摘要：探究肉苁蓉水提物体外抗氧化能力及对小鼠肠道菌群紊乱的作用。以还原力、DPPH 自由基、ABTS+自由基、O2-自由基清除率考察肉苁蓉水提物体外抗氧化能力。以肠道菌群，脏器指数，结肠绒毛形态结构，探究肉苁蓉水提物对肠道菌群紊乱作用。结果表明：肉苁蓉水提物抗氧化能力与其浓度呈正相关，DPPH 自由基、ABTS+自由基、O2-自由基的IC50值依次为：0.225、1.819、12.53 mg/mL。肉苁蓉水提物能够缓解抗生素导致的小鼠体质量下降及对胸腺的生长抑制，显著提高肠道菌群紊乱小鼠粪便中双岐杆菌、乳酸菌含量及B/E 值，对肠球菌及大肠杆菌的生长具有一定抑制作用，改善肠道菌群紊乱小鼠诱发的肠绒毛变短、隐窝深度增加的现象。肉苁蓉水提物具有良好的体外抗氧化作用，能够调节肠道菌群紊乱的作用。关键词：肉苁蓉；水提物；体外抗氧化；肠道菌群；结肠绒毛形态结构肠道微生态由肠道菌群菌种、肠道菌群代谢物和黏膜屏障构成，可以通过肠道神经系统、神经内分泌系统及神经免疫系统调节等参与机体生理活动[1-2]。肠道是机体炎症发生的最初部位，在人体代谢过程中，自由基损伤是炎症病理损伤的重要组成部分，机体未能及时清除自由基使其在机体蓄积，最终在肠道组织内产生，过量的自由基导致肠道组织结构破坏，病原菌与有害物质与肠道上皮细胞充分接触引发炎症，引起肠道菌群紊乱等[3-4]。研究表明，肠道菌群的组成和数量与机体健康有一定联系。抗生素在合理的剂量下，能够有效抑制并杀灭病原体，在治疗疾病中发挥着重要作用[5]。近年来，抗生素的滥用导致植物源及动物源食品抗生素超标从而导致肠道菌群紊乱引发肠道黏膜系统受损导致内部环境紊乱，不利于微生物定植，增加肠道疾病的风险[6-7]。天然植物调节抗生素引起的肠道微生态失衡已成为研究热点[8]。德赢vwin登录 [Cistanche tubulosa（ Schrenk）Wight]，别名大芸，主要寄生于柽柳属植物根部[9]。近年来，肉苁蓉以广泛的药理活性及保健功效在治疗疾病、保障健康中发挥着重要的作用，市场前景乐观[10]。国内外学者对肉苁蓉的化学成分及药理活性等进行深入的研究，药理活性的研究主要集中在激素调节、润肠通便、免疫调节、抗氧化及预防老年痴呆、神经保护、改善微循环、影响肠道菌群等药理作用[11-12]。目前，肉苁蓉调节肠道菌群紊乱的研究较少，本研究主要以还原力、DPPH 自由基、ABTS+自由基、O2-自由基清除能力考察肉苁蓉水提物体外抗氧化能力。通过计算肠道菌群、肠道定植能力（B/E 值），组织染色法观察结肠形态结构，结肠绒毛长度、隐窝深度、结肠绒毛高度/隐窝深度（V/C）综合考察肉苁蓉水提物对小鼠肠道菌群紊乱的影响，以期为肉苁蓉调节肠道菌群紊乱提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料与试剂德赢vwin登录 干片：win德赢官方 ；抗坏血酸（VC）：国药集团化学试剂有限公司；羟甲基氨基甲烷（Tris）：美国Amresco 公司；MRS 培养基：杭州生物试剂有限公司；BBL 培养基：杭州百思生物技术有限公司；Pfizer 肠球菌选择性琼脂、伊红美蓝琼脂：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；SPF 级雄性C57BL/6 小鼠：新疆医科大学实验动物中心24只，体质量（20±2）g。1.2 仪器与设备AL204-4C 电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；XL-02A 粉碎机：烨昌机械有限公司；HH-S 数显恒温水浴锅、DHP-9052 恒温培养箱：江苏省金坛市医疗仪器厂；TU-1810 紫外可见分光光度计、JQ000453 无菌操作台：苏净集团安泰公司；SX-500 高压灭菌锅：日本TOMY 公司；ECLIPS CI 显微镜：尼康映像仪器销售（中国）有限公司1.3 试验方法1.3.1 肉苁蓉水提物的制备参照葛继红等[13]提取方法，并稍作改动。由于水的张力较大，如用粒径小于40 目的肉苁蓉颗粒提取，较难过滤，故将肉苁蓉干片粉碎，取粒径在20 目~40 目间的肉苁蓉颗粒，按料液比1 ∶ 10（g/mL），提取时间5 h，沸水浴条件下回流提取两次，过100 目滤网，抽滤，过0.45 μm 滤膜，浓缩成浸膏备用。1.3.2 肉苁蓉水提物体外抗氧化作用1.3.2.1 肉苁蓉水提物DPPH 自由基清除率的测定参照杨冰鑫等[14]方法，稍作改进。配置不同浓度的肉苁蓉水提物溶液，517 nm 处测定吸光度，VC 为阳性对照，计算其清除率。清除率/%=[A0-（A1-A2） ]/A0×100式中：A0 为蒸馏水加DPPH 溶液的吸光度；A1 为待测样加DPPH 溶液的吸光度；A2 为待测样加蒸馏水的吸光度。1.3.2.2 肉苁蓉水提物还原能力的测定参照Omage[15]方法，稍作改动。配置不同浓度的肉苁蓉水提物溶液取，700nm 处测定吸光度，Vc 为阳性对照。1.3.2.3 肉苁蓉水提物ABTS+·清除试验参照蒲成伟等[16]方法，稍作改动。配置不同浓度的肉苁蓉水提物溶液取，734 nm 处测定吸光度，VC 为阳性对照，计算其清除率。清除率/%=（1-A1/A0）×100式中：A1 为4 mLABTS+溶液加1 mL 样液的吸光度；A0 为4 mL ABTS+溶液加1 mL 蒸馏水的吸光度。1.3.2.4 肉苁蓉水提物中O2-自由基清除率的测定参照Luo 等[17]方法，稍作改动。配置不同浓度的肉苁蓉水提物溶液，325 nm 处测定吸光度，VC 为阳性对照，计算其清除率。清除率/%=[1-（A1-A2）/A3]×100式中：A1 为4 mLTris-HCl 加20 μL 邻苯三酚和1 mL 样液的吸光度；A2 为4 mLTris-HCl 加20 μL 蒸馏水和1 mL 样液的吸光度；A3 为4 mLTris-HCl 加20 μL 邻苯三酚和1 mL 蒸馏水的吸光度。1.3.3 肉苁蓉水提物对肠道菌群紊乱的作用1.3.3.1 动物分组与样品采集处理参照史瑛等[18]方法，稍有改动。小鼠适应1 周后随机分为4 组，每组6 只，分别为空白对照组、头孢克肟诱导肠道菌群紊乱模型组、肉苁蓉水提物低剂量组（1 mg/g）、高剂量组（2 mg/g）。肠道菌群紊乱模型组头孢克肟给药剂量为30 mg/kg 为成人剂量的10 倍每天，第1、3 次灌服头孢克肟，第2 次灌服生理盐水。肉苁蓉水提物低（高）剂量第1、3 次灌服头孢克肟，第2次灌服低剂量肉苁蓉水提物。空白组每天灌服3 次相同剂量生理盐水。每隔3 d~4 d 测定体重，灌胃第0、7、14 天，在无菌操作台下用灭菌管采集老鼠粪便，放入-20 ℃冰箱保存，最后一天灌胃结束后，颈椎脱臼处死小鼠，取心脏、胸腺、脾、肝脏、肺、肾、脑称量脏器质量计算脏器系数。并留取结肠组织样本于在10 %的福尔马林中。脏器系数=小鼠脏器（g）/小鼠体重（g）1.3.3.2 肠道菌群定量检测参照王琳等[19]方法，稍作改动。按表1 肠道菌群培养条件将粪便稀释后，在相应的浓度下接种于不同的选择型培养基中，采用活菌计数公式计数，结果以每克粪便湿重中菌落形成的对数值形式表示以计算菌落总数（lgCFU/g）。并计算B/E 值。每克粪便菌落数=lg（菌落总数×稀释倍数×每次稀释取样体积）/（接种体积×样品质量）B/E 值=双歧杆菌菌落总数/大肠杆菌菌落总数1.3.3.3 小鼠结肠组织病理学观察小鼠处死后，立即取出新鲜的结肠，用生理盐水冲去肠内容物，置于10 %中性福尔马林中固定。按常规方法脱水、透明、石蜡包埋，连续横断切片，切片厚5 μm，HE 染色。使用光学显微镜拍照观察并比较结肠黏膜形态变化，测量结肠绒毛长度、隐窝深度、计算绒毛长度/隐窝深度比值（V/C 值）[20]。1.4 数据统计分析试验数据以（x±s）表示。应用统计分析软件SPSS20 进行两两比较单因素方差分析，P<0.05 表示差异显著，P<0.01 为差异极显著。2 结果与分析2.1 肉苁蓉水提物体外抗氧化作用ABTS+自由基、DPPH 自由基、O2-自由基清除率及还原力是体外抗氧化能力的检测指标，ABTS+自由基、DPPH 自由基清除率的原理是通过提供H 原子或质子清除自由基[21]。O2-自由基清除率是通过结合O2-自由基，阻止H2O2、单重态氧等的形成。还原力则是通过破坏自由基链，给出H 原子并发挥抗氧化作用[22]。图1 为肉苁蓉水提物的体外抗氧化作用。由图1（1）可知肉苁蓉水提物DPPH 自由基清除率随浓度的增大而增加，0.3 mg/mL 时肉苁蓉水提物DPPH 自由基清除率最接近同浓度VC，0.3 mg/mL后肉苁蓉水提物DPPH 自由基清除率增加速率减小。图1（2）可知肉苁蓉水提物对ABTS+自由基具有一定清除率，且与其浓度呈正相关，0.5 mg/mL 时肉苁蓉水提物ABTS+自由基清除率最高为95.49 %。VC 的ABTS+自由基清除率始终维持在97 %左右。图1（3）可知肉苁蓉水提物超氧阴离子自由基清除率明显低于VC，0.3 mg/mL 后超氧阴离子自由基清除率增长缓慢，0.5 mg/mL 时肉苁蓉水提物超氧阴离子自由基清除率最高为32.69 %。图1（4） 可知肉苁蓉水提物及VC 的还原力均具有浓度依赖性，同浓度VC 还原力与肉苁蓉水提物相比增加速率较大。结果表明，肉苁蓉水提物具有良好的体外抗氧化作用，其DPPH 自由基、ABTS+自由基、O2-自由基的IC50 值依次为0.225、1.819、12.53 mg/mL。肉苁蓉水提物具有良好的抗氧化能力可能由于其主要活性成分苯乙醇苷类化合物的苯环上具有多对邻酚羟基，这是使化合物具有清除自由基活性的关键结构[23]。2.2 肉苁蓉水提物对肠道菌群紊乱小鼠的影响2.2.1 肉苁蓉水提物对肠道菌群紊乱小鼠体质量的影响小鼠体质量会随机体生理变化发生改变，4 组小鼠在不同灌胃天数下的体重变化情况见表2。由表2 可知，灌胃第3 天每组小鼠体重出现明显降低，后缓慢升高，可能由于开始灌胃后引起小鼠应激反应使得体重下降。第9 天前每组小鼠体重变化与空白组无显著性差异，第9 天时与空白组相比其他3组体重有显著性差异（P<0.05），第12 天时模型组与空白组相比体重降低（P<0.01），肉苁蓉低剂量组与空白组体重降低（P<0.05），肉苁蓉高剂量组体重变化与空白组相近（P>0.05），第14 天时模型组与空白组有显著性差异，肉苁蓉水提物低剂量与高剂量组无显著性差异，结果表明肉苁蓉水提物在一定浓度下能够控制由抗生素导致的体质量下降。2.2.2 肉苁蓉水提物对肠道菌群紊乱小鼠脏器指数的影响脏器指数能间接反映营养物质在机体中的有效沉积、吸收和利用[24]。4 组小鼠脏器指数变化见表3。由表3 可知，4组小鼠心脏、脾、肝脏、肺、肾、脑指数差异不显著（P>0.05），而与空白组相比，模型组、肉苁蓉低剂量组和高剂量组胸腺指数存在显著性差异（P<0.05），其中肉苁蓉水提物低剂量组胸腺脏器指数与空白组存在极显著差异（P<0.01），模型组与空白组相比胸腺指数显著降低，表明长期灌服头孢克肟对小鼠胸腺的生长发育可能具有抑制作用，引起免疫抑制。与模型组相比肉苁蓉水提物高剂量胸腺指数显著提高（P<0.05），肉苁蓉水提物低剂量组小鼠胸腺指数降低（P<0.05）。胸腺作为中枢免疫器官一定程度上反应了机体的免疫功能，可能由于肉苁蓉水提物中的肉苁蓉多糖促进机体中免疫系统产生的IL-2，促进免疫细胞增殖，促进胸腺成熟细胞的释放，缓解应激功能，使免疫功能趋于稳定，减轻抗生素引起对小鼠免疫器官的生长抑制[25]。2.2.3 肉苁蓉水提物对肠道紊乱小鼠肠道菌群的影响按对机体健康的影响，肠道菌群可分为：益生菌、有害菌和调节致病菌，共同调节肠道微生态平衡。双歧杆菌、乳酸菌作为肠道中典型的益生菌，能够改善肠道功能，刺激机体免疫功能，促进抗炎因子的分泌，缓解炎症反应等。条件致病菌在菌群平衡时不致病，但一旦处于生态失调的状态下，这类细菌可成为致病菌，如大肠杆菌、肠球菌[26]。肠道菌群特定微生物比例失调会影响肠道菌群平衡，B/E 值（双歧杆菌/大肠杆菌） 可反映肠道内正常菌群对致病菌群定植的抵抗力，肠道环境良好时B/E 值≥1[27]。图2 为肉苁蓉水提物对肠道紊乱小鼠肠道菌群数量变化情况。图2（1）可看出灌胃7 d 时，与空白组相比模型组小鼠粪便中双岐杆菌含量降低（P<0.01），肉苁蓉水提物低剂量组及高剂量组与空白及模型组相比双岐杆菌数量升高（P<0.01），14 d 时模型组及低剂量组与空白组相比双岐杆菌显著降低（P<0.01），高剂量组与模型组相比升高（P<0.01）。图2（2）可知，灌胃7 d 时，模型组及低剂量与空白组相比组小鼠乳酸菌数量降低（P<0.01），高剂量组乳酸菌含量升高（P<0.01）。14 d 时低剂量组及高剂量组与模型组相比乳酸菌含量升高（P<0.01）。图2（3）可知，灌胃7 d 时模型组、低剂量组、高剂量组肠球菌与对照组比显著升高（P<0.01）14 d 后低剂量组、高剂量组肠球菌与模型组比显著降低（P<0.01）。图2（4）可知，灌胃7 d 时模型组、低剂量组、高剂量组大肠杆菌菌与对照组比显著升高（P<0.01）14 d后低剂量组、高剂量组大肠菌与模型组比显著降低（P<0.01）。图2（5）可知，灌胃7 d 时模型组、低剂量组、高剂量组B/E 值与对照组比显著降低（P<0.01），且模型组B/E 值<1，低剂量组、高剂量组B/E 值>1，表明低剂量组、高剂量组肠道环境比模型组好。14 d 后组模型组B/E 值显著低于对照组（P<0.01），高浓度组与对照组B/E 值差异不显著（P>0.05）。试验表明肉苁蓉能显著提高肠道菌群紊乱小鼠粪便中双岐杆菌、乳酸菌含量B/E 值，对肠球菌及大肠杆菌生长有一定抑制作用。肉苁蓉对肠道菌群紊乱的调节作用，可能由于其在机体内参与糖代谢从而维持机体内代谢稳态，改善机体内环境，从而降低抗生素对肠道菌群紊乱的影响[28]。2.2.4 肉苁蓉水提物对小鼠肠道菌群紊乱结肠形态结构的影响肠道形态结构的改变对机体生长发育、消化吸收、免疫调节、肠道损伤修复具有一定影响。肠绒毛能够增大肠道黏膜表面积以及与营养物质的接触面积，增强肠道的消化吸收功能。隐窝细胞向绒毛顶端迁移分化后形成绒毛细胞，补充绒毛上皮细胞脱落。绒腺比（V/C 值）能综合反映肠道消化状况，与肠道消化吸收能力成正比。肠绒毛、隐窝、V/C 值代表肠道黏膜完整性的重要指标[29]。肉苁蓉水提物对小鼠肠道菌群紊乱结肠形态结构的影响见图3 和表4。由图3 和表4 可知，不同试验组结肠绒毛形态有一定的差异。对照组及肉苁蓉水提物高剂量组结肠绒毛较长，呈指状，肠道菌群紊乱模型组及肉苁蓉水提物低剂量组肠绒毛较短，模型组肠绒毛顶端断裂。肉苁蓉水提物高剂量组能够极显著提高肠道菌群紊乱小鼠结肠绒毛高度及V/C 值（P<0.01）。与对照组相比其他3 组肠绒毛及V/C 值减小存在极显著性差异（P<0.01），模型组与低剂量组与对照组相比隐窝变深存在极显著差异（P<0.01），高剂量组与空白组隐窝深度无显著性差异（P>0.05），隐窝深度增加会降低营养物质吸收。绒毛长度大小顺序为：对照组>高剂量组>低剂量组>模型组；隐窝深度大小依次为：模型组>低剂量组>高剂量组>对照组；V/C 值大小为：对照组>高剂量组>低剂量组>模型组，故肉苁蓉水提物可调节肠道菌群紊乱小鼠诱发的肠绒毛变短、隐窝深度增加的现象。这可能由于抗生素诱导肠道菌群紊乱，而使肠黏膜屏障促炎症信号上调，诱发炎症细胞传导，引发肠道炎症疾病，影响机体代谢。肉苁蓉水提物通过提高抗炎因子的释放，降低促炎因子的分泌减缓肠道粘膜的炎性损伤，进而调节肠道菌群紊乱引发的肠道形态结构的改变[28]。3 结论肉苁蓉水提物具有良好的抗氧化作用，DPPH 自由基、ABTS+自由基、O2-自由基的IC50 值依次为0.225、1.819、12.53 mg/mL。肉苁蓉水提物在一定浓度下能够缓解抗生素对小鼠体质量下降及对胸腺的生长抑制，能显著提高肠道菌群紊乱小鼠粪便中双岐杆菌、乳酸菌的数量，对肠球菌及大肠杆菌生长有一定抑制作用，调节肠道内正常菌群对致病菌群定植的抵抗力。改善肠道菌群紊乱小鼠诱发的肠绒毛变短、隐窝深度增加现象。由此看出，肉苁蓉水提物具有一定的抗氧化能力及调节肠道菌群紊乱的作用，为肉苁蓉开发产品及其应用提供一定理论依据。参考文献：[1] 张京. 星状神经节阻滞对失血性休克大鼠肠屏障的干预作用[D]. 张家口: 河北北方学院, 2016[2] 王鑫楠,王维维,辛贵忠,等.中草药调控肠道微生态组成与代谢的研究进展[J].中医药学报,2019,47(4):117-124[3] 訾雨歌,徐越,肖瀛,等.原花青素B2 对D-半乳糖模型小鼠肠道菌群的影响[J].食品科学,2019,40(9):146-151[4] 张梅梅. 黄酮类化合物抗氧化能力的比较及其对肠道菌群的调节作用[D]. 重庆: 西南大学, 2018[5] 李静,吕晓玲,吕冬雪,等.头孢克肟诱导肠道菌群紊乱动物模型的建立[J].食品工业科技,2017,38(5):361-365[6] 黄玉霞. 食品中四环素类抗生素残留高选择性吸附材料的制备与应用[D]. 济南: 齐鲁工业大学, 2019[7] 李璇. 肠道菌群紊乱对慢性胰腺炎的影响及机制研究[D]. 无锡:江南大学, 2019[8] 孟艳鸽,李岩.不同剂量长双歧杆菌对抗生素诱导大鼠肠道菌群失调的疗效观察[J].中国微生态学杂志,2015,27(3):280-283,288[9] 闵炬,董刚强,谢文明,等.德赢vwin登录 寄主柽柳林地土壤养分调查研究[J].土壤,2018,50(1):73-78[10] Yang L L, Ding S Q, Zhang B, et al. Beneficial effects of totalphenylethanoid glycoside fraction isolated from Cistanche deserticolaon bone microstructure in ovariectomized rats[J]. OxidativeMedicine and Cellular Longevity, 2019, 2019: 1-13[11] 郭安民,李宇辉,王俊钢,等.新鲜肉苁蓉发酵酒工艺研究[J].食品研究与开发,2019,40(20):59-64[12] 付志飞, 戴永娜, 毛浩萍. 肉苁蓉提取物对快速老化模型小鼠SAMP8 行为学及肠道菌群的影响[J].世界科学技术-中医药现代化,2019,21(6):1103-1109[13] 葛继红,吴亚东,闫波.正交试验优化德赢vwin登录 水提取工艺[J].中国药房,2009,20(30):2347-2349[14] 杨冰鑫,刘晓丽.余甘子总多酚的提取及其抗氧化活性研究[J].食品工业科技,2019,40(16):151-155,162[15] Omage S O, Orhue N E J, Omage K. Evaluation of the phytochemicalcontent, in vitro antioxidant capacity, biochemical and histologicaleffects of Dennettia tripetala fruits in healthy rats [J]. Food Science& Nutrition, 2019, 7(1): 65-75[16] 蒲成伟,阚欢,刘云.核桃仁皮不同极性提取物的体外抗氧化活性分析[J].食品工业科技,2018,39(2):65-69[17] Luo S Y, Jiang X L, Jia L P, et al. In vivo and in vitro antioxidant activitiesof methanol extracts from olive leaves on Caenorhabditis elegans[J]. Molecules, 2019, 24(4): 704[18] 史瑛. 具有修复抗生素导致肠道生态失调功能的乳杆菌筛选及其机制研究[D]. 无锡: 江南大学, 2019[19] 王津,茹鑫,邹妍,等.茶叶膳食纤维作为益生元对肠道菌群的影响[J].食品研究与开发,2019,40(11):76-82[20] 郭蕾. 乳酸菌对小鼠肠道菌群失衡的调节作用研究[D]. 扬州: 扬州大学, 2017[21] Li Y J, Lin D D, Jiao B, et al. Purification, antioxidant and hepatoprotectiveactivities of polysaccharide from Cissus pteroclada Hayata[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2015, 77:307-313[22] 张婧菲,韩红丽,沈明明,等.姜黄素类化合物的体外抗氧化活性及其对红细胞氧化损伤的保护作用[J/OL].食品科学:1-14.[2019-12-14].http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.2206.ts.20191012.1120.036.html[23] 薛宏坤,李鹏程,钟雪,等.高速逆流色谱分离纯化桑葚花色苷及其抗氧化活性[J/OL].食品科学:1-12[2019-12-14].http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20191209.1629.002.html[24] 杨运南,杨昌福,刘亚楠,等.一株牦牛源屎肠球菌对小鼠肠道微生物、形态和免疫功能的影响[J].中国饲料,2019(5):18-23[25] 赵明明. 黑灵芝多糖对小鼠肠道黏膜免疫及黏膜损伤的影响[D]. 南昌: 南昌大学, 2018[26] 王琳,高辰哲,崔石阳,等.五味子多糖的酶解辅助提取及其对小鼠肠道菌群的影响[J].食品研究与开发,2018,39(20):190-196[27] 杜月华. 过敏性紫癜患儿肠道菌群B/E 值变化与血浆IFN-γ、IL-4 关系的研究[D]. 石家庄: 河北医科大学, 2011[28] 姚金茜. 肉苁蓉多糖对气管切开插管留置大鼠肺部免疫功能的影响[D]. 南宁: 广西医科大学, 2019[29] 尚秋辰. 白术多糖对大肠杆菌腹泻模型小鼠肠道黏膜修复机理研究[D]. 扬州: 扬州大学, 2017

摘要：肉苁蓉在荒漠地区生长时与梭梭树共生，为一类野生珍稀保护植物，素有沙漠人参之美誉。从功能价值来看，肉苁蓉皆可入药，不仅具有药用价值，而且保健功能也非常的显著，同时也可以对干旱荒漠地区环境起到一定的保护作用。肉苁蓉的人工种植，大大提高了农民治理沙漠的极积性，并且加快了治理沙漠的步伐，取得了一定的社会和生态效益，实现了经济效率双蠃之目标。从人工种植的角度对肉苁蓉的种植技术要点进行分析，并在此基础上谈一些个人的观点与认识，以供参考。关键词：肉苁蓉；人工种植；技术研究引言肉苁蓉是一种沙漠寄生类中药材，其主要依赖植物根部生长。在传统挖掘过程中，每挖一株肉苁蓉就会破坏周围的沙生植物，加之天然下种量锐减，因此肉苁蓉的野生量越来越少，部分地区甚至灭绝。虽然林业部门严禁采挖，但是基于利益驱使大量偷挖现象屡见不鲜，严重破坏了生态环境，导致生态恶化，亟待采用人工种植方式种植肉苁蓉。1 人工栽植肉苁蓉的技术要点实践中利用多年生梭梭以及红柳等人工林，在寄主根系上接种种植肉苁蓉。通过人为营造适宜的肉苁蓉的接种种植生长环境，达到高效接种成活的目的，实现集约化经营，投入少见效快，产量稳定，以此推动规模化种植生产基地的建设。在进行肉苁蓉生产基地建设时，应考虑三个必要条件，种源、水源和种植技术。集约化生产经营的面积应在666.67～3 333.33万hm2左右，而且地势应当相对平坦，有水源条件，以纯沙漠最佳，用梭梭封沙造林3年后，可接种肉苁蓉，地下水位不能过高。通常要求先将其沙丘刮平，然后再进行梭梭树的栽植。梭梭树均以行距6 m，株距0.3～0.5 m进行密植栽培，为日后实现肉苁蓉的机械化种植做准备。传统种植方法主要以犁播式，打穴种植为主，其种植深度均在30～60 cm之间，受多方条件影响，接种成活率低下，使其种植经济效益不高。为了提高肉苁蓉的种植接种成活率、种植效益，中国矿业大学博土生导师张增志教授研发了超分子渗膜渗灌技术，使其突破性的解决了这一生产种植难题，为今后荒漠肉苁蓉人工大面积种植奠定了基础，甘肃芸林生物科技有限公司应用其技术已种植肉苁蓉示范基地2万多亩并取得了成功。随着种植枝术的不断创新，一种有自主知识产权的深层种植肉苁蓉的方法取得了成功，并以投入生产种植面积达到66.67 hm2，种植深度已突破1 m，此方法的应用将种植肉苁蓉的经济效益提高了20倍，大大加快了以沙治沙的步伐。2 肉苁蓉种植过程中的田间管理肉苁蓉一般生长在荒漠干旱沙漠地区，但是也需要水。当年种植肉苁蓉需水量为400 kg/667m2左右，肉苁蓉接种成功后，年需水量为60 kg/667m2左右，年降雨量基本可满足其生长。应当及时清除杂草以及杂灌木，做好防鼠、灭鼠。如果大规模种植，必须建立肉苁蓉的采种基地。肉苁蓉是雌性同株，开花后还应当采用人工方式进行辅助授粉。一般而言，自然条件下肉苁蓉的授粉率相对较低，在其开花期应当人工授粉。因肉苁蓉花期相对较长，而且授粉时需多次完成才行。肉苁蓉属于虫媒授粉模式，授粉的昆虫主要是苍蝇、蚂蚁以及蜜蜂等。在授粉阶段，切忌喷洒农药。种子的质量，决定肉苁蓉的种植接种率的高低，种子的成熟度尤为重要。3 肉苁蓉种植稳产方法每年的春季对于即将出土的肉苁蓉可以从寄主1～3 cm位置用瓷片刀挖断，切口处撒愈合剂后进行回填；回填完毕应高于地面30 cm并踏实，断口位置到寄生位置萌发生长分枝，然后连年出土即可。肉苁蓉接种以后，需对寄主进行有效的管理，提高寄主的长势，以确保肉苁蓉能够健康的生长。肉苁蓉每年3月份开始出土，5月份结束，从实践来看，接种深度以及和肉苁蓉人工种植模式不同，在很大程度上关系着是否能够安全越冬。管理条件相同的情况下，接种深度处于40 cm的肉苁蓉，较之于50或者60 cm的肉苁蓉更容易被冻坏。同时，还应当注意病虫害的有效防治。比如，梭梭白粉病一般每年的7～8月份会爆发，对嫩枝产生不利影响。实践中可利用Bo-10生物制剂或粉锈宁液进行喷雾防治。此外，还存在着根腐病问题，尤其在苗期，很容易对根部产生危害。对此可采用的防治方法主要是选择排水性较好的砂土，做好松土工作；病害发生期采用浓度为50%的多菌灵液进行灌根。通常，种蝇多发于肉苁蓉出土以及开花季节，此时幼虫对嫩茎会产生危害，而且会钻隧道，能够蛀入到地下茎基部位置。对于该种病害的主要防治措施是，用浓度为90%的敌百虫液或浓度为40%的乐果乳油液进行地上喷雾，也可以进行根部浇灌。对于大沙鼠对梭梭枝条以及根部的啃咬，可利用磷化锌作为诱饵，在洞口外对其进行诱杀。4 利用天然寄主进行肉苁蓉接种荒漠地区大量生长着梭梭林，盖度面积较大的天然梭梭林区可采用人工方式进行肉苁蓉接种，这有利于省去整地以及种植寄主和灌溉工序，大大降低了肉苁蓉的人工种植成本，经济效益也非常的客观。需注意的是，天然寄主通常根系老化，而且根系萌发力相对较弱，接种率比较低，在梭梭树向阳面，用钻孔直径25 cm的打坑机，打深度为60～80 cm的种植坑，植入种子包并使其倾斜放入，用渗膜技术进行种植，然后适量回填沙土。其中，砂土与地表之间应当预留20 cm左右的小坑，种植坑与梭梭之间的距离应当根据梭梭植株的大小以及地形具体确定，原则上选择便于操作种植，侧根、细根密集的区域。梭梭个体较大时，可采用一个寄主多点接种的方式，以提高单位面积产量。由于肉苁蓉及寄主植物分布区域广，价值各地区的自然环境条件存在较大的差异，因此种植方式和方法上也存在很大的区别。实践中，植户应当结合本地区具体情况而定，采取因地制宜的方式和方法，总结和利用适合的栽培技术手段。种植坑距确定时，原则上以方便种植操作为宜，而且侧根以及细根密集区最佳。如果梭梭个体相对比较大，则采用单个寄主多点接种的方法，这有利于提高肉苁蓉的种植产量。在利用天然寄主接种过程中，其产量受到很多因素的影响，比如接种期的温度或湿度，供氧量都会对肉苁蓉接种成功率产生一定的影响 。5 肉苁蓉的采摘与加工肉苁蓉在春秋两季都可以采收，尤其是3～5月最佳。春季采收以后，可以进行阴干，烘干，然通常情况下采用的是阴干晾晒法，将釆挖后的肉苁蓉用棉绳吊起，置遮阳棚内进行阴干。肉苁蓉采收以后，去掉生长点进行晾晒，待其由原来的黄白色逐渐变成棕褐色为止。肉苁蓉晾干以后，其颜色好，而且品质也非常的好，则应当特别注意的一点，采大、留小，开花前进行采挖具有良好的药用价值，开花后肉苁蓉的茎就会变空，而且其柴性相对较大，此时不宜用做药物。值得一提的是，为了能够更好的提高肉苁蓉人工种植的接种率，节约种秄，提高成活率，降低种植成本增加收入，可以将肉苁蓉的种秄经过精选低温层积处理90天有效打破肉苁蓉种秄休眠状态，并将打破休眠期的肉苁蓉种秄制作成种秄包。通过种秄包精细化生产，可以最大限度的保证每包种秄数量，并且提高了接种率达到了寄主根吸入养份后快速生长防止新根衰弱死亡有效的将接种率提高到了90%以上，这样种秄集中，种植可控性强，对寄主树树根系破坏性小，用打坑机打个小坑就可达到肉苁蓉高产种植之目的。6 结语综上所述，肉从蓉又称为从蓉或者大芸等，属于寄生于梭梭以及红柳等植物根部的一种寄生类物种，其对水分以及土壤的肥力没有太高的要求，通常分布于我国的荒漠地带，比如甘肃等地比较多见，素有沙漠人参的美誉，而且药用价值也比较大，发展前景良好。通过大力推广人工肉从蓉种植技术，有效提高了广大农民群众的治理沙漠极积性，而且也加快了治理沙漠的步伐，取得了良好的社会效益、生态效益以及经济效率的双蠃目标。参考文献[1] 王树清，王亚伟，王佳伟，等.肉苁蓉人工培育及病虫害防治技术[J].内蒙古林业，2015，（12）：32.[2] 李少武，罗巧，胡黎涛.梭梭肉苁蓉滴灌栽培技术[J]农村科技，2017，（6）：63-64.[3] 陈庆亮，武志博，郭玉海，等.荒漠肉苁蓉及其寄主梭梭栽培技术[J].中国现代中药，2015，（4）：359-368.

凡五劳七伤。久而不愈，未有不伤其阴也，苁蓉补五脏之精，精足则阴足矣。茎中者，精之道路，精虚则寒热而痛，精足则痛止矣，又滑以去着。精生于五脏，而藏之于肾，精足阳举精坚，令人多子矣。妇人癥瘕，皆由血瘀，精足则气充，气充则瘀行也。———清·陈修园《神农本草经读》

四川、云南、湖南等省区，将蛇菰科寄生肉质草本植物蛇菰Balanophorajaponica Mak.的干燥肉质全草当肉苁蓉使用。《本草纲目》称之为葛花菜。因木品全草呈深红色，四川称之为“红血莲”。本品呈肉质草本，高10~20 m，直径1~1.5 cm。叶为螺旋状互生，着生在花茎上，呈鳞片状，茎为块状，球形。肉苁蓉，为药食两用药物，历代医家认为，肉苁蓉入药，剂量小无效，如寇宗奭言：“入药，少则不效。”单味处方用量，应在30 g 为宜。

摘要:目的 探讨肉苁蓉多糖通过激活Wnt/β-catenin 信号通路对6-羟多巴胺(6-HODA)所致帕金森病大鼠受损神经的保护作用。方法 将45 只SD 雄性大鼠随机分为假手术组、模型组和肉苁蓉多糖治疗组,采用6-HODA 立体定向微量注射制备帕金森病大鼠模型。第32 天观察实验动物行为学改变,之后将大鼠处死,采用蛋白免疫印迹(Western Blot)检测大鼠脑黑质内Wnt1、β-catenin 蛋白表达;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)mRNA 表达。结果 与假手术组比较,模型组游泳静止时间缩短,自主活动站立次数下降,肉苁蓉多糖治疗后上述两种行为得到恢复;模型组脑黑质内Wnt1、β-catenin 蛋白水平低于假手术组;肉苁蓉多糖治疗组脑黑质内Wnt1、β-catenin 蛋白水平高于模型组(P <0.05);模型组脑黑质内GSK-3βmRNA 高于假手术组;肉苁蓉多糖治疗后,帕金森病大鼠脑黑质内GSK-3βmRNA 水平下降(P <0.05)。结论 肉苁蓉多糖能改善6-HODA 所致帕金森病SD 大鼠模型临床症状,这种作用可能通过激活Wnt/β-catenin 信号通路,抑制GSK-3β活性,进而发挥多巴胺神经保护作用。关键词:帕金森病;肉苁蓉多糖;Wnt/β-catenin 信号通路;神经保护;大鼠帕金森症(Parkinson'sdisease,PD)是世界范围内发病率仅次于阿尔茨海默病的第二大神经系统退行性疾病,临床表现为静止性震颤、肌肉强直、运动迟缓等,病理特征为脑黑质致密部多巴胺神经元损伤,纹状体多巴胺水平下降[1-2]。Wnt/β-catenin 信号通路在中枢神经发育过程中发挥重要作用,该信号通路在PD发病过程中的作用受到越来越多关注[3]。肉苁蓉是列当科植物肉苁蓉的干燥带鳞叶肉质茎,具有神经保护、提高免疫力、抗衰老等多种功能[4]。有研究证实,肉苁蓉的有效成分肉苁蓉多糖(cistanche deserticola polysaccharides,CDPS)通过多种细胞因子调节PD 动物模型的临床症状[5],但CDPS 对Wnt/β-catenin 信号通路是否具有调节作用报道较少。本研究旨在探讨CDPS 能否通过激活Wnt/β-catenin 信号通路对6-羟多巴胺(6-HODA)所致PD 大鼠的受损神经起到保护作用,为PD 提供新的治疗思路和研究靶点。1 材料与方法1.1 实验动物 SPF 级雄性成年SD 大鼠45 只,周龄6~7 周,体重200 g 左右,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。造模前实验动物饲养于SPF 级环境1 周。1.2 实验试剂 肉苁蓉生药由我院中药房提供,提取CDPS;6-HODA、抗坏血酸购自美国Sigma 公司;兔抗Wnt、β-catenin 单抗购自美国Cayman 公司;糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、β-actin 引物由上海生物工程有限公司合成。1.3 PD 大鼠动物模型建立 随机选取SD 大鼠30只,以戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉,将实验动物固定于脑立体定位仪上,沿颅顶正中线切开皮肤,钝性分离头骨外膜,参考大鼠脑定位立体图谱,确定右侧纹状体坐标(前囟前1.0 mm,中线右3.0 mm,硬膜下4.5~5.0 mm),将8 μg 的6-HODA 溶于含0.2% 坏血酸的生理盐水中,使用微量注射器抽取后,以1 μL/min速度注射于上述两个靶点,注射后停针10 min,之后缓慢退针(2~3 min)。建模成功标准:建模1 周后,腹腔注射阿扑吗啡(0.5 mg/kg),诱发大鼠旋转,大鼠恒定向左旋转,且30 min内旋转圈数>210圈视为造模成功。1.4 实验动物分组及干预方法 将45 只大鼠随机分为假手术组(Sham 组)、模型组(PD 组)和肉苁蓉多糖治疗组(CDPS + PD组),各1 5 只,每组进行不同干预。1.4.1 CDPS+PD 组 造模3 周后,每日给予造模成功的SD 大鼠CDPS 灌胃治疗,剂量为1.08 g/(kg·d),连续治疗10 d。1.4.2 PD 组 造模3 周后,每日给予造模成功的SD大鼠与CDPS+PD 组相同体积的生理盐水灌胃处理,连续治疗10 d。1.4.3 Sham 组 手术过程同PD 组,只是注射等体积生理盐水,3 周后每日给予SD 大鼠与CDPS+PD 组相同体积的生理盐水灌胃处理,连续治疗10 d。1.5 实验动物行为学观察1 .5.1 游泳实验 第32天,将SD大鼠置于一个20 cm×20 cm×25 cm体积水缸内,水深10 cm,水温20~22 ℃,安静环境下,记录SD大鼠5 min内静止时间。1.5.2 自主活动实验 第32 天,制作一个30 cm×30cm×15 cm 的有机玻璃盒,底部标注6 cm×6 cm 方格,置于安静、昏暗环境中,统计SD 大鼠5 min 内站立次数,连续观察5 次,取平均值。1.6 组织标本提取 第32 天,将SD 大鼠以戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(40 mg/kg),仰位固定于工作台上,沿腹中线剪开皮肤,暴露腹腔,预冷生理盐水灌注心脏,取脑组织,于-80 ℃条件下保存。1.7 蛋白免疫印迹(Western Blot)检测SD 大鼠脑黑质内Wnt1、β-catenin 蛋白表达 将冻存的脑组织剪成碎块,加入蛋白裂解液,离心后取上清液,电泳分离蛋白,将蛋白转移至硝酸纤维素膜(NC 膜),使用含5%脱脂乳粉的TBST 封闭,按顺序添加一抗、二抗,洗涤NC 膜,增强化学发光法(ECL)显色,胶片扫描后使用Bandscan5.0 软件分析蛋白条带灰度。1.8 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测GSK-3β mRNA 表达 将冻存脑组织加液氮研磨,使用Trizol提取总RNA,行逆转录反应。取2 μL RNA 进行PCR扩增:内参为β-actin,内参引物序列,正向引物:TCGGCTATTCGGCTAGCTAGC;反向引物: TCGGTCGATTAGCTAGCCGCA;GSK-3β mRNA 引物序列,正向引物:TCGATTCGATCGGGCTAGCTA;反向引物:TACGGTAGCGGCTAGCTAGG 。扩增条件:95 ℃预变性2 min,1 个循环;95 ℃变性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,共35个循环;72 ℃总延伸6 min。取5 μL PCR 扩增产物进行电泳,紫外线投射仪下观察电泳条带,分析目的基因和参比基因的条带灰度。1.9 统计学处理 采用SPSS 19.0 软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(x ±s )表示,采用t 检验。以P <0.05 为差异有统计学意义。2 结 果2.1 各组大鼠行为学观察结果比较 与Sham 组比较,PD 组游泳静止时间增加(P <0.05),CDPS+PD组游泳静止时间较PD 组缩短(P <0.05);PD 组自主活动站立次数较Sham 组下降(P <0.05),CDPS+PD 组站立次数明显恢复(P <0.05)。详见表1。2.2 各组大鼠脑黑质内Wnt1 蛋白表达 PD 组大鼠脑黑质内Wnt1 蛋白表达少于Sham 组(P <0.05),且CDPS + PD 组Wnt 1 蛋白水平较PD 组提升(P <0.05)。详见图1。2.3 各组大鼠脑黑质内β-catenin 蛋白表达 PD 组大鼠脑黑质内β-catenin 蛋白水平低于Sham 组(P <0.05),CDPS+PD 组大鼠脑黑质内β-catenin 蛋白水平高于PD 组(P <0.05)。详见图2。2.4 各组大鼠脑黑质内GSK-3βmRNA 表达 PD 组大鼠脑黑质内GSK-3βmRNA 高于Sham 组(P <0.05),CDPS+PD 组脑黑质内GSK-3βmRNA 较PD组下降(P <0.05)。详见图3。3 讨 论PD 是由中脑黑质多巴胺神经元选择性退行性病变引起的[2]。近年来,Wnt 信号通路在PD 中的作用日益重视。Wnt 根据细胞内信号通路不同分为两类,在Wnt/β-catenin 通路中发挥作用的是Wnt1,该通路是所有Wnt 通路中重要的一条[6]。该通路在PD 小鼠模型中脑黑质多巴胺神经元病理生理过程中发挥重要作用[3]。动物实验证实,干扰小鼠中脑β-catenin 严重减弱多巴胺神经元再生能力及多巴胺神经元完整性[7];体外研究证实,Wnt1 在中脑前体细胞中促进其分化为多巴胺神经[8],同时Wnt1 缺失导致多巴胺神经元增殖能力下降[9]。本研究结果可见,6-HODA 所致PD 大鼠脑黑质组织Wnt1 和β-catenin 表达较Sham 组大鼠均较低,说明PD 大鼠脑组织内Wnt1 和β-catenin 作用被阻断,该结果与相关研究[8-9]报道一致。GSK-3β是Wnt/β-catenin 通路重要组成分子,该通路激活后,GSK-3β活性被抑制,从而增加β-catenin稳定性[10]。Gong 等[11]研究发现,6-HODA 能激活GSK-3β,进而导致中枢神经细胞凋亡,同时GSK-3β阻断剂可抑制PD 大鼠神经元凋亡;另有研究报道,中脑多巴胺前体细胞抑制GSK-3β活性可增加β-catenin水平,同时促进多巴胺神经元增殖和分化[12]。本研究结果显示,给予SD 大鼠颅内注射6-HODA 后,SK-3βmRNA 表达高于Sham 组,说明6-HODA 能激活GSK-3β使其表达上调,同时抑制Wnt/β-catenin通路活性。肉苁蓉具有免疫调节、抗氧化、抗衰老等作用[4]。有研究证实,肉苁蓉的有效成分在中枢神经保护方面发挥重要作用,对脑卒中、PD、阿尔茨海默病等中枢神经退行性疾病具有良好的防治作用[5]。有研究证实,肉苁蓉中苯乙醇总苷能改善PD 小鼠临床症状,提高纹状体内多巴胺水平[13];另有研究发现,松果菊苷(ECH)通过抗氧化作用而减少氧化应激反应,保护多巴胺神经元免受氧化应激损伤[14]。CDPS 是肉苁蓉的一种主要化学成分,其对PD 的防治研究目前报道较少。本研究采用CDPS 干预6-HODA 所致的帕金森SD 大鼠,治疗后SD 大鼠自主活动能力提高,脑黑质内Wnt1 和β-catenin 蛋白表达较PD 组提高,GSK-3β 基因表达受到抑制,说明CDPS 能改善PD 大鼠临床症状,这种作用可能通过激活Wnt/β-catenin 信号通路而产生的。综上所述,CDPS 可改善6-HODA 所致PD 大鼠临床症状,这种作用可能通过激活Wnt/β-catenin 信号通路,抑制GSK-3β活性而发挥多巴胺神经保护作用而实现的。今后将进一步从细胞分子水平探讨肉苁蓉对PD 动物模型中枢神经细胞保护作用的具体机制。参考文献:[1] CALABRESE V,SANTORO A,MONTI D,et al .Aging and Parkinson'sdisease:inflammaging,neuroinflammation and biological remodelingas key factors in pathogenesis [J]. Free Radic BiolMed,2018,115:80-91.[2] 王世荣,许顺良,岳寿松.帕金森病整合医学治疗方法的探讨[J].中国微生态学杂志,2018,30(11):1358-1360;1364.[3] 王先斌,汤红艳,李兴统,等.Wnt 信号通路与神经发生、神经退行性变过程中的表述及作用[J].中国组织工程研究,2018,22(28):4587-4592.[4] 陆艳,张亚杰,阮杰,等.肉苁蓉颗粒剂对帕金森病大鼠模型黑质纹状体多巴胺能神经元的保护作用研究[J].中华中医药学刊,2016,34(12):113-117.[5] 孟胜喜,霍清萍.肉苁蓉有效成分对神经系统作用研究进展[J].中国中医药信息杂志,2016,23(10):123-126.[6] 张先虎,朱俊德,龙婷婷,等.Wnt/β-catenin 信号通路对小鼠海马神经干细胞的影响[J].安徽医科大学学报,2019,54(1):44-49.[7] 吕慧君.姜黄素通过激活Wnt/β-catenin 通路对6-OHDA 诱导的中脑原代细胞损伤的保护作用[D].郑州:郑州大学,2018.[8] 周婷婷.人参皂苷Rg1 通过Wnt/β-catenin 信号通路对帕金森病模型的保护作用机制研究[D].大连:大连医科大学,2016.[9] 文静,王建,罗世兰,等.Wnt/β-catenin 信号通路参与脑缺血后神经血管单元调控及相关药物的研究进展[J].中国药理学通报,2016,32(3):310-314.[10] REABROI S,SAEENG R, BOONMUEN N,et al .The ant-i canceractivity of an andrographolide analogue functions through aGSK-3β-independent Wnt/β-catenin signaling pathway in colorectalcancer cells[J].Scientific Reports,2018(8):7924.[11] GONG L,ZHANG Q L,ZHANG N,et al .Neuroprotection by urateon 6-OHDA-lesioned rat model of Parkinson's disease:linking toAkt/GSK3βsignaling pathway[J].J Neurochem,2012,123(5):876-885.[12] 覃威,叶水芬,范雯,等.苁蓉精对MPP+ 诱导多巴胺能神经细胞损伤后GSK-3β表达的影响[J].中国神经免疫学和神经病学杂志,2016,23(6):415-420.[13] CHEN W F,WU L, DU Z R,et al .Neuroprotective properties oficariin in MPTP-induced mouse model of Parkinson's disease :involvement of PI3K/Akt and MEK/ERK signaling pathways[J].Phytomedicine,2017(25):93-99.[14] 张万鑫,马婧怡,陈虹,等.松果菊苷对帕金森病大鼠纹状体及海马细胞外液中单胺类神经递质的影响[J].中国药理学通报,2014,30(8):1131-1136.

摘要：目的　探讨音猬因子（Ｓｏｎｉｃ　ｈｅｄｇｅｈｏｇ，Ｓｈｈ）通路在实验性自身免疫性脑脊髓炎（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，ＥＡＥ）小鼠发病过程中的作用，及肉苁蓉多糖（ｃｉｓｔａｎｃｈｅ　ｄｅｓｅｒｔｉｃｏｌａ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＣＤＰＳ）能否通过该通路缓解ＥＡＥ小鼠临床症状。方法　给予Ｃ５７ＢＬ／６小鼠皮下注射髓鞘少突细胞糖蛋白３５－５５多肽（ｍｙｅｌｉｎ　ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　３５－５５，ＭＯＧ３５－５５）抗原制备ＥＡＥ动物模型。将６０只小鼠随机分为正常对照组、ＥＡＥ模型组、ＣＤＰＳ治疗组以及ＣＤＰＳ＋Ｓｍｏ受体阻断剂环王巴明（ｃｙｃ）治疗组（以下简称ＣＤＰＳ＋ｃｙｃ治疗组）４组，每组各１５只。观察各组小鼠免疫注射后０～２６ｄ的临床症状评分，采用勒克斯光蓝染色（Ｌｕｘｏｌ　Ｆａｓｔ　Ｂｌｕｅ，ＬＦＢ）检测各组小鼠脊髓组织内髓鞘脱失情况，Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法检测脊髓组织内Ｓｈｈ、碎片蛋白－１（Ｐａｔｃｈｅｄ－１，Ｐｔｃ－１）蛋白表达，采用ＲＴ－ＰＣＲ检测脊髓组织内平滑蛋白（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ，Ｓｍｏ）ｍＲＮＡ、神经胶质瘤相关癌基因１（Ｇｌｉｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｏｎｃｏｇｅｎｅ－１，Ｇｌｉ１）ｍＲＮＡ表达。结果　自ＣＤＰＳ治疗第９天开始，ＣＤＰＳ治疗组小鼠临床症状评分低于ＥＡＥ模型组（Ｐ＜０．０５），而ＣＤＰＳ＋ｃｙｃ治疗组临床症状评分高于ＣＤＰＳ组（Ｐ＜０．０５）。ＣＤＰＳ治疗组小鼠脊髓ＬＦＢ评分较ＥＡＥ模型组降低（ｔ＝９．６４，Ｐ＜０．０１），而ＣＤＰＳ＋ｃｙｃ治疗组其ＬＦＢ评分与ＥＡＥ模型组比较差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。ＥＡＥ模型组小鼠脊髓组织内Ｓｈｈ、Ｐｔｃ－１蛋白以及ＳｍｏｍＲＮＡ、Ｇｌｉ１ｍＲＮＡ表达水平较正常组升高（均Ｐ＜０．０１），经ＣＤＰＳ治疗后，上述因子表达进一步升高（均Ｐ＜０．０１），而经ｃｙｃ干预后，上述因子表达较ＣＤＰＳ治疗组降低（均Ｐ＜０．０１）。结论　ＣＤＰＳ对ＥＡＥ小鼠临床症状有改善作用，其作用途径可能与Ｓｈｈ信号通路有关。关键词：肉苁蓉多糖；脑脊髓炎，自身免疫性，实验性；Ｓｈｈ通路；神经保护多发性硬化（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＭＳ）是一种以中枢神经系统炎性脱髓鞘病变为主要特点的自身免疫性疾病，其主要病理特征为髓鞘脱失、轴索损伤、少突胶质细胞病变，受损后神经细胞的修复和再生对中枢神经系统的功能重建尤为重要［１］。Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｈｈ）信号通路在神经系统的发育过程中起非常重要的作用［２］，音猬因子（ｓｏｎｉｃｈｅｄｇｅｈｏｇ，Ｓｈｈ）是Ｈｈ家族三大配体成员之一，Ｓｈｈ信号通路的主要成分包括Ｓｈｈ配体、跨膜蛋白受体Ｐｔｃ和平滑蛋白（ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ，Ｓｍｏ）及下游转录因子神经胶质瘤相关癌基因（ｇｌｉｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｏｎｃｏｇｅｎｅ，Ｇｌｉ）蛋白等。近年来有报道证实Ｓｈｈ信号通路在促进神经再生、少突胶质细胞发生混合轴突重塑方面有重要作用，对ＭＳ等神经退行性疾病的发生有重要影响［３］。目前临床上治疗ＭＳ的手段主要有糖皮质激素冲击和免疫调节治疗［４］，但疗效并不理想且副作用较大。肉苁蓉多糖（ｃｉｓｔａｎｃｈｅ　ｄｅｓｅｒｔｉｃｏｌａ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＣＤＰＳ）是从肉苁蓉中提取的化学成分，具有免疫调节、抗衰老、抗肿瘤等功能［５］。有研究证实，ＣＤＰＳ能通过多种机制改善帕金森病、缺血性脑卒中小鼠中枢神经功能［６－７］，但其对ＭＳ的受损神经是否具有保护作用尚未可知。本研究观察了ＣＤＰＳ对实验性自身免疫性脑脊髓炎（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，ＥＡＥ）小鼠中枢神经的作用，并探讨其可能机制，为ＭＳ的临床治疗寻找更安全有效的药物。１　材料和方法１．１　实验动物　ＳＰＦ级雌性Ｃ５７ＢＬ／６小鼠６０只，周龄８～１０周，体重１８～２０ｇ，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。建模前将实验动物在ＳＰＦ级环境下饲养１周。将小鼠随机分为正常对照组、ＥＡＥ模型组、ＣＤＰＳ治疗组及ＣＤＰＳ＋Ｓｍｏ受体阻断剂环王巴明（ｃｙｃｌｏｐａｍｉｎｅ，ｃｙｃ；以下简称“ＣＤＰＳ＋ｃｙｃ治疗组”）４组，每组１５只。１．２　主要试剂　髓鞘少突细胞糖蛋白３５－５５多肽（ｍｙｅｌｉｎ　ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　３５－５５，ＭＯＧ３５－５５）购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，完全福氏佐剂（ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄｓ　ａｄｊｕｖａｎｔ，ＣＦＡ）购自美国Ｓｉｇｍａ公司，百日咳毒素（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ　ｔｏｘｉｎ，ＰＴＸ），购自美国Ｓｉｇｍａ公司，ｃｙｃ购自美国Ｃａｙｍａｎ公司，肉苁蓉生药由本院中药房提供，Ｓｍｏ、Ｇｌｉ１、β－ｃａｔｅｎｉｎ引物由上海生工生物工程有限公司合成，Ｓｈｈ、Ｐｔｃ－１、ＧＡＰＤＨ 抗体购自碧云天生物技术研究所。１．３　方法　１．３．１　ＣＤＰＳ提取：肉苁蓉生药片１０ｇ，研磨成碎片，置９５％（体积分数）乙醇中浸泡３ｈ后用纱布过滤，弃滤液，加水反复煎煮３次，２ｈ／次，过滤后合并滤液，减压浓缩体积至原生药溶液体积的２／３，以５０００ｒ／ｍｉｎ（离心半径１５ｃｍ）离心１０ｍｉｎ，弃沉淀，上清液加２～３倍体积９５％（体积分数）乙醇，４℃下静置２４ｈ后以３０００ｒ／ｍｉｎ（离心半径１５ｃｍ）离心２０ｍｉｎ，弃上清液，沉淀经水复溶、脱蛋白透析、冷冻干燥，获取多糖共２．２０ｇ。紫外分光光度计测定多糖含量＞９０％。１．３．２　ＥＡＥ小鼠模型建立［１］：将１０ｍｇ　ＭＯＧ３５－５５溶于２ｍＬ生理盐水，并与含２．５ｍｇ／ｍＬ结核杆菌的ＣＦＡ等体积混合，使用玻璃注射器反复抽打至完全融合，制成油包水样乳剂。以２％（质量浓度）戊巴比妥麻醉按体重３ｍＬ／ｋｇ给予小鼠背部沿脊柱中线两侧分四点皮下注射抗原乳剂０．２ｍＬ，分别于０、４８ｈ给予小鼠腹腔注射ＰＴＸ　２００ｎｇ，建立ＥＡＥ模型。正常对照组小鼠以同法给予背部皮下注射不含ＭＯＧ３５－５５和结核杆菌的乳剂。自免疫当天起，隔天观察并记录小鼠行为特征，采用五分法对小鼠进行神经功能评分［８］：０分，活动正常，无明显临床症状；１分，尾部无力；２分，后肢无力，翻转后可自行恢复；３分，尾部及双后肢瘫痪，翻转后不能自行恢复；４分，四肢瘫痪；５分，濒临死亡或死亡。神经功能评分≥１分即认为发病。共观察２６ｄ。１．３．３　各组干预措施：（１）ＣＤＰＳ＋ｃｙｃ治疗组：自免疫后第１２天起，每天按体重０．５４ｍｇ／ｇ给予ＣＤＰＳ灌胃（ＣＤＰＳ溶于生理盐水），同时按体重１０ｍｇ／ｋｇ腹腔注射ｃｙｃ，连续２周；（２）ＣＤＰＳ治疗组：自免疫后第１２天起，以同法给予等剂量ＣＤＰＳ灌胃，同时腹腔注射等体积的生理盐水，连续２周；（３）ＥＡＥ模型组和正常对照组：按上述方法给予等体积的生理盐水灌胃及腹腔注射，持续２周。１．３．４　组织标本采集：免疫后第２６天，以２％（质量浓度）戊巴比妥麻醉小鼠，预冷生理盐水进行心脏灌注，采集脊髓组织，部分以４％（质量浓度）多聚甲醛固定后制成石蜡切片，剩余组织置－８０℃冷冻保存备用。１．３．５　勒克斯光蓝（Ｌｕｘｏｌ　Ｆａｓｔ　Ｂｌｕｅ，ＬＦＢ）髓鞘染色［９］：将脊髓腰间膨大组织石蜡切片脱蜡，置于固蓝染液中孵育过夜，９５％（体积分数）乙醇中洗脱１ｍｉｎ，０．０５％（质量浓度）碳酸锂溶液洗脱１０ｓ，乙醇梯度脱水，二甲苯浸泡至透明，中性树胶封片。置光学显微镜下观察髓鞘脱失情况：０分，无脱失，髓鞘完整；１分，１个小范围内脱失；２分，２或３个小范围脱失；３分，１～２个大范围脱失；４分，大范围髓鞘脱失累及２０％以上白质区域。１．３．６　脊髓组织Ｓｈｈ、Ｐｔｃ－１ 蛋白表达：采用Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法检测。将冻存脊髓组织剪成碎块，加蛋白裂解液，离心后取上清液，电泳分离蛋白，将蛋白转移至ＮＣ膜，用含５％（质量浓度）脱脂奶粉的ＴＢＳＴ封闭，按顺序添加一抗、二抗，洗涤ＮＣ膜，ＥＣＬ显色，胶片扫描后用Ｂａｎｄｓｃａｎ５．０软件分析蛋白条带灰度与内参条带灰度比值表示蛋白相对表达水平。１．３．７　脊髓组织Ｓｍｏ、Ｇｌｉ１ ｍＲＮＡ 表达：采用ＲＴ－ＰＣＲ检测。将冻存组织在液氮中研磨，加Ｔｒｉｚｏｌ提取总ＲＮＡ，行逆转录反应。取２μＬ　ＲＮＡ进行ＰＣＲ扩增。β－ａｃｔｉｎ内参引物序列：Ｓｅｎｓｅ：３′－ＴＣＧＡＣＴＴＡＧＣＴＡＧＣＣＡＧＣＴＡＡ－５′；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：３′－ＴＣＧＡＴＴＡＣＧＧＣＴＡＧＣＧＣＧＧＣＴ－５′；Ｓｍｏ　ｍＲＮＡ 引物序列：Ｓｅｎｓｅ：３′－ＴＣＧＧＣＴＡＴＴＡＣＧＣＴＴＧＣＴＡＡＣ －５′；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ： ３′－ＴＣＧＧＣＴＴＡＧＣＴＣＧＡＴＴＡＡＣＣＡ－５′；Ｇｌｉ１ ｍＲＮＡ 引物序列：Ｓｅｎｓｅ：３′－ＴＡＴＴＡＧＣＴＴＡＡＣＧＣＴＡＣＣＣＡＡ－５′；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：３′－ＴＣＧＧＣＴＡＧＣＣＡＡＡＴＴＧＣＴＡＧＧ－５′。扩增条件：９５℃ 预变性２ｍｉｎ，１个循环；９５℃变性３０ｓ，５６℃退火３０ｓ，７２℃延伸２ｍｉｎ，共３５个循环；７２℃总延伸６ｍｉｎ。取５μＬ　ＰＣＲ扩增产物进行电泳，紫外线投射仪下观察电泳条带，分析目的基因和内参基因的条带灰度。１．４　统计学处理　采用ＳＰＳＳ１９．０软件进行统计分析，对数据进行正态性和方差齐性检验，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，多组均数间比较采用单因素方差分析，两两比较用ＬＳＤ－ｔ检验。以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。２　结果２．１　临床症状评分　自免疫后第１０天开始，ＥＡＥ小鼠陆续出现临床症状，ＥＡＥ模型组小鼠神经功能评分于２４ｄ达高峰，随后有所缓解；ＣＤＰＳ治疗组小鼠于治疗第９～２６天（免疫后第２０天）开始，其神经功能评分明显低于ＥＡＥ模型组（均Ｐ＜０．０５）；ＣＤＰＳ＋ｃｙｃ治疗组小鼠自治疗第９天（免疫后第２０天）开始，其神经功能评分显著高于ＣＤＰＳ治疗组（均Ｐ＜０．０５），而与ＥＡＥ模型组小鼠比较差异无统计学意义（均Ｐ＞０．０５）。结果见图１。２．２　ＬＦＢ染色　正常组小鼠髓鞘完整，无脱失；ＥＡＥ模型组小鼠髓鞘密度明显下降；ＣＤＰＳ治疗组小鼠髓鞘ＬＦＢ评分低于ＥＡＥ模型组（１．３０±０．２１比２．５８±０．２５；ｔ＝９．６４，Ｐ＜０．０１）；ＣＤＰＳ＋ｃｙｃ治疗组小鼠髓鞘ＬＦＢ评分与ＥＡＥ模型组比较无统计学差异（２．１３±０．３１比２．５８±０．２５；ｔ＝０．８３，Ｐ＞０．０５）。结果见图２。２．３　各组小鼠脊髓Ｓｈｈ和Ｐｔｃ－１蛋白表达　ＥＡＥ模型组小鼠脊髓Ｓｈｈ、Ｐｔｃ－１蛋白表达高于正常对照小鼠（ｔ＝８．９７，Ｐ＜０．０１；ｔ＝１４．２８，Ｐ＜０．０１），ＣＤＰＳ治疗组脊髓Ｓｈｈ、Ｐｔｃ－１蛋白表达高于ＥＡＥ模型组（ｔ＝２１．７７，Ｐ＜０．０１；ｔ＝２４．３３，Ｐ＜０．０１），经ｃｙｃ阻断后，Ｓｈｈ、Ｐｔｃ－１蛋白表达较ＣＤＰＳ治疗组低（ｔ＝１２．０３，Ｐ ＜０．０１；ｔ＝１８．６９，Ｐ ＜０．０１）。结果见图３、４。２．４　各组小鼠脊髓组织Ｓｍｏ　ｍＲＮＡ 和Ｇｌｉ１ｍＲＮＡ 表达　ＥＡＥ 模型组小鼠脊髓组织ＳｍｏｍＲＮＡ 和Ｇｌｉ１ ｍＲＮＡ 表达较正常小鼠高（ｔ＝１０．２８，Ｐ＜０．０１；ｔ＝７．２２，Ｐ＜０．０１），经ＣＤＰＳ治疗后Ｓｍｏ　ｍＲＮＡ和Ｇｌｉ１ｍＲＮＡ表达较ＥＡＥ模型组高（ｔ＝２５．２８，Ｐ＜０．０１；ｔ＝１２．３０，Ｐ＜０．０１），而经ｃｙｃ干预后，其Ｓｍｏ　ｍＲＮＡ 和Ｇｌｉ１ｍＲＮＡ表达水平与ＥＡＥ模型组比较无统计学差异（ｔ＝１．２５，Ｐ＞０．０５；ｔ＝０．９６，Ｐ＞０．０５），但明显低于ＣＤＰＳ治疗组（ｔ＝１８．３３，Ｐ＜０．０１；ｔ＝２１．０１，Ｐ＜０．０１）。结果见图５、６。３　讨论Ｓｈｈ通过与Ｐｔｃ结合可激发Ｓｍｏ活性，继而引发下游信号通路的级联反应，调节细胞的增殖、分化等活动［３］。前期研究证实，在脑卒中［１０］、ＭＳ［１１］、阿尔茨海默病［１２］等中枢神经受损后，Ｓｈｈ信号通路被激活，继而促进神经细胞再生、少突细胞发生和轴突修复，而抑制Ｓｈｈ信号通路则加剧脑损伤。Ｚｈａｎｇ等［１３］研究结果显示，脑活素能激活脑卒中实验大鼠中枢神经Ｓｈｈ通路，从而促进中枢神经再生，改善神经功能；Ｃｈｅｃｈｎｅｖａ等［１４］研究证实Ｓｍｏ受体激动剂能减轻脑缺血性损伤，促进神经功能恢复。Ｙｕ等［１５］研究显示，Ｓｍｏ受体阻断剂ｃｙｃ可抑制Ｓｈｈ信号通路活性，进而导致神经干细胞的增殖活性受到明显抑制。本研究结果发现，ＥＡＥ小鼠中枢神经系统内Ｓｈｈ信号系统分子Ｓｈｈ、Ｐｔｃ－１、Ｓｍｏ和Ｇｌｉ－１的表达明显高于正常小鼠，表明在受损中枢神经内，Ｓｈｈ信号通路被激活，这与前期研究结果一致。肉苁蓉是列当科植物肉苁蓉的干燥带鳞叶的肉茎，具有免疫调节等作用［５］，对神经系统疾病的防治有显著作用［６－７］。有研究证实，肉苁蓉可以对抗神经细胞内氧化应激反应所造成的ＤＮＡ损伤，维持线粒体膜电位正常，抑制神经细胞的凋亡［１６］；同时，肉苁蓉能降低脑缺血后的梗死范围，保护脑组织的缺血性损伤［１７］；肉苁蓉能通过调控帕金森病模型大鼠中脑黑质－纹状体组织内ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ通路的表达，发挥中枢神经细胞保护作用［６］。蔡克瑞等［７］研究发现，ＣＤＰＳ对Ｄ－半乳糖致衰小鼠的脑神经细胞具有保护作用，但目前有关肉苁蓉对ＭＳ中枢神经系统是否具有保护作用尚未见报道。本研究结果显示，给予ＥＡＥ小鼠ＣＤＰＳ干预后，ＥＡＥ小鼠神经功能评分明显低于ＥＡＥ模型小鼠，髓鞘脱失情况亦得到显著改善；进一步探讨肉苁蓉对ＥＡＥ小鼠中枢神经系统Ｓｈｈ信号通路是否有调控作用发现，肉苁蓉能上调ＥＡＥ 小鼠脊髓组织内Ｓｈｈ、Ｐｔｃ－１、Ｓｍｏ和Ｇｌｉ－１的表达，表明ＣＤＰＳ能激活Ｓｈｈ信号通路；当Ｓｈｈ信号通路被ｃｙｃ抑制后，ＣＤＰＳ改善ＥＡＥ小鼠神经功能学及脱髓鞘的作用被抑制，且Ｓｈｈ相关信号分子的表达也较ＣＤＰＳ治疗组下降，表明Ｓｈｈ信号通路在ＣＤＰＳ对ＥＡＥ小鼠的神经保护效应中起到重要作用。综上所述，本研究结果显示ＣＤＰＳ 能改善ＥＡＥ小鼠临床症状，其发挥神经保护作用的途径可能是通过激活Ｓｈｈ信号通路有关。参考文献：［１］刘淑情．苦参素对实验性自身免疫性脑脊髓炎及其并发症视神经炎作用机制的研究［Ｄ］．郑州大学，２０１８．［２］邵帅．Ｓｏｎｉｃ　ｈｅｄｇｅｈｏｇ／ＰＩ３Ｋ／ＡＫｔ信号通路在帕金森病炎症模型中发挥神经保护作用的研究［Ｄ］．广州医科大学，２０１７．［３］赵红，吴晓君，刘赞华，等．局灶性脑缺血大鼠纹状体区域Ｓｈｈ信号通路成分的表达变化及对髓鞘修复的影响［Ｊ］．中风与神经疾病杂志，２０１６，３３（０７）：６２９－６３２．［４］邱伟，徐雁．多发性硬化诊断和治疗中国专家共识（２０１８版）［Ｊ］．中国神经免疫学和神经病学杂志，２０１８，２５（０６）：３８７－３９４．［５］Ｌｉｎ　Ｓ，Ｙｅ　Ｓ，Ｈｕａｎｇ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ｈｏｗ　ｄｏ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ　ｔｈａｔｔｏｎｉｆｙ　ｔｈｅ　ｋｉｄｎｅｙ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ　ｎｅｕｒｏｎ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ＇［Ｊ］．ＮＲＲ，２０１３，８（３０）：２８２０－２８２６．［６］林瑶，杨莎莎，刘婷，等．肉苁蓉对帕金森病模型大鼠ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ蛋白表达的影响［Ｊ］．江西中医药大学学报，２０１９，３１（０１）：８３－８６．［７］蔡克瑞，刘志新，孙晓冬，等．肉苁蓉多糖对Ｄ－半乳糖致衰小鼠脑神经细胞的保护作用及机制［Ｊ］．中国老年学杂志，２０１８，３８（１９）：４７３２－４７３４．［８］Ｌｉ　Ｊ，Ｃｈｅｎ　Ｗ，Ｌｉ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｌｆａｃｔｏｒｙｅｎｓｈｅａｔｈｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ　ｐｒｏｍｏｔｅｓ　ｐａｒｔｉａｌ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｉｎ　ｒａｔｓ　ｗｉｔｈｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　ＣｌｉｎＥｘｐ　Ｐａｔｈｏｌ，２０１５，８（９）：１１１４９－１１１５６．［９］张明亮，刘方洲，吕莹，等．苦参素对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３表达的影响［Ｊ］．中国医院药学杂志，２０１６，３６（２２）：１９７３－１９７６．［１０］Ｊｉｎ　ＹＭ，Ｒａｖｉｖ　Ｎ，Ｂａｒｎｅｔｔ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　Ｓｈｈ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙｉｓ　ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｉｎ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｅｌｌ　ｔｙｐｅｓ　ｉｎ　ｃｏｒｔｉｃａｌ　ｉｓｃｈｅｍｉａ　ａｎｄｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ　ｔｈｅ　ｏｕｔｃｏｍｅ　ｏｆ　ｓｔｒｏｋｅ　ｉｎ　ａｎ　ａｎｉｍａｌ　ｍｏｄｅｌ［Ｊ］．ＰＬｏＳＯｎｅ，２０１５，１０（４）：ｅ０１２４６５７．［１１］ Ｗａｎｇ　Ｙ，Ｉｍｉｔｏｌ　Ｊ，Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．Ｐａｒａｄｏｘｉｃａｌｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｅｕｒａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｐａｔｈｗａｙ　ｓｏｎｉｃ　ｈｅｄｇｅｈｏｇ－ Ｇｌｉ１ ｉｎ　ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ　ａｎｄ　ｍｕｌｔｉｐｌｅｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．［Ｊ］．Ａｎｎ　Ｎｅｕｒｏｌ，２０１０，６４（４）：４１７－４２７．［１２］Ｖａｚｉｎ　Ｔ，Ｂａｌｌ　Ｋ　Ａ，Ｌｕ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｒｔｉｃａｌｇｌｕｔａｍａｔｅｒｇｉｃ　ｎｅｕｒｏｎｓ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ：Ａｍｏｄｅｌ　ｓｙｓｔｅｍ　ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｉｎ　Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ　ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ　Ｄｉｓ，２０１４，６２（８）：６２－７２．［１３］Ｚｈａｎｇ　Ｌ，Ｃｈｏｐｐ　Ｍ，Ｍｅｉｅｒ　ＤＨ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｏｎｉｃ　ｈｅｄｇｅｈｏｇ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ　ｍｅｄｉａｔｅｓ　ｃｅｒｅｂｒｏｌｙｓｉｎ － ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｆｔｅｒ　ｓｔｒｏｋｅ［Ｊ］．Ｓｔｒｏｋｅ，２０１３，４４（７）：１９６５－１９７２．［１４］Ｃｈｅｃｈｎｅｖａ　ＯＶ，Ｍａｙｒｈｏｆｅｒ　Ｆ，Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ　ＤＪ，ｅｔ　ａｌ．Ａｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｇｏｎｉｓｔ　ｉｓ　ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｐｒｏｍｏｔｅｓｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ａｆｔｅｒ　ｉｓｃｈｅｍｉｃ　ｂｒａｉｎ　ｉｎｊｕｒｙ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ　Ｄｉｓ，２０１４，５（１０）：ｅ１４８１．［１５］Ｙｕ　ＰＰ，Ｗａｎｇ　Ｌ，Ｔａｎｇ　ＦＲ，ｅｔ　ａｌ．Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ　ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｄｅｃｒｅａｓｅｓ　ｉｓｃｈｅｍｉｃ　ｉｎｊｕｒｙ　ａｎｄ　ｉｍｐｒｏｖｅｓ　ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｖｉａ　ｓｏｎｉｃ　ｈｅｄｇｅｈｏｇ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ａｆｔｅｒ　ｓｔｒｏｋｅ　ｉｎ　ｒａｔｓ［Ｊ］．ＭｏｌＮｅｕｒｏｂｉｏｌ，２０１６，５４（１）：１－１５．［１６］Ｗａｎｇ　ＹＨ，Ｘｕａｎ　ＺＨ，Ｔｉａｎ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｃｈｉｎａｃｏｓｉｄｅ　ｐｒｏｔｅｃｔｓａｇａｉｎｓｔ　６ － ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｉｎ　ＰＣ１２ｃｅｌｌｓ　ｖｉａｒｅｄｕｃｉｎｇ　ＲＯＳ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｅｖｉｄ－Ｂａｓｅｄ　Ｃｏｍｐｌ　Ａｌｔ，２０１５，２０１５：１８９２３９．Ｅｐｕｂ　２０１５Ｆｅｂ　１８．［１７］Ｃｈｅｎ　Ｊ，Ｚｈｏｕ　ＳＮ，Ｚｈａｎｇ　ＹＭ，ｅｔ　ａｌ．Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ　ｏｆ　ｃｉｓｔａｎｃｈｅｉｍｐｒｏｖｅ　ｌｅａｒｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｍｅｍｏｒｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｔ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｖａｓｃｕｌａｒｄｅｍｅｎｔｉａ［Ｊ］．Ｅｕｒ　Ｒｅｖ　Ｍｅｄ　Ｐｈａｒｍａｃｏ，２０１５，１９（７）：１２３４．

摘要：肉苁蓉是一种含有多种化学成分的传统补益中药，其中多糖是其主要活性成分之一。现代的药理研究表明，肉苁蓉多糖具有调节免疫活性、抗衰老、改善学习记忆能力、保护神经、抗肝损伤、抗病毒、抗肿瘤、影响肠道菌群等诸多药理作用，广泛应用于临床和保健类食品方面。此外，由于肉苁蓉多糖的组成多样性，对其生物活性也有一定影响。故该文综述了肉苁蓉多糖的药理作用，以期为相关研究和临床应用提供参考。关键词：肉苁蓉多糖；单糖组成；药理作用；研究进展在历代补益药中药处方中肉苁蓉的出现率占据第1 位，其中多糖作为主要的活性成分之一，具有多种药理作用，广泛应用于临床和保健类食品方面，随着科技的进步和相关研究的深入，肉苁蓉多糖在更多领域中的开发和合理利用也越来越受到人们的关注。1 概述肉苁蓉是中药临床常用的一种传统补益中药，又名苁蓉、地精、金笋等，俗称为大芸，具有“沙漠人参”的美誉[1]。在我国已有2000 多年的药用历史，在历代补益性中药处方中出现率占第1位[2]，主要分布于北纬36°~37°，东西横跨内蒙古、陕西、甘肃、宁夏及新疆等5个省区。据统计，全球肉苁蓉属的植物约有22 种，确定我国有5 种，原植物为荒漠肉苁蓉、德赢vwin登录 、盐生肉苁蓉和沙苁蓉以及白花盐苁蓉[3]。据《中华人民共和国药典》记载，肉苁蓉是列当科（Orobanchaceae）肉苁蓉属（Cistanche）植物肉苁蓉的干燥带鳞片的肉质茎，性味为甘、咸、温，归肾、大肠经，功能与主治：补肾阳，益精血，润肠通便。肉苁蓉的药理作用主要有提高学习记忆能力[4]、提高性功能、抗衰老、抗疲劳、抗辐射、调节免疫功能、润肠通便、治疗骨质疏松、保肝等，还被描述有镇静、血管松弛的作用，广泛用于治疗不同的健康问题[5]。2 肉苁蓉多糖的研究肉苁蓉含有多种化学成分，主要包括苯乙醇苷类、多糖类、黄酮类、环烯醚萜类、木脂素类、低聚糖、半乳糖醇、生物碱及挥发性成分，此外，还有氨基酸、无机微量元素等[6]。其中多糖是其主要活性成分之一，主要由葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、果糖等单糖组成。常用的含量测定方法分为两类，第一类是利用多糖的单糖的缩合反应进行测定，例如蒽酮-硫酸法和苯酚-硫酸法，另一类是直接测定多糖本身，例如高效毛细管电泳法、高效液相色谱法、气相色谱法和生物传感器法等。提取方式有传统浸提、超声提取、微波提取和酶法提取等。由于肉苁蓉的种类、产地、分离提取方法各异，肉苁蓉多糖在化学结构、组成和相对分子量上有巨大的多样性，对其生物活性具有很大影响。见表1。3 肉苁蓉多糖的药理作用3.1 调节免疫活性肉苁蓉多糖是肉苁蓉发挥免疫调节作用的物质基础，能促进淋巴细胞的增殖，改善机体免疫功能，激活免疫细胞，同时能显著提高巨噬细胞吞噬及分泌功能，从而活化巨噬细胞，起到调节免疫活性的作用。机制见图1。3.1.1 促进淋巴细胞的增殖淋巴细胞的增殖是机体细胞免疫反应的前提，反映了机体非特异性免疫的功能。白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）是在机体复杂的免疫体系中具有重要调节作用的细胞因子，肉苁蓉多糖能促进淋巴细胞IL-2 的释放及受体的表达，促进淋巴细胞的增殖与分化[16]。而白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）属于促炎因子之一，IL-6 表达的增高会加重炎症反应，引起免疫性病理损伤[17]。王翔岩[18]通过实验验证，肉苁蓉多糖可促进未活化的淋巴细胞增殖，也可促进刀豆蛋白A（concanavalinA，ConA）有丝分裂原受体活化的T 淋巴细胞和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）有丝分裂原受体活化的B淋巴细胞增殖，并且对B淋巴细胞的增殖作用强于T 淋巴细胞。姚金茜等[19] 通过实验探讨了肉苁蓉多糖对气管切开插管留置大鼠肺部免疫功能的影响，发现肉苁蓉多糖通过改善T 细胞亚群的失衡及刺激机体IL-2 的分泌直接增强免疫活性，于此同时，也能够减少促炎因子IL-6 的释放减轻大鼠肺部的炎症反应，有利于肺部局部免疫功能的修复。ZHANGAilian 等[20] 从肉苁蓉中提取出的一种水溶性多糖，通过Toll 样受体4（Toll-like receptors4，TLR4）信号激活树突状细胞，诱导树突状细胞成熟，树突状细胞是重要的抗原递呈细胞，为启动免疫反应提供必要的信号，完全成熟的树突状细胞可诱导T 淋巴细胞增殖，实验表明肉苁蓉多糖可以作为疫苗佐剂，具有免疫调节作用。ZHAO Bin 等[21] 通过肉苁蓉水提物作为季节性流感疫苗多糖佐剂的应用研究中，发现肉苁蓉水提物和季节性流感疫苗联用可以增强HI抗体的产生，更快速的产生体液免疫反应，促进T 淋巴细胞的生长和分化，对季节性流感疫苗产生更加持久的免疫。曾群力等[22]通过噻唑蓝（MTT）比色体外观察法发现，推测肉苁蓉多糖调节免疫活性的作用机制是肉苁蓉多糖能促进小鼠胸腺淋巴细胞内钙离子释放，使细胞内钙离子浓度升高从而促进了IL-2基因的表达，促使T淋巴细胞增殖，同时也发现了肉苁蓉多糖在较高浓度时能对抗异丙肾上腺素（isoprenaline，ISO）、地塞米松（dexamethasone，DEX）对淋巴细胞增殖的抑制作用，及对抗高浓度肿瘤抑制因子-β对淋巴细胞增殖的抑制作用，协同低浓度肿瘤抑制因子-β对淋巴细胞的增殖有促进作用。3.1.2 增强吞噬细胞活性在免疫系统中，吞噬细胞是继上皮屏障之后宿主防御的第一道防线，在免疫功能中起着至关重要的作用[23]。王翔岩等[24] 发现肉苁蓉多糖可显著促进小鼠腹腔巨噬细胞或细胞株RAW264.7 的NO、IL-1、肿瘤抑制因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）释放。在免疫系统中，由吞噬细胞合成释放的NO 可杀伤微生物、寄生虫、肿瘤细胞等[25]，TNF-α不仅直接参与抗肿瘤作用，还可调节自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）等免疫细胞的活性，IL-1 对机体的免疫反应具有启动、放大效应和正向调节作用，可活化淋巴细胞诱导免疫应答及协同刺激胸腺细胞增生等[26]。张涛等[27] 的研究显示肉苁蓉多糖可能通过增强单核巨噬细胞吞噬能力和促进细胞因子释放增强免疫活性。3.2 抗衰老衰老是指人体细胞及组织在结构和功能上出现的退行性变化的现象。肉苁蓉多糖通过不同途径影响机体，产生抗衰老作用。3.2.1 抗氧化肉苁蓉多糖是天然的抗氧化剂，可以清除超氧自由基、羟自由基等多种自由基，旨在保护机体过量产生自由基[28]。衰老自由基学说认为人类随年龄增长的退行性变化是由于自由基活性氧化损伤作用所致。王国卫等[29] 通过研究新疆肉苁蓉多糖清除活性氧自由基的实验结果表明新疆肉苁蓉多糖对超氧阴离子自由基、羟自由基、DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）· 自由基、单线态氧自由基均有明显清除作用，且清除作用与多糖浓度呈正相关性。吴波等[30] 建立D- 半乳糖小鼠亚急性衰老模型，发现灌服肉苁蓉多糖的衰老小鼠血液和肝脏组织中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）明显高于模型组，从而消除D- 半乳糖引起的自由基的增多，提示肉苁蓉多糖具有抗氧化作用从而起到延缓衰老的作用。线粒体是细胞内主要耗氧部位，是产生自由基的主要场所，徐辉等[31] 采用D- 半乳糖所致衰老模型大鼠的实验中发现，肉苁蓉多糖显著提高衰老模型大鼠肝脏Ca2+- 三磷腺苷（adenosinetriphophate，ATP）酶活性、肝线粒体膜流动性及呼吸链复合体的活性，显著降低肝线粒体丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、磷脂酶A2 活性，表明肉苁蓉多糖可以提高肝线粒体的抗氧化能力，减少脂质过氧化产物，减轻线粒体氧化损伤，改善线粒体能量代谢，达到延缓衰老的目的。3.2.2 抗疲劳抗疲劳能力减弱也是衰老的一个典型特征[32]，血清尿素、乳酸及肝糖原、肌糖原是检测疲劳最常用的生化指标[33]，负重游泳实验是评价药物抗疲劳作用最直接、最客观的指标[34]。闫磊等[35] 研究肉苁蓉多糖对D- 半乳糖致衰老小鼠抗疲劳作用的实验中，表明肉苁蓉多糖可以提高衰老小鼠的运动耐力，并且低、高剂量肉苁蓉多糖能降低衰老小鼠血清尿素、乳酸水平，增加肝糖原、肌糖原含量，增强抗自由基损伤，结果表明低、高剂量肉苁蓉多糖均有抗D- 半乳糖致衰老小鼠疲劳的作用。3.2.3 改善呼吸系统退行性变化呼吸系统退行性变化和机体衰老是同步进行的。孙云等[36-37] 通过肉苁蓉多糖对衰老小鼠肺一氧化氮和细胞凋亡以及肺蛋白含量的影响中发现，肉苁蓉多糖可以明显提高机体血清和肺的SOD活力、降低一氧化氮浓度，明显抑制了肺组织细胞凋亡，使胶原蛋白增多和弹性蛋白减少，对肺组织细胞具有保护和改善的作用，从而达到了延缓衰老的作用。3.3 改善学习记忆能力阿尔兹海默症是一种神经退行性疾病。尹刚等[38] 建立阿尔兹海默病大鼠模型，观察肉苁蓉多糖对其学习记忆能力以及脑内海马神经元B淋巴瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3（cysteinyl aspartate specificproteinase-3，Caspase-3）表达的影响，发现肉苁蓉多糖能通过增强Bcl-2 的表达及抑制Caspase-3 的表达抑制海马神经元的凋亡，从而改善阿尔兹海默病大鼠的学习记忆能力。尹刚等[39] 通过实验也发现了肉苁蓉多糖增加了大脑皮质及海马乙酰胆碱酯酶的含量，提高皮质中乙酰胆碱转移酶的活性，提示肉苁蓉多糖可能通过影响机体胆碱能系统来改善学习记忆能力。尹若熙等[40] 研究表明肉苁蓉多糖可明显提高东莨菪碱所致学习记忆障碍模型小鼠突触可塑性相关蛋白的表达水平，促进突触的形成，增加突触的数量，增强了突触的可塑性，从而改善东莨菪碱造成的学习记忆障碍损伤。武燕等[41] 研究肉苁蓉多糖对改善学习记忆障碍的非抗氧化机制时发现，肉苁蓉多糖可通过上调CAMP/PKA/CREB/BDNF信号通路，并且适度提高神经递质的释放来改善衰老小鼠的学习记忆能力。3.4 保护神经Bcl-2 基因是一种原癌基因，它通过抑制凋亡而延长细胞的存活，具有抑制细胞凋亡的作用[42]。蔡克瑞等[43] 探讨肉苁蓉多糖对 D- 半乳糖致衰老小鼠脑神经细胞的保护作用及其机制，发现灌服肉苁蓉多糖可提高SOD活性、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力，降低MDA 含量，增强神经细胞DNA 损伤的修复能力，减少凋亡细胞数，增加Bcl-2 基因表达，具有改善衰老小鼠脑神经细胞损伤的作用。LIUYue 等[44] 研究肉苁蓉多糖保护肾上腺嗜铬细胞瘤（pheochromocytomaderived，PC12）细胞免受糖氧剥夺（oxygen and deprivation，OGD）的损伤，建立OGD损伤的PC12 细胞模型，通过肉苁蓉多糖和丝裂原依赖性癌基因（DJ-1）的相互作用，帕金森疾病有关的蛋白质DJ-1 是通过刺激抗凋亡和抗氧化基因的表达介导神经保护的[45]，发现肉苁蓉多糖抑制OGD 诱导的细胞损伤和凋亡，降低OGD 诱导的细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）的积累，同时肉苁蓉多糖能刺激DJ-1 的分泌，增强其DJ-1 的表达，结果表明肉苁蓉多糖通过抑制氧化应激和调节DJ-1通路对OGD 诱导的损伤具有神经保护作用。3.5 抗肝损伤王艳芳等[46] 通过肉苁蓉多糖对CCl4 所致小鼠急性肝损伤的保护作用试验中发现，肉苁蓉多糖各剂量组小鼠肝脏中的MDA 含量显著降低，SOD水平显著升高，表明肉苁蓉多糖可以改善脂质过氧化物对肝细胞的损伤，提高了肝细胞的抗氧化能力，从而维持肝细胞质膜的完整性，使肝细胞发挥正常的防御和代偿功能。GUO Yuanheng 等[47] 也证实了从肉苁蓉多糖中分离出来的一种多糖组分可以降低MDA、甘油三酯（triglyceride，TG）含量，调节相关酶的活性，从而起到对酒精性肝损伤的保护作用。3.6 抗病毒、抗肿瘤张洪泉等[48] 通过实验发现肉苁蓉多糖能明显增加自然杀伤细胞C（natural killer cellC，NKC）和白细胞介素IL-2 的活性，对Lewis 肺癌和S180 肉瘤有明显的的抑瘤作用。王成蓉等[49] 在实验中证实了肉苁蓉多糖能提高T 淋巴细胞活性，增加了血清中干扰素-γ 含量。干扰素-γ 不仅能与细胞表面相应受体结合，诱导细胞形成抗病毒蛋白，抑制病毒复制，还可通过增强或发动宿主对肿瘤细胞的免疫反应，杀伤肿瘤细胞，达到抗病毒、抗肿瘤的作用。3.7 影响肠道菌群王晓琴等[50] 对肉苁蓉多糖提取物进行大肠杆菌、四叠球菌、枯草杆菌、啤酒酵母、橘青霉的抑菌性实验中，表明肉苁蓉多糖具有一定的抑制细菌及真菌生长的作用，对细菌的抑制作用明显强于对真菌的抑制作用，此实验说明肉苁蓉多糖在抗动植物病原菌方面有潜在应用价值。ZENG Hui等[7] 也证实了从肉苁蓉中分离出来一种新型的均质中性多糖CDA-0.05 可促进多种益生菌的生长，有利于人类促进肠道菌群健康。3.8 其他作用陈志伟等[51] 在肉苁蓉多糖对骨髓抑制性贫血小鼠造血调控的实验研究中发现，肉苁蓉多糖在一定浓度范围均可促进巨核系、红系造血祖细胞的增殖与分化，减轻骨髓抑制，促进造血。高慧等[52] 通过不同浓度的肉苁蓉多糖对体外培养人纤维细胞的试验中，发现肉苁蓉多糖能明显促进体外成纤维细胞的生长，表明应用适当浓度的肉苁蓉多糖可促进创伤愈合。此外，肉苁蓉多糖能抑制核因子-κB受体激活配体（receptor activatornuclear factor-κB ligand，RANKL）诱导的破骨细胞分化和骨吸收[53]，而且能促进内分泌功能的改善，加速新陈代谢，从而改善更年期症状[54]。有试验[55] 证明，肉苁蓉多糖能提高大黄脾虚大鼠模型的胃蛋白酶和唾液淀粉酶的活性，改善脾虚导致的消化功能障碍。4 总结与展望多糖是肉苁蓉的重要活性成分之一，具有调节免疫活性、抗衰老、改善学习记忆能力、保护神经、抗肝损伤、抗病毒、抗肿瘤、影响肠道菌群等诸多药理作用，广泛应用于临床和保健类食品方面，但是相应的药理作用机制研究较少，也限制了对其深度开发与应用。多糖作为大分子物质在人体肠道难以被吸收，肠道微生物群可以将膳食多糖发酵成短链脂肪酸，促进人体肠道的消化吸收，但是肉苁蓉多糖在肠道内如何转化，以及对肠道菌群的影响机制目前仍不清楚，需要科研工作者进一步研究。另外，肉苁蓉多糖组成成分较多、结构较复杂，不同种及不同部位肉苁蓉多糖的药效之间也存在一定的差异，仍需进一步探讨。随着科技的进步和相关研究的深入，肉苁蓉多糖在提取分离、组分分析、构效关系、体内代谢、药理作用及生物学功能等方面的研究势必会更加深入，为肉苁蓉多糖在更多领域中的开发和合理利用提供理论基础和科学依据，发挥其最大的临床药用价值和经济价值。◆参考文献[ 1 ] 钟平. 沙漠人参肉苁蓉[ J ] . 森林与人类，2004 ( 11 )：25.[ 2 ] 朱晓玉，刘雄，高建德，等. 肉苁蓉资源概况及药理作用新进展[ J ] . 甘肃中医药大学学报，2016，33 ( 4 )：91-94.[ 3 ] 石婷婷，葛卫红. 肉苁蓉属植物的研究进展[ J ] . 中国民族民间医药，2009，18 ( 9 )：7-9.[ 4 ] 皋聪，王传社，巫冠中，等. 苁蓉总苷对血管性痴呆大鼠学习记忆的影响及机制研究[ J ] . 中草药，2005，36 ( 12 )：1852-1855.[ 5 ] LI Zhiming，LIN Huinuan，GU Long，et al. Herba Cistanche（RouCong-Rong）：One of the Best Pharmaceutical Gifts of TraditionalChinese Medicine[ J ] . Frontiers in pharmacology，2016，7：41.[ 6 ] 赖青海，王琳琳，丁辉，等. 肉苁蓉治疗骨质疏松症研究进展[ J ] . 辽宁中医药大学学报，2016，18 ( 3 )：102-104.[ 7 ] Z E N G H u i，H U A N G L u l i n，Z H O U L i s h u a n g，e t a l . Agalactoglucan isolated from of Cistanche deserticola Y. C. Ma.and its bioactivity on intestinal bacteria strains[ J ] .CarbohydratePolymers，2019，223：115038.[ 8 ] ZHANG Weijie，HUANG Jing，WANG Wei，et al. Extraction，purification，characterization and antioxidant activities ofpolysaccharides from Cistanche tubulosa[ J ] .International Journalof Biological，2016 ( 93 )：448-458.[ 9 ] SUI Zhifu，GU Tingmin，LIU Biao，et al. Water-solublecarbohydrate compound from the bodies of Herba Cistanches：Isolation and its scavenging effect on free radical in skin[ J ] .Carbohydrate Polymers，2011，85 ( 1 )：75-79.[ 10 ] 龚立冬. 肉苁蓉有效成分分析及指纹图谱研究[ D ] . 无锡：江南大学，2007.[ 11 ] EBRINGEROVA A，HROMADKOVA Z，HRIBALOVA V，etal. An Immunomodulating Pectic Arabin-ogalactan from Roots ofCistanche deserticola[ J ] .Chem Pap，2002，56 ( 5 )：320-325.[ 12 ] DONG Qun，YAO Jian，FANG Jinian，et al. Structuralcharacterization and immunological activety of two cold waterextractablepolysaccharides from Cistanche deserticolaY.C.Ma[ J ] .Carbohydrate Research，2007，342 ( 3 )：1343-1349.[ 13 ] 吴向美，屠鹏飞. 肉苁蓉多糖CDP-4 的化学结构研究[ J ] . 北京大学学报（医学版），2004，36 ( 1 )：24-26.[ 14 ] WU Xiangmei，GAO Xiaoming，TSIM KARL WK，et al. Anarabinogalactan isolated from the stems of Cistanche deserticolainduces the proliferation of cultured lymphocytes[ J ] .InternationalJournal of Biological Macromolecules，2005，37 ( 5 )：278-282.[ 15 ] 赵伟，颜宏，梁忠岩，等. 肉苁蓉茎水溶性多糖SPA的结构分析[ J ] . 高等学校化学学报，2005，26 ( 3 )：461-463.[ 16 ] Jandú Jannyson J B，Moraes Neto Roberval N，ZagmignanAdrielle，et al. Targeting the Immune System with Plant Lectinsto Combat Microbial Infections[ J ] .Frontiers in pharmacology，2017，8：671.[ 17 ] NORELLI M，CAMISA B，BARBIERA G，et al. MonocytederivedIL-1 and IL-6 are differentially required for cytokinereleasesyndrome and neurotoxicity due to CAR T cells[ J ] .NatMed，2018，24 ( 6 )：739.[ 18 ] 王翔岩. 肉苁蓉多糖的免疫调节活性及吸收特性研究[ D ] .北京：中国协和医科大学，2009.[ 19 ] 姚金茜，王学敏，鞠静，等. 肉苁蓉多糖对气管切开插管留置大鼠肺部免疫功能的干预作用[ J ] . 时珍国医国药，2019，30( 2 )：275-277.

摘要:目的探讨肉苁蓉苯乙醇总苷( CPhGs) 对压力超负荷大鼠心肌肥厚的抑制作用及其可能的作用机制。方法♂SPF 级SD 大鼠70 只，随机分为空白组( Con) 、假手术组( Sham) 、模型组( Mod) 、阳性药对照组( Vst) 、CPhGs 125、250、500 mg·kg － 1组。检测心脏超声指标、心脏体质量指数( HWI) 、心肌组织病理学变化、心肌细胞面积( AMC) ，Elisa法检测血浆ET-1、BNP 水平，Western blot 法检测p-PI3K、PI3K 、p-PKB、PKB 蛋白表达变化。结果与Mod 组相比，CPhGs 不同剂量给药后，LVPWT、HWI、血浆ET-1 和BNP、AMC 均有不同程度下降，LVEDD、LVEF、LVFS 以及心肌组织p-PI3K、p-PKB 蛋白表达有不同程度的增加，其中CPhGs250、500 mg·kg － 1组相比于Mod 组各指标有明显差异( P ＜0. 05 或0. 01) ; 与Vst 组相比，CPhGs 500 mg·kg － 1组各指标，没有明显差异。结论CPhGs 对压力超负荷引起的大鼠心肌肥厚具有抑制作用，其作用可能与PI3K/PKB 信号通路的激活有关。关键词:肉苁蓉苯乙醇总苷; 压力超负荷; 心肌肥厚; PI3K/PKB; 腹主动脉缩窄术; 磷酸化心肌肥厚是一种为维持心输出量和保证组织灌流的适应性反应，压力超负荷引起的心肌肥厚与高血压的发生密切相关［1］。研究表明［2］，心肌肥厚的逆转可以降低心血管疾病的死亡率。肉苁蓉( Cistance) 素有“沙漠人参”之美誉。苯乙醇总苷( Cistanche phenylethanoid glycosides，CPhGs) 是肉苁蓉发挥药效的主要物质基础之一［3］，具有抗痴呆、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、缓解疲劳、抗脑缺血/再灌注损伤等多种药理作用［4］。研究显示［5］，CPhGs可以抑制因缺血再灌注损伤引起的心肌细胞凋亡并发挥保护心肌组织的作用。然而，肉苁蓉CPhGs 能否对压力超负荷引起的心肌肥厚能起到抑制作用，尚不可知。因此，本研究通过构建大鼠腹主动脉缩窄( abdominal aorta coarctation，AAC ) 模型，探讨CPhGs 对压力超负荷大鼠心肌肥厚的作用，以及对磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B( phosphatidylinositol3-kinase / protein kinase B，PI3K/PKB) 通路相关蛋白表达的影响，以研究CPhGs 抑制压力超负荷大鼠心肌肥厚的作用机制，为进一步研发对心肌肥厚防控的药物提供实验依据。1 材料1． 1 实验动物健康雄性SPF 级大鼠，70 只，体质量( 200 ± 20) g，由新疆医科大学动物实验中心提供。动物生产许可证号与合格证号分别为: SYXK( 新) 2016 － 0003，SCXK( 新) 2016-0002。1． 2 药物与试剂肉苁蓉苯乙醇总苷CPhGs( win德赢官方 ，批号: 20180502) ，缬沙坦( 北京诺华制药有限公司，规格: 80 mg) ，0. 5%羧甲基纤维素钠( carboxymethylcellulose sodium，CMCNa)( 西安正天药用辅料有限公司) ，戊巴比妥钠( 德国Meck 公司) ，ＲIPA( 美国Thermo 公司) ，p-PI3K、PI3K、p-PKB、PKB、β-actin 兔抗单克隆抗体、大鼠血浆内皮素1( endothelin 1，ET-1) 和脑利钠肽( brainnatriuretic peptide，BNP) 酶联免疫吸附试验试剂盒( 北京博奥森公司) ，辣根过氧化酶标记二抗( 北京中杉金桥公司) ，蛋白酶抑制剂、蛋白磷酸酶抑制剂混合物、BCA 蛋白定量试剂盒( 北京索莱宝公司) ，ECL 显色液( 中国Biosharp 公司) 、PVDF 膜( 英国Ｒoche 公司) 。1． 3 主要仪器飞利浦HD11 XE 超声诊断仪( 德国Philips 公司) ; 移液器( 德国Eppendorf 公司) ; 低温离心机( 美国Sigma 公司) ; 全波长自动酶联免疫反应检测仪( ( 美国Thermo 公司) ; 电泳和转膜装置( 美国Bio-Ｒad 公司) ; FluorChem E 化学发光高灵敏凝胶成像仪( 美国Protein Simple 公司) ; 电热恒温培养箱( 上海一恒科学仪器有限公司) 。2 方法2． 1 动物分组、模型制备及给药根据文献［6］采用AAC 术制备大鼠压力超负荷心肌肥厚模型。雄性SD 大鼠70 只，随机分为7 组: 空白组( Control，Con) 、假手术组( Sham) 、模型组( Mod) 、缬沙坦阳性药对照组( Valsartan，Vst) 、CPhGs 125、250、250 mg·kg － 1组，涉及药物剂量参照文献［7 － 8］及预实验结果设置。Con 组不进行手术，Sham 组分离腹主动脉不予结扎，其余五组建立压力超负荷心肌肥厚模型。术后d 3，CPhGs 各剂量组及Vst 组( 10 mg·kg － 1 )按每天设定剂量灌胃给予受试物，其余3 组均灌胃给予相同体积的0. 5% CMC-Na，连续42 d，每日1次; d 43，以2. 5%戊巴比妥钠麻醉后，行心脏超声检查，开腹采取腹主动脉血处死大鼠，立即开胸，取出心脏。2． 2 大鼠心脏超声指标的检测在2. 5%戊巴比妥钠麻醉下，剃毛后，使用超声诊断仪检测各组大鼠的心功能指标: ( 1) 左心室舒张末期后壁厚度( leftventricular posterior wall thickness，LVPWT) ( 2) 左心室舒张末期内径( left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD) ( 3) 左心室短轴收缩率( left ventricularfractional shortening，LVFS) ( 4) 左心室射血分数( leftventricular ejection fractions，LVEF) 。每只大鼠重复3 次测量后，计算平均值。2． 3 大鼠心脏体质量指数( heart weight /bodyweight index，HWI) 计算大鼠结束心脏超声学检测后，打开腹腔，腹主动脉取血至大鼠死亡后，立即开胸，取出大鼠心脏，用预冷的生理盐水冲洗心腔3次，用干净的滤纸吸干水分，称心脏质量( heartweight，HW) 。HWI = HW/体质量( body weight，BW) 。2． 4 酶联免疫吸附试验检测大鼠血浆ET-1 和BNP 水平腹主动脉血液储存于EDTA 抗凝采血管，混匀后3 000 r·min － 1离心15min，收集上清，－ 20 ℃条件下冻存。按试剂盒说明书操作。2． 5 显微镜观察大鼠心肌组织病理学改变大鼠心肌组织以4%多聚甲醛固定、石蜡包埋后，经伊红苏木素染色后以中性树胶封片，电子显微镜下观察心肌组织和细胞形态并拍图。用Image J 测量细胞表面积，每组选取四张标本，每张随机选取3 个视野，每视野测量10 ～ 15 个心肌细胞面积( area of myocardialcells，AMC) ，计算平均值。2． 6 Western blot 检测p-PI3K，PI3K，p-PKB，PKB 蛋白的表达称取心肌组织50mg，加入液氮研磨充分后加入ＲIPA 裂解液、蛋白酶抑制剂、蛋白磷酸酶抑制剂混合物，提取总蛋白，采用BCA 法进行蛋白定量至60 μg，加入4 × Loading buffer 后在100 ℃下热变性5 min，上样到10% 聚丙烯酰胺凝胶，120 V 电泳60 min，200 mA 恒流电转90 min，PVDF 膜湿转。5%脱脂奶粉室温下封闭PVDF 膜1h，1 × TBST 缓冲液置于摇床振荡清洗10 min，3 次，加入相应比例稀释的一抗( 目的基因p-PI3K，PI3K，p-PKB，PKB 为1 ∶ 1 000，内参β-actin 为1∶ 20 000) ，4 ℃下孵育过夜，清洗3 次后室温下孵育二抗1 h。FluorChem E 化学发光高灵敏凝胶成像仪拍照显色，分析条带灰度值。蛋白相对表达水平=目的条带灰度值/内参条带灰度值× 100%2． 7 统计学分析采用珋x ± s 表示，用SPSS25. 0 软件进行数据分析，通过单因素方差分析( one-wayANOVA) 比较各组数据，组间比较采用LSD 法。3 结果3． 1 CPhGs 对压力超负荷心肌肥厚大鼠的心脏超声指标的影响Tab 1 可见，与Con 组和Sham 组相比，Mod 组的LVPWT 显著增加，LVEDD、LVEF、LVFS 显著减小( P ＜ 0. 01) ; 与Mod 组相比，Vst 组和CPhGs 125、250、500 mg·kg － 1组大鼠的LVPWT减少，LVEDD、LVEF、LVFS 增加，CPhGs 组随着剂量的增加呈现改变逐渐明显的趋势，Vst 组及CPhGs250、500 mg·kg － 1组作用显著( P ＜ 0. 05 或P ＜0. 01) ; 与Vst 组相比，CPhGs 250、500 mg·kg － 1组各指标没有统计学差异。表明中、高剂量的CPhGs对压力超负荷心肌肥厚大鼠有保护作用，其作用与阳性药物相当。3． 2 CPhGs 对压力超负荷心肌肥厚大鼠的HWI的影响Tab 2 可见，各组大鼠的BW 没有明显差异; 与Con 组和Sham 组相比，Mod 组大鼠的HW 和HWI 显著相加( P ＜ 0. 01) ; 与Mod 组相比，Vst 组HW 和HWI 显著减小( P ＜ 0. 01) ，CPhGs 125、250、500 mg·kg － 1组( P ＜ 0. 05 或0. 01) HW 和HWI 有不同程度的减小，且随着剂量的增加呈现逐渐减小的趋势; 与Vst 组相比，CPhGs 500 mg·kg － 1组与其接近，差异无统计学意义。表明中、高剂量CPhGs可以减小压力超负荷心肌肥厚大鼠的心肌肥厚程度，保护心肌，与Vst 作用相当。3． 3 CPhGs 对压力超负荷心肌肥厚大鼠血浆BNP和ET-1 水平的影响Tab 3 可见，与Con 组和Sham组相比，Mod 组大鼠的血浆BNP 和ET-1 水平显著上升( P ＜ 0. 01) ; 与Mod 组相比，Vst 组大鼠的血浆BNP 和ET-1 水平显著下降( P ＜ 0. 01) ，CPhGs 125、250、500 mg·kg － 1组血浆BNP 和ET-1 水平有不同程度下降，并且随着剂量的增加呈现逐渐减小的趋势，其中CPhGs 250 组BNP 显著下降( P ＜ 0. 01) 、500 mg·kg － 1 组BNP 和ET-1 均显著下降( P ＜0. 01) ; 与Vst 组相比，CPhGs 500 mg·kg － 1组BNP和ET-1 水平降低，没有统计学差异。表明250、500mg·kg － 1中、高剂量的CPhGs 可以降低压力超负荷心肌肥厚大鼠的血浆BNP 和ET-1 水平，高剂量组作用强度与Vst 相当。3． 4 心肌组织病理学观察结果Fig 1 和Fig 2 可见，与Con 组和Sham 组相比，Mod 组心肌细胞排列紊乱，组织中可见炎性细胞浸润，单位视野内细胞核的数量减少，AMC 显著增大( P ＜ 0. 01) ; 与Mod 组相比，Vst 组单位视野内的细胞数量增加，AMC 显著减小( P ＜ 0. 01) ，CPhGs 125、250、500 mg·kg － 1组的AMC 也有不同程度减小，并且随着剂量的增加呈现逐渐减小的趋势，其中CPhGs 250、500 mg·kg － 1组较Mod 组有明显差异( P ＜ 0. 05 或0. 01) ; 与Vst 组相比，CPhGs 500 mg·kg － 1组AMC 与其接近，差异无统计学意义。表明中、高剂量CPhGs 在一定程度有减小压力超负荷型心肌肥厚大鼠AMC 的作用，当剂量达500 mg·kg － 1作用与Vst 接近。3． 5 CPhGs 对压力超负荷心肌肥厚大鼠心肌组织PI3K/PKB 通路相关蛋白表达的影响Fig 3 和Fig4 可见，与Con 组和Sham 组相比，Mod 组p-PI3K、p-PKB 蛋白的相对表达量显著降低( P ＜ 0. 01) ; 与Mod 组相比，Vst 组p-PI3K、p-PKB 蛋白的相对表达量显著升高( P ＜ 0. 01) ，CPhGs 125、250、500 mg·kg － 1组有不同程度升高，随着剂量的增加，p-PI3K、p-PKB 蛋白相对表达量呈逐步增加趋势，其中CPhGs 250、500 mg·kg － 1组较Mod 组有明显统计学意义( P ＜ 0. 01) ; 与Vst 组相比，CPhGs 500 mg·kg － 1组p-PI3K、p-PKB 蛋白的相对表达量与其接近，无明显差异。表明中、高剂量CPhGs 能够增加压力负荷型心肌肥厚大鼠心肌组织的p-PI3K、p-PKB 蛋白的相对表达量，高剂量组与Vst 的作用相当。4 讨论心肌肥厚作为高血压的主要并发症之一，同时也参与了慢性心衰、冠心病等心血管疾病的病理过程。在高血压前期，心肌通过增加心室壁张力从而适应增加的压力负荷，心肌细胞代偿性增大，导致左室心肌肥厚。心肌肥厚的抑制可以降低心血管疾病发病率及总死亡率，其作用优于单纯降压治疗［9］。因此，高血压的治疗方案不应局限于血压的控制，逆转心肌肥厚是治疗高血压的亟待解决的问题。肉苁蓉被列为德赢vwin登录 Cistanche tubulosaWight 干燥带鳞叶肉质茎。近年来，肉苁蓉以其显著的生物活性备受人们的关注，国内学者对肉苁蓉的心血管等方面的药理作用进行了较为深入的研究，发现肉苁蓉对心肌具有一定保护作用，但其具体的分子作用机制仍不清楚。研究表明［10］，CPhGs 能减轻自由基对心肌线粒体膜和浆网膜造成的损伤，降低丙二醛含量，减轻心肌超微结构损伤，提高大鼠心肌线粒体抗氧化酶活性，减少心肌梗死面积，提高心肌组织磷酸肌酸激酶活性，对缺血心肌有保护作用。本实验发现，CPhGs 可减小心肌肥厚大鼠的LVPWT、HWI、AMC 及心肌肥厚标志物ET-1、BNP水平，同时增加LVEDD、EF、FS，而抑制心肌肥厚，改善大鼠的心功能。随药物浓度增加，CPhGs 作用效果增加，呈现剂量依赖关系，其中CPhGs 中高剂量组肌肥厚大鼠有明显的保护作用，高剂量组与缬沙坦阳性药组作用相当。PI3K 是心肌细胞肥大和由收缩型向肥厚型转换的最后通路［11］，PI3K 的2 种亚型可参与心肌细胞肥大，其中pll0α 参与生理性心肌肥厚，而p110γ参与病理性心肌肥厚，小鼠敲除p110γ 后，对心肌病理性刺激可产生保护作用，对于心肌细胞肥大的发生、发展起着至关重要的作用［12］。PKB 途径与心肌细胞增殖、生长、代谢、凋亡等多种生物学活动密切相关［13］。叶芳杏等［14］报道玉郎伞单体17-甲氧基-7-羟基-苯并呋喃查尔酮可以通过调控心肌内皮细胞的p-PI3K、p-PKB、p-eNOS 等蛋白逆转大鼠压力超负荷心室的重构。杨洋等［15］报道，绿原酸可通过PI3K/PKB 通路调控细胞凋亡，抑制异丙肾上腺素诱导的心肌细胞肥大。本研究中，CPhGs 中、高剂量组显著增加p-PI3K、p-PKB 蛋白相对表达量，且CPhGs 高剂量组与Vst 组作用相当，进一步证明CPhGs 可以通过激活PI3K/PKB 信号通路，抑制压力超负荷大鼠心肌肥厚。综上，本研究证实CPhGs 对AAC 术后压力超负荷心肌肥厚大鼠有保护作用，可能与其增加PI3K、PKB 磷酸化而激活PI3K/PKB 信号通路有关。这为临床研究高血压心肌肥厚提供了新思路，可能为高血压心肌肥厚的防控和逆转提供了新的治疗药物。参考文献:［1］ Chahal N S，Lim T K，Jain P，et al． New insights into the relationshipof left ventricular geometry and left ventricular mass withcardiac function: A population study of hypertensive subjects［J］．Eur Heart J，2010，31( 5) : 588 － 94．［2］ McCullough P A，Chan C T，Weinhandl E D，et al． Intensive hemodialysis，left ventricular hypertrophy，and cardiovascular disease［J］． Am J Kidney Dis，2016，68( 5S1) : S5 － 14．［3］ 星学军，刁治民，许正泽． 药用植物肉苁蓉生物学特性及应用价值［J］． 青海草业，2018，27( 2) : 17 － 20，29．［3］ Xing X J，Diao Z M，Xu Z Z． Desert medicinal plants cistanchebiological characteristics and application value［J］． Qinghai Pratacult，2018，27( 2) : 17 － 20，29．［4］ 曾克武，廖理曦，万彦军，等． 基于靶点“钩钓”策略的肉苁蓉苯乙醇苷药理靶点鉴定及功效解析［J］． 中草药，2018，49( 1) : 173 － 8．［5］ 于倩． 蒙花苷和肉苁蓉苯乙醇苷对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究［D］． 吉林: 吉林大学，2017．［6］ 朱林强，周永焯，谢晓明，等． 大鼠腹主动脉缩窄术致大鼠慢性心衰的建模与体会［J］． 现代医院，2015，( 10) : 21 － 4．［7］ 施洋，樊官伟． 参附注射液对慢性充血性心力衰竭大鼠心肌miＲNA 表达谱的影响［J］． 中国药房，2017，28( 22) : 3048－ 52．［8］ 王建发，赵国安． 芍药苷通过cAMP-PKA 信号通路对心肌梗死大鼠保护作用的实验研究［J］． 中国循证心血管医学杂志，2018，10( 4) : 479 － 83．［9］ Okwuosa T M，Soliman E Z，Lopez F，et al． Left ventricular hypertrophyand cardiovascular disease risk prediction and reclassificationin blacks and whites: the Atherosclerosis Ｒisk in CommunitiesStudy［J］． Am Heart J，2015，169( 1) : 155 － 61．［10］ 吾买尔江·牙合甫，赵红琼，冯亮，等． 德赢vwin登录 醇提物对大鼠血液生化指标及心血管功能的影响［J］． 畜牧与饲料科学，2016，37( 6 － 7) : 16 － 20．［11］ Qian W，Yu D，Zhang J，et al． Wogonin attenuates isoprenalineinducedmyocardial hypertrophy in mice by suppressing the PI3K/Akt pathway［J］． Front Pharmacol，2018，9: 896．［12］ Shao M，Zhuo C，Jiang Ｒ，et al． Protective effect of hydrogen sulphideagainst myocardial hypertrophy in mice［J］． Oncotarget，2017，8( 14) : 22344 － 52．［13］ Song D，Liu X，Diao Y，et al． Hydrogen-rich solution against myocardialinjury and aquaporin expression via the PI3K/Akt signalingpathway during cardiopulmonary bypass in rats［J］． Mol MedＲep，2018，18( 2) : 1925 － 38．［14］ 叶芳杏，何俊慧，李梅兰，等． 玉郎伞MHBFC 调控eNOS-NO信号通路逆转大鼠心室重构的机制研究［J］． 中国药理学通报，2018，34( 11) : 1516 － 20．［15］ 杨洋，李觉． 绿原酸通过PI3K/Akt 信号通路抑制异丙肾上腺素诱导的心肌肥大［J］． 同济大学学报( 医学版) ，2019，40( 2) : 184 － 9．

摘要：目的　研究肉苁蓉苯乙醇总苷（ｐｈＧｓ）对庆大霉素诱导大鼠急性肾损伤的保护作用。方法　将５４只雄性ＳＤ大鼠随机分为１０ｄ、１５ｄ空白对照组（生理盐水１０ｍＬ／ｋｇ体质量），１０ｄ、１５ｄ模型组（生理盐水１０ｍＬ／ｋｇ体质量），１０ｄ、１５ｄｐｈＧｓ高剂量组（ｐｈＧｓ　５００ｍｇ／ｋｇ体质量），１０ｄ、１５ｄｐｈＧｓ低剂量组（ｐｈＧｓ　２５０ｍｇ／ｋｇ体质量）以及２１ｄ模拟临床治疗组（生理盐水１０ｍＬ／ｋｇ体质量），每组６只，除１０ｄ、１５ｄ空白对照组外其他各组大鼠连续１０ｄ腹腔注射庆大霉素（７５ｍｇ／ｋｇ体质量）建立急性肾损伤模型。各组实验结束后留取大鼠２４ｈ尿液并记录尿量，腹主动脉取血，取双侧肾脏并计算肾脏指数。采用全自动生化分析仪测定各组大鼠血清中肌酐（Ｓｃｒ）和尿素氮（ＢＵＮ）含量，采用生化试剂盒检测各组大鼠肾脏组织中丙二醛（ＭＤＡ）、超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）、过氧化氢酶（ＣＡＴ）、谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＳＨ－ＰＸ）表达量。结果　与空白对照组比较，１０ｄ、１５ｄ模型组大鼠血清Ｓｃｒ、ＢＵＮ、２４ｈ尿量及肾脏组织中ＭＤＡ 表达量均升高，肾脏组织中ＳＯＤ、ＣＡＴ、ＧＳＨ－ＰＸ酶的活性均降低，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０１）。与模型组比较，１０ｄ、１５ｄｐｈＧｓ高、低剂量组大鼠血清Ｓｃｒ、ＢＵＮ、２４ｈ尿量及肾脏组织中ＭＤＡ表达量均降低，肾脏组织中ＳＯＤ、ＣＡＴ、ＧＳＨ－ＰＸ酶的活性均升高，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０５）。结论　肉苁蓉苯乙醇总苷对庆大霉素诱导的大鼠急性肾损伤具有一定保护作用。关键词：肉苁蓉；苯乙醇总苷；庆大霉素；急性肾损伤急性肾损伤（ａｃｕｔｅ　ｋｉｄｎｅｙ　ｉｎｊｕｒｙ，ＡＫＩ）是各种原因引起的肾脏滤过功能突然快速下降或丧失的临床综合征［１］。目前ＡＫＩ的发病率呈逐年上升趋势，其病因多样并能够导致多种并发症，临床治疗的干预手段十分有限［２，３］。研究发现连续接受氨基糖苷类抗生素治疗是ＡＫＩ的独立危险因素［４］，其诱发机制与药物介导的自由基产生、磷脂沉积、肾血流减少及局部炎症有关［５］。临床多采用治疗药物监测技术手段治疗氨基糖苷类抗生素诱导的急性肾功能损伤，但无法从根源上改善或逆转由该类抗生素所产生的肾脏损伤风险［６］。早期干预氨基糖苷类抗生素的肾毒性是目前氨基糖苷类抗生素合理应用研究中的热点。中药肉苁蓉（Ｃｉｓｔａｎｃｈｅｓ　Ｈｅｒｂａ）为列当科Ｏｒｏｂａｎｃｈａｃｅａｅ肉苁蓉属Ｃｉｓｔａｎｃｈｅｓ植物干燥带鳞叶的肉质茎，具有补肾阳、益精血等功效［７］，其性温，味甘，归肾经。苯乙醇总苷是肉苁蓉中主要化学成分，能够增加血清超氧化物歧化酶的活性，抑制丙二醛表达，增强机体对氧自由基的清除能力，减少体内自由基累积，发挥保护机体免受过氧化损伤功效［８］。本研究采用庆大霉素构建大鼠急性肾损伤模型，探究肉苁蓉苯乙醇总苷对庆大霉素诱导急性肾损伤的防治作用，现报道如下。１　材料与方法１．１　实验动物　ＳＤ大鼠５４只，雄性，体质量（２００±２０）ｇ，购于新疆医科大学动物实验中心，动物生产许可证号：ＳＣＸＫ（新）２０１６－０００３，所有动物饲养于新疆医科大学动物实验中心ＳＰＦ屏障环境，使用许可证号：ＳＹＸＫ（新）２０１６－０００２，环境温度２４～２６℃，恒温恒湿，相对湿度在４０％～７０％，大鼠自由进食和饮水。１．２　试药　肉苁蓉苯乙醇总苷（本课题组从德赢vwin登录 中富集纯化而得，苯乙醇总苷含量达８９．５％，松果菊苷含量大于４０％，毛蕊花糖苷含量大于１６．０％），硫酸庆大霉素注射液（河南辅仁怀庆堂制药有限公司，批号１６１２２４１１），丙二醛（ＭＤＡ）检测试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号ＶＡＡＡＫ６Ｓ２８６），超氧化岐化酶（ＳＯＤ）检测试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号ＷＳＨ２７ＳＳ９ＧＢ），过氧化氢酶（ＣＡＴ）检测试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号ＦＧＳ３Ｊ６６Ｄ２Ｋ），谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＳＨ－ＰＸ）检测试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号ＤＫ８Ａ６２２ＸＺＰ），ＢＣＡ 蛋白定量试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号２０１９０６２２）。１．３　实验仪器　ＴＤ５０００２Ａ型电子天平（余姚市金诺天平仪器有限公司），Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ全波长酶标仪（美国Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ公司），ＢＳ－３２０型全自动生化分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司），Ｂｉｏｆｕｇｅｐｒｉｍｏ台式冷冻离心机（美国Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ公司）。１．４　造模、分组及给药方法　５４只雄性ＳＤ大鼠适应性喂养１周后，随机分为１０ｄ、１５ｄ空白对照组，１０ｄ、１５ｄ模型组，１０ｄ、１５ｄ肉苁蓉苯乙醇总苷高剂量组，１０ｄ、１５ｄ肉苁蓉苯乙醇总苷低剂量组、以及２１ｄ模拟临床治疗组，每组６只。除１０ｄ、１５ｄ空白对照组外其他各组大鼠连续１０ｄ腹腔注射庆大霉素（７５ｍｇ／ｋｇ体质量）建立急性肾损伤模型。给药方法：（１）１０ｄ、１５ｄ空白对照组大鼠分别给予生理盐水（１０ｍＬ／ｋｇ体质量）腹腔注射与灌胃至１０ｄ与１５ｄ；（２）１０ｄ、１５ｄ模型组大鼠造模同时分别给予生理盐水（１０ｍＬ／ｋｇ体质量）灌胃至１０ｄ与１５ｄ；（３）１０ｄ、１５ｄ高剂量组大鼠每日造模同时分别给予肉苁蓉苯乙醇总苷（５００ｍｇ／ｋｇ体质量）灌胃至１０ｄ与１５ｄ；（４）１０ｄ、１５ｄ低剂量组大鼠每日造模同时分别给予肉苁蓉苯乙醇总苷（２５０ｍｇ／ｋｇ体质量）灌胃至１０ｄ与１５ｄ；（５）２１ｄ模拟临床组大鼠造模同时给予生理盐水（１０ｍＬ／ｋｇ体质量）灌胃至２１ｄ。大鼠每周称重，根据体质量调整药物用量。１．５　标本采集　各组大鼠第１０ｄ、１５ｄ和２１ｄ收集２４ｈ尿液（动物于前一天放入代谢笼中，每个代谢笼放１只动物，２４ｈ后取出），４℃，３　０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，收集上清液－２０℃冻存，备用。实验结束后各组大鼠禁食不禁水，腹腔注射１０％水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，室温静置１ｈ后４℃，３　５００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，取上层淡黄色澄清液体分装，－２０℃冻存，备用。将各组大鼠麻醉，充分暴露腹腔，用止血钳固定双侧肾组织远心端和近心端的动静脉，剪开肾静脉后经腹主动脉注入４℃等渗生理盐水，灌注至肾脏颜色转为苍白，快速取出双侧肾置于滤纸上吸干水分后称重，计算脏器指数。取大鼠新鲜右肾皮质部分０．４ｇ，按１∶９加入预冷后的生理盐水，低温环境下制成１０％肾组织匀浆，冻存，备用。脏器指数计算公式如下：肾脏指数＝双侧肾质量×１０３／大鼠体质量。１．６　大鼠血清肌酐和尿素氮水平的检测　取待测血清样本置于全自动生化分析仪测定，按试剂盒说明操作测定大鼠血清中肌酐和尿素氮含量。１．７　大鼠肾脏组织ＳＯＤ、ＣＡＴ、ＧＳＨ－ＰＸ、ＭＤＡ的检测　取大鼠肾脏匀浆液室温放置融化，４℃，３　０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，收集上清液，采用ＢＣＡ试剂盒检测各组大鼠肾脏组织蛋白浓度。按照试剂盒说明操作测定肾组织中超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）、过氧化氢酶（ＣＡＴ）谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＳＨ－ＰＸ）活性和丙二醛（ＭＤＡ）含量。１．８　统计学处理　采用ＳＰＳＳ　２１．０统计软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（－ｘ ±ｓ）表示，两组组间比较采用ｔ检验，检验水准α＝０．０５。２　结果２．１　肉苁蓉苯乙醇总苷对各组大鼠体质量、肾指数和２４ｈ尿量的影响　造模前各组大鼠体质量差异无统计学意义（Ｐ ＞０．０５）。造模后，与空白对照组比较，各模型组大鼠体质量降低，肾指数和２４ｈ尿量升高，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０１）；与模型组比较，１０ｄ、１５ｄ肉苁蓉苯乙醇总苷高、低剂量组大鼠体质量升高，肾指数和２４ｈ尿量降低，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０５）；模拟临床组大鼠体质量升高，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０５），肾指数和２４ｈ尿量差异无统计学意义（Ｐ ＞０．０５），见表１。２．２　肉苁蓉苯乙醇总苷对各组大鼠血清肌酐含量的影响　与空白对照组比较，各模型组大鼠血清肌酐含量升高，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０１）；与模型组比较，１０ｄ、１５ｄ肉苁蓉苯乙醇总苷高、低剂量组大鼠血清肌酐含量降低，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０５）；模拟临床组大鼠血清肌酐含量差异无统计学意义（Ｐ ＞０．０５），见表２。２．３　肉苁蓉苯乙醇总苷对各组大鼠血清尿素氮含量的影响　与空白对照组比较，各模型组大鼠血清尿素氮含量升高，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０１）；与模型组比较，１０ｄ、１５ｄ肉苁蓉苯乙醇总苷高、低剂量组大鼠血清尿素氮含量均降低，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０１）；模拟临床组大鼠血清尿素氮含量差异无统计学意义（Ｐ ＞０．０５），见表３。２．４　肉苁蓉苯乙醇总苷对各组大鼠肾组织中ＳＯＤ活力的影响　与空白对照组比较，各模型组大鼠肾组织中ＳＯＤ活力降低，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０１）；与模型组相比较，１０ｄ、１５ｄ肉苁蓉苯乙醇总苷高、低剂量组大鼠肾组织中ＳＯＤ活力升高，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０１）；模拟临床组大鼠肾组织中ＳＯＤ活力升高，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０１），见表４。２．５　肉苁蓉苯乙醇总苷对各组大鼠肾组织中ＣＡＴ活力的影响　与空白对照组比较，各模型组大鼠肾组织中ＣＡＴ活力降低，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０１）；与模型组相比较，１０ｄ、１５ｄ肉苁蓉苯乙醇总苷高、低剂量组大鼠肾组织中ＣＡＴ活力升高，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０１）；模拟临床组大鼠肾组织中ＣＡＴ活力无统计学意义（Ｐ ＞０．０５），见表５。２．６　肉苁蓉苯乙醇总苷对各组大鼠肾组织中ＧＳＨＰＸ活力的影响　与空白对照组比较，各模型组大鼠肾组织中ＧＳＨ－ＰＸ活力降低，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０１）；与模型组相比较，１０ｄ、１５ｄ肉苁蓉苯乙醇总苷高、低剂量组大鼠肾组织中ＧＳＨ－ＰＸ活力升高，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０５）；模拟临床组大鼠肾组织中ＧＳＨ－ＰＸ 活力无统计学意义（Ｐ ＞０．０５），见表６。２．７　肉苁蓉苯乙醇总苷对各组大鼠肾组织中ＭＤＡ含量的影响　与空白对照组比较，各模型组大鼠肾组织中ＭＤＡ含量升高，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０１）；与模型组相比较，１０ｄ、１５ｄ肉苁蓉苯乙醇总苷高、低剂量组大鼠肾组织中ＭＤＡ含量降低，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０１）。模拟临床组大鼠肾组织中ＭＤＡ含量差异无统计学意义（Ｐ ＞０．０５），见表７。３　讨论氨基糖苷类抗生素常见严重不良反应是肾毒性［９］。该类药物极易以原型药物通过肾小球滤过，部分药物分泌入尿液，而绝大部分药物选择性蓄积在肾皮质，使得在该部位的浓度高于血清中药物浓度几倍［１０］，这种药物蓄积不可避免的造成细胞损伤及肾功能下降。长期以来，临床上对氨基糖苷类药物引起的ＡＫＩ始终沿袭停药、常规补液的对症支持治疗原则，静待肾脏病变自身的转归，目前尚无其他药物可以减轻氨基糖苷类药物对肾组织的损伤。因此本研究设立了２１ｄ模拟临床治疗组，尽可能模拟临床常规治疗及机体康复过程，以便进一步客观考察肉苁蓉苯乙醇总苷的治疗效果。在临床治疗中，Ｓｃｒ和ＢＵＮ常作为评价肾功能的指标，Ｓｃｒ和ＢＵＮ水平越高则反映肾功能损伤越严重［１１］。本研究通过大鼠连续１０ｄ腹腔注射庆大霉素７５ｍｇ／ｋｇ建立ＡＫＩ模型，与空白对照组相比，模型组大鼠Ｓｃｒ和ＢＵＮ水平升高，提示造模成功。经过肉苁蓉苯乙醇总苷干预１０ｄ、１５ｄ后，各给药组大鼠Ｓｃｒ和ＢＵＮ下降，表明肉苁蓉苯乙醇总苷对庆大霉素所致ＡＫＩ具有良好的改善作用。研究发现，活性氧簇（ＲＯＳ）的增加在庆大霉素引起的肾小管损伤的病理过程中扮演着重要的角色［１２］。ＭＤＡ是反应机体内ＲＯＳ水平的主要物质之一［１３－１４］，生物体内抵抗ＲＯＳ的抗氧化剂（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ）防御系统包括主要包括ＳＯＤ、ＣＡＴ、ＧＳＨＰＸ等。苯乙醇总苷作为肉苁蓉主要有效成分，能够在动物体内发挥显著的抗氧化活性［１５］。肉苁蓉苯乙醇总苷干预后，给药组大鼠肾脏组织ＭＤＡ 含量则明显降低，ＳＯＤ、ＣＡＴ和ＧＳＨ－ＰＸ活性明显升高，提示肉苁蓉苯乙醇总苷能够改善肾脏氧化应激损伤状况并减轻肾脏损伤。综上所述，肉苁蓉苯乙醇总苷对庆大霉素诱导的急性肾损伤具有保护作用，通过抑制自由基产生和激活自由基清除酶发挥抗氧化作用，改善机体氧化应激状态，增强机体抗氧化能力，减轻肾脏损伤。参考文献：［１］　李明，刘勇强，敖华，等．葛根素减轻庆大霉素诱导的大鼠急性肾损伤［Ｊ］．中国实验方剂学杂志，２０１７，２３（１７）：１７７－１８２．［２］　雷莹，聂晟，孙丹华，等．中国危重症住院患者急性肾损伤的流行病学分析［Ｊ］．南方医科大学学报，２０１６，３６（６）：７４４－７５０．［３］　于乐成，何长伦．肝硬化住院患者急性肾损伤（ＡＫＩ）与病死率及并发症的相关性［Ｊ］．肝脏，２０１３，１８（１１）：４２－４７．［４］　ＫＩＳＨＯＲＥ　Ｂ　Ｋ，ＬＡＭＢＲＩＣＨＴ　Ｐ，ＩＢＲＡＨＩＭ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆ　ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｎｅｐｈｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｉｎ　ｒａｔｓ　ｂｙ　ｐｏｌｙａｎｉｏｎｉｃｐｅｐｔｉｄｅｓ［Ｊ］．Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ　Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，２０１５，８３（８３）：１９１－２０１．［５］　ＡＮ　Ｃ　Ｎ，ＰＵ　Ｘ　Ｐ，ＷＡＮＧ　Ｑ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｉｓｔａｎｃｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓｔｈｅ　ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｈｙｄｒｏｇｅｎ　ｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｉｎ　ｎｅｗｍｕｔａｎｔ　ＤＪ－１－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｍｏｄｅｌｓ［Ｊ］．Ｂｒａｉｎ　Ｂｅｈａｖｉｏｒ，２０１９，９（７）：１－７．［６］　ＫＡＲＡ　Ａ，ＣＥＴＩＮ　Ｈ，ＯＫＴＥＭ　Ｆ，ｅｔ　ａｌ．Ａｍｉｋａｃｉｎ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｒｅｎａｌｄａｍａｇｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ　ｏｎ　ｎｅｏｎａｔａｌ　ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｒｅｎ　Ｆａｉｌ，２０１６，３８（５）：６７１－６７７．［７］　曹丹丹，杨建华，胡君萍．肉苁蓉苯乙醇苷纳米乳鼻腔给药的安全性评价［Ｊ］．新疆医科大学学报，２０１８，４１（１１）：１４１１－１４１５．［８］　居博伟，杨建华，闫瑶，等．肉苁蓉苯乙醇总苷对Ａβ＿（１－４２）诱导的ＰＣ１２细胞损伤的保护作用［Ｊ］．新疆医科大学学报，２０１７，４０（５）：８４－８７．［９］　许桓，唐春雷，范为正．氨基糖苷类抗生素的研究进展［Ｊ］．中国新药杂志，２０１９，２８（１５）：１８２８－１８３３．［１０］　ＫＡＨＹＡ　Ｖ，ＯＺＵＣＥＲ　Ｂ，ＤＯＧＡＮ　Ｒ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅｅｘｔｒａｃｔ：ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｐｒｏｔｅｃｔｏｒ　ａｇａｉｎｓｔ　ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅｏｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ［Ｊ］．Ｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ　Ｏｔｏｌｏｇｙ，２０１４，１２８（１）：４３－４８．［１１］　付玉华，菅建国．血尿素氮、血肌酐与血清胱抑素Ｃ联合检测对肾功能损害程度的诊断价值研究［Ｊ］．中国疗养医学，２０１７，２６（５）：４６６－４６８．［１２］　ＺＨＡＮＧ　Ｌ，ＳＵＮ　Ｄ，ＢＡＯ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．Ｎｅｒｏｌｉｄｏｌ　Ｐｐｒｏｔｅｃｔｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ＬＰＳ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｃｕｔｅ　ｋｉｄｎｅｙ　ｉｎｊｕｒｙ　ｖｉａ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ＴＬＲ４／ＮＦ－κＢ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１７，３１（３）：４５９－４６５．［１３］　夏莉莉，汤瑜斌，邵侃．前列地尔对糖尿病肾病患者血液流变学、免疫功能及ＭＤＡ、ＳＯＤ、ＲＯＳ的影响［Ｊ］．海南医学院学报，２０１６，２２（１４）：１５２８－１５３１．［１４］　徐小惠，范氏泰，韦晓洁，等．杨桃根总提取物对糖尿病小鼠肾功能及其抗氧化应激作用的研究［Ｊ］．中国药理学通报，２０１７，３３（１）：９５－１００．［１５］　薛海燕，焦婵媛，姚军．肉苁蓉总苷药理作用的研究现状［Ｊ］．中国临床药理学杂志，２０１８，３４（４）：４８６－４８８

摘要：目的　分析我国肉苁蓉保健食品的注册现状以及肉苁蓉及肉苁蓉保健食品相关专利的分布特点，为新的保健食品的研发提供参考。方法　收集国家药品监督管理局网站公布的肉苁蓉保健食品信息和国家知识产权局公开的肉苁蓉相关专利信息，以Ｅｘｃｅｌ软件、ａｎａｃｏｎｄａ３＋ｐｙｃｈａｒｍ环境下的Ａｐｒｉｏｒｉ关联规则算法和国家知识产权局政务服务（ＳＩＰＯ）平台对产品开发情况和专利分布特点进行分析。结果　肉苁蓉保健食品数量少，保健功能结构不均衡，特点不突出，还有很大的挖掘空间。肉苁蓉在医药和保健领域的应用以助消化药和强筋健骨为主。在保健食品领域的应用研究呈上升趋势，２０１２年开始有较为明显的提升，涉及的保健功能同现有保健食品一样，以缓解体力疲劳和增强免疫力占比最大，并涉及抗氧化、通便和辅助改善记忆等１５种保健功能。结论　肉苁蓉保健食品的研发除了以传统用药为依据，还应充分参考现代药理学和药物化学研究结果，突出肉苁蓉的特点，以获得功效成分明确、安全可靠和质量可控的保健食品。关键词：肉苁蓉；保健食品；专利肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉（Ｃｉｓｔａｎｃｈｅ　ｄｅｓｅｒｔｉｃｏｌａ　Ｙ．Ｃ．Ｍａ）或德赢vwin登录 ［Ｃｉｓｔａｎｃｈｅ　ｔｕｂｕｌｏｓａ（Ｓｃｈｒｅｎｋ）Ｗｉｇｈｔ］干燥带鳞叶的肉质茎［１］，主产于内蒙古和新疆等地，是著名的补益中药，“主五劳七伤，补中，除茎中寒热痛，养五脏，强阴，益精气，多子，妇人症瘕，久服轻身”，其食用历史可追溯到南北朝时期，现今新疆居民仍常以肉苁蓉炖肉、烹汤，这种饮食习惯也被认为是新疆南疆地区老人长寿的原因之一。现代药理学研究表明，肉苁蓉具有抗疲劳、抗衰老、抗氧化、增强免疫力、保护神经和润肠通便等多种生物活性［２－１８］，适用于保健食品的开发。为了vwin.com 保健食品的开发及专利研究现状，笔者检索国家药品监督管理局网站公布的以肉苁蓉为原料的保健食品信息，对产品的配方类型、剂型、保健功能、归属和组方规律等进行分析，同时，检索国家知识产权局公开的肉苁蓉及肉苁蓉保健食品的相关专利信息，对专利分布特点进行分析，为肉苁蓉保健食品的开发及其在医药和保健领域的应用拓展提供参考。１　资料与方法１．１　肉苁蓉保健食品分析　以国家药品监督管理局网站已公布的保健食品信息为数据来源，以“肉苁蓉”为关键词进行检索，收集已批准的保健食品数据，截止时间为２０１９年６月１日。采用Ｅｘｃｅｌ软件和ａｎａｃｏｎｄａ３＋ｐｙｃｈａｒｍ环境下的Ａｐｒｉｏｒｉ关联规则算法进行统计分析和数据挖掘，获得产品配方类型、剂型、保健功能、归属、配伍原料、标志性成分和组方规律。１．２　肉苁蓉相关专利分析　以国家知识产权局政务服务（ＳＩＰＯ）平台公开的专利信息为数据来源，以“肉苁蓉”为关键词进行检索，并以“肉苁蓉”和“保健食品”为关键词进行复合检索，截止时间为２０１９年６月１日。采用Ｅｘｃｅｌ软件和ＳＩＰＯ平台进行统计分析，获得专利技术主题、年度专利申请量、申请人和涉及保健功能的分布规律。２　结果与分析２．１　肉苁蓉相关保健食品的一般情况分析２．１．１　开发现状　以肉苁蓉或肉苁蓉提取物为原料的保健食品共有４７个，其中国产４５个，进口２个。２．１．２　配方类型　４７个保健食品中以植物药为原料的有１８个，以植物药和动物药为原料的有１６个，以植物药和真菌为原料的有１０个，以植物药、动物药和真菌为原料的有１个，以植物药和营养强化剂为原料的有１个，以植物药、动物药和矿物药为原料的有１个。２．１．３　剂型　４７个保健食品涉及酒剂、胶囊剂、片剂、茶剂、颗粒剂和口服液６种剂型，其中酒剂的占比最高，达４２．５５％，其次是胶囊剂和片剂，见表１。２．１．４　保健功能　４７个保健食品中有１种保健功能的产品有３３个（７０．２１％），有２种保健功能的产品有１４个（２９．７９％）。产品的保健功能涉及缓解体力疲劳、增强免疫力、抗氧化（原为：延缓衰老）和改善胃肠道功能等７种，其中缓解体力疲劳和增强免疫力的比重占７８．６９％，见表２。　注：改善胃肠道功能的描述已不符合现有２７种保健功能描述。２．１．５　标志性成分　除去９个未显示标志性成分信息的保健食品，其余３８个保健食品的标志性成分以总皂苷、粗多糖和总黄酮为主，出现频次均高于１０次，肉苁蓉的特征成分松果菊苷和毛蕊花糖苷的出现频次仅为６和４次，见表３。２．２　肉苁蓉相关保健食品的组方规律分析２．２．１　常用原料使用频次分析　４７个保健食品配方共涉及１０４种原料（除制剂所需辅料外），肉苁蓉使用频次为４４，德赢vwin登录 使用频次为３，其他原料使用频次≥４的共有２４种，其中枸杞、人参和淫羊藿的使用频次均＞１０，见表４。２．２．２　基于Ａｐｒｉｏｒｉ关联规则的组方规律分析　建立ａｎａｃｏｎｄａ３＋ｐｙｃｈａｒｍ环境下的Ａｐｒｉｏｒｉ关联规则，采用支持度０．３、置信度０．７进行计算，挖掘占比最高的缓解体力疲劳和增强免疫力的保健食品组方规律［１９－２０］。缓解体力疲劳产品常用的药物组合为肉苁蓉和刺五加，其余组合出现频次均为１，挖掘关联性获得５条规则，见表５。增强免疫力保健食品常用药物组合为：（１）灵芝、红景天、沙棘；（２）灵芝、红景天、沙棘、肉苁蓉；（３）灵芝、红景天，其余组合出现频次均为１，挖掘关联性获得１条规则（枸杞→肉苁蓉，置信度为０．９１６　６６６　６６７）。２．３　已公开的发明专利特点分析２．３．１　肉苁蓉相关专利技术主题　以“肉苁蓉”为关键词进行检索，共有专利９　８４０件。分析国际专利（ＩＰＣ）分类情况，有８　３３９件涉及Ａ６１Ｋ（医用、牙科用或梳妆用的配制品），占比最大，另有９８５件涉及Ｃ１２Ｇ（果汁酒；其他含酒精饮料；其制备）。肉苁蓉在医药和保健领域的应用以助消化药和强筋健骨等为主，在强肾、性腺疾病或促进生育等方面也占一定比重，见表５。分析２０１０～２０１９年肉苁蓉相关专利的ＩＰＣ分类年度分布情况（排除分布时间为１９９６～２００５年的Ａ６１Ｋ３５／７８），除Ａ６１Ｋ３５／５６外，各ＩＰＣ分类发展总体趋势相似，２０１６年前均有明显上升趋势，之后有所回落（２０１９年数据为６月１日之前，仅供参考，不代表最终趋势）。Ａ６１Ｐ１／１４和Ａ６１Ｋ３５／３２在各年度始终位于前列，但是２０１０～２０１６年增长幅度最大的是Ａ６１Ｐ２９／００，其次是Ａ６１Ｐ１／１４ 和Ａ６１Ｐ１３／１２，见表６和表７。２．３．２　肉苁蓉保健食品相关专利年度申请量　以“肉苁蓉”和“保健食品”为关键词进行复合检索，共有专利１７３件，其中授权专利３０件。１９９５～１９９９年申请数量分别为１，２，３，１和２件，２００２～２０１８年分别为１，１，３，２，４，７，７，７，３，７，１２，１２，２６，１７，２１，１９和１５件。分析专利申请量年度分布情况，总体呈上升趋势，可分为３个阶段，２００７年以前申请量均≤４，２００７～２０１１年开始有所提升，２０１２年之后有较为明显的提升，２０１４年最高，有２６件。２．３．３　肉苁蓉保健食品相关专利申请人分布情况　１７３件专利中个人申请的有７７件，企业和大学等团体申请的有９６件。团体中以江苏康缘药业股份有限公司的申请量最高，达１２件，其次为杏辉天力（杭州）药业有限公司，为５件，合肥康龄养生科技有限公司、青岛铭晨信息技术有限公司各申请３件，无限极（中国）有限公司为代表的５个团体各申请２件，其余６３个团体的申请量均为１件（申请人为２人以上的，以第一申请人做统计），见表８。２．３．４　肉苁蓉保健食品相关专利保健功能分布　１７３件专利所述保健功能不完全符合保健食品的保健功能描述要求，依照描述分别进行归纳，比如，补肾壮阳、增强体力和消除疲劳等纳入缓解体力疲劳，增强体质和恢复机体正常的免疫功能纳入增强免疫力。结果，共涉及缓解体力疲劳、增强免疫力、抗氧化、通便、辅助改善记忆和辅助降血脂等共１５种保健功能，比已批准保健食品更丰富，占比最大的是缓解体力疲劳、增强免疫力和抗氧化，见表９。３　结论４７个肉苁蓉相关保健食品中仅有１个是中药配伍营养强化剂，其余均是中药配伍。剂型以酒剂为主，占近１／２，且该剂型几乎全部涉及缓解体力疲劳和增强免疫力，这２个保健功能在４７个保健食品中也占绝对优势（７８．６９％）。总体而言，肉苁蓉相关保健食品的剂型和保健功能覆盖面相对较广，但结构不均衡。４７个保健食品共涉及１０４种原料，由原料使用频次、常用药物组合及药物间组合的关联规则可知，肉苁蓉主要与枸杞、人参、淫羊藿和大枣等保健食品常用原料配伍，而且产品的标志性成分也是这些原料的主要活性成分（总皂苷、粗多糖和总黄酮），肉苁蓉的特征成分松果菊苷和麦角甾苷则较少，说明肉苁蓉的特点在现有保健食品中并不突出。近１０年的肉苁蓉相关专利在医药和保健领域的应用以助消化和强筋健骨等为主，并且始终处于领先位置，但是２０１０～２０１６年增长幅度最大的是非中枢性止痛剂、退热药或抗炎剂，其次是助消化药和用于肾脏的组合物或制剂。对肉苁蓉相关专利涉及的保健功能进行归纳，结果显示，以缓解体力疲劳、增强免疫力和抗氧化占比最大，并包含通便、辅助改善记忆、辅助降血脂、辅助降血糖、改善睡眠、缓解视疲劳和增加骨密度等共１５种保健功能，比国家药品监督管理局公布的保健食品更丰富，可为丰富肉苁蓉产品、拓宽其应用领域提供参考。肉苁蓉在保健食品领域的应用研究自１９９５年开始呈上升趋势，尤其是２０１２年开始提升较为明显，并且维持在相对稳定的水平，一定程度上反映了各界对肉苁蓉在保健食品领域的应用有越来越多的关注。专利申请量位居前３的地域是江苏省、安徽省和北京市。内蒙古和新疆作为肉苁蓉的主产地，在专利申请量上却并无优势，这与两地肉苁蓉产品以原料为主有一定关系。然而，肉苁蓉产业是内蒙古和新疆发展的重要生态经济型产业之一，随着种植规模的不断扩大，逐渐显现出供需失衡的问题。因此，两地还需加大力度，研发功效成分明确、安全可靠、质量可控的保健食品，丰富肉苁蓉产品，优化产业结构，推动产业发展的核心模块———下游深加工业的发展，形成上下游产业的良性互动，保证产业长足发展。参考文献：［１］　国家药典委员会．中国药典：２０１５年版：—部［Ｓ］．北京：中国医药科技出版社，２０１５：１３５．［２］　Ｒｕｎ－Ｌａｎ　Ｃａｉ，Ｍｅｉ－Ｈｕａ　Ｙａｎｇ，Ｙｕｅ　Ｓｈｉ，ｅｔ　ａｌ．Ａｎｔｉｆａｔｉｇｕｅａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｐｈｅｎｙｌｅｔｈａｎｏｉｄ－ｒｉｃｈ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｆｒｏｍ　Ｃｉｓｔａｎｃｈｅｄｅｓｅｒｔｉｃｏｌａ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ　Ｒｅｓ，２０１０，２４（２）：３１３－３１５．［３］　Ｚｗｅ－Ｌｉｎｇ　Ｋｏｎｇ，Ａｔｈｉｒａ　Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｆａｎ－Ｃｈｉ　Ｋｏ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｃｉｓｔａｎｃｈｅ　ｔｕｂｕｌｏｓａ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｏｎ　ｍａｌｅ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ－ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｄｉａｂｅｔｉｃｒａｔｓ［Ｊ］．Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ，２０１８，１０（１０）：１５６２．［４］　Ｎｉｎｇｑｕｎ　Ｗａｎｇ，Ｓｈａｏｚｈｅｎ　Ｊｉ，Ｈａｏ　Ｚｈａｎｇ，ｅｔ　ａｌ．Ｈｅｒｂａｃｉｓｔａｎｃｈｅｓ：ａｎｔｉ－ａｇｉｎｇ［Ｊ］．Ａｇｉｎｇ　Ｄｉｓ，２０１７，８（６）：７４０－７５９．［５］　Ｘｉａｏｍｉｎｇ　Ｗａｎｇ，Ｊｉｎｆａｎｇ　Ｗａｎｇ，Ｈｕａｎｙｕ　Ｇｕａｎ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｐｒｏｆｉｌｅｓ　ａｎｄ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｄｅｆｆｅｒｅｎｔ　ｐａｒｔｓ　ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ　Ｃｉｓｔａｎｃｈｅ　ｄｅｓｅｒｔｉｃｏｌａｕｓｉｎｇ　ｕｌｔｒａ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅｔｉｍｅ－ｏｆ－ｆｌｉｇｈｔ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ　ａｎｄ　ａ　１，１－ｄｉｐｈｅｎｙｌ－２－ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ－ｂａｓｅｄ　ａｓｓａｙ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１７，２２（１１）：２０１１．［６］　Ｌｉｗｅｉ　Ｄｏｎｇ，Ｄｅｂｉｎ　Ｙｕ，Ｎｕｏｔｉｎｇ　Ｗｕ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｃｈｉｎａｃｏｓｉｄｅｉｎｄｕｃｅｓ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ＳＷ４８０ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ＤＮＡ　ｄａｍａｇｅｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ　ＪＭｏｌ　Ｓｃｉ，２０１５，１６（７）：１４６５５－１４６６８．［７］　高云佳，姜勇，戴昉，等．肉苁蓉润肠通便的药效物质研究［Ｊ］．中国现代中药，２０１５，１７（４）：３０７－３１０，３１４．［８］　唐凤娟，李青云．松果菊苷药理学作用的新进展［Ｊ］．疑难病杂志，２０１６，１５（１２）：１３００－１３０８．［９］　王丽超，刘丹，姜勇，等．基于分子亲和色谱技术的肉苁蓉低分子糖巨噬细胞激活作用靶点群鉴定与机制分析［Ｊ］．中国中药杂志，２０１７，４２（１９）：３６６６－３６７１．［１０］张雨荷，王丽超，屠鹏飞，等．肉苁蓉低分子糖对巨噬细胞激活作用的研究［Ｊ］．中国中药杂志，２０１７，４２（２１）：４２０７－４２１０．［１１］王翔岩．肉苁蓉多糖的免疫调节活性及吸收特性研究［Ｄ］．北京：北京协和医学院，２００９．［１２］曾群力，郑一凡，吕志良．肉苁蓉多糖的免疫活性作用及机制［Ｊ］．浙江大学学报：医学版，２００２，３１（４）：２８４－２８７．［１３］姚金茜，王学敏，鞠静，等．肉苁蓉多糖对气管切开插管留置大鼠肺部免疫功能的干预作用［Ｊ］．时珍国医国药，２０１９，３０（２）：２７５－２７７．［１４］由淑萍，赵军，马龙，等．肉苁蓉乙醇提取物抗大鼠免疫性肝纤维化的作用及其机制［Ｊ］．中国药理学与毒理学杂志，２０１６，３０（５）：５０４－５１０．［１５］蒋晓燕，王晓雯，商小英，等．肉苁蓉总苷对照射损伤小鼠敏感器官超微结构的保护作用［Ｊ］．西北药学杂志，２００１，１６（２）：６３－６４．［１６］Ｘｉｎｇｃｈａｏ　Ｇｅｎｇ，Ｘｕｅｆｅｉ　Ｔｉａｎ，Ｐｅｎｇｆｅｉ　Ｔｕ，ｅｔ　ａｌ．Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｅｃｈｉｎａｃｏｓｉｄｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｏｕｓｅ　ＭＰＴＰｍｏｄｅｌ　ｏｆ　Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ′ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｅｕｒ　Ｊ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００７，５６４（１－３）：６６－７４．［１７］Ｚｈｉｍｉｎｇ　Ｌｉ，Ｈｕｉｎｕａｎ　Ｌｉｎ，Ｌｏｎｇ　Ｇｕ，ｅｔ　ａｌ．ＨｅｒｂａＣｉｓｔａｎｃｈｅ（Ｒｏｕ　Ｃｏｎｇ－Ｒｏｎｇ）：ｏｎｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　ｇｉｆｔｓ　ｏｆ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ［Ｊ］．ＦｒｏｎｔＰｈａｒｍａｃｏｌ，２０１６，７：４１．［１８］高云佳，姜勇，戴昉，等．肉苁蓉润肠通便的药效物质研究［Ｊ］．中国现代中药，２０１５，１７（４）：３０７－３１４．［１９］白银双，谌松霖，崔宇，等．基于Ａｐｒｉｏｒｉ关联规则临床癌性疲乏处方组方及用药规律分析［Ｊ］．亚太传统医药，２０１６，１２（２１）：１２１－１２３．［２０］曾雷．关联规则挖掘中Ａｐｒｉｏｒｉ算法的研究［Ｄ］．重庆：重庆交通大学，２０１６．