 。2 方法2. 1 细胞培养与处理PC12 细胞系用高糖DMEM培养基( 含10%胎牛血清，100 U·L－1 青霉素，100μg·L－1链霉素) 进行传代培养，每2 天传代1 次。将细胞分为空白对照组，缺氧/缺糖再灌注损伤组和不同浓度药物处理组( 12. 5，25，50 mg·L－1 ) 。用1 体积的DMEM 培养液正常培养细胞，构建缺氧/缺糖再灌注损伤模型时，用1 /2 体积的Earle' s溶液替换原DMEM 培养液，并将其置于缺氧盒中孵育4 h。造成缺氧/缺糖损伤后，往1 /2 体积的Earle's溶液中加入3 /2 体积的DMEM 培养液，实现缺氧/缺糖再灌注损伤。2. 2 MTT 法检测细胞存活率PC12 细胞以1×104个/孔接种于96 孔板，模型组诱导缺氧/缺糖再灌注损伤，药物处理组按照上述浓度处理细胞。缺氧后复氧24 h，弃去上清液，并加0. 5 g·L－1MTT 染色，温箱孵育2 h; 加入DMSO 后，酶标仪检测吸光度( A570 nm) 。2. 3 结晶紫染色分析PC12 细胞以5×104 个/孔接种于24 孔板，模型组诱导缺氧/缺糖再灌注损伤，药物处理组按照上述浓度处理细胞。缺氧后复氧24 h，加入4%多聚甲醛固定10 min; 将多聚甲醛吸走，加入PBS 清洗，清洗3 次; 弃去PBS，加入结晶紫染液，染10 min; 将染液吸走，加入PBS 清洗，清洗3次，用倒置显微镜( ×10) 观察细胞形态。2. 4 AO/EB 染色分析PC12 细胞以5×104 个/孔接种于24 孔板，模型组诱导缺氧/缺糖再灌注损伤，药物处理组按照上述浓度处理细胞。缺氧后复氧24 h，加入PBS 清洗，清洗3 次; 弃去PBS，加入200 μL AO/EB( 100 μL AO 和100 μL EB 等体积混合) 染液，避光，染色2 min; 将染液吸走，加入PBS 清洗，清洗3 次，用荧光显微镜观察( ×200) 细胞核形态。2. 5 Hoechst 33258 染色分析PC12 细胞以5×104个/孔接种于24 孔板，模型组诱导缺氧/缺糖再灌注损伤，药物处理组按照上述浓度处理细胞。缺氧后复氧24 h。加入4%多聚甲醛固定30 min; 将多聚甲醛吸走，加入PBS 清洗3 次; 弃去PBS，加入Hoechst33258 染液染色30 min; 将染液吸走，加入PBS 清洗3 次，每次5 min。用荧光显微镜( 激发波长352 nm，发射波长461 nm) 观察( ×200) 细胞核形态。2. 6 JC-1 染色分析PC12 细胞以5×104 个/孔接种于24 孔板，模型组诱导缺氧/缺糖再灌注损伤，药物处理组按照上述浓度处理细胞。缺氧后复氧24h，按试剂盒要求将母液配置成工作液，加入工作液，避光，染色30 min; 将工作液吸走，加入PBS 清洗，清洗3 次，用荧光显微镜( 激发波长514 nm，发射波长529 nm) 观察( ×200) 细胞线粒体形态。2. 7 MitoSOX 染色分析PC12 细胞以5×104 个/孔接种于24 孔板，模型组诱导缺氧/缺糖再灌注损伤，药物处理组按照上述浓度处理细胞。缺氧后复氧24 h，加入PBS 清洗3 次; 弃去PBS，按试剂盒要求将母液配置成工作液，加入工作液，避光，染色20min; 将工作液吸走，加入PBS 清洗3 次，用荧光显微镜( 激发波长488 nm，发射波长525 nm) 观察( ×200) 细胞线粒体形态。2. 8 蛋白免疫印记( Western blot) 分析PC12 细胞经药物处理后，用ＲIPA 裂解液( 含蛋白酶抑制剂) 裂解细胞，得到细胞总蛋白提取液。总蛋白经过定量后，用6%～ 12% SDS-PAGE 分离，湿法转移至PVDF膜上。脱脂奶粉封闭PVDF 膜后加入一抗，室温孵育2 h，充分洗涤后加入二抗，室温孵育1 h。最后加ECL 显色试剂并在凝胶成像系统上拍照。2. 9 统计学分析所有数据用x－ ± s 表示，采用GraphPad Prism 5 统计学软件进行t 检验和单因素方差分析，P＜0. 05 认为有统计学意义。3 结果3. 1 德赢vwin登录 醇提取物保护缺氧/缺糖再灌注所致神经细胞的存活缺氧/缺糖再灌注损伤显著诱导神经细胞存活率降低，而加入德赢vwin登录 醇提取物后，有效逆转了这一过程，在12. 5，25，50 mg·L－13 个剂量下，德赢vwin登录 醇提取物对神经细胞的存活率具有显著提升作用，表明在此实验条件下，德赢vwin登录 醇提取物具有较好的抗缺氧/缺糖再灌注所致神经细胞损伤作用; 而德赢vwin登录 醇提取物在相同剂量条件下对神经细胞存活无明显毒性( 图1) 。此外，从结晶紫染色结果看，德赢vwin登录 醇提取物可以显著保护缺氧/缺糖再灌注所致神经细胞形态学变化，维持细胞正常的形态( 图1) ，这与细胞存活率的研究结果存在一致性。3. 2 德赢vwin登录 醇提取物抑制缺氧/缺糖再灌注所致神经细胞的凋亡AO/EB 染色分析发现，缺氧/缺糖再灌注损伤显著诱导神经细胞凋亡的发生( 红色荧光表示) ; 与损伤组相比，德赢vwin登录 醇提取物显著抑制了神经细胞凋亡的产生，且具有剂量依赖性( 图2) 。Hoechst 33258 染色分析表明缺氧/缺糖再灌注损伤诱导的神经细胞凋亡( 细胞核致密浓染) 被德赢vwin登录 醇提取物显著逆转( 图2) 。由此可见，德赢vwin登录 醇提取物具有较好的神经保护和抗凋亡作用。3. 3 德赢vwin登录 醇提取物抑制缺氧/缺糖再灌注所致神经细胞线粒体损伤线粒体损伤在脑缺血所致的神经凋亡中扮演重要角色。缺氧/缺糖再灌注可引起神经细胞线粒体膜的显著去极化( 绿色荧光) ，而德赢vwin登录 醇提取物处理后的细胞中，绿色荧光显著降低，提示德赢vwin登录 醇提取物可较好的稳定神经细胞线粒体的膜电位( 图3) 。此外，实验采用荧光染料MitoSOX 来特异性标记线粒体内的活性氧自由基( ＲOS) ，结果发现缺氧/缺糖再灌注可引起线粒体内ＲOS 水平显著升高，而德赢vwin登录 醇提取物处理后的细胞中，ＲOS 水平显著降低，且呈剂量依赖性。由此看出，德赢vwin登录 醇提取物可能是通过降低线粒体内的ＲOS 进而发挥线粒体保护作用的。3. 4 德赢vwin登录 醇提取物抑制Bcl-2/Bax 介导的线粒体caspase-3/PAＲP 凋亡通路当缺氧/缺糖再灌注处理细胞后，caspase-3 的表达量下调，cleavedcaspase-3 的表达量上调，提示caspase-3 被激活; 当加入德赢vwin登录 醇提取物后，可见caspase-3 的表达量明显升高，而cleaved caspase-3 的表达量明显下调，即caspase-3 的激活被德赢vwin登录 醇提取物所抑制; PAＲP 的变化规律与caspase-3 类似，当加入德赢vwin登录 醇提取物进行干预后，PAＲP 的表达量明显升高，而cleaved PAＲP 的表达量明显下调，即PAＲP 的激活被德赢vwin登录 醇提取物所抑制; 另外，作为线粒体功能标志蛋白的Bcl-2 表达量被德赢vwin登录 醇提取物显著上调，而Bax 的表达量被显著下调( 图4) 。由此表明，德赢vwin登录 醇提取物可明显抑制Bcl-2/Bax 介导的线粒体caspase-3/PAＲP 凋亡通路。4 讨论随着现代社会的老龄化不断发展，缺血性脑中风及其并发症的发生率也在逐年升高，已经成为目前威胁老年群体的重要致死性疾病。因此寻找治疗此类疾病的特效药物一直是药物研发领域的重要课题。前期研究发现，缺血性脑中风所造成的神经细胞损伤，主要就是缺氧状态影响神经细胞内的线粒体正常功能，引发线粒体内过氧化损伤进而削弱线粒体合成能量的效率，引发整体细胞功能的失调，最终导致神经功能受损［11-12］。因此，针对脑缺血诱发的神经损伤最为有效的手段之一就是保护神经细胞内的线粒体功能。源于中医药的脑保护剂的研发一直是人们关注的热点。德赢vwin登录 是最具代表性的神经保护剂，研究发现其对于神经细胞的过氧化损伤、脂质代谢、单胺类神经递质以及水通道蛋白等均具有较好的逆转和保护作用［13-16］。德赢vwin登录 的活性成分能否通过血脑屏障是其发挥作用的关键因素。前期研究发现，肉苁蓉的主要成分松果菊苷等可通过血脑屏障进而发挥神经保护作用，具有潜在的治疗脑缺血和脑水肿的功效［17-19］。本研究发现，德赢vwin登录 的醇提取物具有较好的抗神经细胞损伤作用，其可能是通过降低神经细胞内的线粒体氧化性损伤，进而抑制线粒体去极化水平来发挥作用的。值得一提的是，笔者发现当线粒体损伤时，其倾向于聚集成团，而德赢vwin登录 能够有效地抑制受损线粒体的成团趋势，提示德赢vwin登录 可能会在一定程度上调控线粒体的动力学过程，但是相关机制有待进一步探究。此外，作为线粒体功能密切相关的2 个标志性蛋白Bcl-2 和Bax 的表达来看，德赢vwin登录 对Bcl-2 的调控作用更为明显，几乎完全逆转了Bcl-2 的降低，由此推测德赢vwin登录 对Bcl-2 的调控可能主要参与了线粒体保护作用。综上所述，本实验从线粒体信号通路探讨了德赢vwin登录 的神经保护作用，并初步阐明了分子作用机制，这对今后开发具有抗神经缺血作用的药物及相关疾病的治疗具有重要的参考意义。［参考文献］［1］ 陈孝男，杨爱琳，赵亚楠，等． 缺血性脑中风的发病机制及其常用治疗中药研究进展［J］． 中国中药杂志，2019，44 ( 3) :422．［2］ 杨薇，黎明全，李杨，等． 缺血性中风病急性期中西药群组模块探索［J］． 中国中药杂志，2018，43( 3) : 618．［3］ Bernardi P，Scorrano L，Colonna Ｒ，et al． Mitochondria and celldeath． Mechanistic aspects and methodological issues［J］． Eur JBiochem，1999，264( 3) : 687．［4］ 张静，赵建军，杨伟，等．基于中医证候特征的缺血性中风复发风险的横断面分析［J］．中国实验方剂学杂志，2018，24( 12) :194．［5］ Soustiel J F，Zaaroor M． Mitochondrial targeting for developmentof novel drug strategies in brain injury［J］．Cent Nerv Syst AgentsMed Chem，2012，12( 2) : 131．［6］ 孙丽新，严明，江振洲，等． 银杏内酯对PC12 细胞缺糖损伤凋亡相关基因的影响［J］． 中国中药杂志，2007，32( 6) : 532．［7］ 汤小蕾，孙平飞． 德赢vwin登录 的研究进展［J］． 中医药导报，2009，15( 5) : 101．［8］ Song D，Cao Z，Liu Z，et al． Cistanche deserticola polysaccharideattenuates osteoclastogenesis and bone resorption via inhibitingＲANKL signaling and reactive oxygen species production［J］．J Cell Physiol，2018，233( 12) : 9674．［9］ 刘文静，刘瑶，宋青青，等． 利用1H-NMＲ 比较德赢vwin登录 野生品和栽培品的化学成分组［J］． 中国中药杂志，2018，43( 17) : 3506．［10］ 安军明，柯铁军．苁蓉总苷胶囊治疗血管性痴呆99 例［J］． 陕西中医学院学报，2011，34( 2) : 36．［11］ Farajdokht F，Mohaddes G，Karimi-Sales E，et al． Inhibition ofPTEN protects PC12 cells against oxygen－glucose deprivation inducedcell death through mitoprotection［J］． Brain Ｒes，2018，1692: 100．［12］ 杜肖，路畅，贺晓丽，等． 小续命汤有效成分组对脑缺血/再灌注大鼠恢复早期脑线粒体的保护作用研究［J］． 中国中药杂志，2017，42( 11) : 2139．［13］ Liu Y，Wang H，Yang M，et al． Cistanche deserticola polysaccharidesprotects PC12 cells against OGD/ＲP-induced injury［J］． Biomed Pharmacother，2018，99: 671．［14］ Li M，Xu T，Zhou F，et al． Neuroprotective effects of four phenylethanoidglycosides on H2O2-induced apoptosis on PC12 cellsvia the Nrf2 /AＲE pathway［J］． Int J Mol Sci，2018，19( 4) :1135．［15］ Chen M，Wang X，Hu B，et al． Protective effects of echinacosideagainst anoxia /reperfusion injury in H9c2 cells via up-regulatingp-AKT and SLC8A3［J］． Biomed Pharmacother，2018，104: 52．［16］ Fu Z，Fan X，Wang X，et al． Cistanches Herba: an overview ofits chemistry，pharmacology and pharmacokinetics property［J］．J Ethnopharmacol，2018，219: 233．［17］ 骆新，李建英，许永华，等． 肉苁蓉苯乙醇苷对大鼠高原脑水肿的防治作用［J］． 中南药学，2014，12( 8) : 747．［18］ 魏丽丽，陈虹，姜勇，等． 高效液相法测定松果菊苷在脑缺血大鼠血浆和脑组织中的浓度［J］． 中国药理学通报，2011，27( 5) : 737．［19］ 陶义存，董翔，许永华，等． 肉苁蓉苯乙醇总苷对高原脑水肿大鼠水通道蛋白4 的影响［J］． 中国现代中药， 2015， 17( 4) : 302．

1.2.4 倒置显微镜拍照观察CPbGs对HepG2细胞形态学的影响 取对数生长期的HepG2细胞，以1x10个／mL的细胞密度接种于6孔细胞培养板中，分别加入含0、32、64、128μg／mL．CPhGs的完全培养基培养24h后，在倒置显微镜下拍照观察细胞形态变化情况。1.2.5 Hoechest33258检测CPhGs对HepG2细胞核的 影响 取对数生长期的HepG2细胞，以1x10个／mL的细胞密度接种至4分格玻底皿中，细胞分组处理同“1.2.4”实验。待细胞处理24h后，收集细胞用Hoechst33258稀释液染色15min，然后在激光共聚焦显微镜下观察细胞核损伤情况。1.2.6 线粒体染色检测CPhGs对HepG2细胞线粒体的影响 取对数生长期的HepG2细胞，以1x10个／ml的细胞密度接种至4分格玻底皿中，细胞分组处理同“1.2.4”实验。待细胞处理24h后，收集细胞用线粒体染剂染色15min，然后在激光共聚焦显微镜下观察细胞线粒体损伤的发生情况。1.2.7 AnnexinV-FITCIPI 双染法观察CPhGs对 HepG2细胞凋亡率的影响 取对数生长期的HepG2细胞，以1x10个／mL的细胞密度接种于6孔细胞培养板中，分别加入含0、32、64、128μg／ml．CPbGs的完全培养基培养24h后，收集细胞根据调亡试剂盒说明逐步处理细胞，然后用流式细胞仪检测细胞凋亡率。1.2.8 流式细胞术检测CPhGs对HepG2细胞周期的影响 HepG2细胞按“1.2.4”步骤接种至6孔板中，细胞分组处理同“1.2.4”实验。待细胞处理24h后，收集细胞用预冷的75％乙醇中固定过夜，次日洗涤并收集细胞，按试剂盒说明书逐步处理细胞，然后采用流式细胞仪检测细胞周期。1.2.9 Western-blot 检测不同浓度CPhGs对HepG2细 胞凋亡蛋白Bd-2、Cleaved-Caspase3及PARP表达的 影响 HepG2细胞按“1.2.4”步骤接种至6孔板中，细胞分组处理同“1.2.4”实验。待细胞处理24h后，收集蛋白进行定量并使蛋白变性。根据目的蛋白分子量大小配置12％、10％的分离胶及5％的浓缩胶，每个样品按等质量上样，恒压电泳，恒流转膜，5％的脱脂牛奶室温封闭2h，4℃孵育一抗过夜，室温孵育二抗1h，曝光拍照，并用imag＝J进行条带灰度值分析。1.3 统计学分析 采用SPSS21.0统计软件进行统计分析，多样本均数比较采用方差分析，结果以均数±标准差（x±s）表示，两两比较采用LSD法，检验水准α＝0.05。2 结果2.1 CPhGs对HepG2细胞的增殖抑制作用 随着CPhGs药物浓度的增加，CPhGs对HepG2细胞的抑制逐渐增加，当CPhGs药物浓度为500μg／mL时，抑制率为（82±2.3）％，经过pobit分析，CPhGs对HepG2细胞的IC。为187μg／mL，见图1。在24、48、72h干预后，与空白对照组比较，CPhGs各剂量组OD值均显著降低，抑制率均显著增高，且差异均有统计学意义（P＜0.01）；干预24h后，CPhGs对HepG2细胞的增殖抑制具有一定的剂量依赖性（P＜0.01）。同时，比较CPhGs各剂量组在3个时间段的抑制率发现，CPhGs中、高剂量组，3个时间段HepG2细胞抑制率差异均有统计学意义（P＜0.01）。见表1。 图1 CPhGs对HepG2细胞的IC。2.2 不同浓度CPhGs对HepG2肝癌细胞克隆率的影响 随着CPhGs药物浓度的增加，细胞克隆形成能力逐渐降低，当CPhGs为64μg／m与128μg／mL时， 注：A．空白对照组；B，CPhG低剂量组（32μg／mL）；C，CPhGs中剂量组（64μg／mL．）：D．CPhGs高剂量组（128μg／mL）右侧为不同剂量组细胞克隆率相对空白对照组的比值。与空白对照组比较，”P＜0.01图2 不同浓度CPhGs对HepG2细胞平板克隆率的影响2.3 从形态学观察不同浓度CPhGs对HepG2细胞凋亡的影响 在不同浓度CPhGs处理组中，HepG2细胞随着药物浓度增高，细胞形态发生改变，细胞出现空泡，细胞折光度下降，细胞密度降低，细胞间连接疏松，细胞轮廓发生改变。CPbGs各剂量组干预24h后，细胞核出现染色质浓缩、核碎裂、核边集的细胞凋亡现象，并且细胞核发出的蓝色强光较空白对照组强。线粒体染色发现，CPhGs各剂量组细胞发生线粒体肿胀、碎片化、数量以及荧光强度都发生改变，且随着CPhGs剂量的增加，线粒体损伤特征也越来越明显。此外，还可以看出，CPhGs高剂量组的细胞数量下降明显，细胞皱缩。除了细胞核与线粒体发生明显改变外，细胞边界不清，处于即将崩裂、死亡的状态。注：A.空白对照组；B.CPbGs低剂量组：C，CP％G中剂量组；D.CPhGs高剂量组图3 不同浓度CPhGs诱导HepG2细胞凋亡的形态学现察（600x）2.4 不同浓度CPhGs对HepG2细胞凋亡率的影响注：a空白对照组：b，CPhGs低剂量：c．CPbGs中剂量：dCPbGs高剂量。与空白对照组比较，“P＜0.01，＂P＜0.05；与低剂量组比较．P＜0.01；与中剂量比较，P＜0.01图4 Annexin V-FITC／PI双染流式细胞术检测CPhGs对HepG2细胞凋亡的影响2.5 不同浓度CPhGs对HepG2细胞周期的影响胞比例，与空白对照组比较，GPhGs各剂量组均出现G1期与G2／M期细胞比例，与空白对照组比较， 明显增加（P＜0.01）。此外，CPhGs各剂量组之间比CPhGs各剂量组均出现显著降低（P＜0.01）；而S期细 较，差异也具有统计学意义（P＜0.01）。见表2，图5。表2 不同浓度CPhGs对HepG2细胞周期的影响（xts，n＝3）分组剂量／细胞周期(pgmL)GI/GOC2MS空白对照组067.10m2.708.97-0.5823.93.2.15CPhG低剂组326224*2.89601+0.83*31,76*2.76*CPhG中剂组6456.40m281**3.31m0.59*40.29x2.23*CPhG高剂组12843.93±3.492.80ml.56%53.253.73*注：与空白对照组比较，P＜0.01；与低剂量组比较，＊P＜001；与中剂量组比较，＊P＜0.01注：a空白对照组：b，CPhGa低剂量：c，CPhGs中剂量；d，CPbGa高剂量图5 不同浓度CPhGs对HepG2细胞周期的影响凋亡是一种依赖蛋白酶的级联反应，它主要存在两种相互交错的途径：外在死亡受体途径和内在线粒体途径7，此外，还包含一些非经典途径，这些细胞凋亡途径大都依赖Caspase介导的级联反应。确定CPhGs诱导的细胞凋亡方式还需通过其他实验进行综合判断。目前，天然药物与肿瘤治疗的相关研究颇多，机制也复杂多样。因此，深入探讨CPhGs抑制HepG2细胞增殖、诱导HepG2细胞凋亡的具体分子学机制尤为重要，这为探讨防治肝癌的分子机制及肉苁蓉药物抗肝癌的研发提供一定的实验依据，也为新疆德赢vwin登录 药物的开发提供研究基础。

齐鑫鑫＇，由淑萍2，何转霞1，赵军3，刘涛（新疆医科大学公共卫生学院：新疆医科大学护理学院；乌鲁木齐830011；新疆维吾尔自治区药物研究所，乌鲁木齐830004）摘要：目的探讨肉苁蓉苯乙醇苷（Cistache deserticola phenylethanoid glycosides，CPhGs）对HepG2 细胞增殖、凋亡的影响。方法实验以HepG2细胞为研究对象，采用MTT及平板克隆实验检测细胞增殖情况、Annexin V-FITC／PI、Hochest33258和线粒体染色法分析细胞凋亡、流式细胞术分析细胞周期，免疫印迹法检测Bcl-2、Cleaved-Caspase3及PARP表达情况。结果CPhGs可抑制HepG2细胞增殖，IC，为187μg／mL；平板克隆实验发现，CPhGs中、高剂量组对HepG2细胞有明显的抑制作用（P＜0.01）。通过倒置显微镜、细胞核及线粒体染色发现，CPhGs各组均可诱导HepG2细胞发生凋亡。同时，Annexin V／PI双染实验结果表明，CPhGs各组均诱导HepG2细胞发生早期凋亡（P＜0.01），且呈现一定的剂量依赖性；CPhGs各剂量组还可将HepG2细胞周期阻滞在S期（P＜0.01）。Western-blot结果显示，CPhGs可诱到凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase3及PARP表达的增加，同时还可抑制抗凋亡白Bcl-2的表达（P＜0.01）。结论CPhGs对HepG2细胞具有一定的抑制增殖、诱导凋亡的作用，其机制可能与调控细胞周期、诱导细胞凋亡相关蛋白表达有关。关键词：肉苁蓉苯乙醇苷；HepG2肝癌细胞；细胞增殖；细胞凋亡；细胞周期肝癌在全球都是严重的公共卫生问题。2018年，肝癌发病率在全球癌症发病率中排第6位，死亡率在全球癌症相关死亡率中排第2位，其中超过一半的新发病例和死亡病例在中国＂。传统的肝癌治疗方法存在许多局限，与化疗药物相比，天然药物因具有温和、毒副作用小、无耐药性的特点，能有效改善患者症状，提高生活质量，延长肿瘤患者生存期等独特的优势而逐渐得到广泛研究与应用。肉苁蓉（Cistache deserticola）是我国传统的名贵补益类中药，自古就有“沙漠人参”的美誉。近年来，肉苁蓉以其显著的生物活性备受人们关注。其化学及药理作用研究显示，苯乙醇苷是肉苁蓉发挥药效的主要物质基础之一，它具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗菌和免疫调节等多种生物活性。研究发现，其单体松果菊苷可通过降低氧化损伤、减轻肝脂肪病变来预防酒精引起的肝损伤，而类叶升麻苷可有效预防肝细胞癌的发生＂。已有研究发现类叶升麻苷可有效减缓酒精性肝损伤中的炎症反应；此外，CPhGs、松果菊苷与毛蕊花糖苷均具有良好的抗纤维化作用。因此，本实验旨在通过CPhGs调控HepG2肝癌细胞增殖、凋亡防治肝癌的实验研究进一步充实CPhGs在医药领域的应用。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 细胞株 HepG2肝癌细胞株（货号：ZQ0022，上海中桥新舟生物科技有限公司）。1.1.2 药物与试剂 肉苁蓉苯乙醇苷（CPhGs，含松果菊苷≥35％，毛蕊花糖苷≥16％；批号：20180502，win德赢官方 ）；MEM不完全培养基（美国Gibeo公司）；胎牛血清（批号：1928702）、谷氨酰胺（批号：1941832）、丙酮酸钠（批号：1916979）；双抗（青霉素与链霉素）、细胞凋亡试剂盒与细胞周期试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司）；四甲基偶氮唑盐MTT（批号：EZ5679C133）、二甲基亚砜（DMSO与Hoechst33258（美国Sigma公司）。1.1.3 仪器 超净工作台与全管波长自动酶联免疫反应检验测试仪（美国Themo Scientifie公司）；CO2细胞培养箱（英国NEW BRUNSWICK Galaxy系列）；CK-40影型荧光倒置显微镜（日本Olympus公司）；AEL-200型电子天平；TGL-16G型台式低温高速离心机；低温离心机（美国Sigma公司）；数显恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）。1.2 方法1.2.1 细胞培养及分组 HepG2肝癌细胞用MEM完全培养基（含10％FBS、1％双抗、1％谷氨酰胺、1％丙酮酸钠），在37℃，5％CO2培养箱中培养，待细胞长至对数生长期实验。实验分为4组：空白对照组（完全培养基）、CPhGs低、中、高剂量组（含不同浓度CPhGs的完全培养基），并使用相差倒置显微镜拍照，观察不同浓度CPhGs对HepG2细胞形态的影响。1.2.2 MTT法检测HepG2细胞增殖抑制的影响 取对数生长期的HepG2细胞，调整细胞密度为3x10个／孔，接种于96孔细胞培养板中，待细胞贴壁后，分别加入含0、78、110、125、150、170、188、220、375、500 μg／ml．CPhGs的完全培养基培养24h，加MTT溶液处理4h，再加人DMSO避光孵育10min，然后用酶标仪在490nm处检测吸光度值（OD值）。计算细胞半数抑制率（IC）并设置后续实验干预剂量。抑制率＝（空白对照组OD值-实验组OD值）／空白对照组OD值］x100％。1.2.3 平板克隆实验观察CPhGs对HepG2肝癌细胞克隆率的影响 取对数生长期的细胞，以2000个／孔的细胞密度均匀的铺至六孔板中，细胞贴壁后，换含不同浓度的CPhGs完全培养基培养。7d后，弃上清，PBS洗涤2次，加入1mL4％组织固定液固定30min。30min后，弃去组织固定液，加入1mL结晶紫，染色30min，然后再用PBS洗涤细胞2次，室温晾干拍照。

养生，原指道家通过各种方法颐养生命、增强体质、预防疾病，从而延年益寿的一种医事活动。养，即调养、保养、补养之意；生，即生命、生存、生长之意。现代意义的“养生”指的是根据人的生命规律主动进行物质与精神方面身心养护的活动。冬季如何养生是人们非常关心的话题，尤其是对于男性朋友来说，此时做好养生工作能够防止疾病入侵身体，增强抵御寒冷的能力，但也一定要有正确的养生方式。冬日男性养生，应当从冬日起居、饮食和心态等多方面进行调整。心理养生 心理养生的核心是养心，养心主要在于调整情志。首先要强调精神修养，学会节制不良情绪。当情绪不佳时，采用“郁而发之”的方法，将不良及过激情绪合理地释放出来，以得到精神心理上的解脱。平时可培养广泛的兴趣爱好，在活动中获得幸福和满足感，驱除心中的烦恼，比如多参加旅游、摄影、琴棋书画、运动锻炼等活动。另外，更要树立远大理想，做一个有目标、有追求的人，不断提高自身修养，培养阔的胸怀和高尚的情操，保持善良平和的品质与心态，才能更好地促进身心健康。身体养生人到中年，生长发育盛极而衰，正是生命过程中盛衰转折阶段，这个时期是男人的高压阶段和男性积劳成疾的高发阶段，所以要劳逸结合、调整心态、避免不良习惯。工作上要避免过劳，思想上避免过虑，性事上避免纵欲，要适当锻炼，多与家人、朋友交流，采取适当的方法缓解压力、颐养心神，避免各种慢性病和男科疾病的发生。此外身体养生还要注意顺应四时阴阳，调摄神志起居，饮食有节，保持合理的体育锻炼等。性养生 “饮食男女，人之大欲存焉”，“食、色，性也”。研究证明，和谐的性生活对于延年益寿和预防疾病有很关键的作用，适度的性生活能让生活充满乐趣，工作保持活力，夫妻关系融洽，身体少病而长寿。性生活作为生活乐趣的一部分，容易出现两种极端：禁欲和纵欲。男性性养生的主要原则是适度原则，要根据不同年龄、身体条件、不同的气候环境、生活习惯、心理因素、居住条件等做出适度的选择和调整。食疗养生药膳是中医学的一个重要组成部分，是中华民族在九州大地上，历经数千年不断探索、积累而成，是中国特有的。具有养生保健、防病治病和延年益寿功能的药膳，是祖国宝贵文化遗产中的一颗灿烂的明珠。药膳食疗的特点，是根据药食同源、养医同理的原则，充分发挥各类食物与药物的功效，达到防治疾病、养生康复、延长寿命的目的。药膳学是在中医理论指导下，运用营养学、营养治疗学、营养卫生学和烹饪学等有关知识，研究中药和膳食结合，用于保健强身、防治疾病和延年益寿的一门临床应用医学学科。严格地说，药膳与食疗两者并不相同，单纯研究和应用饮食进行保健强身、防治疾病，称为食疗。实际上药膳学已包含了食疗的内容，仅在应用和制作上有所不同。男性保健药膳学中药物和食物的配伍组方与临床施膳，都是以中医学的基本理论，尤其是辨证论治理论为指导，突显出中医学的特点。药膳是按照中药的性味功能与相适宜的食物配伍，调配成为与人体脏腑阴阳、气血盛衰、寒热虚实相适应的多种类型的膳食，分别满足人们防治疾病、调补虚损、增强体质、缓减衰老和延年益寿等不同需要。药膳作为膳食，须精心制作，矫除某些药物或食物的不良气味，以使药膳气香、味美，增进食欲，促使消化吸收，使服用者感到适口、乐于接受。＊补肾壮阳药膳1．参片鸡子牛鞭来源：《中医养生药膳学》。原料：鸡子50克，牛鞭80克，西洋参片8克，枸杞子20克，姜、葱、料酒各适量。制作：牛鞭入高压锅焖5分钟至半熟去汤捞出，油锅烩姜加水1000毫升，将牛鞭与鸡子同入锅烧，至将出锅时加入西洋参片及枸杞子，调味后即出锅。功效：补肾壮阳。适用于男性神疲乏力、精神不振、活力低下、易疲劳、畏寒怕冷、四肢发凉等症。2．鹿鞭炖鸡汤来源：民间药膳方。原料：鸡1只，鹿鞭、陈皮各9克，肉苁蓉、熟地黄各12克，枸杞子、巴戟天、杜仲、龙眼肉各10克，姜2片。制作：将鹿鞭切成片，用酒浸泡一夜。然后和鸡、中药下锅加清水，炖煮至熟，下盐调味食用。功效：补肾壮阳。3．当归羊肉汤来源：《陈素庵妇科补解》。原料：鲜羊肉500克，当归、黄芪、党参各10克，葱、姜、料酒各适量。制作：全部用料洗净放入锅中，加适量清水，武火煮沸，改文火煲2小时，加盐调味食用。功效：补心气、疗血虚。4．猪尾汤来源：民间药膳方。原料：猪尾1条，乌豆、巴戟天、肉苁蓉各12克，丁香15克，姜4片，酒100克。制作：全部用料洗净放入锅中，加适量清水，武火煮沸，改文火煲2小时，加盐调味食用。功效：治疝气、肾虚、阳痿。益精固本药膳1．肉苁蓉羊肾汤来源：《滇南本草》。原料：肉苁蓉30克，羊肾2个。制作：将羊肾切开洗净，挑去白色筋膜，与肉苁蓉一起加水煮汤，食盐调味服食。功效：补肾、益精、壮阳。2．海参杞参汤来源：民间药膳方。原料：海参150克，党参、枸杞子各12克。制作：一起煮60分钟左右后，加入味精、油、盐等调味品，即可吃参喝汤。功效：补气益肾，生精养血。适用于气虚乏力、面色萎黄、头晕眼花、腰脚酸软、阳痿、遗精、小便频数等症。3．鹿血蒸蛋来源：《中医养生药膳学》。原料：鹿血100克，鸡蛋2个。制作：将鸡蛋打花，加入鹿血及佐料后入蒸笼蒸熟。功效：益精血、补阳气。适用于肾阳亏虚、肝肾不足之腰膝酸软、阳痿遗精、 脾虚湿阻，食欲不佳，大便稀溏等症状。头目昏花、不育等。＊化湿祛痰药膳  1．怀山薏苡仁萝卜粥来源：《中医药膳学》。原料：大萝卜1000克，薏苡仁30克，怀山药20克，大米50克。萝卜煮熟绞汁，与薏苡仁、怀山药、大米一起煮粥食用。功效：化湿祛痰，行气健脾。适用于痰湿阻滞所导致的男性性功能下降等疾病。2．怀山大枣藕粉糊来源：《中医药膳学》。原料：怀山药60克（切片），大枣5枚（去核），核桃仁3个，藕粉50克，前3味先煎熟，后加入藕粉煮沸搅匀即成，每日1次。功效：补气健脾，利湿安神。适用于脾虚湿阻，食欲不佳，大便稀溏等症状3．鲫鱼冬瓜汤原料：鲫鱼300克，冬瓜150克，植物油、盐、葱段、姜片、香菜段、料酒各适量。①鲫鱼去鳞，除鳃和内脏，洗净，切段，控水。②冬瓜去皮除籽，洗净，切成薄片。③锅置火上，放植物油烧热，先下葱段、姜片，待爆出香味时，放入鲫鱼；待鱼皮煎黄后，加料酒、盐，至酒香溢出时，加冷水3大碗煮沸。④盛入砂锅内，加冬瓜片，小火慢煨约1小时，至鱼汤呈奶白色，鱼肉熟烂，放上香菜段即可。功效：利湿，健脾，补气。用于气虚，湿邪较重，身体困重等症。

肠道是人体的一个极其重要的排毒器官，如果出现排便无力、便秘的时候，粪便就会在肠道内被反复吸收，如果经常排便不正常，人们不仅会出现面部痤疮、色素沉着、肥胖、体臭等不适，至还有可能诱发癌症。记得有一次，我跟一个肛肠科的大夫一起聊天，他说最近碰到一个直肠癌晚期的病人，是位38岁的女士。在做手术的时候，主刀的大夫把她的直肠一打开-好家伙！一股刺鼻的臭味马上传遍了整个手术室，大家虽然都戴着医用口罩，仍然被熏得难以忍受。手术结束以后大家都在讨论，像这种慢性顽固性便秘的病人，怎么会不得癌症呢？因此，保持大便通畅非常重要。要想保持大便通畅，喝海参粥是个不错的方法。取海参10克、木耳20克、猪大肠50克，把木耳用水泡发以后，将海参和猪大肠切成丁，一同加水放入锅中煲熟，加入调料即可。大约做成两三碗的样子，根据自己的饭量，早晚一顿，吃完就可以了。一位朋友说自己最近一段时间便秘，好几天都不怎么解大便。大便排不出来就像是垃圾堆在了肚子里，非常难受，让人整天都感觉肚子里边胀胀的。我当时就给他开了上面的食疗方。这个方法非常有用，第三天朋友便打来电话，告诉我大便通了之后，真是一身轻松，舒服极了。您知道海参的来历吗？因为它像人参一样珍贵，所以才起名叫海参。海参同人参、燕窝、鱼翅等齐名，被列为世界八大珍品之一。海参性温，滋阴健阳，阴阳双补。当然，除了具有补益之功外，它还可以润肺通肠、通便排毒。猪大肠性寒，味甘，也有润肠，去下焦风热的作用。黑木耳则富含膳食纤维和植物胶原，可有助于有益菌的生长，软化粪便，促进胃肠蠕动，加速肠道食物运动进程，有效帮助体内有毒物质及时清除和排出，治疗便秘。很多人不认为便秘是一种疾病，认为不解大便就不解大便，反正积攒久了早晚要排出来。其实，大便对于人体来说就是垃圾，垃圾堆在屋子里不清理就会滋生细菌，影响屋内环境。如果大便停滞在肠道长时间排不出，毒素和细菌就会通过血液循环流窜到身体各部位，威胁我们的身体健康。肠道有大量的废物，比如硫化物、细菌、毒素，奇臭无比。古语说：“要想长生，肠中常清要想不死，肠中无滓。”讲的就是这个道理。所以，有便秘的人千万不要再掉以轻心了。除了排便不畅外，还有很多老年朋友还容易出现排便无力的情况。社区的张大娘这几天便秘，自己去药店买了一瓶果导片，吃了不见效，以为是买到假药了，便前来找我核实。我看包装盒上写着主要成分是“酚酞片”，又查了产品批号和防伪码，便对张大娘说：“这药没有质量问题，确实是用来治疗急性便秘的。”张大娘听我这么一说，挠了挠头说：“咦，这就奇怪了，为什么我吃了没有用呢？”我说：“便秘有很多证型，在没有正确诊断前是不能乱吃药的。”随即，我拉起张大娘的手说：“来，我给你号号脉。”果导片，其主要成分是具有刺激性的酚酞。我们都知道，虚证之人是不能用攻下药的。虚弱的肠道再经历一番折腾，肯定是更没力气排出大便了。所以，我当时便对张大娘说：“大娘，您这便秘得养着治，就像小孩。你得顺着它性子，用药的时候不能跟它唱反调。我给您说个方子，您回家试一试，不行的话再来找我。”大娘听了说：“行，行，你是大专家，开的方子怎么能不行呢。”我笑了笑说：“行不行，得等您实践后才知道。您回去啊，每天晚上喝一碗汤。但是我这不是一般的汤，您得准备阿胶6克、肉苁蓉15克、葱白3根，外加蜂蜜2勺。做的时候把阿胶砸碎，先用一碗水煮葱白和肉苁蓉，煮沸后捞去葱白和肉苁蓉、加入阿胶、蜂蜜溶化，睡前温服一碗。” 张大娘听了说：“这不难，我退休了，在家里没什么事做，就喜欢在厨房里折腾。”果然，张大娘当天就从药店买回来了1斤阿胶、2斤肉苁蓉，准备打一场“持久战”。

李先芝＊，刘洋，石豪，关宏霞，林 露，严 玲，钱全全，胡杨（劲牌有限公司中药保健食品质量与安全湖北省重点实验室，湖北大冶435100）摘 要：目的：对肉苁蓉药材中松果菊苷、毛葛花糖苷含量进行测量不确定度评定，方法：参考《化学检测领域测量不确定度评定利用质量控制和方法确认数据评定不确定度（RB／T 141-2018）》，通过安达森一达林检验验证测量系统，应用期间精密度及方法确认数据，计算出期间精密度不确定度分量ug、偏倚不确定度分量，合成标准不确定度的与扩展不确定度U。结果：经过安德森一达林检验，证明测量系统符合正态性与独立性假设，质量控制数据与期间精密度数据可用于不确定度计算。结论：期间精密度和方法确认数据可用于检验实验室对肉苁蓉药材中松果菊苷、毛蒸花糖苷含量的测量不确定度评定，此评定方法也可用于其他药材的含量测量不确定评定。关键词：质量控制；方法确认数据；肉苁蓉；松果菊苷；毛墓花糖苷；不确定度评定肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉 Cistanche deseticola Y.C.Ma或德赢vwin登录 Cistanche tubulosa（Schenk）Wight的 干燥带鳞叶的肉质茎，被誉为“沙漠人参”，是中国传统的名贵中药材［。在2015年版《中华人民共和国药典；一部》中规定，松果菊苷、毛蕊花糖苷是肉苁蓉药材的含量测定指标，其含量检测采用高效液相色谱法进行测定。松果菊苷、毛蕊花糖苷作为肉苁蓉药材的质量控制指标，评定其含量测定不确定度对于评价肉苁蓉药材的质量有着重要意义。按照《化学检测领域测量不确定度评定利用质量控制和方法确认数据评定不确定度（RB／T 1412018），在期间精密度测量条件下，获得肉苁蓉的质量控制结果和方法确认数据，应用安德森一达林统计检验对测量系统正态性与独立性假设进行检验，对期间精密度不确定度分量ug和偏倚不确定度分量u。进行合并，最终计算出样品水平下的合成标准不确定度。与扩展不确定度U，以一种相对简单的方法对肉苁蓉药材中松果菊苷，毛蕊花糖苷含量的测量不确定度进行了评定。2 肉苁蓉药材含量检测肉苁蓉药材的含量检测参照2015年版《中华人民共和国药典：一部》“肉苁蓉”项下“含量测定”进行：色谱条件与系统适用性试验：以C，键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以0.1％甲酸溶液为流动相B．按表1中的规定进行梯度洗脱：检测波长为330nm，理论板数按松果菊苷峰计算应不低于3000。表1 流动相梯度洗脱条件时间（min）流动相A（％）流动相B（％）0~1726.573.517~2026.5--29.573.5-70.520~2729.570.5对照品溶液的制备：取松果菊苷对照品，毛蕊花糖苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1mL各含0.2mg的混合溶液，即得。供试品溶液的制备：取本品粉末（过四号筛）约1g，精密称定，置100mL棕色量瓶中，精密加入50％甲醇50ml，密塞，摇匀，称定重量，浸泡30min，超声处理40min（功率250W，频率35kHz），放冷，再称定重量，加50％甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液，滤过，取续滤液，即得。测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，得到对照品溶液与供试品溶液中各化合物的保留时间与峰面积，根据保留时间进行定性，峰面积进行定量，计算得到药材中松果菊苷，毛蕊花糖苷的含量。3 测量系统的安德森一达林检验实验室根据高效液相色谱法（通则0512）．将肉苁蓉药材样品（QCS样品）纳入日常检测中，在期间精密度测量条件下，对肉苁蓉药材中的松果菊苷、毛蕊花糖苷含量进行不确定度评定。实验室在近2个月的时间内，得到24个测试结果（m＝24，单位为％），统计受控检验按下式计算，结果见表2．-Σ%(2i-1)[ln(pi)+ln(1-po+1-)](1+ m0.75-2.25㎡式中：A＊分别由正态性的A！”和独立性的A膝检验表示，其中A中的＝ 5x0，为第1个标准化值：x，为第1个结果：元为系列x，的均值：A盐中的w，-MR.MR 为移动极差MR，＝｜x-x｜的均值，1.128P．-第i个正态概率值，由第i个ω，值按RB／T 141-2018附录A求得。表2中肉苁蓉药材中松果菊苷的含量测量结果经计算，A-0.346 2．A1-0.650 3．表3中肉苁蓉药材中毛蕊花糖苷的含量测量结果经计算，A＊＝0.368 9．A-0.668 3．结果均小于1.0，表明在99％概率下接受测量系统的正态性与独立性假设。表2期间精密度条件下松果菊苷测量结果统计原始数据 基于样品标准差（3）XIMR.I(3)A(4)P-+1-1m(1-+1-)AD112.88/-1.620.05-2.940.98-3.96-6.90212.850.03-1.480.07-2.660.96-3.29-17.86312.770.08-1.050.15-1.930.92-2.54-22.34412.990.22-1.040.15-1.900.91-2.36-29.79512.640.35-0.900.18-1.700.88-2.15-34.63612.710.07-0.760.22-1.490.74-1.36-31.33713.060.36-0.730.23-1.450.67-1.11-33.32813.030.03-0.490.31-1.170.60-0.91-31.11912.840.19-0.470.32-1.140.57-0.85-33.931012.720.12-0.450.32-1.130.54-0.78-36.291112.660.07-0.240.40-0.900.49-0.68-33.2712