结果1 CDPS 对Aβ25 － 35诱导损伤的保护作用结果显示，Aβ25 － 35作用细胞48 h 后，细胞存活率已降低为( 42． 91 ± 4． 59) %，与对照组比较差异具有统计学意义( P ＜ 0． 05 ) 。阳性药人参皂苷( GSrd) 对细胞有保护作用，与模型组比较差异具有统计学意义( P ＜ 0． 05) ; CDPS( 50 和150 μg·mL － 1 )对于AD 模型细胞均有保护作用，并且有剂量依赖性，与模型组比较差异具有统计学意义( P ＜ 0． 05) 。MTT 法结果见表1。2 CDPS 对于损伤细胞凋亡情况的影响2． 1 流式细胞术检测细胞凋亡率由图1 可知，正常组的细胞凋亡率为0． 0%，均为活细胞; 与正常组相比，模型组的细胞凋亡率明显上升( 33. 7%) ，差异有统计学意义( P ＜ 0. 05 ) ，说明Aβ25 － 35引起PC12 细胞的凋亡; 与模型组比较，给与GSrd 后，细胞凋亡率明显降低到( 0． 8% ) 。给与CDPS( 50 和150 μg·mL － 1 ) 组干预后，明显降低了细胞的凋亡率，且有剂量依赖性，分别为18． 1% 和12． 1% ，表明CDPS 能抑制Aβ25 － 35诱导PC12 细胞的凋亡，结果见表2。2． 2 CDPS 对于PC12 细胞中HATs 和HDAC2 含量的影响结果显示，与HATs 活性模型组相比，空白对照组显著降低; HDAC2 活性模型组相比空白对照组显著升高; 给与GSrd 后HATs 活性显著升高，HDAC2 活性显著降低。给与CDPS( 50 和150 μg·mL － 1 ) 干预后，与模型组相比HATs 活性显著升高，HDAC2 活性显著降低，且有剂量依赖性。说明Aβ25 － 35诱导PC12 细胞的凋亡过程中组蛋白乙酰化修饰参与其中，HATs 和HDAC2 的酶活性变化对PC12 细胞存活产生了影响，结果见图2。3 CDPS 组PC12 细胞中P300 /CBP 和HDAC2 蛋白表达的影响P300 /CBP 是目前发现的与学习记忆相关的HAT，HDAC2 是公认的与学习和记忆相关的HDAC。本研究中采用Western Blot 分析各组细胞中P300 /CBP 和HDAC2 的表达情况。结果显示，与空白对照组相比模型组P300 /CBP 表达量降低( P ＜ 0. 05) ; 给与GSrd 后P300 /CBP 表达增加( P ＜ 0. 05) ; 给与CDPS( 50 和150 μg·mL － 1 ) 干预后，P300 /CBP 表达增加( P ＜ 0. 05) ，且有剂量依赖性。结果与酶活性检测结果一致( 见图3) 。4 CDPS 组PC12 细胞中BDNF 分泌的影响BDNF 对神经元的存活、分化、生长发育起重要作用，防止神经元受损伤死亡、改善神经元的病理状态、促进受损伤神经元再生及分化等生物效应。为了探究CDPS 对Aβ25 － 35诱导PC12 细胞凋亡的保护机制。我们用ELISA 法检测各组细胞培养基中BDNF蛋白分泌量。结果显示，与空白对照组相比模型组BDNF 分泌减少( P ＜ 0． 05) ; 给与GSrd 后BDNF分泌增加( P ＜ 0． 05) ; 给与CDPS ( 50 和150 μg·mL － 1 ) 干预后，BDNF 分泌增加( P ＜ 0． 05) ，且有剂量依赖性。说明CDPS 介导的神经保护作用随着BDNF 分泌增加而增强，结果见表3。5 CDPS 对于PC12 细胞H3 乙酰化水平的影响有研究表明BDNF 的分泌受到组蛋白乙酰化修饰影响。为了确定本研究PC12 细胞中BDNF 的组蛋白乙酰化修饰是否受到Aβ25 － 35的影响，我们采用染色质免疫共沉淀法来分析各组细胞中AC-H3 和HDAC2 水平。ChIP 分析显示在Aβ25 － 35诱导后，BDNF 的外显子IV 的HDAC2 水平( 图4A) 和H3乙酰化水平( 图4B) 显著降低，这与BDNF 表达的下调一致( 见表3) 。给与CDPS 后BDNF 外显子IV区H3 乙酰化水平增加( 图4B) ，与模型组相比有显著性差异。GSrd 组BDNF 外显子IV 区H3 乙酰化水平增加与文献［17］报道一致。通过以上结果可知CDPS 介导的神经保护作用过程伴随着BDNF 分泌的显著增加，而BDNF 分泌受到Ac-H3 和HDAC2调控，见表4。讨论Aβ 异常产生与沉积是AD 的早期事件和核心病理改变。介导细胞凋亡［18］、炎症级联反应［19］、氧化应激、线粒体功能障碍等毒性效应，加剧AD 的发展。体内、体外研究均显示，Aβ25 － 35具有与Aβ1 － 42类似的凝聚性质及毒性作用，能够引起神经元损伤、学习记忆能力受损，且因其具有易于溶解等优势，被广泛用于Aβ 损伤及毒性作用的研究［20］。MTT 结果表明，Aβ25 － 35浓度20 μmol·L － 1，作用时间48 h 条件下培养的PC12 细胞会出现明显的凋亡特征，可作为较理想的AD 细胞模型。V-FITC 及PI 双染流式细胞技术检测不同实验组PC12 细胞的凋亡情况。Aβ25 － 35处理后的细胞凋亡率明显增高，给予CDPS 后，PC12 细胞的凋亡率明显下降，且有剂量依赖性。表明CDPS 具有抑制细胞凋亡的作用，因此本研究细胞模型可以作为评价CDPS 对Aβ25 － 35诱导PC12 细胞损伤保护作用的理想细胞模型。GSrd 是从天然植物中分离出的单体成分，具有活跃的生物活性。研究［21］ 表明GSrd 能够降低PC12 细胞内活性氧簇水平、通过减少丙二醛含量、增强抗氧化酶的活性来抵抗过氧化氢诱导的细胞毒性损伤。体内实验发现GSrd 可通过重建Ac-H3 和HDAC2 之间的平衡，增加BDNF 表达，从而改善、促进神经元存活，改善慢性脑损伤［17］。CDPS 与GSrd类似，均从补益类天然植物中分离得到，且均有神经营养和神经保护作用。研究发现，CDPS 可通过增加Bcl-2 的表达，降低caspase-3 的表达，抑制海马神经元凋亡，改善AD 模型大鼠的学习记忆能力。本课题组前期实验结果［22 － 26］表明，CDPS 可显著提高东莨菪碱所致学习记忆障碍模型小鼠突触素生长相关蛋白43( GAP-43) 的表达，增多海马区突触数量，增强神经突触的可塑性，缓解学习障碍表现。并观察到CDPS 可增加D-半乳糖所致衰老小鼠脑组织SOD 活性，减少MDA 含量，改善脑组织神经元损伤，并激活cAMP/PKA/CＲEB 信号通路，以改善学习记忆障碍。因此本研究选GSrd 作为阳性药。本研究探索了CDPS 介导的BDNF 上调机制。研究表明BDNF 在突触可树性、神经发生及细胞存活中的重要作用［27］。但是这些调控机制慢慢向表观遗传机制退让，通过表观遗传修饰影响基因的表达在多种人类疾病中发挥重要作用。组蛋白赖氨酸残基在组蛋白乙酰基转移酶HATs 的作用下发生乙酰化，从而使染色质结构松解，暴露转录因子与DNA 作用的结合位点，启动转录机制，而组蛋白去乙酰化酶HDAC 则与转录抑制相关。HDAC2 是大脑中最高度表达的Ⅰ类HDAC 之一［28］。HDAC2 的升高可伴随人类神经变性大脑的认知衰退［28 － 29］，并且HDAC2 也负面调节健康小鼠脑中的记忆和突触可塑性［30 － 31］。本研究揭示AD 细胞模型中H3 乙酰化水平显著降低、HDAC2 显著增加的机制。这一研究说明BDNF 受到表观遗传途径的调控。目前，通过使用非选择性HDAC 抑制剂在逆转认知缺陷方面的旨在增加组蛋白乙酰化的药理学治疗中已取得可喜的结果［32 － 33］。本研究显示AD 细胞模型中HDAC2 水平升高，BDNF 分泌量减少; 应用GSrd 阻断HDAC2 会增强BDNF 的表达，在给与CDPS 处理后结果相似。基于以上体外试验，本课题组将进一步对CDPS 对AD 病理状态下体内组蛋白乙酰化水平的影响进行研究，并进行后续实验。［ 参考文献］［1］ 李佳蔚，周婉，李俊松．《中华人民共和国药典》中肉苁蓉的基源考证［J］． 中华中医药学刊，2014，32( 7) : 1756 － 1760．［2］ 隋玉荣． 多糖类药物的研究进展［J］． 天津药学，2013，25( 2) : 41 － 43．［3］ LIN W，ZHANG J，LIU Y， et al． Studies on diagnostic biomarkersand therapeutic mechanism of Alzheimer's disease throughmetabolomics and hippocampal proteomics［J］． Eur J Pharm Sci，2017，8( 105) : 119 － 126．［4］ ZHANG J，ZHANG Ｒ，ZHAN Z， et al． Beneficial effects of sulforaphanetreatment in Alzheimer's disease may be mediatedthrough reduced HDAC1 /3 and increased P75NTＲ expression［J］． Front Aging Neurosci，2017，5( 1) : 1 － 12．［5］ TＲAN HT，LAFEＲLA FM，HOLTZMAN DM， et al． Controlledcortical impact 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［摘要］ 目的: 探讨肉苁蓉多糖( CDPS) 对Aβ25 － 35诱导的大鼠肾上腺嗜络瘤细胞( PC12) 损伤BDNF 基因表观遗传的调控作用，分析组蛋白乙酰化对BDNF 基因转录的影响。方法: 采用Aβ25 － 35诱导PC12 细胞损伤建立阿尔茨海默病( AD) 体外模型，在给予阳性药人参皂苷Ｒd( GSrd) 、CDPS 高、低浓度后，流式细胞术检测细胞凋亡情况; Hoechst33258 染色观察细胞形态的变化。ELISA 法检测组蛋白乙酰化酶( HATs) 、组蛋白去乙酰化酶2( HDAC2) 和BDNF 的含量变化。Western Blotting 检测P300 和HDAC2 的表达水平变化。染色质免疫共沉淀( CHIP) 检测BDNF exon Ⅳ组蛋白H3 乙酰化水平的变化和HDAC2 含量变化。结果: 20 μmol·L － 1 Aβ25 － 35暴露PC12 细胞48 h 后成功建立AD 细胞凋亡模型。GSrd 组、CDPS 高、低浓度作用48 h 后，HATs表达增加( P ＜ 0． 05) ，HDAC2 表达下降( P ＜ 0． 05) ，BDNF 水平提高( P ＜ 0． 05) ，并且有剂量依赖性。ChIP分析证实Aβ25 － 35诱导PC12 细胞后BDNF 基因exon Ⅳ组蛋白H3 乙酰化水平明显下降，且降低呈HDAC2 依赖性; 给药48 h 后，BDNF 基因exon Ⅳ组蛋白H3 乙酰化水平显著升高，HDAC2 水平显著降低。结论: CDPS可能通过重建Ac-H3 和HDAC2 之间的平衡，抑制HDAC2 的表达来活化BDNF 基因转录从而起到保护PC12 细胞、刺激PC12 细胞再生的作用。［关键词］ 肉苁蓉多糖; PC12 细胞; 组蛋白乙酰化酶2; 组蛋白H3肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉( Cistanche deserticolaY． C． Ma) 或德赢vwin登录 ［Cistanche Tubulosa( schrenk) Ｒ． Wight］的干燥带鳞叶的肉质茎。入肾经，能补肾阳、益精血; 入大肠经，能润肠燥、缓通便［1］。研究表明［2］，多数药用植物的多糖都具有显著的生物活性，如免疫调节、抗衰老、抗炎保肝、抗肿瘤等。阿 尔茨海默病( Alzheimer's disease，AD) 是一种进行性的神经退行性疾病［3］。认知功能下降是该病的主要病理特征，但目前对于认知功能下降的原因尚不明确，同时也缺乏有效的治疗方法。大量研究［4］发现，组蛋白乙酰化异常是AD 发病过程中常见的表观遗传异常。在如认知功能障碍的AD 特征性症状病理机制研究中发现，组蛋白乙酰化修饰调节了记忆相关基因的表达情况［5 － 7］。组蛋白乙酰化动态平衡由组蛋白乙酰化酶( HATs) 和组蛋白去乙酰化酶( HDACs) 2 种活性酶共同调节。HATs 主要对染色质核小体的核心组蛋白N 端尾部赖氨酸残基进行可逆性乙酰化修饰，中和DNA 和相邻组蛋白之间的正电荷，促进DNA 解螺旋，松弛染色质结构，有利于转录因子与DNA 功能区结合，最终激活转录。目前发现的参与学习记忆的组蛋白乙酰化酶是P300 /CBP［8］。另外，有研究表明［9］HATs 活性降低参与到神经退行性疾病中。脑源性神经营养因子( brain derived neurotrophicfactor，BDNF) ，是神经元和神经胶质重要的神经营养因子，被认为是记忆形成过程中的关键蛋白之一，是成熟的中枢及周围神经系统的神经元维持生存及正常生理功能所必需的物质［10 － 11］。一些研究表明BDNF 在齿状回的颗粒细胞层( GCL) 中高度表达，表明其通过TrkB 受体参与突触可塑性和神经元发育。此外，BDNF 表达和释放也可以通过遗传和表观遗传变异，如组蛋白修饰［12 － 13］。P300 /CBP是具有HAT 活性的转录共激活剂，对长期记忆过程有重要影响，取决于从头基因表达［14］，并且BDNF的表达受P300 /CBP 的活性调节［15］。研究证实［16］，不仅环境因素可以造成BDNF 启动子区的长期表观遗传改变，药物刺激也会如此，如丙咪嗪通过HDAC5 的下调增强bdnf P4 和P6 的H3 乙酰化。但是，我们仍不清楚这些快速的表观遗传变化是否参与在给与肉苁蓉多糖( CDPS) 后Aβ25 － 35诱导的PC12 细胞中调节BDNF 转录表达。本研究以GＲsd 为阳性药［17］，结果证实在Aβ25 － 35诱导的AD 细胞模型给与肉苁蓉3 种有效成分后，通过重建Ac-H3 和HDAC2 之间的平衡，增加BDNF 表达，从而改善、促进神经元存活。本研究表明BDNF 表达和释放与表观遗传修饰，特别是和由HDAC 和HAT 调节的组蛋白乙酰化改变密切相关。材料与方法1 药品与试剂DMEM 培养基( 美国Gibco 公司，批号: 12491-015) ; FBS( 美国Gibco 公司，批号: 10099141) ; MTT( 美国Sigma 公司，批号: M5655) ; BDNF 酶联免疫试剂盒( 武汉新启迪生物科技有限公司，批号:3374518) ; HATs 酶联免疫试剂盒( 武汉新启迪生物科技有限公司，批号: 6907299) ; HDAC2 酶联免疫试剂盒( 武汉新启迪生物科技有限公司，批号:6907236) ; 人参皂苷( 成都曼斯特生物科技有限公司，批号: A0245) ; Aβ25 － 35( 上海吉尔生化有限公司，批号: 10-375) ; HDAC2 多克隆抗体( 英国Abcam 公司，批号: ab32117) ; P300 多克隆抗体( 英国Abcam公司，批号: ab142163) ; β-actin 多克隆抗体( 北京中杉金桥生物技术有限公司，批号: ZM-0001) ; HＲP-羊抗兔二抗( 英国Abcam 公司，批号: ab205718) ; 彩色预染蛋白分子量标准( 美国Sigma 公司) ; ECL 显色液( Theromo Fisher Scientific，批号: 10318H08) ; 核蛋白提取试剂盒( 康为世纪生物科技有限公司，批号:CW0199S) ; 蛋白磷酸酶抑制剂混合物( 康为世纪生物科技有限公司，批号: CW2383S) ; 染色质免疫沉淀试剂盒( 德国Merck Millipore 公司，批号: 17-371) 。2 主要仪器PL 203 电子天平( 梅特勒-托利多仪器上海有限公司) ; TGL 16 超低温离心机( 长沙平凡仪器仪表有限公司) ; TU 1901 紫外分光光度计( 上海精密仪器仪表有限公司) ; DYY 6C 电泳仪电源( 北京市六一仪器厂) ; 聚丙烯酰胺凝胶电泳( WesternBlotting 电泳，北京市六一仪器厂) ; 转膜装置( 美国Bio-ＲAD 公司) ; wH 1 微型旋涡混合器( 上海沪西分析仪器厂) ; 十万分之一电子天平( 美国MettlerToledo 公司) ; 10 μL，100 μL，200 μL 和1 000 μL 移液枪( 美国Ｒainin Instrument 公司) ; MDF U3386S低温冰箱( 日本三洋公司) ; SB2200 T 超声波清洗器( 上海必能信超声有限公司) ; Model680 酶标仪( 日本Bio-ＲAD 公司) ; C6 流式细胞仪( 美国BD Accuri公司) ; Odyssey 双色红外荧光成像系统( 美国LI-COＲ 公司) ; UH 100A 超声波细胞粉碎仪( 天津奥特赛恩斯有限公司) 。3 CDPS 的制备及鉴定肉苁蓉生药材，经热乙醇浸泡3 h 后，用纱布过滤，弃滤液。药渣加水煎煮3 次，每次1 ～ 2 h，过滤，合并滤液( 呈棕红色) 。蒸发浓缩后5 000 r·min － 1离心10 min 去沉淀，上清液加2 ～ 3 倍体积的95%乙醇沉淀，4 ℃ 静置24 h，次日，于6 000 r·min － 1( 4 ℃) 离心20 min，收集沉淀。沉淀经水复溶、脱蛋白、透析、冷冻干燥后获CDPS。通过紫外分光光度法测定多糖含量＞ 90%，其余为极少量的几种单糖和低聚糖。4 细胞PC12 细胞株( 北京协和细胞资源中心) 。5 细胞模型建立取对数生长期的PC12 细胞，按照每毫升3 ×104 个的密度接种到96 孔培养板中，每孔0． 1 mL，培养48 h 后，用Aβ25 － 35和CDPS( 50 和150 μg·mL － 1 ) 共同作用48 h，收集细胞进行实验。6 流式细胞术检测凋亡情况用去离子水将10 × Binding Buffer 稀释成1 ×Binding Buffer; 2 000 r·min － 1 ( 室温) 离心5 ～ 10 min，收集细胞; 细胞洗涤: 用4 ℃预冷的1 × PBS 重悬细胞，2000 r·min － 1 离心5 ～ 10 min，洗涤细胞; 加入300 μL 的1 × Binding Buffer 悬浮细胞; Annexin VFITC标记: 加入5 μL 的Annexin V-FITC 混匀后，避光，室温孵育15 min; 上机前5 min 再加入5 μL的PI 染色。在1 h 内，进行流式细胞仪的检测和观察。7 酶联免疫法测定HATs，HDAC2 和BDNF药物处理后，收集PC12 细胞培养液，2 500r·min － 1离心10 min，取上清测试。制作标准曲线，按照试剂盒操作步骤，加入规定体积的检测试剂，避光孵育30 min 后，在酶标仪上测定450 nm 处的吸光度( A) 值并计算HATs，HDAC2 和BDNF 的含量。各实验组设置3 个复孔，实验重复3 次。8 Western Blotting 电泳ＲIAP 缓冲液裂解PC12 细胞，提取核蛋白，BCA法进行蛋白质含量定量。加ＲIAP 缓冲液，将各组蛋白量调整一致。SDS-PAGE 电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部，转移至NC 膜( 100 V，2 h) ，预染蛋白marker 确定蛋白分子量标准位置。用50 g·L － 1 脱脂奶粉封闭1 h。一抗P300 /CBP( 1 ∶ 5 000) ，HADC2( 1∶ 5 000) 和β-actin( 1 ∶ 200) 多克隆抗体分别用封闭液按比例稀释后，4℃孵育过夜，再用TBS 脱色3次，每次10 min。辣根过氧化物标记的山羊抗兔多克隆抗体( 1∶ 5 000) 室温孵育1 h，加入DAB 显色后用Bandscan 分析软件分析条带灰度，进行半定量比较分析，均采用自身灰度值校正，以目的基因的条带灰度与管家基因β-actin 的灰度比值表示蛋白的表达水平。9 染色质免疫共沉淀( ChIP)在装有20 mL 生长培养基的150 mm 培养皿中培养PC12 细胞，长到80% ～90%的密度，用1%甲醛在室温下搅拌15 min。加入甘氨酸( 125 mmol·L － 1 终浓度) 终止固定。在PBS 中洗涤组织并将沉淀悬浮在十二烷基硫酸中( SDS) 裂解缓冲液( 50 mmol·L － 1Tris，10 mmol·L － 1 EDTA，1 % SDS) 。以6 × 10 s 条件将染色质在冰上超声处理，获得约200 ～ 400 bp 的碎片。将1 /10 的裂解物保存为input 用于ChIP 标准化。每组加入针对乙酰化组蛋白H3 或HDAC2抗体的多克隆抗体样品并在4 ℃下温和混合温育过夜，并使用兔或小鼠IgG 作为阴性对照。将免疫复合物与磁珠( life technologies) 一起孵育4 ～ 6 h，然后依次用150 mmol·L － 1 NaCl 低盐缓冲液和500 mmol·L － 1 NaCl 高盐缓冲液洗涤，重悬浮于含0． 1 mol·L － 1NaHCO3的120 mL 1%SDS 中，在65 ℃温育过夜。解交联样品用ＲNase 和蛋白酶K( 美国Sigma-Aldrich公司) 处理，并通过QIAquick PCＲ 纯化试剂盒纯化DNA( Qiagen) 。对免疫沉淀的DNA 样品进行定量实时PCＲ。PCＲ 进行靶基因的转录控制区的片段扩增( 约200 bp) 。引物设计如下: bdnf 外显子IV( 5'-TCAGGAGTACATATCGGCCACCA-3'，5'-GTAGGCCAAGTTGCCTTGTCCGT-3') GAPDH ( 5'-AGACAGCCGCATCTTCTTGT-3'， 5'-CTGCGGGAGAAGAAAGTCAG-3') 。10 统计学处理所有数据均以珋x ± s 表示。采用SPSS 软件进行统计分析，多个实验组比较采用单因素方差分析。P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。

［摘　要］　目的：探讨肉苁蓉醇提物（ＣＤＥ）对骨质疏松大鼠的治疗作用，阐明其作用机制。方法：７２只雌性ＳＤ 大鼠随机分为对照组，模型组，雌二醇组（０．３ ｍｇ·ｋｇ－１）， 低、中和高剂量（０．５、１．０ 和２．０ｇ·ｋｇ－１）ＣＤＥ 组；每组１２只。对照组大鼠摘除少量卵巢周围脂肪，其余各组大鼠手术摘除双侧卵巢，制备骨质疏松模型。手术后第５天，雌二醇组大鼠皮下注射雌二醇，不同剂量ＣＤＥ 组大鼠分别开始灌胃相应剂量的ＣＤＥ，对照组和模型组大鼠给予等量蒸馏水。给药２０周后，质体比法检测大鼠右侧股骨密度，骨力度仪检测大鼠左侧股骨生物力学指标，ＥＬＩＳＡ 法检测大鼠血清中碱性磷酸酶（ＡＬＰ） 及骨钙素水平，全自动生化仪检测大鼠血清中钙离子和磷离子水平，ＨＥ 染色观察大鼠子宫组织形态。结果：与模型组比较，雌二醇组及低、中和高剂量ＣＤＥ组大鼠右侧股骨密度明显升高（犘＜０．０５ 或犘＜０．０１），各剂量ＣＤＥ 组间比较差异无统计学意义（犘＞０．０５）；与模型组和低剂量ＣＤＥ 组比较，中和高剂量ＣＤＥ 组大鼠左侧股骨的最大弯曲力、最大应变和骨刚性明显升高（犘＜０．０５），血清中ＡＬＰ水平降低（犘＜０．０５）。与模型组及低、中剂量ＣＤＥ 组比较，高剂量ＣＤＥ 组大鼠血清中骨钙素水平明显降低（犘＜０．０５）。与模型组比较， 低、中和高剂量ＣＤＥ 组大鼠血清钙离子水平明显升高（犘＜０．０５），各剂量ＣＤＥ 组间比较差异无统计学意义（犘＞０．０５）。与模型组比较，低、中和高剂量ＣＤＥ 组大鼠子宫组织形态表现均有不同程度改善。结论：ＣＤＥ 可以通过升高大鼠血清ＡＬＰ、骨钙素及钙离子水平起到治疗骨质疏松的作用。［关键词］　肉苁蓉；醇提物；碱性磷酸酶；骨钙素；钙离子骨质疏松是以骨密度降低及其显微结构发生实质性变化为主要特征的一类型疾病。骨质疏松的发病与年龄呈明显的正相关关系，尤其在４０ 岁以上人群其相关性更加明显［１２］。目前，我国６０岁及以上人口总数已达到总人口数的１３．２６％［３］。对于骨质疏松的治疗现以使用骨吸收抑制剂、骨形成促进剂等治疗为主，虽然药物疗效确切，但不良反应也十分明显，寻找毒副作用小的治疗药物显得尤为重要［４］。肉苁蓉是名贵中药之一，又有沙漠人参的美誉。中国药典记载，肉苁蓉具有补肝肾、益精气的功效［５］。现代药理研究［６］证实：肉苁蓉具有一定的雌激素样作用。而雌激素是治疗女性骨质疏松的临床常用药物之一。国内外暂无使用肉苁蓉醇提物（ｃｉｓｔａｎｃｈｅ ｄｅｓｅｒｔｉｃｏｌａ ｅｔｈａｎｏｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ＣＤＥ）进行骨质疏松治疗的研究，因此本文作者旨在探讨ＣＤＥ 对去卵巢所致的骨质疏松大鼠的治疗作用及其机制，为肉苁蓉的临床应用奠定基础。１　材料与方法１．１　实验动物、药物、主要试剂和仪器　雌性ＳＤ大鼠７２只，ＳＰＦ 级，体质量１４０～１８０ｇ，购于河南省实验动物中心，动物合格证号：ＳＣＸＫ （豫）２００５０００１。饲养于ＳＰＦ 级实验动物房， 室温（２３±２）℃，光照与黑暗时间各１２ｈ。戊酸雌二醇，购于德国拜耳公司，使用前用生理盐水配置成０．３ｇ·Ｌ－１注射液。肉苁蓉，购于北京同仁堂，打粉过１０ｍｍ 筛，加入７５％乙醇溶液利用索氏提取器，回流提取４ｈ，共提取２次，合并２次提取液，置于负压的旋转蒸发仪中，６０℃ 浓缩至生药量为１ｇ·ｍＬ－１。骨钙素试剂盒（南京建成生物工程研究所），碱性磷酸酶（ＡＬＰ）ＥＬＩＳＡ 试剂盒（美国Ｒ＆Ｄ 公司），多聚甲醛（天津大茂化学试剂有限公司），其余化学试剂均为国产分析纯。恒温水浴槽（上海精宏实验设备有限公司），骨密度仪（美国ＨＯＬＯＧＩＣ 公司），全自动生化仪（河北厚德汉方医疗器械公司），常温低速离心机（湖南湘仪仪器有限公司），酶标仪（美国Ｂｉｏｒａｄ 公司），骨密度仪和生物力学试验仪（英国ＬＬＯＹＤ 公司），游标卡尺（广州晨光科技有限公司）。１．２　实验动物分组、造模和给药　７２ 只雌性ＳＤ 大鼠随机分为对照组， 模型组， 雌二醇组（０．３ｍｇ·ｋｇ－１），低、中和高剂量（０．５、１．０ 和２．０ｇ·ｋｇ－１）ＣＤＥ 组；每组１２ 只。除对照组外，其余各组大鼠进行双侧卵巢摘除手术。３％ 戊巴比妥钠麻醉大鼠，使用剃毛器剔除背部中下部分毛发，酒精及碘酒双重消毒后，背部正中间开口，分别往两边扯动找到卵巢位置。使用手术线结扎子宫顶端后，剪除双侧卵巢，最后伤口缝合，并撒上青霉素。对照组大鼠于卵巢周围剪去少量脂肪。手术完成后，大鼠置于暖炉旁恢复，并连续３ｄ肌肉注射青霉素预防感染（每天２０ 万单位）。手术后第５天，待动物状态恢复正常后，开始灌胃给药。１．３　大鼠右侧股骨密度测定　给药２０周后，麻醉大鼠，腹主动脉取血完成后，分离大鼠右侧股骨。钝性分离股骨后，使用纱布擦去股骨附近肌肉及组织，采用骨密度仪对离体大鼠右侧股骨进行密度分析。１．４　大鼠左侧股骨生物力学测定　给药２０ 周后，麻醉大鼠，腹主动脉取血完成后，分离大鼠左侧股骨。４℃储存股骨，直至实验前２４ｈ，室温解冻股骨，并与实验前用滤纸吸干表面水分。置于生物力学实验仪上测定左侧股骨生物力学变化。设定参数为跨距２０ ｍｍ，加速度为１ ｍｍ·ｍｉｎ－１。实验完成后，使用游标卡尺测定股骨断面内外径。按文献［６］中的方法，计算左侧股骨最大弯曲力、最大应变和骨刚性。１．５　大鼠血清中ＡＬＰ 和骨钙素水平测定　给药２０周后，麻醉大鼠， 腹部下部开口， 使用草纸拨开肠及肠下黏膜，暴露腹主动脉，使用一次性采血针与配套的采血管，与腹主动脉下部Ｙ 字岔口处进针取血， 每只大鼠约取５ ｍＬ 全血。室温静止４ｈ，使得血液完全凝固。３５００ｒ·ｍｉｎ－１、离心１０ｍｉｎ，取血清。按照ＡＬＰ及骨钙素ＥＬＩＳＡ 试剂盒说明，测定血清中ＡＬＰ和骨钙素水平。１．６　大鼠血清中钙离子和磷离子水平测定　按１．７中所述分离血清，取１ ｍＬ 血清置于全自动生化仪中，测定血清中钙离子和磷离子的水平。１．７　观察ＨＥ 染色大鼠子宫组织形态表现　给药２０周后，麻醉大鼠， 腹主动脉取血完成后， 分离大鼠子宫。取大鼠子宫左侧靠中部的部分，４％ 多聚甲醛固定４８ｈ。送检本医院病理科进行石蜡切片，ＨＥ 染色后观察子宫组织形态表现。１．８　统计学分析　采用ＳＰＳＳ１６．０统计软件进行统计学分析。各组大鼠右侧股骨密度、左侧股骨最大弯曲力、左侧股骨最大应变、左侧股骨骨刚性及血清中ＡＬＰ、骨钙素、钙离子和磷离子水平均以狓±狊表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析。以犘＜０．０５表示差异有统计学意义。２　结　果２．１　各组大鼠右侧股骨密度　与对照组比较，模型组大鼠右侧股骨密度明显降低（犘＜０．０１）。与模型组比较，雌二醇组及低、中和高剂量ＣＤＥ 组大鼠右侧股骨密度明显升高（犘＜０．０５ 或犘＜０．０１）。见表１。２．２　各组大鼠左侧股骨生物力学指标　与对照组比较，模型组大鼠左侧股骨的最大弯曲力、最大应变及骨刚性明显降低（犘＜０．０１）。与模型组比较，雌二醇组、中和高剂量ＣＤＥ 组大鼠的最大弯曲力、最大应变及骨刚性明显升高（犘＜０．０５ 或犘＜０．０１），且中和高剂量ＣＤＥ 组大鼠上述指标明显高于低剂量ＣＤＥ 组（犘＜０．０５）。见表１。２．３　各组大鼠血清中ＡＬＰ和骨钙素水平　与对照组比较，模型组大鼠血清ＡＬＰ 和骨钙素水平明显升高（犘＜０．０１）。与模型组比较，雌二醇组和中、高剂量ＣＤＥ 组大鼠血清ＡＬＰ 水平明显降低（犘＜０．０５或犘＜０．０１），且中和高剂量ＣＤＥ 组大鼠血清ＡＬＰ 水平低于低剂量ＣＤＥ 组（犘＜０．０５）。与模型组比较，雌二醇组和高剂量ＣＤＥ 组大鼠血清骨钙素水平明显降低（犘＜０．０５ 或犘＜０．０１），且高剂量ＣＤＥ 组大鼠血清骨钙素水平明显低于低和中剂量ＣＤＥ 组（犘＜０．０５）。见表２。２．４　各组大鼠血清中钙离子和磷离子水平　与对照组比较，模型组大鼠血清钙离子的水平明显降低（犘＜０．０１）。与模型组比较，雌二醇组及低、中和高剂量ＣＤＥ 组大鼠的钙离子水平明显升高（犘＜０．０５或犘＜０．０１）。各组大鼠血清磷离子水平比较差异无统计学意义（犘＞０．０５）。见表３。２．５　ＨＥ 染色观察各组大鼠子宫组织形态表现　对照组大鼠子宫内膜细胞排列整齐，腺体上皮呈高柱状，间质疏松，腺腔较大。模型组大鼠子宫内膜萎缩，腺体上皮呈低柱状，固有层组织较致密，上皮细胞细胞质较少。雌二醇组大鼠子宫内膜增厚，腺体上皮呈高柱状，上皮细胞肥大，胞浆丰富，腺体肥大。低、中和高剂量ＣＤＥ 组大鼠子宫内膜上皮较模型组明显增厚， 腺体上皮呈高柱状致密排列，间质较为致密，且随剂量增加，腺体数量明显增加。见图１ （插页三）。３　讨　论骨质疏松是老年常见病之一，尤以女性发病率较高，其根本原因在于女性更年期后，机体雌激素水平的降低［７８］。随着年龄的增加，人体各类型的激素水平产生波动，女性的雌激素分泌水平明显降低，这些因素均会导致骨质疏松的产生。卵巢摘除手术建立大鼠骨质疏松模型，模拟了这一疾病的进程，是目前筛选骨质疏松药物的首选动物模型［９］。本研究在手术造模后，使用青霉素注射的方法，消除了动物感染对实验造成的误差，并且明显提高手术后动物的成活率。中医认为骨质疏松属于“骨萎”的范围，病因以肾虚、肝血亏虚为主。肉苁蓉有沙漠人参的美誉，是中药中的上品［１０］，肉苁蓉补肾的中医功效与骨质疏松“骨萎”的中医本质相对应，中医认为“肾主骨，生髓”。补肾不仅可以纠正免疫力低下，加强下丘脑垂体性腺功能，还可以改善肠道对钙离子等关键离子的吸收，促进骨吸收，加快骨形成，起到调节机体内环境微量元素平衡的作用［１１］。本研究采用现代药理学研究的手段和方法证实了这一中医内涵，发现ＣＤＥ 具有提高骨质疏松大鼠骨密度、改善骨生物力学功能的作用。ＡＬＰ及骨钙素大部分由骨细胞合成，在骨的矿化过程中起到关键性的作用，而去卵巢大鼠由于雌激素的缺失会代偿性增加ＡＬＰ 和骨钙素的分泌［１２１３］。临床研究［１４］表明：妇女的骨钙素和ＡＬＰ在绝经后的一段时间内均会保持在较高水平。血清中的多项指标，现在均已经作为诊断和预防措施选择的指标之一［１５］。去卵巢大鼠模拟是高转换型骨质疏松，即卵巢摘除后破骨细胞骨吸收活性明显增强，伴随成骨细胞活性代谢性上调，骨代谢速率加快，ＡＬＰ作为成骨细胞分泌物，可与血液中的钙离子相互作用共同促进骨质的合成［１６１７］。因此血清中的ＡＬＰ和钙离子水平可以反映骨代谢的速率。本研究结果显示：去卵巢模型大鼠血清ＡＬＰ 水平明显升高，钙离子浓度降低，而肉苁蓉给药组则能够有效地逆转这一趋势， 起到治疗骨质疏松的作用。骨骼是运动系统的重要组成部分，而骨骼的质量主要体现在生物力学功能上，骨质疏松患者骨组织中钙质大量流失，可以导致包括最大弯曲力、最大应变、骨刚性在内的多种骨功能下降［１８］。本研究结果显示：ＣＤＥ 给药后可以有效地改善去卵巢所导致大鼠股骨生物力学功能下降。而现代药理学研究证实了肉苁蓉具有雌激素样作用，这也是肉苁蓉能够起到治疗骨质疏松的原因之一。［参考文献］［１］ 严孙杰，冯　霖，沈喜妹， 等． 健康成人体成分差异对不同年龄段人群骨密度的影响［Ｊ］． 福建医科大学学报，２００９，４３ （４）：３０１３０５．［２］ 张萌萌．中国老年学学会骨质疏松委员会骨代谢生化指标临床应用专家共识［Ｊ］．中国骨质疏松杂志，２０１４，２０ （１１）：１２６３１２７２．［３］ 胡鞍钢，刘生龙，马振国． 人口老龄化、人口增长与经济增长———来自中国省际面板数据的实证证据［Ｊ］． 人口研究，２０１２，３６ （３）：１４２６．［４］ 胡一梅． 老年性骨质疏松症病理研究及治疗进展［Ｄ］． 成都：成都中医药大学，２００６．［５］ 赖青海，王琳琳，丁　辉， 等． 肉苁蓉治疗骨质疏松症研究进展［Ｊ］．辽宁中医药大学学报，２０１６，１８ （３）：１０２１０４．［６］ 魏珍珍． 肉苁蓉苯乙醇苷对大、小鼠围绝经期模型的影响［Ｄ］．郑州：河南中医学院，２０１４．［７］ ＧｅｉｓｌｅｒＪ，ＬｏｎｎｉｎｇＰＥ，ＫｒａｇＬＥ，ｅｔａｌ．Ｅｓｔｒｏｇｅｎｓａｎｄｂｏｎｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌｗｏｍｅｎｗｉｔｈｅａｒｌｙｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒａｔｌｏｗ ｒｉｓｋｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈｅｘｅｍｅｓｔａｎｅ：ａｒａｎｄｏｍｉｚｅｄｐｌａｃｅｂｏｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｓｔｕｄｙ ［Ｊ］．ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ，２００４，２２ （１４）：５３１．［８］ ＦｌｏｒｅｓＲ， Ｄｈｒｍａｎｎ Ｓ，Ｓｃｈａａｌ Ｃ，ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｔｒａｐｆｏｒｍａｔｉｏｎ ［Ｊ］．ＦｒｏｎｔＩｍｍｕｎｏｌ，２０１６，７：５６６．［９］ 李素萍．骨质疏松动物模型的研究现状［Ｊ］． 中国组织工程研究与临床康复，２０１１，１５ （２０）：３７６７３７７０．［１０］ 杨峻山． 沙漠人参—肉苁蓉［Ｊ］． 中国药学杂志，２０１１，４６ （１２）：８８１．［１１］ 黄继锋，宋　敏，李泽佳，等．补肾固本方对去卵巢大鼠骨质疏松症骨密度、骨矿盐含量及ＣＴ 含量的影响［Ｊ］． 中国实验方剂学杂志，２０１５，２１ （４）：１４９１５２．［１２］ 司会群，卜淑敏，赵俊勇，等．全身垂直振动对去卵巢骨质疏松大鼠胫骨和子宫血管内皮生长因子蛋白表达的影响［Ｊ］．中国老年学杂志，２０１６，３６ （１８）：４４２３４４２５．［１３］ Ｙａｎｇ Ｓ，Ｚｈｏｕ Ｙ，ＳｈｕａｉＢ，ｅｔａｌ．Ｒｏｌｅｏｆｔｈｅ ＥＲ／ＮＯ／ｃＧＭＰ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ ｏｆ ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｒａｔｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｂｙａｃｔａｅａ ｒａｃｅｍｏｓａ ｅｘｔｒａｃｔ ［Ｊ］． Ｅｖｉｄ Ｂａｓｅｄ ＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔＡｌｔｅｒｎａｔＭｅｄ，２０１６，２０１６：２６１５６２０．［１４］ＬｆｍａｎＯ， Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ Ｐ， Ｔｏｓｓ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｍｏｎｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｍａｒｋｅｒｓｏｆｂｏｎｅｔｕｒｎｏｖｅｒｐｒｅｄｉｃｔｆｕｔｕｒｅｂｏｎｅｌｏｓｓ：ａ ５ｙｅａｒ ｆｏｌｌｏｗｕｐ ｓｔｕｄｙ ［Ｊ］． Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ，２００５，３５６ （１／２）：６７７５．［１５］ 薛昊罡，冷　冰，马恩元，等．血清细胞因子水平检测在辅助诊断和治疗老年骨质疏松中的作用［Ｊ］．中国老年学杂志，２０１１，３１ （１１）：１９８４１９８５．［１６］ Ｚｈａｏ Ｄ， ＷａｎｇＪ，Ｌｉｕ Ｙ，ｅｔａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｂｏｎｅ Ｇｌａｐｒｏｔｅｉｎ， ｂｏｎｅ ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅａｎｄ ＣｔｅｒｍｉｎａｌｔｅｌｏｐｅｐｔｉｄｅｏｆｔｙｐｅＩｃｏｌｌａｇｅｎｉｎｂｏｎｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ ［Ｊ］．Ｐａｋ ＪＭｅｄＳｃｉ，２０１５，３１ （１）：９１９４．［１７］ Ｘｕ ＭＨ，Ｌｉ Ｘ， Ｙｕａｎ ＦＬ．Ｉｓｉｔｎｅｃｅｓｓａｒｙｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｒａｐａｍｙｃｉｎｍｏｄｕｌａｔｅｄ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓｉｎｆｅｍａｌｅｒａｔ ［Ｊ］．ＯｓｔｅｏｐｏｒｏｓＩｎｔ，２０１６，２７ （１２）：３６６５３６６６．［１８］ＰｅｎｇＳ，Ｌｉｕ ＸＳ， Ｈｕａｎｇ Ｓ，ｅｔａｌ．Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｔｉｍｉｎｇ ｏｆｓｔｒｏｎｔｉｕｍ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｎ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎｉｎｄｕｃｅｄｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓｉｎｒａｔｓ：ｂｏｎｅｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｍｅｃｈａｎｉｃｓ ［Ｊ］．ＪＯｒｔｈｏｐＲｅｓ，２０１４，３２ （３）：４７７４８４．

摘要: 目的探讨肉苁蓉苯乙醇总苷( phenylethanol glycosidesfrom cistanche tubuiosa，CPhGs) 脂质体对大鼠肝星状细胞( HSC-T6) 凋亡的影响及其抗肝纤维化的相关分子机制。方法培养HSC-T6，取生长状态良好的对数生长期细胞用于实验，采用重组大鼠血小板衍生生长因子BB( rrPDGFBB)刺激HSC-T6，构建体外肝纤维化模型。MTT 法测定CPhGs 脂质体( 29. 45、14. 72、7. 36 mg·L － 1 ) 对HSC-T6 增殖的影响; AnnexinV-FITC/PI 细胞凋亡双染试剂标记后，流式细胞仪检测CPhGs 脂质体不同浓度组的细胞凋亡率; 实时荧光定量PCＲ( qＲT-PCＲ) 检测α-SMA、Collagen I、CollagenⅢ mＲNA 的表达水平; Western blot 法检测CPhGs 脂质体对p-JNK 蛋白表达的影响。结果不同浓度CPhGs 脂质体均可抑制rrPDGF-BB 诱导的HSC-T6 的增殖; CPhGs 脂质体( 29. 45、14. 72 mg·L － 1 ) 组凋亡率明显升高; qＲT-PCＲ 结果显示，CPhGs 脂质体不同浓度组均可下调α-SMACollagen I、Collagen Ⅲ mＲNA 水平的表达，并能降低p-JNK 蛋白的表达。结论CPhGs 脂质体能抑制大鼠HSC-T6 的增殖并诱导其凋亡，其作用可能与抗肝纤维化有关。关键词: 肉苁蓉; 苯乙醇总苷; 肝星状细胞; 细胞凋亡; 脂质体; 肝纤维化肝纤维化( hepatic fibrosis，HF) 是一种慢性的瘢痕形成与修复过程，是发病率和死亡率都很高的世界医学难题。HF 的特点是细胞外基质过度沉积，晚期HF 可诊断为肝硬化，并最终可能发展为肝衰竭，甚至肝细胞癌［1］。目前公认肝星状细胞( hepaticstellate cell，HSC) 的活化是HF 进展过程中的关键事件［2］。在HF 进程中，HSC 激活成肌成纤维细胞是瘢痕形成的关键环节［3 － 4］。中医具有治疗复杂疾病及相关疾病的功效，肉苁蓉( Cistanche) 是著名的名贵补益类中药，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、免疫调节等作用。课题组前期研究证实，肉苁蓉苯乙醇苷类化合物具有良好的保肝护肝作用，且其能引起Fas 诱导的HSC 凋亡［5］。本研究旨在探讨肉苁蓉苯乙醇总苷( phenylethanol glycosides from cistanche tubuiosa，CPhGs) 脂质体对HSC 凋亡的影响及其分子机制，通过靶向载药系统转运药物，来克服一些药物半衰期短、无法到达靶器官，或到达了但无法在其周围形成有效药物浓度等缺点，最大程度发挥药物疗效，达到长效、靶向及减轻药物副作用等目的，期望能寻求更多的可以应用于临床治疗HF 的靶向药物治疗途径，为HF 的治疗提供理论基础。1 材料与方法1． 1 材料1． 1． 1 细胞株大鼠HSC-T6 细胞株，购自上海中乔新舟生物科技有限公司，货号: ZQ0780。1． 1． 2 药物与试剂用薄膜分散二次包封法制备pPB 修饰的肉苁蓉总苷靶向脂质体，其粒径为212. 7 nm，电位35 ～ 50 mV，包封率( 38. 46 ±7. 85) %，由本实验室保存。胎牛血清( 美国Gibco公司) ; DMEM 高糖培养基( 美国Hyclone 公司) ;MTT( 美国Sigma 公司) ; Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒( 美国BD 公司) ; TＲIzol Ｒeagent ( Lifetechnologies) ; ＲevertAid First Strand cDNA SynthesisKit、ＲIPA 裂解液( 赛默飞公司) ; SYBＲ Premix ExTaqTMⅡ( TaKaＲa 公司) ; 蛋白定量试剂盒( Biomiga公司) ; 重组大鼠血小板衍生生长因子BB( recombinantrat platelet-derived growth factor BB， rrPDGF-BB)( Ｒ＆D 公司) ; 抗β-actin、JNK、p-JNK 多克隆抗体( 北京博奥森生物科技有限公司) 。1． 1． 3 仪器超净工作台、全波长自动酶联免疫反应检验测试仪( 美国Thermo Scientific 公司) ; CK-40型荧光倒置显微镜( 日本Olympus 公司) ; 低温离心机( 美国Sigma 公司) ; Western blot 电泳装置及转膜装置( 美国Bio-Ｒad 公司) ; QuantStudio 6 Flex 型实时荧光定量PCＲ 仪( 美国ABI 公司) 。1． 2 方法1． 2． 1 细胞培养与传代HSC-T6 在含有100 kU·L － 1青霉素、100 mg·L － 1 链霉素和10% 胎牛血清的高糖DMEM 细胞培养液，于37℃、5% CO2培养箱中培养。细胞隔日换液，待生长融合至80% ～90% 时，使用0. 25% 胰蛋白酶消化收集细胞，按1 ∶ 2进行传代培养，所有实验采用对数生长期细胞。1． 2． 2 细胞分组实验分为Normal 组、rrPDGF-BB组、rrPDGF-BB + CPhGs 脂质体( 29. 45、14. 72、7. 36mg·L － 1 ) 组。各组细胞均培养24 h 后，收集细胞进行后续实验。1． 2． 3 MTT 法检测细胞增殖HSC-T6 以5 000个/孔密度接种至96 孔板，待细胞贴壁后进行分组干预，每组设3 个复孔。分别培养24、48、72 h，向每孔加入10 μL MTT 溶液，培养箱内37℃培养4 h 后，弃去MTT 溶液，再向各孔加入100 μL DMSO，置于摇床室温摇动10 min，待结晶充分溶解后，于酶标仪492 nm 波长处测定吸光度。1． 2． 4 流式细胞术检测细胞凋亡取生长状态良好的对数生长期细胞，经胰酶消化后接种于6 孔板，每孔细胞数为1 ×105 个， 24 h 后按相应浓度加药，继续培养48 h 后，每孔加入500 μL 胰酶消化细胞，加完全培养液终止消化，吹打混匀移至15 mL 离心管，PBS冲洗细胞，1000 r·min － 1离心5 min。弃上清，加PBS冲洗细胞2 次，用AnnexinV-FITC/PI 细胞凋亡双染试剂标记后，用流式细胞仪检测细胞凋亡。1． 2． 5 实时荧光定量PCＲ 检测α-SMA、Collagen I、Collagen Ⅲ mＲNA 的表达TＲIzol 试剂盒提取HSC-T6 总ＲNA，经纯度及完整性鉴定后反转录反应生成cDNA。按照实时荧光定量PCＲ 试剂盒说明书建立PCＲ 反应体系，使用实时荧光定量PCＲ 检测仪进行检测。PCＲ 热循环参数为: 95℃预变性30s，95℃变性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，共40个循环。结果分析以β-actin 为内参基因，确定每个样本、每个基因扩增的循环阈值( CT) ，按照2 －△△CT计算目的基因的相对表达量，所用引物序列见Tab1。1． 2． 6 Western blot 法分析p-JNK 蛋白表达水平收集细胞，ＲIPA 细胞裂解液提取各组细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，取相同质量的蛋白上样，经SDS-PAGE 凝胶电泳转移至硝酸纤维素膜，5% 的脱脂奶粉室温封闭1 h，p-JNK、JNK 一抗( 1 ∶ 5 000 稀释) 4℃ 摇床孵育过夜，TBST 漂洗3 次，二抗( 1 ∶ 5 000) 室温孵育1 h，TBST 漂洗3 次后，化学发光显影试剂盒( ECL) 曝光显影。利用图像分析软件Image J 对条带进行灰度值的测定，计算分析各组蛋白相对表达量，以p-JNK 与JNK 条带信号强度的比值表示p-JNK 蛋白表达水平。1． 3 统计学分析采用SPSS 17. 0 软件进行统计学分析，计量资料以珋x ± s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组样本两两比较采用LSD 法。2 结果2． 1 CPhGs 脂质体对rrPDGF-BB 刺激的HSCT6增殖的影响Fig 1 的MTT 结果显示，在24 h时，与Normal 组比较， rrPDGF-BB 组OD 值明显增加( P ＜ 0. 05) ; 与rrPDGF-BB 组比较，除CPhGs 脂质体7. 36 mg·L － 1组外，其余CPhGs 脂质体不同浓度组OD 值均明显下降( P ＜ 0. 05 ) ; 与CPhGs 脂质体7. 36 mg·L － 1组相比，CPhGs 脂质体29. 45 mg·L － 1组OD 值明显降低( P ＜ 0. 05) 。在48、72 h 时，与Normal 组比较， rrPDGF-BB 组和CPhGs 脂质体不同浓度组OD值均明显增加( P ＜ 0. 05) ; 与rrPDGF-BB组比较，CPhGs 脂质体不同浓度组OD 值明显下降( P ＜ 0. 05) ; 与CPhGs 脂质体7. 36 mg·L － 1 组比较，CPhGs 脂质体( 14. 72、29. 45 mg·L － 1 ) 组OD 值明显下降( P ＜ 0. 05) ; 与CPhGs 脂质体14. 72 mg·L － 1组比较，CPhGs 脂质体29. 45 mg·L － 1 组OD 值明显下降( P ＜ 0. 05) 。结果提示，随着药物浓度增大和干预时间的延长，CPhGs 脂质体各剂量组抑制HSC-T6 增殖的作用呈现明显的剂量－ 效应关系。2． 2 CPhGs 脂质体对rrPDGF-BB 刺激的HSCT6凋亡的影响如Fig 2 所示，与Normal 组相比，rrPDGF-BB 组凋亡率下降( P ＜ 0. 05) ; 与rrPDGF-BB组相比，CPhGs 脂质体不同浓度组凋亡率均明显上升( P ＜ 0. 05) ; 与CPhGs 脂质体7. 36 mg·L － 1 组比较，CPhGs 脂质体( 14. 72、29. 45 mg·L － 1 ) 组凋亡率明显上升( P ＜ 0. 05) ; 与CPhGs 脂质体14. 72 mg·L － 1组比较，CPhGs 脂质体29. 45 mg·L － 1 组凋亡率明显增高( P ＜ 0. 05) 。结果显示，随着CPhGs 脂质体药物浓度的升高，HSC-T6 凋亡率也逐渐增高，CPhGs 脂质体各剂量组间呈现剂量－ 效应关系。2． 4 CPhGs 脂质体对rrPDGF-BB 刺激的HSCT6p-JNK 蛋白表达的影响如Fig 4 所示，与Normal组比较，p-JNK 蛋白在rrPDGF-BB 和CPhGs 脂质体不同浓度组表达明显增加( P ＜ 0. 05) ; 与rrPDGF-BB 组比较，p-JNK 蛋白在CPhGs 脂质体不同浓度组表达下降( P ＜ 0. 05) ; CPhGs 脂质体各剂量组间比较，p-JNK 蛋白随CPhGs 脂质体干预剂量增加表达明显下降，呈现剂量－ 效应关系( P ＜ 0. 05) ，其中以29. 45 mg·L － 1组效果最明显。3 讨论在慢性肝病中，HSC 的反复激活导致HF，其特征是广泛的瘢痕形成和干扰肝脏正常结构与功能［6］。目前，抗HF 的主要策略是抑制HSC 活化、增殖、收缩，诱导HSC 凋亡。HSC 的活化是HF 的主要过程［7］，HF 主要是由于细胞外基质过度沉积所致，而活化的肝HSC是细胞外基质的主要来源。肝损伤后，HSC 经历一个复杂的从静止状态向肌成纤维细胞转换或激活过程，α-SMA 是HSC 活化的标志物，α-SMA 在肌成纤维细胞分化中起作用。α-SMA 降低了收缩力和Collagen I 合成，并抑制伤口收缩。Collagen I 和α-SMA 被认为是HF 中诱导HSC 活化的标志物，可以减少α-SMA 的含量，促进HSC 凋亡，逆转HF 进程。宋阳等［8］的研究结果证实，其研究的药物可明显抑制HSC 的增殖，促进其凋亡，并使α-SMA 蛋白表达明显降低，以此降低细胞外基质的沉积，从而起到逆转HF 的作用。由淑萍等［9］研究表明，肉苁蓉苯乙醇总苷可以抑制rrPDGF-BB 诱导的HSC 增殖。上述研究结果提示，抑制HSC 的激活和增殖，促进HSC 凋亡已成为阻止HF 发生、发展的关键事件。最近的临床实验证据也提示，HF 具有可逆性的［10］。HF 的逆转与HSC 的凋亡有着密切关联。HF 逆转期，活化的HSC 数量减少主要依靠细胞凋亡，而不是活化状态细胞向静止状态转化。细胞凋亡是细胞的主动“自杀”过程，与坏死不同，细胞凋亡发生于HF 的产生和发展过程中。HSC 凋亡在HF 发展过程中不仅起着主动作用，而且贯穿整个纤维化形成的过程。本研究用不同浓度的CPhGs 脂质体药物作用于HSC-T6 48 h后，用流式细胞仪检测细胞凋亡，结果显示，与Normal组相比， rrPDGF-BB 组凋亡率下降，CPhGs 脂质体( 29. 45、14. 72 mg·L － 1 ) 组凋亡率上升，与rrPDGF-BB 组相比，CPhGs 脂质体不同浓度组凋亡率均明显上升，且CPhGs 脂质体不同浓度组相比，差异具有统计学意义。实验结果表明，CPhGs 脂质体可诱导HSC-T6 的凋亡，且凋亡程度与CPhGs 脂质体浓度存在联系，CPhGs 脂质体各剂量组间表现出明显的剂量－ 效应关系。HF 是指结缔组织过度增殖和异常沉积，特别是胶原蛋白、非胶原蛋白和肝小叶门管区的蛋白多糖等。因此，细胞外基质降解和生成之间的不平衡是HF 发生与发展的关键因素。因此，保护肝细胞，促进肝再生，保持胶原蛋白的正常代谢也成为预防和治疗HF 的重要措施。人类有19 种胶原蛋白，在肝脏中存在的有5 种类型，在HF 的总蛋白中胶原蛋白约占50%，主要涉及Collagen I 和Collagen Ⅲ。在肝脏中，Collagen I 占60% ～ 70%，Collagen Ⅲ占20% ～ 30%，是构成细胞外基质的主要成分。因此，Collagen I 和Collagen Ⅲ被认为是反映胶原蛋白在肝脏中进行新陈代谢的重要参数。李伟伟等［11］的研究结果显示所研究药物可通过抑制CollagenⅢ沉积而起到抗HF 作用。张扬武等［12］的实验结果也证实了可通过抑制HSC 的活化，降低Collagen I 的表达，达到逆转HF 的作用。本研究采用实时荧光定量PCＲ 检测α-SMA、Collagen I 和Collagen Ⅲ基因表达，研究结果显示，与Normal 组相比， rrPDGFBB组α-SMA、Collagen I、Collagen Ⅲ mＲNA 表达明显增高，与rrPDGF-BB 组相比，不同浓度的CPhGs脂质体组均可不同程度下调α-SMA、Collagen I 和Collagen Ⅲ的mＲNA 表达，其中29. 45 mg·L － 1CPhGs 脂质体组下调作用最明显，且随着药物浓度的升高，其下调程度越明显。我们认为产生这种现象的原因在于浓度越高，其对rrPDGF-BB 引起的HSC 增殖的抑制效果越明显，越趋近于正常。因此，我们认为其能抑制HSC 增殖，促进其凋亡，以此来阻止HF 的形成。JNK 已显示对不同细胞类型的细胞增殖有积极的调节作用，JNK 通过负性调节作用来抑制静止HSC 的活化，从而阻止HSC 的增殖，刺激MAPK 信号通路，从而使其下游通路阻断，起到预防HF 的作用。本研究结果显示，与Normal 组比较， rrPDGF-BB组p-JNK 的蛋白表达量明显增高，表明rrPDGF-BB可通过影响MAPK 信号，使HSC 活化增殖。不同浓度的CPhGs 脂质体组，p-JNK 的蛋白表达量随着药物浓度的升高逐渐降低，且不同浓度的CPhGs 脂质体组p-JNK 的蛋白表达量与rrPDGF-BB 组比较，差异均有统计学意义。由此可见，CPhGs 脂质体可在一定程度上抑制rrPDGF-BB 诱导的HSC 增殖与活化，促进HSC 凋亡，从而抑制HF 的发生、发展。本研究结果为后续实验进一步研究CPhGs 脂质体抗HF 作用机制提供了扎实的理论基础。期望能够寻求更多抗HF的靶向给药途径，给HF 患者带来福音。参考文献:［1］ Huang Y，Deng X，Liang J，et al． Modulation of hepatic stellatecells and reversibility of hepatic fibrosis［J］． Exp Cell Ｒes，2017，352( 2) : 420 － 6．［2］ Zhao G N，Jiang D S，Li H，et al． Interferon regulatory factors: atthe crossroads of immunity，metabolism，and disease． ［J］． BiochimBiophys Acta，2015，1852( 2) : 365 － 78．［3］ Mederacke I，Hsu C C，Troeger J S，et al． Fate tracing revealshepatic stellate cells as dominant contributors to liver fibrosis independentof its aetiology［J］． Nat Commun，2013，4( 7) : 2823．［4］ Iwaisako K，Jiang C，Zhang M，et al． Origin of myofibroblasts inthe fibrotic liver in mice［J］． Proc Natl Acad Sci USA，2014，111( 32) : 3297 － 305．［5］ Liu T，Zhao J，Ma L，et al． Hepatoprotective effects of total triterpenoidsand total flavonoids from Vitis vinifera L against immunologicalliver injury in mice［J］． Evid Based Complement AlternatMed，2012，2012( 1) : 969 － 86．［6］ Yin C，Evason K J，Asahina K，et al． Hepatic stellate cells in liverdevelopment，regeneration，and cancer［J］． J Clin Invest，2013，123( 5) : 1902 － 10．［7］ Puche J E，Lee Y A，Jiao J，et al． A novel murine model to depletehepatic stellate cells uncovers their role in amplifying liverdamage in mice［J］． Hepatology，2013，57( 1) : 339 － 50．［8］ 宋阳，詹磊，黄成，等． 瞬时感受器电位离子通道香草素受体亚家族4 调控肝星状细胞活化增殖作用研究［J］． 中国药理学通报，2016，32( 5) : 681 － 7．［9］ 由淑萍，赵军，马龙，等． 肉苁蓉苯乙醇总苷对血小板衍生生长因子诱导的肝星状细胞增殖的影响及机制［J］． 中国药理学通报，2016，32( 9) : 1231 － 5．［10］ Xu D D，Li X F，Li Y H，et al． TIPE2 attenuates liver fibrosisby reversing the activated hepatic stellate cells［J］． Biochem BiophysＲes Commun，2018，498( 1) : 199 － 206．［11］ 李伟伟，高海丽，宋新文，等． 吡咯烷二硫代氨基甲酸酯在二甲基亚硝胺诱导肝纤维化大鼠中的作用及机制［J］． 中华实用诊断与治疗杂志，2018，32( 1) : 5 － 9．［12］ 张扬武，罗伟生，陈姗，等． 枇杷叶熊果酸对大鼠肝星状细胞增殖抑制作用及对PPAＲ-γ、TGF-β1 表达的影响［J］． 中国药理学通报，2017，33( 4) : 517 － 21．

【摘要】目的： 研究肉苁蓉苯乙醇总苷(CPhGs)的抗肝癌作用，并探讨其可能的作用机制。方法：采用前肢右侧腋部皮下注射法建立小鼠肝癌H22荷瘤模型，实验设空白对照组、肝癌H22荷瘤模型组、肝复乐阳性治疗组(1 351.5 mg/kg)、CPhGs高剂量组(500mg/kg)、中剂量组(250 mg/kg)、低剂量组(125 mg/kg)，共6组，每组10只。除空白对照组和模型组外，其余各组分别灌胃给予肝复乐或CPhGs，连续10 d。期间监测小鼠的一般状况，观察各组H22荷瘤小鼠瘤体生长情况，实验结束时，摘眼球取血，酶联免疫(ELISA)法检测血清白介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和甲胎蛋白(AFP)含量；分离脾脏、肝脏，称质量，计算脏器系数；完整剥取瘤体，计算各组小鼠的肿瘤抑制率；HE染色观察瘤体病理组织学变化。结果：荷瘤模型组动物腋下肿瘤出现早且生长最快，CPhGs低、中剂量组次之，高剂量组和阳性治疗组瘤体生长较慢。与模型组比较，CPhGs中、高剂量组瘤质量均明显降低(P<0.05)，各剂量组抑癌率随CPhGs剂量增加依次升高(P<0.05)；阳性治疗组和CPhGs各剂量组脾脏系数均明显升高及肝脏系数均明显降低(P<0.05)；CPhGs中、高剂量组和阳性治疗组IL-2含量均明显升高(P<0.05)，而AFP含量均明显降低(P<0.05)；CPhGs各剂量组和阳性治疗组TNF-α含量均明显降低(P<0.05)。病理结果发现CPhGs各剂量组小鼠肝癌细胞生长受到抑制、数目较少、异质性降低、并伴有大量坏死细胞。结论：CPhGs能降低肝癌H22荷瘤小鼠肝脏损伤，并对其肿瘤生长有抑制作用，可能与CPhGs降低荷瘤小鼠血清中AFP含量及提高荷瘤小鼠免疫能力有关。【关键词】肉苁蓉；苯乙醇总苷；H22细胞；肝癌肉苁蓉(cistanche)主产于新疆、内蒙古阿拉善盟，素有“沙漠人参”之美誉，具有极高的药用价值，是[1] 中国传统的名贵中药材。始载于《神农本草经》，被列为上品，其味甘、咸，性温，具有补肾阳、益精血、润肠通便的作用，常用于治疗男子阳痿、女子不[2] 孕、腰膝冷痛、血枯便秘等症。国内学者对肉苁蓉的化学成分进行了大量的研究，包括苯乙醇总苷(phenylethanol glycosides from cistanche，CPhGs)、环烯醚萜类、木脂素类、多糖、生物碱等，其中最主要的[3-4] 成分为CPhGs ，现代药理研究表明CPhGs具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、增强记忆、助阳等多种药理活性，同时课题组成员前期对CPhGs进行的大量研究表CPhGs具有抗肝纤维化的作[5-7] 用。本实验用肉苁蓉药材中分离得到的CPhGs，研究其对肝癌H22荷瘤小鼠的抗肝癌作用，旨在为CPhGs的抗肝癌作用机制及相关健康产品及药品的开发提供依据。1 材料与方法1.1 受试物及实验动物肉苁蓉苯乙醇总苷(CPhGs)由新疆药物研究所赵军[8] 研究员提取分离并鉴定，纯度为70% ，试验时用0.5%羧甲基纤维素钠(0.5% CMC-Na)溶解，配制成不同浓度，4 ℃保存，1周内使用。SPF级昆明种小鼠，雄性，60只，体质量18~22g，购自新疆医科大学实验动物研究中心，合格证号为SCXK(新)2016-0002，使用许可证号为SYXK(新)2016-0003。1.2 细胞株小鼠H22肝癌细胞株，由武汉普诺赛生命科技有限公司提供，货号CL-0341。1.3 仪器及主要试剂低速离心机(70L-5-A型，上海安亭)；CO 培养箱2(Heal Force，HF240)；电热恒温水槽(DK-8D，上海一恒科技有限公司)；酶标仪(Bio-rad)；游标卡尺(上海将来实验设备有限公司)；电子天平(常州万泰天平仪器有限公司)。肝复乐为康普药业股份有限公司产品(国药准字Z20060389)；RPMI-1640培养基和1%双抗(以色列BI公司)；胎牛血清(Gibco，美国)；0.4%台盼蓝和4%多聚甲醛(北京索莱宝)；小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素2(IL-2)、甲胎蛋白(AFP)ELISA试剂盒(武汉华美)。1.4 试验方法1.4.1 肝癌H22荷瘤小鼠模型的建立●于37 ℃复苏H22细胞，离心弃上清，加入新鲜RPMI-1640完全培养基重悬细胞快速复苏，体外培养活细胞达95%以6 上，至细胞密度达1×10 /mL时接种于小鼠腹腔，每只0.2 mL。约8~l0 d传代一次。无菌抽取培养至8 d左右的小鼠腹腔H22瘤液，生理盐水稀释调整瘤细胞数7 为l×10 /mL，充分混匀，备用。除空白对照组在同部位注射等量生理盐水外，其余各组小鼠经消毒后，于其前肢右侧腋下接种H22瘤细胞悬液， 每只0.2[9-10] mL ，造模24 h后每天观察瘤体生长情况。1.4.2 分组及给药●随机将上述造模的H22荷瘤小鼠分为5组，分别为模型组，阳性治疗组(肝复乐1 351.5[11] mg/kg) ，CPhGs高(500 mg/kg)、中(250 mg/kg)、低(125mg/kg)剂量组，每组10只。于造模24 h后开始灌胃给药，除空白对照组和模型组给予同体积的0.5% CMCNa溶液外，其余各组分别按照给定剂量灌胃给予阳性[12-13] 药物或CPhGs，连续10 d 。期间每天观察荷瘤小鼠精神活动状态、右腋膨隆大小及出现时间、毛色及食欲等情况。末次给药24 h后，称质量，摘眼球取血，分离血清备用；颈椎脱臼法处死小鼠，分离脾脏、肝脏，称质量，计算肝脾系数；完整剥取瘤体，滤纸拭干净后称质量，计算各组小鼠的肿瘤抑制率；瘤体组织行病理组织学检测。1.4.3 检测指标●①脾脏和肝脏系数测定：各组小鼠处死后分别剪取脾脏和肝脏并称质量，计算脏器系数，脏器系数=脏器质量/小鼠体质量×100%。②瘤质量及抑瘤率测定：末次给药24 h后，颈椎脱臼法处死小鼠并称体质量，完整剥取瘤体，用滤纸擦拭干净后置电子天平上称瘤质量，根据瘤质量计算各给药组小鼠的肿瘤抑制率，抑癌率=(模型组瘤质量-实验组瘤质量)/模型组瘤质量×100%。③摘眼球取血后，分离血清-80 ℃保存待检。按ELISA试剂盒说明书检测血清中IL-2、TNF-α和AFP含量。④肿瘤组织病理学检查：各组瘤体用4%多聚甲醛固定24 h后，石蜡包埋切片，常规HE染色，在光镜下观察肿瘤组织病理学改变，以肿瘤细胞坏死的面积大小初步判定CPhGs药物的治疗效果。1.5 统计学方法应用SPSS 17.0软件进行统计分析，各组数据结果以 x-±s 表示，以单因素方差分析进行多组间数据比较，检验水准α=0.05。2 结●果2.1 小鼠的一般情况观察给药前，各组间小鼠体质量差异均无统计学意义(P>0.05)。模型组在试验过程中由于灌胃操作有2只小鼠死亡。给药后，与空白对照组比较，模型组小鼠体质量随肿瘤的生长而增加，但差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，阳性治疗组和CPhGs各剂量组小鼠体质量均有一定的下降，但差异无统计学意义(P>0.05)。试验第4 d开始，小鼠腋下开始出现膨隆，动物精神活动状态变差，对外界刺激反应迟钝，食欲减退，毛色变暗淡。模型组最先出现肿瘤块，且生长速度最快，以上反应最明显，CPhGs低、中剂量组次之，高剂量组和阳性治疗组肿瘤生长较慢，生存质量较好，未见明显的不良反应(见表1)。2.2 肉苁蓉CPhGs对H22荷瘤小鼠脾脏和肝脏系数的影响表2结果显示，与空白对照组相比，模型组脾脏系数明显减少、肝脏系数明显增大(P均<0.01)；与模型组比较，阳性治疗组、CPhGs各剂量组脾脏系数明显增大、肝脏系数明显降低(P均<0.01)，表明CPhGs可在一定程度上提高荷瘤小鼠的免疫功能，抑制肝脏受损。2.3 肉苁蓉CPhGs对H22荷瘤小鼠瘤体生长的影响表3结果显示，与模型组比较，阳性治疗组与CPhGs中、高剂量组H22荷瘤小鼠瘤质量明显下降，差异具有统计学意义(P均<0.01)，阳性治疗组及CPhGs中、高剂量组肿瘤抑制率分别为56.91%、52.97%和35.80%。2.4 肉苁蓉CPhGs对H22荷瘤小鼠血清IL-2、TNF-α和AFP含量的影响由表4可见，与空白对照组比较，模型组TNF-α和AFP含量显著增加， 差异均具有统计学意义(P均<0.05)；与模型组比较，阳性治疗组与CPhGs中、高剂量组IL-2含量均明显增加(P均<0.05)；阳性治疗组和CPhGs各剂量组TNF-α含量均明显减少(P<0.05)；阳性治疗组与CPhGs中、高剂量组AFP含量均明显下降(P<0.05)； CPhGs高剂量组IL-2含量、TNF-α含量及AFP含量与阳性治疗组更接近，但差异无统计学意义(P>0.05)。提示肉苁蓉CPhGs可促进IL-2的表达，抑制TNF-α与AFP的表达，且高剂量组效果更好。2.5 肿瘤组织病理学观察大体可见：模型组瘤体较大，表面颜色淡红，质地较软，与周围组织分界较清楚，剖面渗血较多。CPhGs各剂量组肿瘤组织边缘区毛细血管明显减少，肿瘤瘤体较小，表面灰白，质地较韧，剖面灰白，中央区可见坏死，切面渗血较少。光镜HE染色(图1)可见：模型组荷瘤小鼠的癌组织中，有大量的肿瘤细胞，细胞排列紧密，细胞核着色均匀，形态清晰，细胞间质较少。与模型组相比较，给药组肿瘤组织中细胞数明显减少，形态不规则，异质性降低，细胞核破碎，并伴有大量细胞坏死，坏死周边有大量的炎细胞浸润(包括中性粒细胞、淋巴细胞和浆细胞，如图中箭头所示)，且高剂量组CPhGs肿瘤细胞坏死区域出现肉芽组织的修复，其中CPhGs不同剂量组随着给药剂量的增加，肿瘤细胞的坏死面积也在增大，而CPhGs高剂量组与阳性治疗组有相当量的肿瘤细胞坏死，因此，可以初步判断CPhGs对H22肝癌荷瘤小鼠具有良好的治疗效果。3 讨●论原发性肝癌是一种临床上常见的恶性肿瘤，占我[14] 国肿瘤发病率的第4位，死亡率的第2位，其防治仍是我国目前研究的热点问题。传统中药在控制患者病情发展、改善症状体征及提高生存质量等方面的优势日渐显现，为从我国中药中寻找低毒、高效的抗肝癌作用的药物，本课题采用H22肝癌细胞制备H22荷瘤小鼠肿瘤模型，将不同剂量的CPhGs处理组与模型对照组和肝复乐阳性治疗组进行比较，探索CPhGs对H22荷瘤小鼠体内抗肿瘤的作用及其机制。结果显示，模型组最先出现腋下肿瘤膨隆且生长最快，小鼠精神状态变差、食欲下降、毛色开始暗淡等反应，CPhGs低、中剂量组次之，高剂量组和肝复乐阳性治疗组较慢，且CPhGs各剂量组小鼠体质量和肝复乐阳性治疗组均无明显的下降，提示CPhGs药物可以相对改善H22荷瘤小鼠的生存质量、降低肿瘤对机体的毒性。CPhGs各剂量组、肝复乐阳性治疗组瘤质量均明显低于模型对照组，且高剂量组肿瘤抑制率与肝复乐阳性治疗组相当，提示CPhGs对H22荷瘤小鼠体内肿瘤具有一定的抑制作用，另外，本研究结果显示，肝复乐阳性治疗组和CPhGs各剂量组的脾脏系数均高于模型组，而肝脏系数均低于模型对照组，提示CPhGs在发挥抑制肿瘤作用的同时在一定程度上提高了荷瘤小鼠的免疫功能且对肝脏也有保护作用，但对脾脏及肝脏的作用与肝复乐无明显差异。IL-2是免疫系统中的一类细胞生长因子，参与细胞免疫，在机体复杂免疫网络中起中心调节作用，能够通过促进T细胞增殖和分化等作用提高机体的免疫机能，并能产生具有抗肿瘤活性的免疫细胞。研究发现IL-2可促进淋巴因子激活的杀伤细胞的存活、扩增及活化，这种细胞是淋巴细胞与IL-2接触后产生的一种具有高效抗肿瘤细胞的杀伤细胞，且这种杀伤细胞[15-16] 只识别肿瘤抗原，对宿主正常细胞无影响。本实验结果显示，CPhGs高、中剂量组可显著提高小鼠IL-2的含量，表明CPhGs可增强H22荷瘤小鼠的免疫能力，有利于机体杀伤肿瘤细胞。TNF-α是迄今为止所发现的直接抗肿瘤作用最强[17-18] 的生物活性因子之一。TNF通过与受体结合诱导肿瘤细胞凋亡、增强宿主免疫功能、作用肿瘤血管内皮细胞，导致血管功能紊乱，继而引起肿瘤出血坏死等[19] 途径来发挥抗肿瘤作用，但TNF-α在肿瘤中表现出[20-21] 两重性，既可致肿瘤坏死，也可促肿瘤的生长。在正常机体内TNF-α的浓度较低，具有抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞血管形成血栓而发生出血坏死、增强机体抗肿瘤免疫功能等作用；同时TNF作为一个内源性的肿瘤促进因素，由肿瘤细胞本身产生的TNF-α可以刺激肿瘤细胞生长，并抑制免疫效应细胞对肿瘤细胞的毒性作用；因此，TNF-α的生物学作用与其体内的水平高低密切相关。本实验中发现，与正常组比较，模型组TNF-α明显升高，这与肿瘤的TNF-α升高一致，CPhGs各剂量组小鼠TNF-α水平显著下降，表明CPhGs具有抑制H22荷瘤小鼠血清中TNF-α异常升高的作用，抑制肿瘤的发生。正常情况下，AFP主要来自胚胎的肝细胞，胎儿出生后约两周AFP从血液中消失，因此正常成年人血[22] 清中AFP的含量尚不到20 μg/mL 。在成人，AFP可以[23] 在大约80%肝癌患者血清中升高。当人肝细胞发生癌变时，其恢复产生AFP这种蛋白的功能，而且随着病情恶化它在血清中的含量也会急剧增加。AFP作为诊断原发性肝癌的一个特异型临床指标，血清AFP浓[24] 度通常与肝癌大小呈正相关。本实验结果显示CPhGs高、中剂量组可显著降低小鼠AFP的含量，表明CPhGs能够抑制H22荷瘤小鼠血清中AFP的表达，抑制肿瘤的生长。HE染色可见，与模型组比较，CPhGs能明显促进肿瘤细胞凋亡，使肿瘤细胞生长受抑制，瘤细胞异质性降低，并伴有大量细胞坏死，其中CPhGs不同剂量组随着给药剂量的增加，肿瘤细胞的坏死面积也在增大，而CPhGs高剂量组与肝复乐阳性治疗组有相当量的肿瘤细胞坏死，提示CPhGs对H22肝癌荷瘤小鼠具有良好的抑瘤效果。综上，CPhGs具有良好的抗肝癌作用，可能与CPhGs降低荷瘤小鼠血清中AFP含量及提高荷瘤小鼠免疫能力有关。本研究为利用肉苁蓉中CPhGs成分开发新的抗肝癌药物提供了基础数据。参考文献[1] 彭芳，徐荣，王夏，等. 肉苁蓉属药材加工炮制研究进展[J].中国现代中药，2015，17(4)：406-412.[2] 钟耀欣. 解读《神农本草经》32[J]. 开卷有益(求医问药)，2015，35(8)：40-41.[3] 刘雄，李成明，高建德，等. 肉苁蓉的研究进展[J]. 中国中医药科技，2013，20(5)：575-576.[4] 耿惠杰，于光恩. 肉苁蓉属植物的开发与利用[J]. 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2.2 抗衰老衰老是生物界最基本的自然规律之一，是随着时间的推移所有个体都将发生功能性和器官性衰退的渐进过程。皮肤衰老与机体衰老同步发展，随着人们对皮肤衰老机制的认识不断深入，目前关于皮肤衰老的机制学说已有30多种。中药延缓皮肤衰老的作用主要体现在清除自由基、修复胶原等方面。YANG等研究发现肉苁蓉提取物可以清除DPPH自由基，具有抗氧化能力。同时，肉苁蓉提取物可以显著降低胶原酶和弹性蛋白酶mRNA的表达水平，并抑制胶原酶、弹性蛋白酶及透明质酸酶的活性，具有延缓皮肤衰老的作用。研究表明，肉苁蓉的活性成分苯乙醇苷、多糖等对延缓皮肤衰老均有一定的效果。肉苁蓉的不同活性成分对应的衰老作用途径如表1所示。表1 肉苁蓉活性成分与其抗素老作用途径Tabi Actveingredertsd Cstanche andthe pathwaydheirartr-agingefleds苯乙醇苷 ①清除羟自由基及超氧阴离子自由基，降低活性氧自由基（ROS）的积累，减轻ROS损伤202②提高谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氯酶（CAT）的活性，降低丙二醛（MDA）含量，减少脂质过氧化物（LPO）的产生和堆积2；③提高羟脯氨酸含量，促进胶原蛋白生成；④调节巨噬细胞、T细胞、NK细胞等免疫细胞，影响白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等细胞因子的产生和释放，提高机体免疫能力，延缓细胞衰老［2324；⑤通过调节NRF2和RACH1转录因子的活性，诱导角质形成细胞中血红素氧化酶1（HMOX1）的基因表达，刺激内源性防御机制，增强细胞保护能力，减轻皮肤衰老和氧化应激损份。多糖①抗氧化作用，清除DPPH自由基、羟自由基和ABTS自由基，增强皮肤中SOD、CAT、GSH-Px的活性，降低MDA和脂褐素含量，减轻皮肤氧化损伤；②提高皮肤羟脯氨酸含量，增强皮肤弹性； ③抑制非酶糖化反应，减少高级糖基化中末产物（AGEs）的产生网；④促进淋巴细胞增殖，增强巨曜细胞活性，增强机体免疫能力。其他D-甘露醇能提高皮肤羟脯氨酸含量，使老龄鼠的LPO／SOD活性向正常成年鼠逆转网；黄酮类、酚类物质具有显著的抗氧化作用。2.3 防晒随着光对皮肤损伤研究不断深入，人们的防晒意识不断提高。然而目前市场上防晒化妆品中的防晒剂，包括物理防晒剂及化学防晒剂均具有一定的危害，难以满足人们的需求。广谱、安全、天然的植物防晒剂成为当下研究的热点。肉苁蓉的主要活性成分苯乙醇苷分子中具有多个苯环和共轭结构，研究发现，苯乙醇苷在280～380nm具有较强吸收，可用作天然防晒剂，缓解紫外线对皮肤的伤害。苯乙醇苷添加量为1％或2％的防晒霜无不良反应，且具有良好的稳定性和光保护作用。FACINO等研究发现，松果菊苷可以保护皮肤免受UVA／UVB诱导的氧化应激损伤，清除自由基，防止胶原蛋白的降解。ZHANG等“采用UVB照射小鼠皮肤损伤模型和人永生化表皮细胞（HaCaT）损伤模型进一研究了松果菊苷对UVB诱导的皮肤损伤的光保护作用及潜在的作用机制。小鼠实验结果表明，外用松果菊苷乳膏可以明显改善UVB所致的小皮肤病变，包括水肿、粗糙、红斑、溃烂、皱纹、表皮增厚、真皮层组织排列紊乱等，且改善作用与松果菊苷的含量呈正相关。HaCaT细胞实验结果表明，松果菊苷对UVB诱导的DNA损伤和细胞凋亡具有显著的保护作用。松果菊苷可以提高细胞中SOD、CAT、GSH-Px的活性，降低MDA、ROS的含量，发挥抗氧化作用，减少细胞的氧化损伤，阻止DNA碎片化，抑制细胞凋亡；另外，松果菊苷可以下调细胞中ATM／Rad3相关蛋白（ATR）、Chk1、p53、半胱天冬酶（Caspase-3）、多腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）的表达，减少细胞凋亡，井上调XPA蛋白的表达，促进DNA的修复。AVILA等研究毛蕊花糖苷的光保护作用，结果发现毛蕊花糖苷对UVB诱导的细胞凋亡的保护作用优于防晒剂甲氧基肉桂酸乙基己酯，且采用豚鼠模型测定的SPF值是甲氧基肉桂酸乙基己酯的4倍多。综上，肉苁蓉的苯乙醇苷成分不仅可以吸收紫外线，还具有抗氧化、修复DNA损伤和减少细胞凋亡的作用，在防晒化妆品中具有潜在的应用价值。2.4 抑菌化妆品富含油脂、水分、蛋白质等营养物质，适宜微生物的生长和繁殖。因此，化妆品中需添加一定量的防腐剂来防止腐败变质。相对目前常用的化学合成防腐剂，中药防腐剂具有低毒、安全性高、天然来源等多种优势，更受消费者的欢迎。肉苁蓉有较好的抑菌效果。王晓琴等＊研究发现肉苁蓉多糖对四叠球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、啤酒酵母和橘青霉的生长均有一定的抑制作用。杜锐等”研究发现肉苁蓉水煎剂对金黄色葡萄球菌也有明显的抑制作用。NAJEEB等研究了德赢vwin登录 的甲醇提取物、水提取物、乙酸乙酯提取物、氯仿提取物、正己烷提取物、丁醇提取物的抗细菌（伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌和大肠埃希氏菌）和抗真菌（烟曲霉、黑曲霉和黄曲霉）活性，结果发现，德赢vwin登录 的不同提取物具有不同的抑菌效果，这可能与不同提取物中所含的活性成分不同有关。2.5保湿保湿是皮肤护理的基本诉求，也是保证皮肤健康、延缓衰老的重要条件。皮肤角质层的含水量维持在10％～20％时，皮肤处于最理想的生理状态，柔润、丰满、亮泽并富有弹性：低于10％时，皮肤状态变差，干燥、粗糙，久之皮肤暗淡、出皱纹。通过外用保湿化妆品，可以提高角质层含水量，减少水分散失，维持皮肤屏障的正常功能。研究表明，肉苁蓉提取物具有优秀的持水能力，皮肤经30％的肉苁蓉酒精提取物涂敷后可明显降低水分的蒸发，可在保湿化妆品中使用。范倩文等“发明了一种包含寡糖混合物的肉苁蓉鳞茎提取物，并通过荧光标记手段观察表皮细胞表达外皮蛋白、水通道蛋白（AQP-3）、透明质酸受体CD44蛋白的水平，进而判断提取物的锁水性能。结果显示，该肉苁蓉麟茎提取物能明显提高角质细胞中3种蛋白的表达水平，提高表皮层自身锁水力，带来长久的保湿效果。同时，肉苁蓉含有的甘露醇、甜菜碱、尿囊素成分均是经典的保湿成分，也提示肉苁蓉具备保湿功效。2.6 防辐射自然界中的一切物体，只要温度在绝对温度零度以上，都以电磁波的形式时刻不停地向外传送热量，这种传送能量的方式称为辐射。辐射对皮肤、免疫系统、神经系统、造血系统等造成损害，甚至引起癌变及死亡等，天然防辐射活性成分已成为当下研究热点。胞免受x射线损伤，抑制成纤维细胞的凋亡。3 在化妆品中的应用现状随着中国传统中医药文化在全世界的认可程度与日俱增，以“天然、安全、有效”著称的“中药化妆品”已然成为业内普遍关注的焦点，备受消费者青睐。肉苁蓉具有美白、抗衰老、防晒、保湿等多种功效，目前在化妆品中已有一定的应用。赵毅等“公开了含德赢vwin登录 提取物的美白抗衰老化妆品及其制备方法，含德赢vwin登录 提取物的化妆品可以增强皮肤弹性，减少皮肤黑色素含量，提高皮肤亮度。东方淼森开发的多款功效原料均含肉苁蓉提取物。如专利保湿原料“胶倍湿”“，通过“低温恒时”提取技术，萃取桃胶、铁皮石斛、银耳、肉苁蓉4种植物的天然大分子多糖，形成空间网状结构的植物多糖保护膜，可以使肌肤柔软细滑。再如抗衰老原料“虫草回青净萃”Nutri-Boost，通过“君臣佐使”组方原则，将冬虫夏草、松茸、铁皮石斛、肉苁蓉4味中药进行科学配伍，可以有效清除自由基，抵御肌肤氧化损伤。Nutri-Boost已应用于DR PLANT冬虫夏草焕活奢养原生液中，可以为肌肤补充多重营养，使肌肤焕发活力。上海家化联合股份有限公司旗下品牌佰草集和高夫众多产品中也添加了肉苁蓉提取物，如佰草集新恒美系列产品添加的专利成分“恒颜三萃方”“由肉苁蓉、黄芪、雪莲花3味中药精炼而得，可以预防皮肤衰老，尤其是光老化；高夫恒时水润多效保湿面膜添加了由苁蓉、黄芪、雪莲花、麦冬4味中药复配的明星保湿成分“丝路水源素”。由肉苁蓉在化妆品中的应用现状可以看出，肉苁蓉凭借其中药天然优势，在化妆品中有广泛的应用价值。4 结束语肉苁蓉作为一种延年益寿、美容养颜的名贵中药，具有美白、抗衰老、防晒、抑菌、保湿、防辐射多种功效，已被应用于化妆品中。虽然肉苁蓉在化妆品中有一定的应用，但肉苁蓉的活性成分、作用机制研究仍存在不足，今后肉苁蓉作为中药化妆品原料的研究方向可从以下方面入手：①肉苁蓉主要活性成分受种属、产地等因素影响较大，作为化妆品原料进行开发需关注其质量标准的控制及产业化应用；②肉苁蓉具有多种护肤功效，但研究数据多为体外实验所得，人体数据亟待补充；③目前肉苁蓉的应用主要集中在抗衰老、

郝姗姗＇，陈素梅2，闫东海，陈明霞＇，韩雅慧＇，易斌2（1．北京斯利安药业有限公司，北京 102600；2．建昌帮药业有限公司，江西抚州344099）摘要：综述了肉苁蓉在化妆品中的应用研究进展。介绍了肉苁蓉的主要活性成分，包括苯乙醇苷、多糖等，并通过对不同种、不同产地、不同采收期和不同寄主肉苁蓉主要活性成分的综述，阐明了不同条件下肉苁蓉主要活性成分的差异性。重点概述了肉苁蓉的美容护肤作用机制及肉苁蓉在化妆品中的功效，包括美白、抗衰老、防晒、抑菌、保湿。阐述了近年来肉苁蓉在化妆品原料及化妆品中的应用现状，并分析了肉苁蓉作为化妆品原料应用到化妆品中的开发缺陷以及技术上的不足。最后指出了肉苁蓉在化妆品领域今后的研究方向。关键词：化妆品；肉苁蓉；应用肉苁蓉在我国已有两千多年的使用历史，始载于《神农本草经》，列为上品。其味甘、咸，性温，素有“沙漠人参”、“中华仙草”之美誉。肉苁蓉富含多种活性成分，具有保健美容功效。古人对肉苁蓉在保健美容方面的记载有：“久服轻身”，“润五脏，长肌肉”，“益髓，悦颜色，延年”，“补精败，面黑，劳伤”等。近年来，肉苁蓉在化妆品领域的开发应用已逐步开展，相关的科学研究表明其在美白、抗衰老、防晒、抗炎、抑菌、保湿及防辐射方面具有良好的效果。本文从肉苁蓉的主要活性成分、美容护肤机制、在化妆品中的功效及应用现状等方面进行综述，为肉从蓉在化妆品中的进一步应用提供一定的理论基础。1 肉苁蓉的主要活性成分肉苁蓉的活性成分中既有挥发性成分，也有100多种已分离出的非挥发性成分，包括苯乙醇苷、多糖、低聚糖、木脂素类、环烯醚萜类、黄酮、生物碱、氨基酸、微量元素等。苯乙醇苷和多糖是研究较为深入的主要活性成分，具有显著的神经保护、免疫调节、抗氧化等药理作用＂。目前，肉苁蓉共分离得到70个苯乙醇苷成分，其中松果菊苷和毛蕊花糖苷是衡量肉苁蓉质量标准的关键苯乙醇苷化合物。松果菊苷和毛蕊花糖苷的结构式见图1。肉苁蓉中分离得到的多糖包括cistan A、CDA-IA、CDA-3B，CDP-4、ACDP-2、 SPA等，主要由葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、果糖等单糖组成。研究表明，不同种、不同产地等因素均会影响肉苁蓉中苯乙醇苷、多糖等活性成分的含量。 图1 松果菊苷和毛蕊花糖苷的结构式Fig.1 Structure of echinacoside and acteoside1.1 不同种肉苁蓉的活性成分差异肉苁蓉属约20种，我国有4种1变种，分别为肉苁蓉（又名荒漠肉苁蓉，Cistanche deserticola Y.C.Ma）、德赢vwin登录 （C.tubulosa（Schenk）R.Wight）、盐生肉苁蓉（C.salsa，C.A. Mey.）G.Beck）、沙苁蓉（C.sinensisG.Beck）和白花盐苁蓉C.salsa var albiflora P.F.Tu et Z.C.Lou）。居鹏飞等”对我国s 种肉苁蓉所含的苯乙醇苷成分进行了定性分析，并对松果菊苷和毛蕊花糖苷进行了定量分析。定性分析结果表明荒漠肉苁蓉、德赢vwin登录 、盐生肉苁蓉和白花盐苁蓉所含的苯乙醇苷成分相似，沙苁蓉差别较大。定量分析结果表明5种肉苁蓉中的松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量各不相同，其中盐生肉苁蓉含量最高，沙苁蓉含量最低。1.2不同产地肉苁蓉的活性成分差异中药素有“道地性”，不同产地中药的活性成分具有一定的差异。刘雄等“测定甘肃张掖、甘肃靖远、新疆、内蒙4个产地肉苁蓉中的松果菊苷含量，发现4个产地肉苁蓉中松果菊苷的质量分数在0.42％～1.52％。其中张掖的含量最高，靖远的含量最低。王果平等”发现南疆不同产地德赢vwin登录 中松果菊苷含量差异显著，质量分数介于2.78％～11.93％，井且同一产地栽培和野生的德赢vwin登录 中松果菊苷含量也有差异。薛德钧等”对不同产地肉苁蓉的多糖含量进行比较分析，发现不同产地肉苁蓉多糖含量存在差异，且组成多糖的单糖成分也不尽相同。1.3不同采收期肉苁蓉的活性成分差异中国药典2020年版一部肉苁蓉项下规定，肉苁蓉在春季苗刚出土时或者秋季冻土前进行采挖，但春秋两季采收的肉苁蓉的质量具有一定的差别。钱浩等对比春秋两季采收的肉苁蓉中4种苯乙醇苷成分松果菊苷、肉苁蓉苷A、毛蕊花糖苷和2＇-乙酰基毛蕊花糖苷的含量。结果发现，不同季节采收的肉苁蓉中4种成分含量差异显著，其中秋季采收的肉苁蓉中松果菊苷和肉苁蓉苷A含量较高，春季采收的肉苁蓉中2＇-乙酰基毛蕊花糖苷和松果菊苷含量较高。王雪媛等考察春秋两季采收的肉苁蓉中松果菊苷、毛蕊花糖苷、多糖等活性成分的含量。结果发现春季采收的肉苁蓉中松果菊苷与毛蕊花糖苷的总量是秋季的3倍多，达12.21mg／g，而秋季采收的肉苁蓉中多糖的量显著高于春季。1.4 不同寄主肉苁蓉的活性成分差异肉苁蓉为多年生，根部全寄生草本植物，寄生于梭梭、盐爪爪等寄主植物的根部。肉苁蓉和寄主关系密切，寄主植物为肉苁蓉输送营养物质和水分。张烜等测定3个不同品种，5种天然寄主和2种栽培寄主肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量，结果发现同一品种不同寄主肉苁蓉所含的松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量明显不同。对于盐生肉苁蓉，以松果菊苷含量为指标排序为：甜菜＞琵琶柴＞囊果碱蓬（栽培）＞盐爪爪；以毛蕊花糖苷含量为指标排序为：囊果碱蓬（栽培）＞甜菜＞琵琶柴＞盐爪爪。2 肉苁蓉的美容护肤作用机制及功效研究证明，肉苁蓉不仅具有广泛的药理作用，在皮肤改善及美容等方面也有很好的功效。2.1美白我国有句俗语“一白遮百丑”，白暂、光洁、细腻的肌肤一直是东方女性追求的目标。因此美白剂的研发一直是行业内的重点课题。目前，美白剂的研发主要以抑制酪氨酸酶活性为主导”。含苯环或酚羟基结构的化合物具有潜在的美白功效，如目前常用的美白剂熊果苷，可以通过抑制酪氨酸酶的活性发挥美白作用。肉苁蓉的主要活性成分苯乙醇苷是一类天然糖苷类化合物，由母核糖基、苯丙烯酸和部分苯乙醇通过酯键和糖苷键连接形成。杨建华等“研究发现纯度为48.2％的苯乙醇总苷能够有效抑制酪氨酸酶的活性，对酪氨酸酶的效应表现为竞争型可逆性抑制。之后杨建华团队”又考察了纯度为87.6％的苯乙醇总苷对酪氨酸酶活性和人表皮黑素细胞黑色素生成的抑制作用。结果发现，苯乙醇总苷对酪氨酸酶的抑制作用优于熊果苷，其IC为716.51pg／ml。进一步研究发现，400μg／mL的苯乙醇总苷能显著抑制黑色素的生成，抑制率达31.43％，与熊果苷相当。同时，通过单独比较10种苯乙醇苷化合物对黑色素生成的抑制作用，发现其抑制能力与酚羟基和苷元的数目、酚羟基的位置、空间位阻、母核糖基糖醛基上的取代基有关。且杨建华团队利用微乳技术、传递体技术解决了苯乙醇苷溶解性能和透皮吸收差的问题，为苯乙醇苷在美白化妆品中的应用提供了指导。YANG等也发现肉苁蓉提取物对酪氨酸酶活性有较强的抑制作用，10mg／mL的肉苁蓉提取物对酪氨酸酶活性的抑制率高达78.5％。

帖晓燕＇，冯银平＇，马冬妮＇，张云鹤＇，张文广＇，王丹＇，樊秦2，李芸（1．甘肃中医药大学，甘肃兰州 730000；2．甘肃省中藏药化学与质量研究省级重点实验室，甘肃兰州 730000）摘要：探讨产地蒸制加工对荒漠肉苁蓉药材质量的影响，为肉苁蓉的产地加工提供科学依据。新鲜的荒漠肉苁蓉刷去表面浮土，刮去表皮鳞叶，后根据其粗细、长短规格进行大小分档并蒸制（蒸至透心为止），将直径为3.0～4.0cm、4.0～4.5cm、4.5～5.0cm的肉苁蓉分别蒸制10mim、12～13 min、15～16mim，然后在70℃下烘至七入成干，切成不同规格的饮片和丁，按照《中华人民共和国药典》（2015年版）方法分别测定水溶性浸出物，醇溶性漫出物，松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量。结果表明，肉苁蓉的浸出物均符合《中华人民共和国药典》规定，且以5～10mm饮片为佳，新鲜肉苁蓉药材的松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量明显不达标，但经过产地加工，肉苁蓉的含量均都达到《中华人民共和国药典》要求，且1.5cm丁的质量较好，经过蒸制加工后的肉苁蓉较新鲜药材质量明显提高。产地蒸制加工对肉苁蓉的质量影响显著，为肉苁蓉合理的产地加工提供科学依据。关键词：肉苁蓉：满制加工；漫出物；松果菊苷；毛蕊花糖苷中图分类号：8853.72      文献标识码：A   文章编号：1000-6354（2021）02-0080-04肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉 Cistanche deserticola Y.C.Ma和德赢vwin登录 Cistanche tmbulosa（Schenk）Wight的干 燥带鳞叶的肉质茎叫，主产于内蒙古、新疆、甘肃等地，主要生长在盐碱地、戈壁沙漠一带，主要寄生在红柳、莎莎、西伯利亚白刺等植物的根上。《神农本草经》将肉苁蓉归为上品，又有肉松容、黑司命之称。有研究表明，肉苁蓉总寡糖、去半乳糖醇总寡糖和半乳糖醇是肉苁蓉通便的主要活性成分吗。肉苁蓉中含有苯乙醇苷类、生物碱、多糖等多种成分。其中，苯乙醇苷类具有重要的神经保护作用，常用于治疗和预防帕金森病。产地加工是中药材生产的第一个环节，也是最关键的一步。《中华人民共和国药典》记载肉苁蓉的产地加工为：除去茎尖，切段，晒干叫。荒漠肉苁蓉的传统产地加工方法为在出土前被挖去带有鳞片的肉质茎，干燥后即可作为药用”。现代常常采用蒸制加工处理的方法，以此来尽可能保留或提高肉苁蓉中的醇溶性成分及苯乙醇苷类等有效成分的含量网。但荒漠肉苁蓉的肉质茎比较粗壮，采收期天气比较寒冷，太阳光较少，很不容易干燥，药材极易发生霉烂变质，而且好不容易干燥的药材，在炮制成饮片时需进行二次网润，难免会造成水溶性成分的流失，从而影响了药材的品质和临床疗效。而趁鲜蒸制加工并切制干燥，将采挖的新鲜肉苁蓉直接蒸制加工，再切制干燥，即在产地就形成中药饮片，减少中间形成干药材的环节，既能避免有效成分的损失，又能降低成本。笔者等以探讨产地蒸制加工对荒漠肉苁蓉质量的影响为目的，为规范肉苁蓉的产地加工提供科学依据。1 仪器与试药1.1 仅器Agilent 1260ll型高效液相色谱仅（美国Agilent科技有限公司，DAD检测器）；MA37型快速水分测定仪（赛多利斯科学仪器有限公司）；BT125D型1／10万电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；KQ3200DB型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；FW-400A型高建万能粉碎机（北京科伟永兴仪器有限公司）；SHB-3型循环水多用真空泵（郑州杜甫仪器厂）：DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）。1.2 试剂松果菊苷对照品（批号CHB170302．HPLC≥98％）、毛蕊花糖苷对照品（批号CHB171103，纯度≥98％）均购自成都克洛玛生物科技有限公司：甲醇均为色谱纯；45％乙醇为分析纯；水为娃哈哈纯净水。1.3 药材实验用荒漠肉苁蓉采挖自内蒙古阿拉善盟左旗，经甘肃中医药大学附属医院杨锡仓主任中药师鉴定为列当科植物肉苁蓉 Cistanche deserticola Y.C.Ma的干燥带鳞叶的肉质茎。新鲜采挖的肉苁蓉水分为71.22％。2 方法与结果2.1 新鲜肉苁蓉的加工处理新鲜荒漠肉苁蓉刷去表面浮土，刮去表皮鳞叶，后根据其粗细长短规格进行大小分档并蒸制（蒸至透心为止），将直径为3～4cm的蒸制10mm；直径为4.0～4.5cm的肉苁蓉蒸制12～13min；直径为4.5-5cm肉苁蓉蒸制15～16 min．然后在70℃下烘至水分约20％时（七八成干），切成不同规格的片和丁。见表1。表1 样品信息Tab.1 Information of samples编号规格厚度／mmOS鲜药材IS片5S25-10S310S4丁10SSS615202.2 水分测定取样品粉末（过3号筛）约3.0g．精密称定，使用快速水分测定仪测定，每个样品平行测定3次。结果见表2。2.3 浸出物测定测2.3.1 水溶性浸出物 取样品粉末（过4号筛）约3.0g．精密称定，照《中华人民共和国药典》2015年版四部（通则2201），采用水为溶剂以冷浸法进行测定，每个样品平行3份。结果见表2。2.3.2 醇溶性浸出物 取样品粉末（过4号筛）约3.0g．精密称定，照《中华人民共和国药典》2015年版四部（通则2201），采用稀乙醇为溶剂以冷浸法进行测定，每个样品平行3份。结果见表2。2.4 松果菊苷和毛蕊花糖苷含量测定叫2.4.1 色谱条件 参考《中华人民共和国药典》2015年版（一部）肉苁蓉项下含量测定方法优化。色谱柱为AgilentExtend Ca（4.6mmx250mm，5μm），以甲醇为流动相A．0.1％甲酸溶液为流动相B进行梯度洗脱（0～15 min．26.5％ A：15～20min，26.5％～35％A；20～25 min，35％～40％A），流速为1.0ml／min，柱温为30℃，进样量为10pL．检测波长为330mm。色谱图见图1。2.4.2 混合对照品溶液的制备 取松果菊苷对照品、毛蕊花糖苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1mL分别含1mg松果菊苷和0.495mg毛蕊花糖苷的混合溶液，即得。2.4.3 供试品溶液的制备 取本品粉末（过4号筛）约1g．精密称定，置100ml棕色量瓶中，精密加入50％甲醇25ml，密塞，摇匀，称定重量，浸泡30min，超声处理40min图1 松果菊苷和毛蕊花糖苷对照品（A）、新鲜肉苁蓉（B）、不同规格饮片（C）溶液HPLC图谱Fig.1 HPLC of chinacoside and verbascoside reference substance(A),fresh Cistanche desenicola(B),different specificatioms(C)solution注：1．松果菊苷：2．毛蕊花糖苷。Notes:1.Chinacoile:2.verhasconile.表2产地加工不同规格肉苁蓉水分、浸出物、苯乙醇苷类成分的含量测定结果（n＝3）Tab.2 Determination results of moisture,extracts,com-tent of phenylethanoid glycosides of Cistanche deserticola (m=3)（功率250W，频率35kHz），放冷，再称定质量，用50％甲醇补足减失的质量，摇匀，静置，取上清液，滤过，取续滤液，即得。2.4.4 方法学考察2.4.4.1 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液0.02mL、0.04mL，0.10ml．0.20mL．0.40 mL、1.00 ml．．分别置 5.00mL量瓶中，加入50％甲醇定容，摇匀，按上述色谱条件注入色谱仪，记录峰面积，以质量浓度为横坐标（X），峰面积值为纵坐标（Y），绘制标准曲线。2.4.4.2 精密度试验 取混合对照品溶液，按上述色谱条件重复进样6次，依法测定。2.4.4.3 重复性试验 取SI样品，按上述供试品溶液的制备方法平行制备6份，依法测定。2.4.4.4 稳定性考察 取S1样品溶液，分别于配制后0h、2 h、4h、6h、10h、24h进样，依法测定。2.4.4.5 样品含量测定 分别精密称取S0～S6样品，按上述供试品溶液的制备方法分别制样，依法测定，计算党参炔苷的含量。结果见表2。2.5 产地加工不同规格肉苁蓉水分测定结果结果见表2。由表2可知，产地加工不同规格肉苁蓉（无论是片或丁）蒸制加工后的饮片水分均比新鲜药材低。经过蒸制加工，肉苁蓉不同规格的饮片水分均比新鲜时的低，且3种规格下饮片的水分均比3种规格的丁低。2.6 产地加工不同规格肉苁蓉浸出物测定结果由表2可知，产地加工不同规格的肉苁蓉经过蒸制加工后，无论是片还是丁，其水溶性浸出物均高于新鲜药材；3种规格下片的醇溶性浸出物均高于新鲜药材，但3种规格下丁的醇溶性浸出物却低于新鲜药材。且水溶性浸出物和醇溶性浸出物最高的均为0.5～1.0cm的片。2.7 方法学考察结果松果菊苷回归方程为Y＝7 346X-23.749，r＝0.999 9．毛蕊花糖苷回归方程为Y＝8 783.8X-10.522，r＝0.999 9。结果表明松果菊苷在0.004～1.000mg／ml．范围内线性关系良好；松果菊苷和毛蕊花糖苷峰面积的RSD分别为0.18％和0.14％，表明仪器的精密度良好；松果菊苷和毛蕊花糖苷含量RSD分别为5.54％和3.65％，表明该方法重复性良好；松果菊苷和毛蕊花糖苷峰面积的RSD分别为0.16％和0.47％，表明样品中松果菊苷和毛蕊花糖苷在24h内稳定性良好；新鲜的荒漠肉苁蓉松果菊苷和毛蕊花糖苷的总含量仅为0.13％，不符合《中华人民共和国药典》标准（不低于0.3％），但经过蒸制切制成不同规格的饮片后，其总含量均达到《中华人民共和国药典》要求，其总含量由高到低依次为1.5cm丁＞（0.5～1.0）cm片＞2.0cm丁＞0.5cm片＞1.0cm丁＞1.0cm片。2.8 统计分析结果见表3。由方差分析结果可得，与新鲜的荒漠肉苁蓉相比，肉苁蓉不同规格干燥品的水溶性浸出物、醇溶性浸出物、松果菊苷、毛蕊花糖苷、总含量指标均具有显著的统计学差异。表3 方差分析Tab.3 Variance analysis方差来源方差平均和 自由度均方F显著性水溶性浸出物373.619662.2707.610Pc0.05醇溶性浸出物453.005675.5014.928Pc0.05松果菊苷8.82861.471207.124P0.05毛蕊花糖苷0.480608001.749Pc0.05总含量10.87961813109,385P00.05 3 讨论3.1 肉苁蓉的产地加工主要以蒸制为主，研究表明，蒸制可显著提高肉苁蓉中苯乙醇苷类成分的含量。课题组对蒸制前后的肉苁蓉进行比较，发现蒸制后，肉苁蓉质变软，颜色变深，并伴有烤红薯气味，蒸制后肉苁蓉的品质较新鲜肉苁蓉有了很大提高，关于是否与蒸制后使其颜色变化，产生气味的物质基础有关，还有待进一步研究与探讨。3.2 趁鲜蒸制加工并切制干燥，避免了传统炮制过程中因“二次闷润”造成有效成分的损失，从面提高药材品质和临床疗效。目前，常常会将肉苁蓉切制成约5mm的厚片监は-매，而未见有相关研究关于其他规格下的肉苁蓉质量检测情况。笔者对蒸制后的肉苁蓉进行了不同规格的切制，分别为5mm、5～10mm、10mm的厚片和10mm、15mm、20mm的丁，研究结果表明，15mm丁和5～10mm厚片相较于其他规格质量最佳，可在实际生产中切制成此类规格，即能保证质量，又便于临床调剂。3.3 本研究以探讨鲜药材在经过产地加工过程化学成分的变化为目的，以水溶性浸出物、醇溶性浸出物、松果菊苷、毛蕊花糖苷的含量为考察指标，科学合理，为肉苁蓉产地加工规范化生产提供参考，也为以肉苁蓉为核心研发系列产品提供依据。参考文献：［］国家药典委员会，中华人民共和国药典：一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2015：135-136．［2］沈连生．神农本草经中药彩色图谱［M］北京：中国中医药出版社，1996：93-94．［3］高云佳，姜 勇，戴 昉，等．肉苁蓉润肠通便的药效物质研究［J］中国现代中药，2015,17（4）：307-310＋314．［4］龚千锋．中药炮制学［M］．9版．北京：中国中医药出版社，2015:347.[5] SHENG G.PU X.LEI L.et d.Tubuloside B from Cistanche salsa rescues the PC12 neuronal cells from 1-methyl-4-phenylpyridinium ion -induced apoptosis and oxidative stre-[J].Planta Medica,2002.68(11):966-970.[6]GENG X.SONG L.PU X.et a. Neuroprotective effects

2.1.7 稳定性试验取同一批肉苁蓉样品6份，按“2.1.2”项制备供试品溶液2.1.3”项色谱条件下于0、2、4、12、24h进样，记录松果菊苷、肉苁蓉苷A、管花苷A和毛蕊花糖苷峰面积，RSD值分别为0.45％、1.68％、1.89％、1.05％，表明供试品在24h内稳定。2.1.8 加样回收率试验取已知含量的肉苁蓉样品0.5g，精密称取6份，分别加入适量对照品溶液，加50％甲醇补足至50mL，按“2.1.3”项色谱条件进样，测得松果菊苷、肉苁蓉苷A、管花苷A、毛蕊花糖苷平均加样回收率分别为103.24％、103.54％、97.67％、101.01％， RSD分别为4.18％、3.89％、3.90％、3.32％，加样回收率良好。2.1.9 含量测定按“2.1.2”项下方法制备样品，分别精密吸取供试品溶液各10μL注入高效液相色谱仪测定。2.2 可溶性多糖测定2.2.1 供试品溶液制备取干燥后的肉苁蓉粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入95％乙醇50mL，超声30 min，趁热过滤，重复提取1次，滤渣挥干乙醇后加水50mL，超声处理30min，重复提取1次。合并滤液，加活性炭吸附脱色，转移至100mL容量瓶中，蒸馏水定容至刻度线，密塞，摇匀，取1mL溶液至50ml量瓶中，蒸馏水定容至刻度线，即得可溶性多糖供试液。2.2.2 对照品溶液的制备精密称定葡萄糖对照品12.3mg，加蒸馏水溶解并定容至100mL棕色量瓶中。吸取1、3、5、7、8、9mL分别置于10ml量瓶中，蒸馏水定容至刻度线，即得到不同浓度的对照品溶液。2.2.3 含量测定以蒸馏水做空白对照，取蒸馏水与供试品各2mL，冰水浴中缓慢加硫酸-蒽酮试液5mL，摇匀，沸水浴10min，冷却，于626nm波长下测定。2.2.4 方法学考察精密度试验RSD值为0.65％，表明仪器精密度良好：稳定性试验RSD值为4.55％，表明供试品在2h内稳定性良好：重复性试验RSD值为0.05％，表明该方法重复性良好。2.3 数据分析利用Excel 2010软件进行数据统计，SPSS 23.0软件进行方差分析。3 结果及分析3.1 不同寄主和不同采收季节肉苁蓉苯乙醇苷含量以甘肃省民勤治沙综合试验站采收的四翅滨藜寄生肉苁蓉和甘肃省民勤县采收的梭梭寄生肉苁蓉为研究对象，通过对不同寄主和不同采收季节肉苁蓉苯乙醇苷含量的测定可以看出（表1），不同寄主和不同采收季节肉苁蓉苯乙醇苷含量存在差异。秋季采收的不同寄主肉苁蓉中，寄主在四翅滨藜上的肉苁蓉中松果菊苷、肉苁蓉苷A和管花苷A含量均高于寄主在梭梭上肉苁蓉各成分含量，且差异显著（P＜0.05），分别高出了49.05％、49.31％、59.39％。春季采收的不同寄主肉苁蓉中，四翅滨藜寄生肉苁蓉松果菊苷、肉苁蓉苷A和毛蕊花糖苷含量分别高出了梭梭寄生肉苁蓉73.50％、49.29％、50.95％，且差异显著。而以4种苯乙醇苷成分含量作为评价标准，不论是秋季采收还是春季采收，均以四翅滨藜寄生肉苁蓉苯乙醇苷成分含量高。春季采收的梭梭寄生肉苁蓉中松果菊苷、管花苷A和毛蕊花糖苷含量都高于秋季采收的肉苁蓉，分别高出了29.06％、89.44％、90.77％，且差异显著，而肉苁蓉苷A含量差异不显著。春季采收的四翅滨藜寄生肉苁蓉中松果菊苷、管花苷A和毛蕊花糖苷含量显著高于秋季采收的肉苁蓉，分别高出了63.10％、68.67％、95.03％，而肉苁蓉苷A含量差异不明显。通过对两种不同寄主植物春秋两季采收肉苁蓉中4种苯乙醇苷成分含量进行分析，总体来看，以春季采收的质量较好。表1 不同寄主和不同采收季节肉苁蓉苯乙醇苷含量Table 3 Determi nation of phenylethanoid glyconides in C. deserticola from different hosts and harvest seasons(mg*g-')寄主植物 采收季节松果肉苁管花毛蕊花菊苷蓉苷AV8糖苷梭梭秋季19.4644.7240.2601.715%桉梭春季27.438"4.8722.458*18.574四翅滨藜秋季38.2019.319*0.6391.884四超滨藜春季103.5269.607*2.04137.865*注：同列不同小写字母表示差异显著，P＜0.05，下同。3.2 不同寄主和不同采收季节肉苁蓉可溶性多糖含量以甘肃省民勤治沙综合试验站采收的四翅滨藜寄生肉苁蓉和甘肃省民勤县采收的梭梭寄生肉苁蓉为研究对象，通过对不同寄主和不同采收季节肉苁蓉可溶性多糖含量的测定可以看出（表2），秋季采收的不同寄主肉苁蓉中，四翅滨藜寄生肉苁蓉可溶性多糖含量高于梭梭寄生肉苁蓉，高出了24.73％；春季采收的不同寄主肉苁蓉中，梭梭寄生肉苁蓉可溶性多糖含量显著高于四翅滨藜寄生肉苁蓉（P＜0.05），高出了84.97％。不同季节采收的梭梭寄生肉苁蓉中，春季采收的肉苁蓉可溶性多糖含量显著高于秋季采的肉苁蓉；不同季节采收的四翅滨藜寄生肉苁蓉中，秋季采收的肉苁蓉可溶性多糖含量显著高于春季采收的肉苁蓉（P＜0.05）。表2 不同寄主和不同采收季节肉苁蓉可溶性多糖含量Table 2. Dete mination of soluble polysaccharide content ofC.desertimla in different hosts and harvest seasons(m*g-)寄主植物采收季节可溶性多糖梭梭秋季18.317梭梭春季23.733四翅滨藜秋季24.333*四翅滨蒙春季3.5673.3 不同产地梭梭寄生肉苁蓉苯乙醇苷含量通过对甘肃省不同产地4种苯乙醇苷含量的测定可以看出（表3），不同产地的肉苁蓉样品中4种苯乙醇苷类含量存在差异，这可能是由于不同产地药材种植环境差异较大，甘肃民勤肉苁蓉松果菊苷含量为最高，达19.463mg＊g＇，分别高出了甘肃靖远和甘肃景泰74.62％、26.15％，且差异显著（P＜0.5）。甘肃景泰肉苁蓉肉苁蓉苷A含量相比其他两个产地较高，达到了5.239mg＊g，且显著高于甘肃靖远72.09％。甘肃民勤肉苁蓉管花苷A含量最高为0.260mg·g，高出了甘肃靖远54.74％。甘肃靖远肉苁蓉毛蕊花糖苷含量最高，达到了1.898mg·g。通过对3个产地肉苁蓉4种苯乙醇苷含量分析，整体来看还是以甘肃民勤的质量最优。表3 不同产地梭梭寄生肉苁蓉苯乙醇苷含量Table 3 Detemination of phenylethancid glycosides in C.deserticola from different habitats (mg*g-')产地松果菊苷肉苁蓉苷A 营花苷A 毛蕊花糖苷甘肃民勤19.4644.7240.2601.715*甘肃靖远4.9391.4620.1181.898*甘肃景泰14.3755.239*0.2211.1443.4 不同产地梭梭寄生肉苁蓉可溶性多糖含量通过对甘肃省不同产地可溶性多糖含量的测定可以看出（表4），甘肃景泰肉苁蓉中可溶性多糖含量最高为20.467mg·g，与其他两个产地的肉苁蓉存在显著差距（P＜0.05），3个产地肉苁蓉可溶性多糖含量依次为甘肃景泰＞甘肃民勤＞甘肃靖远。表4 不同产地梭梭寄生肉苁蓉可溶性多糖含量Table 4 Determination of soluble polysaccharides in C.deserticola from different habitats产地可溶性多糖甘肃民勤18.317甘肃靖远17.133%甘肃景泰20.467*4 讨论与结论产地、品种及采收期对中药材成分含量的影响一直是学者关注的热点问题，如赵志红等 研究发现，肉苁蓉在不同产地种药材的化学成分含量会产生变化：王雪媛等 研究发现，肉苁蓉春季、秋季样品中有效成分波动差异较大。本研究结果显示，不同寄主肉苁蓉药材中5种有效成分含量存在较大差异。四翅滨藜寄生肉苁蓉药材中苯乙醇苷和可溶性多糖的含量整体高于梭梭寄生肉苁蓉，原因可能与不同寄主植物、生长条件、水分等多种因素有关0。此外，因为四翅滨藜本身生物量大，可能给肉苁蓉提供了大量的养分，而到底是如何传递养分，需要后续的进行进一步说明。现阶段四翅滨藜寄生肉苁蓉研究较少且样本不够多，可为开发四翅滨藜寄生肉苁蓉提供一定的参考价值，为后续肉苁蓉的开发利用提供理论依据。对于春秋两季采收的肉苁蓉，两种不同寄主肉苁蓉药材苯乙醇苷含量均以春季采收的含量最高，梭梭寄生肉苁蓉药材可溶性多糖含量以春季最高，四翅滨藜寄生肉苁蓉可溶性多糖含量以秋季最高。这可能与不同采收期环境中生态因素（如土壤温度、空气温度、空气湿度、光合有效辐射等）会发生不同程度的变化等有关-0，而中国药典规定松果菊苷和毛蕊花糖苷含量作为肉苁蓉质量评价标准，可以得出肉苁蓉以春季采收较好，为后续肉苁蓉采收季节提供理论依据。甘肃不同产地梭梭寄生肉苁蓉苯乙醇苷含量有较大差距，说明产地对肉苁蓉质量有一定的影响，而不同产地肉苁蓉中可溶性多糖含量无较大变化，综合评价出甘肃民勤梭梭寄生肉苁蓉质量最优。研究结果显示产地和寄主及采收季节均会影响肉苁蓉中苯乙醇含量和可溶性多糖含量。苯乙醇苷类成分，具有较强的补肾阳和神经保护作用，而肉苁蓉含有丰富多糖，具有较强的抗衰老和润肠通便之功效-。由上述可知，肉苁蓉寄主植物的不同对肉苁蓉质量有一定影响，且各成分含量存在较大差异性。新兴发现的四翅滨藜寄生肉苁蓉质量较好，且春季采收明显好于秋季采收，这需要后续研究学者对四翅滨藜寄生肉苁蓉进行大量研究，制定更加客观统一的质控标准。新兴寄主植物四翅滨藜的成功引入对于提高肉苁蓉资源以及开发利用具有深远意义。参考文献：0］ 国家药典委员会，中华人民共和国药典（一部）］．北京：中国医药科技出版社，2015：281-282[2] 毕苹萃，刘银路，魏芬芬，等，肉苁蓉的主要化学成分及生物活性研究进展D］，药物评价研究，2019.42（9）：1896-1900.0 lei L. Jiang Y.Lin X.etal Now ghemides fven Gistanche deser-ticvla 1.Helv Chin Acta.2010.90(1):79.[4] Lin X M.Li J.Jiang Y. e al Chemical cunstitornts fm Cisanche deserticnla(Olnchara),Bicchem Syst Eed. 2013.47(8):21.[s] Tu P F. Shi H M. Sung Z H.et al. Chemical comtkuents of Cidanche dewnicala [].JAsian Nat Prod Bes.2007.9 (1):79.6 范亚楠，黄玉秋，贾天柱，等，星点设计-效应面法优化肉苁蓉软化切制工艺，中药材，2017.40（）：656-659．[7] 颜显，中药肉苁蓉化学成分及体内成分分析［D］.北京：中央民族大学，2018．] 刘文静，刘瑶、宋青青，等，利用-1H-NMR比较德赢vwin登录 野生品和栽培品的化学成分组0］，中国中药杂志，2018．43(17):3506-3512.9] 薛海燕，焦婵媛，姚军，肉苁蓉总普药理作用的研究现状山，中国临床药理学志，2018.34（4）：486-488[00 王晓琴，黄慧，李彩峰，等，列当属、肉苁蓉属与草苁蓉属药用植物亲缘学初探国。中国中药杂志，2018.43（23）：4608．01] LiF.Yang X.Yang Y,et al. Antinstepertic actiity of echina-coside in ovariectomized rats 1).Phytneticine,2013.20(6): 549.[2] 王雪媛，肖波，张治峰，等，不同采收期肉苁蓉中松果菊苷、毛蕊花糖苷、半乳糖醇、甜某碱及可溶性多糖量的测定及其道地性研究山，中草药，2017.48（18）：3841-3846．03] 王晓琴，黄慧，李彩峰，等、列当属、肉苁蓉属与草苁蓉属药用植物亲缘学初探［］，中国中药杂志，2018.43(23):4608.

冯洁2，郭晔红2，未文娟，安青2，陈彬，焦鹏1．甘肃省干旱生境作物学重点实验室，甘肃兰州730070：2．甘肃农业大学 农学院，甘肃兰州730070摘 要 目的：研究不同寄主植物以及不同产地对肉苁蓉4种苯乙醇苷和可溶性多糖含量的影响。方法：分别采用HPLC法和蕙酮-硫酸法测定内苁蓉4种苯乙醇苷和可溶性多糖含量。结果：在不同寄主植物对内苁蓉有效成分影响的研究中，秋季采收的四超滨藜寄生内苁蓉中4种苯乙醇苷和可溶性多糖含量均高于梭梭寄生肉苁蓉；春季采收的四翅滨藜寄生内苁蓉中松果菊苷、内苁蓉苷A和毛菜花糖苷含量高于被梭寄生肉苁蒙，而管花苷A和可溶性多糖含量低于梭梭寄生内苁蓉。在不同产地对内苁蓉有效成分影响的研究中，以甘肃民勤松果菊苷和管花苷A含量最高：甘肃景泰内苁蓉苷A和可溶性多糖含量最高；毛葛花糖苷含量则以甘肃靖选最高。4种苯乙醇苷含量均以春季采收时最佳；春季采收的梭梭寄生内苁蓉中可溶性多糖含量高于秋季，四翅滨藜寄生肉苁蓉则以秋季最佳。结论：不同寄主、产地及采收期内苁蓉药材中5种有效成分含量存在较大差异，可为内苁蓉后续的开发利用提供实验依据。关键词 内苁蓉；梭梭；四翅滨藜：苯乙醇苷：可溶性多糖中图分类号：R284.2       文献标识码：A    文章编号：1006-9690（2021）05-0018-06肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉（Cistanches deseni-cola Y.C.Ma）或德赢vwin登录 （Cistanche tubulosa （Schenk）Wight）干燥带鳞叶的肉质茎，亦称大芸，是我国名贵的中药材，也是甘肃省道地药材之一、主要活性成分为苯乙醇苷类和可溶性多糖［2-9。现代药理学研究表明，肉苁蓉具有助阳通便、抗氧化、抗肿瘤、增强机体免疫力等药理作用6-，主要用于阳痿、不孕、肠燥便秘等。肉苁蓉传统寄主植物为藜科植物梭梭（Haloxy-lon ammodendron（C.A.Mey.）Bunge）和白梭梭 （Haloxylon persicum Bunge ex Boiss et Buhse），具有 耐旱、耐寒、耐盐碱、耐贫瘠等特性，以梭梭为寄主植物种植肉苁蓉已经获得了成功，但梭梭年生长量较小，经济价值较低［5-6］。为了解决传统寄主植物的弊端，甘肃地区技术人员成功种植以四翅滨藜（Atriplex canescens（Pursh）Nutt.）为寄主植物的肉 苁蓉，四翅滨藜和梭梭都属于藜科属植物，两者基源相同，这为接种肉苁蓉提供了科学依据，四翅滨藜生物量大，接种成功可为肉苁蓉提供更多的养分，有益于肉苁蓉的生长，研究表明，四翅滨藜在高盐碱地的造林成活率明显高于红柳、多枝柽柳、梭梭等抗盐碱树种［］，不同寄主植物生长的肉苁蓉，产地、采收期的不同也会使肉苁蓉的有效成分含量存在差异［-20］。2015年版《中国药典》只规定了以松果菊苷和毛蕊花糖苷2种苯乙醇苷成分作为指标成分，而中医理论研究表明，中药药效的发挥是多种有效成分共同作用的结果，有效成分含量的多少将直接影响中药药效，因此仅以2种苯乙醇苷成分并不足以全面反映肉苁蓉的整体质量21-23。由于对四翅滨藜寄生肉苁蓉研究较少，而为了探究这种新型寄主植物对肉苁蓉的药效成分的影响，本研究以春、秋2个采收期的四翅滨藜寄生肉苁蓉为研究对象，以梭梭寄生肉苁蓉为对照，基于5种有效成分一松果菊苷、肉苁蓉苷A、管花苷A、毛蕊花糖苷、可溶性多糖对肉苁蓉质量进行较全面考察和分析，进一步揭示了肉苁蓉整体质量特征和道地性品质内涵。同时研究甘肃不同产地梭梭寄生肉苁蓉功效成分的差异性，旨在为肉苁蓉道地产区和采收季节的确定提供科学的理论依据。1 材料与仪器1.1 材料梭梭寄生肉苁蓉分别采收于甘肃省民勤县、景泰县、靖远县肉苁蓉种植基地，四翅滨藜寄生肉苁蓉采收于甘肃省民勤治沙综合试验站。样品经流水洗净，去除泥沙，蒸制软化，切片，再于70℃烘干，粉碎，过4号筛，备用。1.2 仪器与试剂试验仪器：Waters Acquity 液相色谱仪，PDA检测器，Empower色谱工作站及四元溶剂管理系统（美国Waters 公司）：AL104分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）：超声波清洗机（深圳市得康科技有限公司）：超纯水器-优普系列（成都优普仪器设备有限公司）：DK-II数显恒温水浴锅（天津伊若达仪器设备有限公司）：UV-2450紫外-可见分光光度计（东莞市宏诚光学制品有限公司）。试验试剂：蒽酮、浓硫酸、乙醇、对照品松果菊苷（批号82854-37-3，质量分数≥98％）、肉苁蓉苷A（批号93236-42-1，质量分数≥95％）、毛蕊花糖苷（批号61276-17-3，质量分数≥98％）均购于成都普菲德生物技术有限公司；管花苷A（批号112516-05-9，质量分数≥98％）购于上海源叶生物科技有限公司：无水葡萄糖购于上海源叶生物科技有限公司：甲酸（德国 Menk公司，色谱纯）：甲醇（德国Merck公司，色谱纯）；超纯水，其他试剂均为分析纯。2 测定方法2.1 苯乙醇苷成分的测定2.1.1 混合对照品溶液的制备精密称取松果菊苷、肉苁蓉苷A、管花苷A和毛蕊花糖苷对照品适量，置棕色量瓶中，加50％甲醇制成浓度分别为0.57、0.16、0.016.0.048mg＊mL-＇混 合溶液，摇匀，即得。2.1.2 供试品溶液的制备称定样品粉末1.0g，置100mL棕色量瓶中，精密加入50％甲醇50mL，密塞，摇匀，称定，浸泡30min，超声处理（功率250W，频率35kHz）40min，待冷却至室温，称定，加50％甲醇补足减失质量，摇匀，静置，取上清液，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。2.1.3 色谱条件图1 混合对照品（A）和供试品（B）HPLC图Fig.1 HPLC Chromatograme of mived reference suhstances(A)and smple(B) 注：1．松果菊苷：2．肉苁蓉苷A：3．管花苷A：4．毛蕊花糖苷。2.1.4 线性关系考察分别取上述混合对照品溶液0.5、5、10、15、20μL，按“2.1.3”项色谱条件进行测定。以对照品进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，得回归方程分别为松果菊苷Y＝1x10°X＋44933，r＝0.999 8，线性范围0.285-11.4 μg：肉苁蓉苷AY＝1x10°X-4454.9．r＝0.9999，线性范围 0.08-3.2 μg；管花苷AY＝2x10X-9819.9，r＝ 0.9992，线性范围0.008～0.32 μg：毛蕊花糖苷Y＝1x10°x-12 989，r＝0.999 4，线性范围0.024～ 0.96μg·μm）：流动相为甲醇（A）-0.1％甲酸水溶液（B），洗脱梯度0-5min，15％-20％A：5-12 min，20％-45%A:12~16 min,45%~55%A:16~20 min,55%~ 35%A:20-22 min.35%-15%A:22~24 min,15%A; 流速1.0mL·min-＇：检测波长330nm：进样量10L：柱温30℃。对照品和供试品的色谱图见图1。2.1.5 精密度试验取“2.1.1”项混合对照品溶液10μL，连续进样6次，记录4种对照品各自的峰面积，结果松果菊苷、肉苁蓉苷A、管花苷A和毛蕊花糖苷峰面积RSD值分别为0.20％、0.18％、2.10％、1.45％，表明仪器精密度良好。2.1.6 重复性试验取同一批肉苁蓉样品6份，按“2.1.2”项制备供试品溶液“21.3”项色谱条件进样，记录峰面积。计算得到松果菊苷、肉苁蓉苷A、管花苷A和毛蕊花糖苷的RSD值分别为0.08％、0.40％、1.11％、0.81％，表明该方法重复性良好。