2.3 宋、元、明、清时期北宋苏颂等所著《本草图经》对肉苁蓉做了较为详细的描述：“肉苁蓉，生河西山谷及代郡雁门。今陕西州郡多有之，然不及西羌界中来者，肉厚而力紧。旧说是野马遗沥落地所生。今西人云大木间及土堑垣中多生此，非游牝之所而乃有，则知自有种类耳。或疑其初生于马沥，后乃滋殖。如茜根生于人血之类是也。皮如松子，有鳞甲。苗下有一细扁根，长尺余，三月采根，采时掘取中央好者，以绳穿，阴干。至八月乃堪用。《本经》云：五五日采。五月恐已老不堪，故多三月采之。西人多用作食品啖之，刮去鳞甲，以酒净洗，去黑汁，薄切，合山芋、羊肉作羹，极美好益人，食之胜服补药。又有一种草苁蓉，极相类，但根短，茎圆，紫色。比来人多取，刮去花，压令扁，以代肉者，功力殊劣耳”［1，其产地与今肉苁蓉属植物产地相近。苏颂以其生长环境推测陶弘景所言“野马遗精所生”的观点错误，认为肉苁蓉由种子生长而来，又猜测其最初生于马精，而后滋生繁殖。苏颂提出肉苁蓉的采收时间、加工方式等与今相近。根据其附图（图1A）及文字描述“其皮如松子，有鳞甲”，与肉苁蓉下部宽卵形或三角形鳞叶特征相近，推测宋代所用肉苁蓉为肉苁蓉 C.deserticola。《本草图经》中又记载有草苁蓉“又下品有列当条云；生山南岩石上，如藕根，初生掘取，阴干，亦名草苁蓉。性温，补男子。疑即是此物。今人鲜用，故少有辨之者，因附见于此”［。。元代《本草衍义补遗》记载肉苁蓉的伪品曰：“盖肉苁蓉罕得，人都以金莲根用盐盆制面为之”［），以金莲根加工后冒充肉苁蓉，经现代学者考证研究推测为现今的黄花列当O．pycnastachya Hancef1。明《本草蒙筌》记载：“今人以嫩松梢盐润为之＂［］，当时以松的幼嫩枝梢加工后冒充肉苁蓉。明代《本草品汇精要》所附肉苁蓉图（图1B）与今肉苁蓉属植物的肉质茎特征相近。明代《本草纲目》中引述了肉苁蓉的几种伪品：“震亨曰：河西混一之后，今方识其真形，何尝有所谓鳞甲者？盖苁蓉罕得，人多以金莲根用盐盆制而为之，又以草苁蓉充之，用者宜审。嘉谟曰：今人以嫩松梢盐润伪之”［7］。其所附肉苁蓉图（图1C）鳞叶特征、基上细下粗的特征与肉苁蓉属植物相近。《本草纲目》中尚对肉苁蓉的易混淆品种列当及锁阳作了引“颂曰：草苁蓉根与肉苁蓉极相类，刮去花，压扁以代肉者，功力殊劣。即列当也。陶九成《辍耕录》云：锁阳，生鞑靼田地，野马或与蛟龙遗精入地。久之发起如珣，上丰下俭，鳞甲栉比，筋脉连络，绝类男阳，即肉苁蓉之类”［］％。明代《本草原始》曰：“如松稍有鳞甲，形柔软如肉，故吴普名肉松蓉。····草苁蓉，生山南岩石上，暮春抽苗，长五六寸，至一尺以来。茎花俱紫色，与肉苁蓉极相类，故名草苁蓉。日华子名花苁蓉。俗呼紫花地丁”四。其所附图中肉苁蓉（图1D-1）形态与今肉苁蓉C.deserticola 相近，草苁蓉与肉苁蓉极相似，长五六寸至一尺，茎圆，紫色，其所附草苁蓉图（图1D-2）形态与现今列当相近。清代《本草求真》所附肉苁蓉图（图1E）根据其特征可推测为肉苁蓉属植物［］，而《植物名实图考》所附图（图IF）中植物特征则与肉苁蓉属差别较大［）。《中国药物标本图影》中附淡苁蓉与咸苁蓉2种商品图（图1G）m，其特征与今所用肉苁蓉药材相近。综上所述，历代所用肉苁蓉基原不止一种，受当时条件所限，对于同属近缘、生长方式等存在较多不解，但主流当为肉苁蓉C.deserticola无疑，亦有盐生肉苁蓉入药的情况，且认为肉苁蓉 C.deserticola质佳。德赢vwin登录 被《中国药典》2010年版列为肉苁蓉基原植物之一，为近现代出品，非古代所用品种。肉苁蓉药源稀缺，古时草苁蓉常充作肉苁蓉入药，其来源为列当科植物列当，其与肉苁蓉性状相近，但疗效较次。元明时期有金莲根及嫩松梢常做伪品入药。3 道地性及品质考证历代本草记载肉苁蓉的产地均在内蒙古、山西、陕西、青海、甘肃、宁夏一带，与今肉苁蓉的产区相近。唐代之前以内蒙古、山西、陕西为主要产区和优质产区，唐代以后产地扩展到甘肃、青海、宁夏一带。而德赢vwin登录 仅生于新疆天山一带，未见有记载，可推测古代药用肉苁蓉中无德赢vwin登录 。现代山西、陕西基本上已不再生产肉苁蓉，肉苁蓉C.deserticola 主要分布在内蒙古的阿拉善盟、新疆北部、甘肃等地，而德赢vwin登录 在我国分布于新疆天山以南塔克拉玛干沙漠周围各县。肉苁蓉历代道地性及品质变迁见表1。历代本草所载肉苁蓉的品质评价中，多以“松子鳞甲”为优质品的标准之一，以质柔润、肉厚紧实者为佳。4 药用部位考证考证历代本草对肉苁蓉的描述，可判断其入药部位较为一致，均为其根。《嘉佑本草》转引《蜀本草》记载：“三月四月掘根”（2）；《本草图经》曰：“三月采根”［”；《本草品汇精要》：“三月、五月五日取根”（，后世多沿此记载。古代对于该植物的认识与今植物学有所不同，古代将地下部分统称为“根”，对于肉苁蓉而言，即今日植物学上的“肉质茎”。5 采收加工炮制考证历代本草中记载肉苁蓉的采收期不断变化，后逐步统一，五月（阳历6月）恐其根过老，多三月（阳历4月）采收，采后阴干。《中国药典》2020年版记载于春秋两季采挖，阴干，切厚片。炮制方法为阴干，酒浸去黑汁后蒸制、炙干、焙干等，古代因干燥技术所限，加之肉苁蓉肉质茎含水量高，难以干燥，为防止腐烂采集后于盐湖中腌制保存，随着干燥技术的发展，腌制法已不再使用，现产区均以晒干、烘干等方法加工。关于肉苁蓉的历代采收加工炮制演变情况见表2。南北朝《雷公炮炙论》最早记载了肉苁蓉的炮制方法：“凡使，先须用清酒浸一宿，至明，以棕刷刷去沙土、浮甲尽，劈破中心，去白膜一重，如竹丝草样是。此偏隔人心前气不散，令人上气不出。凡使用，先须酒浸，并刷草了，却蒸，从午至酉，出，又用酥炙得所”［），酒浸后蒸干酥炙，后世绝大多数本草著作关于肉苁蓉的炮制方法均引自于此。表1 不同历史时期肉苁蓉道地性及品质变迁信息历史时出处文献记载道地性及品质变迁魏晋《名医别录》生河西及代郡、雁门。［口］河西：今陕西，甘肃一带；代郡；今河北蔚县；雁门：今山西代县。南北朝《本草经集注》代都雁门属井州，多马处便有，芮芮河南芮芮指古代柔然民族，主要游牧于今蒙古国鄂间至多，今第一出陇西，形扁黄，柔润，多花尔浑河流域：河南：今内蒙古一带；陇西：今面味甘。次出北国者。形短面少花。巴东、建六盘山以西黄河以东一带;国:今山西平间亦有，面不如也。（）陕西一带；巴东建平：鄂西川东三峡一带，广泛分布的物种为列当面非肉苁蓉。品质评价：形扁黄，柔润，多花面味甘唐代《千金翼方）原州、灵州产苁蓉；兰州、肃州产肉苁蓉。（）原州：今甘肃镇原；灵州：今宁夏中卫、中宁；兰州：今甘肃皋兰；肃州：今甘肃五代《蜀本草》出肃州福禄县沙中。今甘肃酒泉。宋代《本草图经》生河西山谷及代郡雁门。今陕西州郡多有之，西羌：今甘肃、宁夏、青海一带。品质评价：然不及西羌界中来者，肉厚面力紧。］肉厚面力紧明代《本草蒙签》陕西州郡供有。（间今陕西、甘肃、宁夏全部、以及青海、新疆和内蒙古一带。清代《本草求真》长大如臂，重至斤许，有松子鳞甲者良。［］品质评价：松子鳞甲。民国《本草药品实地之观察》北平药肆俗称大云，用盐制者又称盐苁蓉；乃采西伯利亚、蒙古及甘肃。取西伯利亚、蒙古及甘肃一带产品·长20-30cm，径3-3.5cm，略成圆柱形，间或屈曲不齐，稍稍扁平，上端钝头，下部常呈块形，外面黑褐色乃至污褐色，呈密砌之鳞片状残基，或作覆瓦状面配列之：横切面类灰黄白色，肥大者略呈海绵状，轴筒周围作粗大之放射状裂隙，中心柱呈暗褐色面凹陷之，亦作纤细之放射纹，或特呈类白色而平坦；质稍松面微带柔软；有一种微弱之特臭；味微成面甜，咀嚼之略有砂鸣之感。［25］

翁倩倩口，赵佳琛＇，金艳＇，张卫”，彭华胜，蔡秋杰＇，李兵，陈周全＇，杨洪军＂，张华敏＇，詹志来！”1．中国中医科学院 中药资源中心道地药材国家重点实验室培育基地，北京 100700；2．江西中医药大学院士工作站，江西 南昌 330004；3．中国中医科学院 中药研究所，北京 100700；4．安徽中医药大学，安徽 合肥 230012；5．中国中医科学院 中医药发展研究中心，北京 100700；6．中国中医科学院 中医药信息研究所、北京 100700；7．华润三九医药股份有限公司，广东 深圳 518029；8．中国中医科学院，北京 100700［摘要］肉苁蓉为我国西北干旱地区特有的名贵补益类药材，应用历史悠久，可补肾阳、益精血、润肠通便。通过查阅历代本草、医书典籍，结合现代文献资料对经典名方中肉苁蓉药材的名称、基原、产地变迁及品质、药用部位、采收加工及炮制进行考证，并主要讨论其酒洗炮制沿革。经考证后认为古时所用肉苁蓉主流当为肉苁蓉Cistanche deserticola Y.C.Ma.，亦有盐生肉苁蓉C saba（C.A.Mey.）G.Beck入药的情况。肉苁蓉历代主流的炮制方法为酒浸后炙干、焙干或酒蒸，演变至今，皆有传承，建议济川煎中采用《中华人民共和国药典》2020年版中酒苁蓉炮制规格，地黄饮子可参考“酒炙法”进行炮制。［关键词］经典名方：肉苁蓉；炮制沿革；本草考证肉苁蓉为我国西北干旱地区特有的名贵补益类药材，应用历史悠久，可补肾阳、益精血、润肠通便。2018年国家中医药管理局会同国家药品监督管理局制定并公布的《古代经典名方目录（第一批）》中包含肉苁蓉药材名方2首，分别为地黄饮子（肉苁蓉酒浸，焙，出自金·刘完素《黄帝素问宣明论方》）和济川煎（肉苁蓉酒洗去咸，出自明·张景岳《景岳全书》），均采用酒为辅料进行加工炮制。《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020年版中收载的肉苁蓉正品基原为列当科植物肉苁蓉Cistanche deserticola Y.C.Ma或德赢vwin登录 C.tubulosa （Schenk）Wight的干燥带鳞叶的肉质茎，炮制方法有净制生品和酒苁蓉（炖或酒蒸法）2种，与古籍有所出入。经查阅文献发现，肉苁蓉在古时存在草苁蓉、列当等植物混用入药的现象，关于历代所用肉苁蓉的基原问题经诸多学者［2分析考证已基本清晰，历代本草记载肉苁蓉的原植物为肉苁蓉 C.deserticola和盐生肉苁蓉 C.salsa（C.A.Mey.）G.Beck，且认为前者质量较佳，德赢vwin登录 仅自然分布在新疆南疆地区，植株形态与肉苁蓉和盐生肉苁蓉相差较大，古时肉苁蓉药材原植物应不包括德赢vwin登录 。德赢vwin登录 在20世纪50年代始存在地方性入药，20世纪60年代由于肉苁蓉商品紧缺，德赢vwin登录 被大量作为肉苁蓉的替代品使用。因此《中国药典》2010年版将德赢vwin登录 列为基原植物之一，是为了解决肉苁蓉资源不足的问题，在保护资源的同时满足市场的需求。而肉苁蓉属的植物如盐生肉苁蓉、沙苁蓉C.sinensis G.Beck 及列当属列当 Orobanche coerulescens Steph.也曾在不同地区作“肉苁蓉”人药。关于肉苁蓉的基原问题现代学者观点较为一致，然尚未达成共识的是2首名方中肉苁蓉的炮制加工问题。如经典名方济川煎中注明肉苁蓉需“酒洗去咸”，其“酒洗”之法不知是指药材前期加工抑或是指炮制方法，查阅现代文献发现关于肉苁蓉的酒洗问题目前还未有学者进行研究讨论，关于“去咸”有认为是采用酒作为溶媒洗涤之意，或认为“咸”具有入肾经之功效。而现行法规中的“酒苁蓉”与古代方法表述亦不相同，因此不同学者持不同观点，基于此，有必要对肉苁蓉历代的采收加工与炮制沿革进行系统的梳理及分析，明晰其历史演变过程，为涉及该类药材的经典名方开发提供依据。1 名称考证肉苁蓉始载于《神农本草经》，列为上品，以“肉苁蓉”为正名，而后世历代本草均沿袭之。李时珍释其名曰：“此物补而不峻，故有从容之号。从容，和缓之貌”，因其药性而得名。魏晋《吴普本草》中记载肉苁蓉又名“肉松蓉”“黑司命”［。“肉松蓉”之名因其外形而来，如《本草原始》记载：“皮如松稍有鳞甲，形柔软如肉，故吴普名肉松蓉”］。又有一说因苁蓉感马精而生，唐代《新修本草》记载：“代郡雁门属并州，多马处便有，言是野马精落地所生”［0］。清代《本草崇原》释其名曰：“马属午畜，以少阴为正化，子水为对化，故名黑司命”［。2 基原考证2.1 唐代以前肉苁蓉始载于东汉《神农本草经》：“味甘、微温。主五劳七伤，补中，除茎中寒热痛，养五脏，强阴，益精气，多子，妇人症瘕。久服轻身。生山谷”［］，提及其生长环境。《名医别录》记载：“生河西（今陕西、甘肃一带）及代郡（今河北蔚县）、雁门（今山西代县），五月五日采，阴干”［叫，提及其产地及采收时期，与今肉苁蓉属植物相符。《吴普本草》记载：“生河西山阴地，长三四寸丛生，或代郡、雁门，二月至八月采”，其产地与今肉苁蓉、盐生肉苁蓉的产地接近，而“长三四寸”“丛生”等特征则与盐生肉苁蓉更为接近。南北朝陶弘景在《本草经集注》中记载：“代郡雁门属并州，多马处便有，言是野马精落地所生，生时似肉，以作羊肉羹，补虚乏极佳，亦可生噉。芮芮河南间至多，今第一出陇西，形扁黄，柔润，多花而味甘。次出北国者，形短而少花。巴东、建平间亦有，而不如也”，提及肉苁蓉的不同产区及品质。陇西为今甘肃、内蒙古西部一带，为今肉苁蓉的产区，其形态扁圆形、质地柔润、味道甘甜等与肉苁蓉亦相近。北国为今山西、陕西一带，现今有盐生肉苁蓉分布，其描述“形短而少花”与盐生肉苁蓉茎与花序短小的特征相符合。推测陶弘景时期药用肉苁蓉的原植物为肉苁蓉与盐生肉苁蓉，且认为肉苁蓉的品质更好。至于陶弘景所云肉苁蓉是“野马精落地所生”一说，后代多以为荒谬。但此说可以表明古代已经观察到肉苁蓉区别于一般的植物，以此解释寄生植物的现象。现代有学者研究后对此做出推测，认为野马在肉苁蓉属植物的寄主周围活动时可能使散落在地表的种子被踩入土中，接触到寄主后生长，才让古人误以为肉苁蓉是“野马精落地所生”。2.2 唐及五代时期唐代《新修本草》对《本草经集注》中所记载的“巴东、建平间也有，而不如也”做出论注：“此注论草苁蓉，陶未见肉者。今人所用亦草苁蓉刮去花，用代肉尔。本经有肉苁蓉，功力殊胜。比来医人，时有用着”［］，苏敬认为陶弘景所云“巴东、建平间”所产为草苁蓉，而当时人们亦用草苁蓉刮去花人药，但质量较次。巴东、建平为今鄂西、川东的三峡一带，非现今肉苁蓉属植物的产区。《证类本草》引《蜀本图经》云：“出肃州禄福县沙中，三月、四月掘根，切取中央好者三、四寸，绳穿阴干。八月始好，皮如松子鳞甲，根长尺余。其草苁蓉，四月中旬採，长五、六寸至一尺已来，茎圆紫色，採取压令扁，日干。原州、秦州、灵州皆有之”［”，其描述的“草苁蓉”则与列当接近。五代《日华子本草》中记载肉苁蓉：“治男绝阳不兴，女绝阴不产，润五脏，长肌肉，暖腰膝，男子泄精，尿血，遗沥，带下阴痛。据本草云，即是野马精余沥结成。采访人方知勃落树下井土堑上，此即非马交之处。陶说误耳。又有花苁蓉，即是春抽苗者，力较微耳”，提出肉苁蓉生长于“勃落树下井土堑上”［6］，反对了陶弘景提出的肉苁蓉为野马精生成的说法。“勃落树”有可能为肉苁蓉的寄主梭梭 Halorylon ammodena Bunge。《日华子本草》中提出“花苁蓉”，后代认为其与草苁蓉为一种，苏颂曰草苁蓉“即列当也”，《本草原始》中记载草苁蓉：“日华子名花苁蓉，俗呼紫花地丁”

陈静＇，唐秀松＇，吴林＇，陈炜，王清碧＇，李鹏1．广西中医药大学．广西南宁530001：2．广西中医药大学第一附属医院．广西南宁530023；3．广西中医药大学附属瑞康医院．广西南宁530011：4．济宁市中医院，山东济宁272100摘要：目的 基于网络药理学探讨内苁蒙治疗血管性痴呆（vascular demeitia，VD）的作用机制。方法采用TCMSP分析平台检索中药活性成分和中药靶点，利用GenrCards数据库和OMIM数据库薄选肉苁蓉治疗VD的作用靶点，构建蛋白互作网络（PPI），进行CO功能富集分析及KEGG通路富集分析，构建可视化的中药-疾病靶点相关的信号通路。结果从肉苁蓉中筛选出4个有效成分，作用于60个血管性痴呆靶点，内苁蓉治疗VD的核心基因主要有IL．6．VEGFA．EG-FR、CASP3、MYC、CCND1．FOS、PPARG．AR．RELA．NOS3，ICAMI等。中药-疾病靶点涉及的GO功能主要包括DNA结合转录激活活性、核受体活性、转录国子活性，直接配体调节的序列特异性DNA、乙酰胆碱受体活性、泛素蛋白连接酶结合、RNA聚合酶II转录因子结合等。中药-疾病靶标涉及的KEGG通路主要包括流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路、前列腺癌信号通路、糖尿病并发症中AGE-RAGE信号通路，肿瘤坏死国子信号通路、癌症中的蛋白多糖信号通路，PBK-Ad信号通路、肝细胞癌信号通路、细胞调亡信号通路、丙肝信号通路等。结论基于网络药理学探讨了肉苁蓉治疗血管性痴果的分子机制，为中药现代化研究提供了理论基础。关键词：肉苁蓉；血管性痴果；网络药理学；作用制：蛋白互作网络中图分类号：R277.749.13       文献标志码：A      文章编号：1673-7717（2021）02-0156-06血管性痴呆（vascular dementia.VD）是一种由脑缺血、缺氧或者出血所引起的行为、记忆等严重认知功能障碍综合征［-21。其典型临床表现为具有脑卒中病史，在脑卒中后3个月内出现明显的认知记忆功能障码叫。VD发病率随着全球人口老龄化加剧面逐渐增加，成为继阿尔茨海默病（Alzhei-mer＇＊diseae，AD）后的第二大痴呆类型，给家庭和社会带来沉重的经济负担。到日前为止尚未有被美国食品药品管理局（The US Food and Drug Administration，FDA）批准用于VD 的临床治疗药物，目前主要以改善脑循环、抗血小板聚集、调脂稳斑等治疗原发性血管性疾病，多用多奈哌齐、吡拉西坦等胆碱酯酶抑制剂改善记忆减退情况［5-1。由于VD是目前唯一可以预防的痴呆类型”，在无西药专药治疗该病的现实下，从中医药中寻找有效防治VD药物是日前医学研究的重点。近年来，很多研究表明中药能够改善VD症状。李强等网运用“中医传承辅助系统”对VD方药组成进行数据挖掘分析。发现肉苁蓉出现频次较多、肉苁蓉，学名：Cistanches HerbaMa.别名寸芸，列当科植物肉苁蓉Cistanches Heba Y.C.Ma或管肉苁蓉 Cistanche tubulosa（Schrenk）Wight 干燥带鳞叶的肉质茎，素有“沙漠人参”之美誉，其性温，味甘，咸：归肾、大肠经，具有补肾阳、益精血、润肠通便的功效。有研究报道，肉苁蓉富含甾醇、木脂素类、苯乙醇苷类、环烯醚萜类等有效成分，可有效改善老年痴呆患者的认知功能，但对改善VD患者认知功能的机制仍未完全明确，研究肉苁蓉中有效成分治疗VD的作用机制具有重要意义。中药复方具有令人信服的疗效，但其多靶点、多成分、多途径的共同作用特点，使得我们很难明确何种成分在治疗疾病中起到主要作用［。网络药理学是一门基于生物信息学、分子生物学及各大数据库信息系统的学科，综合分析中药成分作用于疾病的共同靶标，深入分析靶标涉及的基因、蛋白、信号通路，与中药多成分-多靶点的特点是相统一的“-叫。本研究基于网络药理学探讨肉苁蓉治疗VD的作用机制。1 资料本研究使用相关分析平台和数据库见表1．2 方法2.1 筛选肉苁蓉中有效成分和靶点 本研究通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Datahase and Analysis Platform），以肉苁蓉 为关键词搜索其全部活性成分，然后以为口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30％，药物类药性（drug likeness． DL）＞0.18为筛选条件％，见表2．采用Ped 软件对相关有效成分作用靶点进行预测。表1 本研究使用相关分析平台和数据库名称网址版本中药系统药理学分平台（TCMSP）http://lsp.nww.cda.cn/temp.plp2.3https://www.umiprot.ong/GeneCanh 数据库https://genealacart.generands.org/OMIM 数据库lttps://www.omim.ong/STRING 在线软件https://sring-db.ong/11Perl 软件https://www.perl.org/gst.html5.26.3R语言软件Https://www.t-poject.ong/3.6.1Cykmcape 软件https://eykmcape.ong/3.7.2表2 筛选肉苁蓉中有效成分和靶点的结果编号Mol编码 名称(%)80DL1MOL000358 B-谷番醇（beta-sitosterol）36.910.752 MOL005320 花生四烤酸(Arachidonale)45.570.203 MOLD05384 全草含苏齐内酯(Suchilactone)57.520.564 MOL007563 木脂素(Yangambin)57.530.815MOLD00098 槲皮素（Quercetin）46.430.286MOLD08871 Makine37.050.692.2 注释肉其蓉靶点基因（genm symbol） 通过UmiProt 知识库和Perl 软件对筛选出的靶点基因进行注释。2.3 获取VD疾病相关基因 以“Vacular dementia”作为关键词，检索Gene：Cands数据库、OMIM数据库的疾病靶点，从而得到VD疾病相关基因。2.4 找出肉苁蓉靶点和VD疾病靶点交集 R语言软件将VD疾病相关靶点和肉苁蓉靶点取交集，得到肉苁蓉和VD疾病共同靶点的韦恩图，见图1．得到肉苁蓉-VD靶点。 图1 中药-疾病靶点2.5 构建中药-有效成分-疾病-靶点调控网络 将2.2获得的肉苁蓉靶点和2.4获得的肉苁蓉-VD靶点利用Perl 软件进行一一映射，然后运用 Cytoscape 软件对该网络进行拓扑计算．得到中药-成分-疾病-靶点调控网络。见插页XW图2．其中节点的类型有中药、有效成分、疾病和中药一疾病靶点。2.6 构建中药-疾病靶点蛋白相互作用网络与簿选核心基因利用STRING 在线软件将中药一疾病靶点输入软件，筛选条件为种属选择 homo sapiens，保存结果文件。见插页XW图3。将所得文件输人R语言计算，得到蛋白互作网络核心靶点的条图。见图4。2.7 GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析 将中药-疾病靶点利用R语言软件计算，得到GO功能富集分析（插页XM图5、插页XXII图6）和KEGG 通路富集分析（插页XX图7～图8）。3结果3.1 肉苁蓉中有效成分的筛选和靶点预测结果 通过对TC-MSP数据库中肉苁蓉所有有效成分及其相关靶点筛选，共搜索到有效成分75个，相关靶点658个。根据OB和DL．标准对肉苁蓉的有效成分进行筛选，共获得有效成分6个，有效成分对应的靶点224个。3.2 中药-疾病靶点构建的结果 利用R语言软件将VD疾病相关靶点与肉苁蓉靶点取交集，得到中药-疾病共同靶点的韦恩图（图1），从中得到中药-疾病靶点60个，其中 VD疾病相关靶点3047个，肉苁蓉靶点85个。3.3 构建中药-有效成分-疾病-靶点调控网络的结果 插页XU图2中红色代表血管性痴呆（VD），绿色代表中药肉苁蓉，紫色代表肉苁蓉的有效成分，蓝色代表肉苁蓉-VD疾病共同靶点。中药肉苁蓉主要通过4种有效成分作用于60个靶点，这60个靶点可能影响VD的发生。3.4 构建中药-疾病靶点蛋白相互作用网络与簿选核心基因的结果 据图4可知，中药-疾病核心基因按邻接节点数目由多到少依次为：116、VEGFA．EGFR．CASP3．MYC．CCNDI、FOS,PPARG、AR.RELA、NOS3.ICAMI、HIFA、AHR、CAVI、 PGR.CASPS,NFKBIA,CASP9,VCAMI,NFE212、RBI、HSPBI、 IGF2、PRPI、CRP、CYP3A4、IGFBP3，NQO1．PLAU．邻接节点 数日越多，成为核心基因的概率越大。 图4 中药-疾病核心靶点的条图左列为基因名，如IL-6（interleukin-6．白分素-6），数字为相应基因邻接节点数目，如IL-6邻接节点数目为40。3.5 GO功能富集分析 肉苁蓉治疗VD的核心靶点的GO功能富集分析结果见插页XW图5～插页XXII图6。肉苁蓉治疗VD的核心基因的CO功能主要涉及 DNA结合转录激活活性、激活转录因子结合、核受体活性、转录因子活性，直接配体调节的序列特异性DNA、乙酰胆碱受体活性、泛素蛋白连接酶结合、泛素样蛋白连接酶结合、RNA聚合酶II转录因子结合、半胱氨酸型内肽酶活性与细胞凋亡的关系，类固醇激素受体，G蛋白偶联胺受体活性、激酶调节活性、整合素结合、抑制转录因子结合等。柱状图：插页XM图5左侧字母为GO名称，下面数字为富集在CO上的基因数目，柱状图形表示富集在CO上的基因.P代表富集的显著性，颜色越红，富集的程度越高，相应的P值越小。气泡图：插页XXM图6左侧字母为GO名称，下面数字为基因的比例，大小表示富集的基因的数目，颜色代表P值，颜色越红，富集的程度越高，相应的P值越小。3.6 KEGG 通路富集分析 肉苁蓉治疗VD的核心靶标的KEGG 通路富集分析结果见插页XX图7～图8，肉苁蓉治疗VD的核心基因的KEGG通路主要涉及：流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染信号通路、前列腺癌信号通路、糖尿病并发症中的年龄-年龄信号通路、人巨细胞病毒感染信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、肺小细胞癌信号通路、癌症中的蛋白多糖信号通路、PI3K-Akt信号通路、肝细胞癌信号通路、细胞凋亡信号通路、丙肝信号通路等.柱状图：插页XX图7左侧字母为KEGG名称，下面数字为富集在KEGG上的基因数日，柱状图形表示富集在KEGG上的基因，P代表富集的显著性，颜色越红，富集的程度越高，相应的P值小。气泡图：插页XXI图8左侧字母为KEGG名称，下面数字为基因的比例，圆圈大小表示富集的基因的数目，颜色代表P值，颜色越红，富集的程度越高，相应的P值越小。4 讨论现代研究显示，肉苁蓉具有神经免疫调节、抗疲劳、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等多种药理活性。本研究利用网络药理学对肉苁蓉治疗血管性痴呆的作用机制进行探讨，网络药理学是一种包括网络分析，系统生物学和多效性的药物设计方法［。结合中医药“整体观念”的理论，全面分析中药成分作用于疾病的靶点，对于研究中药治疗疾病的作用机制具有深远意义。本研究表明，肉苁蓉的主要有效成分可通过多靶标、多通路影响VD的发生。肉苁蓉治疗VD的核心基因主要有116、VEGFA.EGFR.CASP3.MYC、CCNDI、FOS、PPARG、AR、RELA、 NOS3．ICAMI等，这些基因可通过影响DNA结合转录激活活性、激活转录因子结合、核受体活性、转录因子活性，直接配调节的序列特异性DNA、乙酰胆碱受体活性、泛素蛋白连接酶结合、RNA聚合酶II转录因子结合、半胱氨酸型内肽酶活性与细胞凋亡的关系、类固醇激素受体、G蛋白偶联胺受体活性、激酶调节活性、整合素结合、抑制转录因子结合等来调控VD的发生，即主要从炎症因子、细胞因子等分子水平来治疗VD.炎症因子可损伤脑白质细胞（星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞和周细胞），细胞间黏附分子-1（intercellular cell ad-hesion molecule-1．ICAM-1）能加快斑块脱落，导致脑血管堵塞，增加二次脑卒中风险，进面使患VD概率增加。研究发现．IL-6（intedeulin6，白细胞介素-6）是一种多功能的细胞因子［叫，IL-6升高与认知功能下降、脑血管疾病关联性很大，它参与VD发病的病理过程-。VEGF在缺血性脑血管病的微循环重建中发挥关键的作用，是目前最强的促血管生长因子，能促进新生毛细血管的形成，提高机体输氧能力和氧交换面积，减轻缺氧对人体的伤害［。肉苁蓉治疗VD的核心基因的KECG通路很多，这些通路主要包括流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染信号通路、前列腺癌信号通路、糖尿病并发症中AGE-RAGE信号通路、人巨细胞病毒感染信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、肺小细胞癌信号通路、癌症中的蛋白多糖信号通路、P3K-Akt信号通路、肝细胞癌信号通路、细胞调亡信号通路、丙肝信号通路等。前列腺癌信号通路的下游通路包括凋亡信号通路。解恒革2对睾丸切除术患者（包括认知功能正常者、MCI、AD、VaD）进行研究，结果发现痴呆患者出现血清睾酮和EZ的下降，与痴呆严重程度密切相关。T和EZ对认知功能的影响依认知功能是否受损面不同。动脉粥样硬化信号通路的下游通路包括NFkB 信号通路、MAPK信号通路、凋亡信号通路等。张海燕研究发现五脏温阳化瘀汤能改善动脉粥样硬化VD大鼠学习记忆能力，其作用机制可能与抑制动脉粥样硬化VD大鼠的氧化应激反应。王晋平等叫通过动物实验发现益肺宣肺降浊方能提高cAMP含量，促进PKA表达（P＜0.05），改善VD大鼠学习记忆功能和空间探索能力，减少神经细凋亡。综上所述，肉苁蓉多种有效成分通过调控VD相关的基因起到治疗VD的作用。网络药理学为发现新信号通路，调控富集程度高的基因和信号通路来治疗疾病以及全面认识中药和疾病的关系拓宽了渠道。本研究可为肉苁蓉治疗VD提供一定的依据，也可为临床治疗VD及新型药物的开发提供思路。

本研究的PPI网络拓扑学分析显示，CPhGs治疗HCC的核心靶点有29个，其中包括AKT1，PIK3R1，STATI，SRC，MAPK1，CASP3，MAPK8，MAPK14， IGF1R等，均涉及细胞凋亡和细胞增殖过程。采用DAVID数据库对上述29个关键靶点进行GO功能和KEGG富集分析。GO功能富集分析结果显示CPhGs可以对细膜、核、质、细胞器膜及细胞空间等细胞组成过程，并通过与蛋白、酶各类受体结合等分子功能产生活性。KEGG功能富集分析结果显示，CPhGs防治HCC可能是通过调控癌症信号通路、癌症蛋白聚糖通路、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K-Akt）信号通路、GnRH信号通路等多条信号转导通路，其中均涉及PI3K／Akt信号通路，其作用尤为关键。PI3K／Akt信号通路在肝癌的起始过程中起着至关重要的作用，涉及多种生物学过程，如增殖、转移、耐药、放射抗性、能量代谢和自噬等［2223。PI3K是由调节亚单位p85和催化亚单位p110组成的异源性二聚体。根据底物和序列同源性，将PI3K分为3个亚型，都能磷酸化磷脂酰肌醇第3位羟基，从而产生特定的磷酸肌醇形式而发挥作用2。蛋白激酶B是位于PI3K下游的靶蛋白，是细胞增殖和存活的重要调节因子。目前，已经鉴定出3种Akt基因，分别称为Aktl、Akt2和Akt3。抑制Akt活性可诱导一系列哺乳动物的细胞凋亡，因此，将Akt抑制剂与抗癌药物联合治疗具有突变的肿瘤有一定的疗效25］。本研究将“中药-活性成分-靶点”网络中排名前5的核心活性化合物与PPI分析中度值排名前10的蛋白靶点进行分子对接，进一步明确其发挥效用的治疗机制。采用Autodock vina进行对接，选取亲和力最佳的构象，其中最低结合能≤-5.0kcal／mol即表明药效分子与蛋白对接效果良好，结合能越低，表明分子与蛋白结合能力越佳。本研究结果提示肉苁蓉中的苯乙醇苷类活性化合物与AKT1、HSP90AA1等靶标结合后最低结合能均≤-5.0 kcal／mol，表明其具有较强的结合能力，充分验证了网络药理学的预测结果。蛋白激酶B（AKT）是一种人类丝氨酸-苏氨酸激酶，是AGC蛋白激酶家族的成员26。AKT蛋白在大多数癌症类型中都高度表达，包括HCC、肺癌、乳腺癌和以及结肠癌，其中AKT1是治疗癌症的主要药物靶点，在细胞增殖和抗凋亡的过程中发挥作用。有研究表明沉默AKT1能够抑制肿瘤生长和诱导细胞凋亡，并可有效上调肿瘤抑制基因PTEN的表达、减少Notchl的表达，靶向AKT1可以抑制HCC的发展27。热休克蛋白90a（Heatshock protein 90a，Hsp90a）由HSP90AA1基因编码，是分子伴侣Hsp90的诱导亚型，是真核生物中高度保守且必不可少的伴侣蛋白28。HSP90已成为治疗癌症中的关键目标，Hsp90与多种促进肿瘤发生的蛋白相互作用，因此，Hsp90是一个重要的致癌因子。研究表明，HCC患者血清HSP90AA1水平明显高于健康对照组［2，分泌型HSP90AA1可能是HCC良好的生物标志物，被批准用于中国HCC的临床诊综上所述，本文以CPhGs主要活性成分为研究对象，通过网络药理学技术分析其潜在的防治HCC靶点及信号通路，并结合分子对接方法初步验证了CPhGs主要活性成分能与HCC靶点发生相互作用，为进一步深入探讨其作用机制奠定了基础。

通过Cytoscape 3.8.0软件构建CPhGs治疗HCC的“中药-活性成分-靶点-通路”网络，见图6，共有79个节点和901条边，涉及29种活性成分、29个关键靶点、20条KEGG通路，体现了CPhGs可能通过多成分、多靶点、多途径发挥多效应的特点。度值排名前10的靶点蛋白（ALB、AKT1、EGFR、MAPK1、IGF1、SRC、CASP3、MMP9、HRAS、HSP90AAI）进行分子对接，筛选对接结果中结合能低的分子构象即为最优对接结果，其中活性成分与蛋白间的结合能等信息，见表2，具体对接过程，见图7。结果显示，50个对接结果均有较优的（Total score≤-5.0）对接活性，其中，43个对接结果有强烈的匹配活性（Total score≤-7.0）。以上对接结果充分表明，CPhGs活性组分与HCC关键核心靶基因的结合作用良好。表2 活性成分与靶点蛋白结合能结合能（kcal／mol）化松果菊苷肉苁蓉苷A管花苷A毛蕊花糖苷2-乙酰毛蕊花糖苷ALB-8-9-8.2-81-7.5AKT1-8.8-10-8.7-89-9.1EGFR-7.9-7.7-7.3-8.1-7.3MAPK1-8.5-8.8-8.9-8.4-8.8IGF1-5.9-6.7-5.9-6.3-5.9SRC-9.2-9.8-8.5-9.2-7.9CASP3-7.6-7.1-6.7-7.1-7MMP9-9.7-9.7-9.3-9.3-8.7HRAS-6.6-7-8.2-8.2-8.6HSP90AA1-8.8-9.2-8.9-9-8.8图7 靶点受体蛋白与活性成分的分子对接模式A．Acteoside 与AKTI；B．Echinacoside与AKT1；C．Acteoside与HSP90AA1；D．Echinacoside与HSP90AA1。3 讨论HCC是严重威胁人类健康的十大恶性肿瘤之一，具有发病隐匿，进展迅速，治疗困难、转移概率高的特点＂7。HCC是各种信号通路及细胞因子共同参与的病理生理过程，因此单靶点、单通路治疗很难起效。中药具有多成分、多作用靶点和作用途径复杂等特点，并以“人”为核心，将整体与局部相关联，通过中药有效成分在体内的代谢过程，进而从系统上实现药物对机体的调控。通过“中药-活性成分-靶点”的网络结果显示，CPhGs类成分毛蕊花糖苷、松果菊苷、红景天等均具有较高的防治肝癌活性，在治疗过程中可能发挥重要作用。毛蕊花糖苷对环境、饮食及二乙基亚硝胺（DEN）诱导的大鼠肝癌具有预防作用，其发挥作用可能是由STAT-3依赖性的氧化应激和凋亡调控介导的（18）。另外，毛蕊花糖苷可通过干扰JNK信号通路的激活和调控自噬蛋白的表达来抑制肝癌细胞的增殖。研究表明，松果菊苷（ECH）能抑制二乙基亚硝胺（DEN）诱导的小鼠肝癌，并对HepG2肝癌细胞株具有抗增殖和促凋亡作用，其作用机制可能是通过降低TREM2的表达和PI3K／AKT信号通路发挥其抗肿瘤活性201。红景天苷联合奥沙利铂给药可以提高HCC患者的化疗疗效，通过抑制HIF-la信号通路，显著提高HCC患者对铂类药物的敏感性，抑制缺氧诱导的EMT2。综上所述，目前针对CPhGs类成分防治HCC的作用机制研究较少，尚未见有关CPhGs防治HCC作用机制的报道。基于此，本课题应用网络药理学及分子对接技术对CPhGs防治HCC的作用机制进行系统研究，丰富和完善中药、天然药物治疗HCC的研究资料，拓展新疆地产药材肉苁蓉的开发应用价值。

摘要：目的建立HPLC 法测定肉苁蓉水提液中松果菊苷的含量。方法采用HPLC 法测定松果菊苷的含量，色谱柱为Inertsil ODS-SP C18 柱；流动相为乙腈（A）-0.4%磷酸溶液（B），梯度洗脱；检测波长为333 nm；柱温为30 ℃；流速为1.0 mL·min-1；进样量为10 μL。结果松果菊苷在44.939 7 ~ 539.276 4 μg·mL-1 的浓度范围内线性关系良好（r = 0.999 8）；加样回收率为94.59% ~ 105.31%（RSD = 2.93%，n = 9）；3 批肉苁蓉水提液中松果菊苷的平均含量分别为15.527、7.347、12.267 mg·g-1。结论所建立的HPLC 法准确、重复性好、简单易行，适用于肉苁蓉水提液中松果菊苷的含量测定。关键词：高效液相色谱法；肉苁蓉水提液；松果菊苷；含量测定肉苁蓉为临床常用的一种补益中药，有“沙漠人参”的美誉[1]。《中国药典》2015 年版收载的肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉Cistanche deserticola Y. C. Ma 或德赢vwin登录 Cistanche tubulosa（Schenk）Wight 的干燥带鱗叶的肉质茎。其性温，味甘、咸，归肾、大肠经，具有补肾阳、益精血、润肠通便的功效[2]。《神农本草经》谓之可“补中，养五脏，强阴养精气”。肉苁蓉主要含有苯乙醇苷类、环烯醚萜及其苷类、木脂素及其苷类、多糖类、酯类化合物和生物碱等[3]。苯乙醇苷类化合物是肉苁蓉的主要活性成分，其中松果菊苷和毛蕊花糖苷是《中国药典》对肉苁蓉进行鉴别和含量测定的指标性成分。药理研究[4]表明，肉苁蓉具有润肠通便、保肝、抗骨质疏松、抗氧化、抗衰老、抗疲劳等多种药理作用。肉苁蓉水提液能促进大鼠成骨细胞骨形态发生蛋白2 基因，以及去卵巢小鼠血清中抗酒石酸酸性磷酸酶、骨钙素和骨髓中Smad1、Smad5 基因，转化生长因子-β等的表达，有抗骨质疏松的作用[5-6]。松果菊苷能促进成骨细胞的增殖以及促进体外培养的骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化[7-9]。近年，肉苁蓉醇提物及其复方制剂中松果菊苷和毛蕊花糖苷含量测定的研究报道较多[10-12]，但肉苁蓉水提液中指标性成分含量测定的相关报道少见。本研究采用高效液相色谱法（HPLC）测定肉苁蓉水提液中松果菊苷的含量。1 材料1.1 仪器LC-20AT 高效液相色谱仪、SPD-20A 检测器、SIL-20A 自动进样器、CTO-10ASvp 柱温箱、LC solution 液相色谱工作站，日本岛津公司；MES125P-OCE-DU 电子分析天平，德国Sartorius 公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水式多用真空泵，河南省予华仪器有限公司；RC2B SO25 旋转蒸发仪冷却循环系统、RV 10 D S96 旋转蒸发仪，德国IKA 公司；DK-S26电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；UPR系列超纯水机，四川优普超纯科技有限公司。1.2 药材与试剂肉苁蓉药材，购自广州岭南中药饮片有限公司， 批号： 1801001、1806001、181001。经广州中医药大学第三附属医院涂兴明主任中药师鉴定为列当科植物肉苁蓉Cistanche deserticola Y. C.Ma 的干燥带鳞叶的肉质茎，样本存放在广州中医药大学第三附属医院药检室；松果菊苷对照品，含量89.7%，中国食品药品检定研究院，批号：111670-201706；乙腈为色谱纯（德国默克公司）；甲醇、磷酸为分析纯（天津市富宇精细化工有限公司）；水为超纯水。2 方法与结果2.1 肉苁蓉水提液的制备取肉苁蓉药材粗粉，加入10 倍量蒸馏水，加热回流提取2 次，每次1 h，过滤，合并滤液，滤液用旋转蒸发仪浓缩至含生药量为0.100 g·mL-1，4 ℃保存备用。2.2 色谱条件与系统适用性色谱柱：Inertsil ODSSPC18 柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.4%磷酸溶液（B），梯度洗脱：0 ~ 5 min，17%A；5 ~ 25 min，20% A；25 ~ 30 min，17% A；检测波长：333 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL。在该色谱条件下，松果菊苷与相邻组分峰之间的分离度大于1.5，理论塔板数以松果菊苷峰计应不低于4 000。色谱图见图1。2.3 溶液的制备2.3.1 对照品溶液称取松果菊苷对照品适量，精密称定，置于10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解，制成每毫升含松果菊苷898.794 μg 的对照品溶液，4 ℃保存备用。2.3.2 供试品溶液精密量取2.0 mL 肉苁蓉水提液，水浴蒸干，加甲醇溶解，定容至10 mL 容量瓶中，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。2.4 线性关系考察精密量取2.3.1 项下的对照品溶液0.25、0.50、1.00、2.00、2.50、3.00 mL 置于5 mL容量瓶中， 加甲醇定容， 摇匀， 得梯度浓度为44.939 7、89.879 4、179.758 8、359.517 6、449.397 0、539.276 4 μg·mL-1 的对照品溶液，0.22 μm 微孔滤膜过滤。按2.2 项下色谱条件进行测定，记录峰面积。以对照品质量浓度为横坐标（X，μg·mL-1），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得回归方程：Y=13 185.0X-32 273.0，r = 0.999 8。结果表明，松果菊苷在44.939 7 ~ 539.276 4 μg·mL-1 的浓度范围内线性关系良好。2.5 精密度试验取539.276 4 μg·mL- 1 对照品溶液，按2.2 项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果松果菊苷峰面积的RSD 为1.81%，表明仪器精密度良好。2.6 稳定性试验精密量取2.0 mL 肉苁蓉水提液，水浴蒸干，加甲醇溶解，定容至10 mL 容量瓶中，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜过滤，按2.2 项下色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24 h 进样测定，记录峰面积。结果松果菊苷峰面积的RSD 为1.16%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。2.7 重复性试验精密量取2.0 mL 肉苁蓉水提液6 份，按2.3.2 项下方法平行制备6 份供试品溶液，按2.2 项下色谱条件，分别进样测定，记录峰面积。结果松果菊苷质量浓度的RSD 为1.28%，表明方法的重复性良好。2.8 加样回收率试验精密量取1.0 mL 肉苁蓉水提液9 份，分别加入0.8、1.0、1.2 mL 的对照品溶液（1.552 mg·mL-1），水浴蒸干，加甲醇溶解，定容至10 mL 容量瓶中；摇匀，0.22 μm 微孔滤膜过滤，制得高、中、低浓度的供试品溶液，每个浓度平行制备3 份，按2.2 项下色谱条件进行测定，记录峰面积并计算加样回收率。结果见表1。2.9 样品含量测定精密量取2.0 mL 肉苁蓉水提液各3 份，水浴蒸干，加甲醇溶解，定容至10 mL 容量瓶中，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜过滤，按2.2 项下色谱条件进行测定，记录峰面积，计算松果菊苷的含量。结果见表2。3 讨论3.1 供试品制备方法肉苁蓉水提液中含有苯乙醇苷类、多糖类等多种化学成分，对待测成分产生一定的干扰。本研究考察了50%甲醇和甲醇两种不同浓度的溶剂。结果表明，以50%甲醇为溶剂的供试品色谱图中松果菊苷与相邻组分峰的分离效果较差；以甲醇作为溶剂，松果菊苷峰的分离度较好，且无其他杂质峰干扰。故选用甲醇作为供试品溶液的溶剂。以甲醇为溶剂，肉苁蓉水提液水浴蒸干，采用甲醇溶解定容摇匀和甲醇超声（10 min）溶解两种处理方法。结果显示，两种方法无明显差异。因甲醇溶解定容摇匀操作简便，故选用此方法制备供试品溶液。3.2 流动相的选择本研究参考2015 年版《中国药典（一部）》[2]肉苁蓉药材项下含量测定的流动相（甲醇-0.1%甲酸）进行测定，结果发现，松果菊苷峰展宽且出现前沿现象，可能与流动相洗脱能力弱有关；参考相关文献[12-13]，以乙腈-0.5%醋酸为流动相，但松果菊苷峰形较差，且出现拖尾现象，考虑为流动相pH 值的问题，最终以乙腈-0.4%磷酸为流动相，结果理论塔板数以松果菊苷峰计大于4 000，松果菊苷与相邻组分峰之间的分离度大于1.5，峰形对称，无杂质峰干扰，基线稳定。因此，本研究松果菊苷含量测定采用乙腈-0.4%磷酸为色谱流动相。本研究采用HPLC 法测定肉苁蓉水提液中松果菊苷的含量，该方法操作简单，结果准确，重复性好，适用于肉苁蓉水提液中松果菊苷的含量测定，可作为肉苁蓉水提液的质量控制方法。本研究仅测定了肉苁蓉水提液中松果菊苷的含量，后续拟对肉苁蓉复方汤剂中松果菊苷的含量进行测定，以探讨各种因素对松果菊苷含量的影响，为含肉苁蓉的汤剂的质量控制提供参考。参考文献：[1] 钟平. 沙漠人参肉苁蓉[J]. 森林与人类，2004，24（11）：25.[2] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典（一部）[M]. 北京：中国医药科技出版社，2015：135-136.[3] 陈飞，陈卓，邢雪飞，等. 肉苁蓉的研究进展[J]. 药物评价研究，2013，36（6）：469-475.[4]方鉴. 肉苁蓉的药理研究进展[J]. 光明中医，2017，32（14）：2140-2142.[5] 邢晓旭，刘钟杰，韩博. 肉苁蓉水提液对大鼠成骨细胞骨形态发生蛋白2基因表达的影响[J]. 中国畜牧兽医，2013，40（1）：17-21.[6] LIANG H，YU F，TONG Z，et al. Cistanches herba aqueous extractaffecting serum BGP and TRAP and bone marrow Smad1 mRNA，Smad5 mRNA，TGF-β1 mRNA and TIEG1 mRNA expression levelsin osteoporosis disease[J]. Molecular Biology Reports， 2013， 40（2）：757-763.[7] 方海林，李军考，姚森明，等. 松果菊苷通过激活ERK/BMP-2信号通路促进大鼠成骨细胞增殖观察[J]. 基层医学论坛，2015，19（4）：435-438.[8] 田原. 松果菊苷诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化及作用机制研究[D]. 沈阳：辽宁中医药大学，2015.[9] 尉大为，葛锌雨，刘奕含，等. 松果菊苷诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的研究[J]. 中药药理与临床，2017，33（2）：48-52.[10] 田玉彪，杨广安，黄维杰，等. HPLC测定肉苁蓉微粉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量[J]. 安徽农业大学，2015，43（3）：171-173.[11] 杨素德，胡军华，李家春，等. HPLC法同时测定苁蓉总苷胶囊中松果菊苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷的含量[J]. 世界科学技术-中医药现代化，2015，17（3）：609-613.[12] 许晓雪. 肉苁蓉及其有效成分抗骨质疏松药效学及代谢组学研究[D]. 银川：宁夏医科大学，2017.[13] 闫瑶，孟新源，许欢欢，等. 高效液相色谱法测定芪蓉润肠口服液中松果菊苷与毛蕊花糖苷的含量[J]. 新疆医科大学学报，2018，41（7）：886-888，892.

摘要目的：优化德赢vwin登录 中毛蕊花糖苷的提取工艺，为该药材的深入开发和综合利用提供参考。方法：采用高效液相色谱法对德赢vwin登录 中的毛蕊花糖苷进行含量测定。色谱柱为Inertsil-ODS-3V，流动相为甲醇-0.2％甲酸水溶液（40 ∶60，V/V），流速为1 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为330 nm，进样量为10 μL。以毛蕊花糖苷的提取率为考察指标，分别对浸泡时间、乙醇浓度、液料比、提取时间、提取次数进行单因素试验；根据上述试验结果采用Box-Behnken 响应面法对乙醇浓度、液料比、提取时间等条件进行优化，并对优化后的提取工艺进行验证试验。结果：毛蕊花糖苷检测质量浓度的线性范围为18.65～932.4 μg/mL。最优提取工艺为乙醇浓度63％、液料比8 ∶1（mL/g）、浸泡2 h、提取时间1.5 h、提取2 次。3 次平行验证试验所得毛蕊花糖苷的提取率分别为78.21％、76.95％、79.34％，与预测值76.76％的相对误差分别为1.89％、0.25％、3.36％。结论：优化所得德赢vwin登录 中毛蕊花糖苷的提取工艺稳定、可行，适用于该化合物的提取。关键词德赢vwin登录 ；毛蕊花糖苷；响应面法；Box-Behnken 设计；提取工艺；优化德赢vwin登录 为列当科植物德赢vwin登录 [Cistanche tubulosa（Schenk）R. Wight]的干燥带鳞叶的肉质茎，性温、味甘咸，为补肾壮阳、润肠通便之要药，是中亚地区及新疆特有的药用植物，主要分布于南疆塔克拉玛干沙漠边缘地区[1]。德赢vwin登录 收载于2015 年版《中国药典》（一部）[2]，其主要功能成分为苯乙醇苷类化合物[3]。近年来研究发现，德赢vwin登录 中的苯乙醇苷类化合物在神经保护[4]和延缓神经退行性疾病[4-5]方面具有良好的开发前景，现已成为研究的热点之一。毛蕊花糖苷为苯乙醇苷类化合物中的活性成分之一，本课题组前期药效评价实验结果表明，毛蕊花糖苷对神经细胞具有保护作用[4]、对东莨菪碱所致小鼠学习记忆获得性障碍具有改善作用[5]、对D-半乳糖致衰老模型小鼠的氧化损伤具有抑制作用[6]。毛蕊花糖苷在德赢vwin登录 中的含量约为0.05～8％[7]，对其进行开发利用具有很大的药用前景。药效学实验表明，毛蕊花糖苷具有多靶点作用，有望开发成保护脑神经、改善记忆的脑病药物[8-9]。Box-Behnken 响应面设计法是可靠的实验设计以及分析方法，可通过对过程的回归拟合和响应曲面、等高线的绘制来计算出响应于各因素水平的响应值，是解决多变量问题的一种有效的统计方法[10]。鉴于此，本研究采用该法优化德赢vwin登录 中毛蕊花糖苷的提取工艺，为德赢vwin登录 的深入开发和综合利用提供参考。1 材料1.1 仪器LC-20AT型高效液相色谱仪，包括LC-20AB型二元泵、SPD-M20A型二极管阵列检测器、CBM-20A型系统控制器、CTO-20A型柱温箱、SIL-20A型自动进样器（日本Shimadzu 公司）；SQP-QUINTIX 35-1 CN型万分之一分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；DZTW型恒温电热套（北京市永光明医疗仪器有限公司）。1.2 药品与试剂德赢vwin登录 炮制片（新疆维吾尔自治区和田苁蓉堂2015 年秋收炮制片，批号：20150806，毛蕊花糖苷含量：≥3.79％；将德赢vwin登录 炮制片用药锤敲碎，粉碎机粉碎后过四号筛，即得德赢vwin登录 粉末，备用）；毛蕊花糖苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111530-201208，纯度：92.5％）；甲醇为色谱纯，甲酸、乙醇等为分析纯，水为纯化水。2 方法与结果2.1 毛蕊花糖苷的含量测定采用高效液相色谱法（HPLC）测定。2.1.1 色谱条件色谱柱：Inertsil ODS-3V（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.2％甲酸水溶液（40 ∶60，V/V）；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：330 nm；进样量10 μ L。在上述色谱条件下，取“2.1.2”“2.1.3”“2.1.4”项下溶液进样测定，色谱图见图1。2.1.2 对照品溶液的制备取毛蕊花糖苷对照品适量，精密称定，置于10 mL棕色量瓶中，加50％甲醇溶解并稀释至刻度，得每1 mL含毛蕊花糖苷0.932 4 mg的对照品溶液。2.1.3 供试品溶液的制备准确称取德赢vwin登录 粉末100 g，按液料比8 ∶1（溶剂体积∶粉末质量，mL/g，下同）加入63％乙醇，浸泡2 h，然后置于100 ℃恒温水浴锅中回流提取2 次，每次1.5 h，趁热滤过，放冷，合并提取液，精密量取提取液1 mL至25 mL量瓶中，加50％甲醇定容，即得。2.1.4 阴性对照溶液的制备分别以50％甲醇与63％乙醇作为阴性对照溶液。2.1.5 方法学考察精密量取“2.1.2”项下对照品溶液0.2、0.5、1、2、3、5、10 mL，分别置于10 mL 量瓶中，加50％甲醇定容至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，按“2.1.1”项下色谱条件测定。以对照品溶液质量浓度（x）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程为y＝19 952x－218 412（r＝0.999 8），表明毛蕊花糖苷检测质量浓度的线性范围为18.65～932.4 μg/mL。以信噪比10 ∶1、3 ∶1 测得定量限、检测限分别为0.229 6、0.071 8 μg/mL。方法学考察结果显示，精密度[毛蕊花糖苷峰面积的RSD为0.57％（n＝6）]、稳定性[毛蕊花糖苷峰面积的RSD为1.38％（n＝6）]、重复性[毛蕊花糖苷峰面积的RSD为0.87％（n＝6）]、加样回收率[毛蕊花糖苷低、中、高质量浓度的平均加样回收率依次为99.6％、100.5％ 、100.7％ ，RSD 分别为2.55％ 、0.83％ 、0.44％（n＝9）]均符合2015年版《中国药典》（四部）要求[11]。2.2 提取方法准确称取德赢vwin登录 粉末，按一定液料比加入适宜浓度的乙醇，浸泡一定时间后，置于100 ℃恒温水浴锅中回流提取数次，趁热滤过，放冷，合并提取液，精密移取提取液1 mL至25 mL 量瓶中，以50％甲醇定容后，取样10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，按标准曲线法计算毛蕊花糖苷含量。另取德赢vwin登录 粉末，采用2015 年版《中国药典》（一部）项下方法[2]进行含量测定，并通过以下公式计算毛蕊花糖苷提取率[12]：提取率（％）＝{[提取液体积（mL）×提取液含量（mg/mL）]/[药材质量（g）×药材含量（mg/g）]}×100％。2.3 单因素试验在德赢vwin登录 苯乙醇苷类成分乙醇回流提取的过程中，浸泡时间、乙醇浓度、提取时间、液料比、提取次数等因素对提取效果有重要影响[13-14]。因此本研究以毛蕊花糖苷提取率为考察指标，对上述因素进行考察。2.3.1 浸泡时间称取德赢vwin登录 粉末100 g，共5 份，固定提取时间为1 h、液料比为10 ∶1、溶剂浓度为60％、提取次数为1 次，分别对浸泡时间0、2、8、12、24 h 进行考察，结果见图2A。由图2A可见，当浸泡时间≥2 h，毛蕊花糖苷的提取率基本趋于稳定，综合考虑提取效率，最终确定最佳浸泡时间为2 h。2.3.2 乙醇浓度称取德赢vwin登录 粉末100 g，共4 份，固定提取时间为1 h、液料比为10 ∶1、浸泡时间为2 h、提取次数为1 次，分别对提取溶剂水、40％乙醇、60％乙醇和80％乙醇进行考察，结果见图2B。由图2B 可见，当乙醇浓度为60％时，毛蕊花糖苷的提取效果最好；提高乙醇浓度至80％时，毛蕊花糖苷的提取效率反而下降，故选择乙醇浓度50％～70％进行后续试验。2.3.3 提取时间称取德赢vwin登录 粉末100 g，共4 份，固定液料比为10 ∶1、乙醇浓度为60％、浸泡时间为2 h、提取次数为1 次，分别对提取时间1、1.5、2、2.5 h 进行考察，结果见图2C。由图2C可见，随着提取时间延长，毛蕊花糖苷提取率先增大后减小，于1.5 h 达到峰值，故选择提取时间1～2 h进行后续试验。2.3.4 液料比称取德赢vwin登录 粉末，100 g，共4 份，固定提取时间为1.5 h、乙醇浓度为60％、浸泡时间为2 h、提取次数为1 次，分别对液料比6 ∶1、8 ∶1、10 ∶1、12 ∶1 进行考察，结果见图2D。由图2D 可见，当液料比为8 ∶ 1时，毛蕊花糖苷的提取率最高；随着液料比增加，毛蕊花糖苷提取率先增大后减小，故选择液料比6 ∶1～10 ∶1 进行后续试验。2.3.5 提取次数称取德赢vwin登录 粉末100 g，共4 份，固定液料比为8 ∶1、乙醇浓度为60％、浸泡时间为2 h、提取时间为1.5 h，分别对提取次数1、2、3、4 次进行考察，结果见图2E。由图2E 可见，提取2 次后毛蕊花糖苷的提取率为73.57％，提取第3 次与第4 次时毛蕊花糖苷提取率基本不变，考虑工艺的成本，最终确定最佳提取次数为2 次。由上述单因素试验结果可知，浸泡2 h 以后，延长浸泡时间所得毛蕊花糖苷的提取率基本保持不变；提取2次以后，增加提取次数所得提取率亦基本保持不变。故从节约能源与缩短试验周期的角度考虑，未将浸泡时间与提取次数作为后续优化因素。2.4 Box-Behnken响应面试验2.4.1 Box-Behnken 试验设计在单因素试验的基础上，选择乙醇浓度（A）、液料比（B）、提取时间（C）为考察因素，采用3 因素3 水平的响应面法进行试验。因素与水平见表1，试验设计与结果见表2。2.4.2 模型建立与方差分析通过Design-Expert 8.0.5软件对上述试验结果进行多元二次回归拟合，得到回归方程：毛蕊花糖苷提取率（Y）＝75.86+5.38A+1.38B－0.58C + 0.18AB + 0.57AC + 0.57BC － 9.00A2 － 5.26B2 －2.50C2（r＝0.993 3）。r＞0.09 提示该模型拟合度较好，预测性较好[15]。对该模型进行方差分析，结果见表3。根据表3 中F 的大小，推测影响本试验提取率大小的影响因素为乙醇浓度＞液料比＞提取次数，所建模型经检验具有显著性（P＜0.000 1），说明模型与实际情况吻合良好；模型失拟项检验不具有显著性（P＝0.671 5＞0.05），说明未知因素对模型拟合结果的干扰少，模型误差较小；可用该模型较好地描述各因素与响应值之间的真实关系。因此，可用该模型预测毛蕊花糖苷的提取工艺条件。2.4.3 响应面图与等高线图分析分别以乙醇浓度（A）、液料比（B）、提取时间（C）为响应因子，以毛蕊花糖苷提取率为响应值，使用Design-Expert 8.0.5软件绘制响应面和等高线图，详见图3。乙醇浓度和液料比的交互作用对毛蕊花糖苷提取率的影响如图3A、3B 所示，固定液料比，乙醇浓度在50％～62.96％范围内，毛蕊花糖苷的提取率逐渐增高，当乙醇浓度超过62.96％时，毛蕊花糖苷的提取率降低，当固定乙醇浓度时，毛蕊花糖苷的提取率随着液料比的增加，先增大后减小；图3B等高线图表明，乙醇浓度和液料比之间的交互作用显著。乙醇浓度和提取时间的交互作用对毛蕊花糖苷的提取率影响如图3C、3D所示，固定乙醇浓度，提取时间在1～2 h 的范围内毛蕊花糖苷的提取率先升高后下降，提取率最高点对应的提取时间为1.47 h；图3D等高线图表明，乙醇浓度和提取时间交互作用显著。提取时间和液料比的交互作用对毛蕊花糖苷的提取率影响如图3E、3F 所示，固定提取时间，液料比在6 ∶1～10 ∶1 的范围内毛蕊花糖苷提取率先增高后下降，提取率最高点对应的液料比为8.26 ∶1；图3F 等高线图表明，液料比和提取时间之间的交互作用显著。根据以上结果，运用Design-Expert 8.0.5 软件优化所得的毛蕊花糖苷提取最佳工艺为乙醇浓度62.96％、液料比8.26 ∶ 1、浸泡时间2 h、提取时间1.47 h、提取2次。在此条件下毛蕊花糖苷提取率的预测值为76.76％。考虑到试验的便捷性、可行性与可操作性，笔者对预测的工艺参数进行微调，选择工艺参数为乙醇浓度63％、液料比8 ∶1、浸泡时间2 h、提取时间1.5 h、提取2 次。2.5 验证试验取德赢vwin登录 粉末100 g，共3 份，进行验证试验。结果，3 次验证试验毛蕊花糖苷提取率的RSD为1.20％（n＝3），实测值与预测值的相对误差分别为1.89％、0.25％、3.36％，表明方程与真实试验情况拟合较好，优化的工艺可靠、可行，详见表4。3 讨论响应面法是通过一系列确定性的试验，拟合一个响应面来模拟真实极限状态的曲面图，其基本思想是假设一个包括一些未知参量的极限状态函数与基本变量之间的解析表达式来代替实际不能明确表达的结构极限状态函数[16-20]。而传统数理统计不能在已有“点”数据基础上对整体的“面”数据进行预测。因此，传统数理统计具有一定的局限性[17]。利用响应面设计试验，根据Box-Behnken 的中心组合试验设计原理来寻求最优的考察因素和响应值来避免传统数理统计存在的问题，最终精确找到最佳点并灵敏地考察各因素间的交互作用[17-22]。有关德赢vwin登录 中总苯乙醇苷类化合物的提取工艺报道较多[23-24]，但对于因素的优化均采用正交试验方法进行，因此本文采用Box-Behnken 响应面分析法对德赢vwin登录 中毛蕊花糖苷的提取工艺进行研究。本研究选择浸泡时间、乙醇浓度、液料比、提取时间、提取次数等进行单因素试验，并从中筛选对提取率影响较明显的3 个因素（即乙醇浓度、液料比、提取时间）及相应水平，运用3 因素3 水平的响应面分析法进行最佳提取工艺筛选。该方法获得拟合程度较高的数学模型，交互作用结果表明乙醇浓度、提取时间和液料比对毛蕊花糖苷提取率的影响并非简单的线性关系。在乙醇浓度考察中，乙醇浓度至80％时毛蕊花糖苷的提取效率反而下降的原因，笔者认为，一方面，当乙醇浓度达到50％～70％时，药物在该溶剂中的溶解度最高；另一方面，可能是由于“相似相溶”原理，60％乙醇的极性与毛蕊花糖苷极性相近[25]。在提取时间考察中，随着提取时间的延长，毛蕊花糖苷提取率反而下降，可能与毛蕊花糖苷发生降解有关。在提取液料比考察中，毛蕊花糖苷提取率的变化与其向溶剂扩散有关。当液料比低于6 ∶1 时，两相界面间的浓度差较小，不利于成分扩散；当液料比大于8 ∶1 时，受到已提成分对未提成分协同浸提作用的影响，提取率反而降低；当液料比大于10 ∶1时，成分质量浓度下降，不利于协同浸提，毛蕊花糖苷提取率反而降低[25-26]。最终获得的最佳工艺参数为乙醇浓度63％、液料比8 ∶1、提取时间1.5 h，并通过验证试验证明了工艺的可行性。本工艺所用乙醇浓度为63％，浓度较低，可节省生产成本；同时，与其他提取方法[27-28]相比，具有更好的可重复性；此外，回流提取法简便易行，可作为进一步扩大生产的依据。综上所述，本研究优化所得德赢vwin登录 中毛蕊花糖苷的提取工艺稳定、可行，适用于该化合物的提取。参考文献[ 1 ] 郭元亨.荒漠肉苁蓉资源的综合利用[D].北京：中国科学院大学，2017.[ 2 ] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2015 年版.北京：中国医药科技出版社，2015：135-136.[ 3 ] 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当前，男性不育发生率呈现上升趋势。大约有15%的育龄夫妇不能生育，而男性因素所致不育症比例约为50%[1]。引起男性不育的因素甚为复杂，而少弱精子症是男性不育的重要原因。目前治疗少弱精子症药物主要有抗雌激素类药物克罗米芬、L-肉碱类左卡尼汀、抗氧化剂维生素E等，临床上多联合使用，有效率不高。近年来中医从补肾益精、健脾疏肝、活血通络等治法入手，取得了良好的临床疗效，对其有效成分及作用机制等基础研究也日益增多。现将近年来常用中药治疗少弱精子症的分子机制相关研究进展综述如下。一、中草药（一）巴戟天巴戟天具有壮阳补肾、固精安神等功效，其提取物不仅能提高精子数量及存活率、降低精子畸形率，而且对睾丸微细结构和超微结构的损伤具有修复作用。环境污染、生殖道感染以及精索静脉曲张等因素均可使精液中活性氧（reactive oxygen species，ROS）过量，过量的ROS造成氧化应激，不仅会损伤精子膜的结构和功能，还会进一步损伤精子DNA，导致精液质量下降。而巴戟天提取物能增加睾丸组织中超氧化歧化酶（superoxide dismutase，SOD）含量，通过SOD清除自由基，抑制细胞膜脂质过氧化反应，对精子氧化损伤具有保护作用 [2]。巴戟天提取物可作用于环磷酰胺诱导生精障碍大鼠睾丸支持细胞，提高支持细胞中卵泡刺激素受体（follicle stimulatinghormone receptor，FSHR）mRNA和雄激素结合蛋白（androgen binding protein，ABP）mRNA表达,其机制可能是增加卵泡刺激素（follicle-stimulatinghormone，FSH )与FSHR结合，通过cAMP-PKA、Ca+等通路，促进蛋白磷酸化，增加蛋白产物ABP的表达，ABP与睾酮特异性结合，可维持生精小管内的睾酮水平，为精子的发生和成熟提供适宜的环境[3]。巴戟天还能直接作用于垂体，增加垂体质量，促进其合成和分泌FSH，进而促进生精；但部分研究发现各治疗组FSH水平差异并无统计学意义，可能是巴戟天并非直接作用于垂体，而是通过影响激素水平，通过反馈机制作用于下丘脑-垂体-睾丸轴[4]。此外，巴戟天中药治疗少弱精子症的分子机制研究进展孔祥军 综述 姜 睿 审校西南医科大学附属医院泌尿外科（四川泸州 646000）含有在精子的发生、成熟、获能过程中均有重要作用的锌等微量元素，可能与其改善精子质量有关。（二）肉苁蓉肉苁蓉是治疗男性生殖功能障碍的常用组方药，其活性成分主要包括苯乙醇苷类、多糖类、黄酮等物质。肉苁蓉能保护小鼠睾丸组织，改善附睾管微环境，规范生精小管形态，增加睾丸间质细胞数量，提高睾酮水平，使睾丸生精功能增强。其作用机制可能是肉苁蓉能上调精子生成过程中能量代谢的关键酶-乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）及睾酮合成过程中起关键作用的StAR、CYP11A1、CYP17A1、CYP3A4、β-HSD及17β-HSD等类固醇生成酶的表达，进而提高睾酮水平 [5, 6]。肉苁蓉苯乙醇苷可提高体外大鼠精子悬液SOD活力，降低丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量，对ROS所致精子膜的氧化应激损伤具有拮抗作用，且中、大剂量组（0.25，0.5g/mL）肉苁蓉苯乙醇苷抗氧化活性明显优于维生素C[7]。（三）锁阳锁阳有补肾阳、益精血、润肠通便之功效。锁阳能显著提高少、弱精子症模型大鼠的精子数量和活力，增加睾丸质量。其糖类、黄酮类、多酚类物质均具有良好的清除氧自由基作用,能防止过量ROS造成氧化应激而导致的精子数量及活力下降。锁阳中含有锌、锰等多种微量元素，对精子的形态及活力均有积极作用。锁阳可诱导大鼠睾丸支持细胞中胶质细胞源性营养因子（glial cell line-derived neurotrophicfactor，GDNF）的表达，GDNF与精原干细胞表面受体GFRα1特异性结合后，激活Ret蛋白酪氨酸激酶，随后激活PI3K/AKt、Src、Ras/ERK1/2等信号通路，引起通路下游相应转导因子表达上调，促进精原干细胞的增殖，进而促进精子发生过程； GDNF还能以自分泌方式促进支持细胞的分裂和成熟，参与睾丸的发育；此外，GDNF能以旁分泌形式作用于毛细血管内皮细胞，促进其增殖及形成紧密连接，参与血睾屏障的形成[8]。（四）黄芪黄芪的有效成分包括黄芪总酮（TFA）、黄芪总多糖（TPA）、黄芪总皂苷（TSA）等。黄芪作为体外添加剂在辅助生殖技术如宫腔内人工授精（IUI）、体外受精（IVF）以及精子冻存技术中具有应用价值，加入黄芪注射液后的人精子活力、直线速度（VSL）、曲线速度（VCL）、平均路径速度（VAP）均明显升高，这可能与黄芪的抗氧化活性以及能增加精子内Ca+浓度，增强精子线粒体活性有关[9]。cAMP反应元件调节因子（cAMP-responsiveelement modulator, CREM）和睾丸特异性CREM激活因子（activator of CREM in testis, ACT）在精子减数分裂后的细胞分化中起重要作用，黄芪还能通过增加大鼠睾丸中CREM和ACT蛋白的表达来促进精子发育[10]。此外，TPA具有抑制血小板凝集、促进纤溶活性、扩张血管的作用，还能提高抗氧化相关酶的活性，降低过氧化脂质含量，减轻自由基造成的氧化损伤，改善精子质量。（五）淫羊藿淫羊藿有增强精子活力、增加精子数量、刺激阴茎勃起等作用。淫羊藿苷是淫羊藿茎叶中提取的总黄酮，是淫羊藿的主要生物活性成分。睾丸生精小管内保持较高浓度的睾酮对促进精子的发生具有重要作用，淫羊藿苷有性激素样作用，能直接刺激性腺使睾酮分泌增加。此外，淫羊藿苷还能通过调控在睾酮合成中起重要作用的外周型苯二氮卓受体（peripheralbenzodiazepine receptor，PBR）和类固醇激素急性调节蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，StAR）的表达，以及作用于下丘脑-垂体-性腺轴来调控睾酮水平[11]。淫羊藿苷能提高大鼠精子悬液SOD活力，降低MDA含量，有助于减轻精子DNA的氧化性损伤，保护精子的正常形态和功能 [12]。有研究表明在腺嘌呤所致睾丸损伤的模型大鼠中，与甲基睾酮相比，淫羊藿总黄酮抗氧化作用优于前者，但对血清睾酮值的改善弱于前者；与维生素E相比，其对血清睾酮值的改善优于前者，而抗氧化作用则弱于前者[13]。此外，淫羊藿苷还能通过激活ERK1/2信号通路促进支持细胞体外增殖[14]，而支持细胞有为生精细胞提供支架、参与血-睾屏障的形成、分泌多种精子分化、成熟所必须的物质等重要功能，这可能是淫羊藿苷改善生殖功能的作用机制之一，但其是否能促进体内支持细胞增殖，尚待进一步研究。（六）枸杞子枸杞子的主要活性成分为枸杞多糖（lyciumbarbarum polysaccharide，LBP），LBP主要由木糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露醇组成。LBP可通过调节垂体性腺轴，维持T、TSH、LH之间平衡，维持正常的生精环境。LBP具有抗氧化活性，能提高辐射诱导的少弱精子症模型小鼠精子悬液SOD活力，降低MDA含量,减轻睾丸组织氧化损伤，促进生殖腺体的发育和恢复，提高精子数量和活力[15]。精子减少与生精细胞发生凋亡有关，调控生精细胞凋亡的基因主要有Fas/Fasl基因、Bcl-2/Bax基因家族、P53基因、HSP基因等。研究发现，LBP可通过上调抑凋亡基因Bcl-2、Bcl-w、Hsp70的蛋白表达，下调促凋亡基因Bax、Fas、P53的蛋白表达，以及抑制细胞色素C（cytC）自线粒体的释放，减少Caspase-3的表达，从而减少生精细胞的凋亡 [16, 17]。此外，有研究发现，在环磷酰胺诱导的少精子症小鼠模型中，枸杞煎提液各剂量治疗组较对照组睾丸中初级精母细胞（4C细胞）比例均有一定程度升高，因而推测枸杞子治疗少精子症的机制与其能促进精原细胞分裂和分化，进而促进4C细胞的增殖有关[18]。（七）菟丝子菟丝子主要含黄酮类、糖苷、微量元素等，其中菟丝子黄酮为其主要药效成分，有促进生殖系统发育，改善精子活力、存活率的作用。菟丝子黄酮在妇科内分泌疾病中也有广泛应用，这表明菟丝子并非是某种激素的替代物，而是能够作用于下丘脑-垂体-性腺轴，具有促性腺激素样作用。菟丝子提取物有较好的抗氧化活性，且0.25g/mL生药的菟丝子提取物抗氧化活性明显优于维生素C，能提高精子悬液SOD活性，降低MDA含量，提高精子抗氧化能力，对精子膜结构和功能具有保护作用[19]。菟丝子黄酮可通过修复生精细胞S期，干预生精细胞的分裂周期，保护生精细胞的增殖能力，同时可通过下调凋亡基因Fas与Fasl的表达来减少生精细胞的凋亡[20]。菟丝子提取物能增加大鼠睾丸中细胞色素P450芳香化酶（cytochromeP450aromatase,P450arom）和CYP19的表达，P450arom是睾丸合成雌激素的限速酶，CYP19是雌激素合成的关键基因，而内源性雌激素水平异常可使输精管、附睾和睾丸网小管发生损害，导致生殖细胞凋亡和分化障碍，因此，菟丝子可能通过调控雌激素的合成来影响精子的发生[21]。适宜浓度的菟丝子在有效的时间内能明显改善弱精子症患者体外精子活力、运动功能、增强受精过程中重要的蛋白水解酶-顶体酶的活性，利于精子对卵细胞卵丘的分解及对透明带的穿透，易于受精，这可能是其作用于弱精子症的机制之一，同时也表明菟丝子在体外受精技术中可能具有应用价值[22]。（八）五味子五味子是治疗男性生殖功能障碍的常用中药，其主要成分为多糖、木脂素、黄酮等。五味子多糖能使环磷酰胺诱导的生精障碍小鼠生精上皮层数增加、细胞层次分明、生精细胞排列整齐；较对照组精子浓度、精子存活率升高，精子畸形率降低，血清FSH和LH水平降低，睾丸组织中T含量升高，其机制可能与恢复下丘脑-垂体-性腺轴调控，调节生殖激素水平有关[23]。此外，五味子多糖、木脂素均有较强的抗氧化作用，能提高SOD、GSH-PX等抗氧化酶活性，对超氧化阴离子自由基、羟基自由基及DPPH自由基均有一定的清除效果，可能与五味子保护生精功能有关[24, 25]。（九）丹参丹参为临床常用中药，目前主要在心脑血管疾病的治疗中广泛应用，而丹参类药物在男性不育、附睾炎、精索静脉曲张等男性生殖系统疾病中也有较好疗效。丹参水提液能改善由环磷酰胺损伤构建的少、弱精子小鼠模型的精子浓度、存活率、总活力，提高向前运动精子百分比（PR）、精子平均运动速度（CVP）及直线运动速度指标（VSL），且可以减少生精细胞早期染色体畸变与精子DNA损伤，这可能与其抗氧化活性有关[26]。此外，丹参对大肠埃希菌、金色葡萄球菌等均有抑制作用，复方丹参注射液能明显提高大肠埃希菌生殖系统感染小鼠的精子数量、精子存活率，降低精子畸形率 [27]。二、中成药（一）五子衍宗丸有“种子第一方”之称的五子衍宗丸是中医补肾益精经典名方，由枸杞子、菟丝子、车前子、五味子、覆盆子5味中药组成。多项临床试验表明五子衍宗丸可显著改善少、弱精子症患者精液质量，提升精子浓度，提高精子总活力，降低精子畸形率。与左旋肉碱相比，五子衍宗丸对精子数量和浓度的改善优于左旋肉碱，而对精子总活力的改善则弱于左旋肉碱，两者合用具有协同作用[28]。其作用机制有：（1）参与调节下丘-垂体-性腺轴，促进睾酮的分泌；（2）提高精子胞浆中果糖及Ca+浓度，增加精子线粒体膜电位，减轻精子线粒体结构损伤，维持精子正常的活力及运动能力 [29]；（3）有较强的抗氧化能力，可减轻辐射诱导的模型大鼠睾丸及精子的氧化损伤，其抗氧化作用优于维生素E [30]；（4）参与调控支持细胞线粒体自噬来维持支持细胞正常功能，以及抑制Cox7a2基因过表达来调控大鼠睾丸支持细胞雄激素结合蛋白（ABP）、转铁蛋白（TF）、抑制素B（INHB）等分泌产物水平，进而改善生精功能[31]；（5）提高Bcl-2蛋白表达水平，降低Bax、Caspase-3、p-p53、p-p38蛋白的表达，减少生殖细胞凋亡[32]。（二）养精胶囊养精胶囊是益肾填精法的代表方药，成分包括淫羊藿、当归、黄精、熟地、紫河车等，可用于少弱精子症、勃起功能障碍等男性生殖系统疾病。养精胶囊能通过引发PI3K/AKT通路激活，上调POU3F1，促进GC-1精原干细胞增殖[33]。养精胶囊还能通过cAMP/PKA通路，促进StAR、CYP11A1、HSD3B等类固醇生成酶mRNA和蛋白的表达，提高睾酮的合成。同时StAR还能下调促凋亡因子Bax、Caspase-3的表达，提高抗凋亡因子Bcl-2的表达，减少生殖细胞凋亡[34, 35]。养精胶囊除能促进精原干细胞增殖及减少生殖细胞凋亡外，还能改善睾丸微循环，维持适宜的生精环境，与其抗氧化活性及促进血管内皮生长因子分泌相关，但具体作用机制尚缺乏文献报道。（三）黄精赞育胶囊黄精赞育胶囊由黄精、淫羊藿、菟丝子、丹参、枸杞子、五味子、熟地黄、续断等中药组方。黄精赞育胶囊能增加少弱精子症患者精子数量，提高精子活力，且与克罗米芬、左卡尼汀等药物联合应用疗效更佳。其改善精子活力及运动能力的机制可能与其能增强精子线粒体琥珀酸脱氢酶和乳酸脱氢酶能量代谢活性，提高精子ATP含量，以及增加与精子获能及运动能力相关的钙通道蛋白Catsper1的表达相关[36]。此外，黄精赞育胶囊还能通过调控Bax、Caspase-3和Bcl-2蛋白和基因的表达来抑制生精细胞凋亡。精子形态结构以及DNA完整性与精子质量密切相关，该药除能改善少弱精子症患者的一般精液参数外，还能有效改善精子DNA损伤，对精子头体、颈部、鞭毛等超微结构形态也具有修复作用，具体作用机制不详，可能与其抗氧化作用有关[37, 38]。综上所述，少弱精子症的病因复杂，包括生殖道感染、环境及理化因素、精索静脉曲张、内分泌疾病、遗传性疾病等。在治疗上，西医主要应用克罗米芬、左卡尼汀、促性腺激素等药物，疗效有限，而传统中医药取得了较好的疗效。其作用机制主要包括：（1）抗氧化作用 如巴戟天、肉苁蓉、锁阳、黄芪、淫羊藿等能增加睾丸中SOD含量，降低MDA含量来拮抗生殖细胞及精子的氧化损伤，且抗氧化活性普遍优于维生素E和维生素C；（2）调节激素水平 如巴戟天、肉苁蓉、淫羊藿、枸杞子、菟丝子、五味子等能作用于下丘脑-垂体-睾丸轴来促进睾酮的分泌，且肉苁蓉、淫羊藿还能通过增加StAR等类固醇生成酶的分泌来促进睾酮分泌；（3）促进生精细胞增殖 锁阳可以增加睾丸GDNF表达，激活PI3K/AKt、Src、Ras/ERK1/2等信号通路，促进精原干细胞的增殖。而枸杞子也能促进精原细胞分裂和分化，促进4C细胞的增殖，但其具体作用途径尚不明确；（4）抑制生精细胞凋亡 如枸杞子、菟丝子可以通过上调抑凋亡基因Bcl-2，下调促凋亡基因Bax、Fas来减少生精细胞的凋亡；（5）其他 如巴戟天、锁阳富含锌等微量元素对精子的生成过程也具有重要作用；锁阳、淫羊藿能促进支持细胞增殖；菟丝子、黄芪可增加体外精子的运动能力，在辅助生殖中具有应用价值等。而五子衍宗丸等中成药则利用多种中药优势互补，综合了上述多种作用途径。此外，多项临床研究表明中药联合左卡尼汀、维生素E、克罗米芬等能取得更好的临床疗效。然而传统中药组方药物种类多以及每种中药成分复杂，使得构效关系不明确，目前相关研究尚处于初级探索阶段，多数报道仍局限于临床观察，且较多研究是在同一水平的重复。未来仍需进一步加强相关中药的有效成分、作用机制以及不良反应的研究，为临床辩证用药的标准化奠定理论基础，使中医药治疗少弱精子症更加科学化和规范化。参 考 文 献1 Wein AJ, Kavoussi LR, Partin AW, et al . Campbell-walshUrology. Philadelphia : Elsevier Saunders 2016; vol. 12 Wu Z Q, Chen D L, Lin F H, et al. J Ethnopharmacol2015; 164: 283-2923 陈桐君, 相健美, 王玮. 广东医学 2016; 37(19): 2855-2859.4 Song B, Wang F, Wang W. Evid Based ComplementAlternat Med 2015; 2015: 3607305 Jiang Z, Wang J, Li X, et al. J Ethnopharmacol 2016; 193:321-3286 Wang T, Chen C, Yang M, et al. Pharm Biol 2015; 54(3):481-4877 李刚, 朱文斌, 牛飞, 等. 时珍国医国药 2010; 21(9):2205-22078 Yang WM, Kim HY, Park SY, et al. J Ethnopharmacol2010; 128(3): 693-6969 张燕, 郭贤坤, 刘汉丹. 中药材 2010; 33(3): 485-48610 10 Kim W, Kim do R, Chang MS, et al. J TraditComplement Med 2016; 6(3): 294-29811 Chen M, Hao J, Yang Q, et al. Molecules 2014; 19(7):9502-951412 黄展森, 肖恒军, 齐涛, 等. 华中科技大学学报·医学英德文版 2014, 34(5):755-76013 张作涛, 谢高宇, 陈凯, 等. 重庆医学 2012; 41(7): 683-68514 Nan Y, Zhang X, Yang G, et al. Andrologia 2014; 46(1):9-1615 Luo Q, Cui X, Yan J, et al. Phytother Res 2011; 25(5):694-70116 Luo Q, Li J, Cui X, et al . 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白羊肾羹材料：肉苁蓉50 克，荜拨10 克，草果10 克，陈皮5克，胡椒10 克，白羊肾2 对，羊脂200 克，食盐、葱、酱油、酵母面、姜各适量。做法：将白羊肾、羊脂洗净；将肉苁蓉、陈皮、荜拨、草果、胡椒装入纱布袋内，扎住口后，与白羊肾、羊脂一同放入铝锅内，加水适量；将铝锅置灶上，用武火烧沸，文火炖熬，待羊肾熟透时，放入葱、姜、酵母面、酱油，如常法制羹。用法：吃羊肾，喝羹。功效：壮肾， 暖脾胃。适用于肾虚阳道衰败（阳痿）、腰膝无力、脾虚食少、胃寒腹痛等症。

“一晚起夜好几次,小便明显增多,觉都睡不好!”许多人到了冬季都会感觉有点尿频,专家这么说:正常成人日间平均排尿4～6 次,夜间就寝后0～ 2 次,每次尿量300～500 毫升。如在单位时间内排尿次数明显超过正常范围则称为尿频。生理尿频用热水泡脚唐山53 岁孙阿姨是位教师,入冬以后一节课上到一半就要跑一趟厕所,去医院做过B 超和尿常规,并没有感染等问题。北京中医医院肾病科副主任医师孙明霞:尿频主要见于泌尿系感染、前列腺增生、泌尿系结石、糖尿病、尿崩症、肿物压迫膀胱(如盆腔肿瘤)及孕妇等特殊群体。如果没有这些问题,就属于生理性尿频。冬季尿频现象增多源于身体水分代谢排出方式的改变,皮肤是人体最大的器官,夏季人体水分通常以汗液大量排出,冬季出汗少,更多会以尿液排出。如果把人体排水系统看成“淋浴喷头”,正常时水流是均匀柔和且水量充沛,若喷头某些水孔形成堵塞,水流就会急喷四射水量却不多。因此我经常会建议尿频患者通过泡脚的方式打开汗腺,至身体微微出汗缓解尿频症状。时间最好在晚上7～9 点肾经主事的时候,泡脚水温度在40～45 摄氏度为宜,一般来说泡脚时间在20～25 分钟即可,以泡到后背感觉有点潮,身体微微出汗为好,用熬制的治疗尿频的中药渣泡脚效果更好。夜间尿频练提肛强壮括约肌王先生一到冬天就爱起夜,而且往往是跑两趟再回来就睡不着了,头昏脑胀的,精神都受影响了,苦恼不已。南京军区福州总医院干部病房副主任医师陈学香:造成老年人夜间尿频的原因有多种,最主要的是老年人睡眠质量下降,易被轻度尿意刺激觉醒。有的老年人肾脏浓缩尿液功能降低,摄入少量水即可生成尿液,且老年人盆底部肌肉松弛、膀胱弹性差,较少尿量便可引起较强尿意。想告别尿频,老年人首先需要提高睡眠质量,创造一个安静舒适的睡眠环境。入睡前减少摄入水量,睡前热水淋浴、温水泡脚按摩涌泉穴。睡觉之前尽量排空膀胱,促进自主神经功能的正常,减轻如此次数。此外,可尝试提肛训练,强壮括约肌。提肛运动是指有规律地往上提收肛门,然后放松,一提一松就是提肛运动。站、坐、行均可进行,每次保持收紧3 秒钟,然后放松3 秒钟,连续做上15～20 分钟。熟练以后,可以慢慢地延长收缩时间,以连续收缩10 秒钟为佳。当然,最好做到持之以恒,三天打鱼两天晒网的方式,很难起到效果。肾虚尿频喝肉苁蓉粥马阿姨天气一冷,上厕所的次数也明显多了,还常感觉腰疼,四肢冰凉,怕冷,小腿内侧轻轻一掐就会出现一个凹陷的坑。安徽中医药大学传统疗法科副主任朱庆军:人上了年纪,尿频是很常见的事。中医认为,肾主水,年纪大了肾气会逐渐亏虚,肾要是虚了,小便就没了把门的,自然就会总得跑厕所了。像这位患者的情况是典型的肾阳虚,因为腰是肾的家,所以肾阳虚会首先表现在腰上,肾主一身之阳,肾阳虚了,全身的阳气就会跟着变得虚弱,阳气不能温煦全身,四肢自然也就会冰凉了。此时,可以熬点肉苁蓉粥喝。《本草汇言》称“肉苁蓉,养命门,滋肾气,补精血之要药”。它质地温润,能温通肾阳、补肾虚,补阳气却不燥热,也正因为它补性和缓,才有苁蓉(同音从容)之称。这味药在一般的药店都可以买到,且价格相当实惠。这个粥的做法也很简单,将15 克肉苁蓉洗净切片,与30～60 克大米,适量羊肉一起煮稠成粥,每天早晚空腹食用就可以了。需要注意的是肉苁蓉能助阳、滑肠,所以阴虚火旺以及大便泄泻的人不宜服食。