摘要: 研究肉苁蓉及淫羊藿对小鼠早期胚胎体外发育的影响。试验选取6 ～ 8 周龄昆明小鼠早期胚胎，以不添加中药培养液组为空白对照，分以下试验组: I 组: 早期胚胎在纯培养液M16 + 5% FBS( M1) 与M16 + 5% FBS +EDTA + 牛磺酸( M2) 中的体外发育情况; Ⅱ组: 早期胚胎添加至中药体积浓度为0． 1% 的M1与M2培养液中。Ⅲ组: 早期胚胎添加至不同体积浓度中药成分的培养液中。Ⅳ组: 将早期胚胎加入中药不同组合体积浓度培养液中。试验结果: ( 1) M2液优于M1液，特别是在克服2 细胞发育阻滞上。( 2) 添加0． 1%肉苁蓉桑葚胚率与囊胚率高于0． 1%淫羊藿组，差异极显著( P ＜ 0． 01) ，中药组桑葚胚率与囊胚率显著高于培养液空白对照，差异极显著( P ＜ 0． 01) 。( 3) 高浓度中药会对胚胎活力产生副作用，抑制胚胎后阶段发育，与其他组对比差异极显著( P ＜ 0． 01) 。( 4) 添加高浓度中药组合培养液对早期胚胎成活率、2 细胞发育率，与低浓度组合中药和空白组相比有显著差异性( P ＜0． 05) ，与低浓度组合中药和空白对照相比桑葚胚及囊胚发育率差异极显著( P ＜ 0． 01) 。在小鼠胚胎体外培养液中添加一定浓度EDTA、牛磺酸能克服2 细胞阻滞; 0． 1% 肉苁蓉能有效促进胚胎体外发育，同时添加低浓度中药及低浓度组合中药也有促进作用。关键词: 肉苁蓉; 淫羊藿; 卵母细胞; 体外培养随着胚胎生物工程研究的发展，人们对早期胚胎发育与微环境、自身代谢特征等方面的认识在不断深入，目前大多数研究者普遍采用改变培养液的成分、改善培养的条件提高胚胎发育率，并建立了胚胎共培养体系。传统中药相对于化学药物来说具有经济、低毒等明显的优点，目前国内外在研究中药对胚胎体内外发育的影响方面几乎都在研究中药有效成分中多糖类和黄酮类抗自由基的特性，而从中药全药的特性出发来研究中药对早期胚胎发育的影响方面，国内外报道不多。本研究在前人基础上探索如何进一步提高早期胚胎体外发育率，研究添加中药对孕期胚胎发育的影响。1 材料与方法1． 1 试验材料1． 1． 1 动物及药材6 ～ 8 周龄清洁级昆明小鼠( 购自新疆医科大学实验动物中心) ，雌性120 只，雄性20 只，体质量18 ～ 22 g，实验动物生产许可证号SCXK( 新) 2003 － 2002，使用许可证号: SY( 新) 2003 －003。肉苁蓉及淫羊藿原药材，均购自乌鲁木齐市百草堂大药房。1． 1． 2 仪器设备及试验试剂Motic K 系列倒置显微镜; NikonT － SAM 倒置显微镜( NT － 88 － V3， Japan); 手术器械( 苏州六六视觉) ; 拣卵针( 自制) ; 5%FBS( 杭州四季青) ; DPBS + 0． 5%PVP 冲胚液; Galaxy－ 48R CO2培养箱( New brunswick) ; 微量移液器( Eppendorf) ; 96 孔细胞培养板( greiner bio － one) ;青、链霉素( 华北制药股份有限公司) ; M16培养液( Sigma) ; EDTA( 天津福晨化学试剂厂) ; 牛磺酸( 国药集团化学试剂有限公司) 。1． 2 试验方法1． 2． 1 小鼠发情鉴定及合笼购回小鼠后随机分笼饲养1 周，待其适应环境后备用，参照李聚学等［1］制定的判断标准，采用阴门直接观察法进行鉴定，将处于发情盛期的母鼠于当日下午19: 00 左右按1∶ 1比例与公鼠合笼过夜，次日08: 00 左右检查阴道栓，见栓当日记为第0 天，将见栓小鼠标记置于笼中饲养，给予人道关怀，自由采食与饮水，备用。1． 2． 2 中药肉苁蓉及淫羊藿的熬制取5 g 原药置于100 mL 烧杯中并加Milli － Q 水浸没，经大火煮沸与文火维持沸腾20 min 后收取药汤，重复以上过程连续收取3 次后定容至100 mL 后0． 22 μm 滤膜过滤备用。1． 2． 3 小鼠早期胚胎的获取及形态鉴定于见栓后第0． 5 天将见阴道栓小鼠颈椎脱臼处死，φ = 75%酒精浸泡5 min，无菌打开腹腔，用手术剪和手术镊剪下输卵管迅速将其置于冲胚液中洗涤数遍，去除血渍，在倒置显微镜下用连有1 mL 注射器的5 号针头将输卵管壶腹部明显膨大处撕破，冲出卵丘－ 卵母细胞团，置于添加有青链霉素的培养皿中清洗后即得到小鼠早期胚胎。1． 2． 4 胚胎的培养本试验采用96 孔板微滴法( 50 μL /滴， 10 － 15 枚/滴) 培养，收集小鼠早期胚胎，分别加入经过5%CO2、37 ℃饱和湿度的CO2培养箱平衡4 h 后的M16 + 5%FBS( 标记为M1液) 和M16+ 5%FBS + EDTA + 牛磺酸中( 标记为M2液) ( 牛磺酸添加浓度为215 mmol /L 即0． 027 g /mL; EDTA 添加浓度为100 mmol /L 即0． 037 g /mL) ，每24 h 观察记录胚胎发育情况，待胚胎在M16 + 5%FBS + EDTA+ 牛磺酸培养液中培育越过2 细胞阻滞期后将胚胎换液转入M16 + 5%FBS 中继续培养。按10 ～ 15 枚/组/滴进行分组: ( 1) 纯培养液组: 将M1、M2培养液分别加入96 孔板内，加入早期胚胎并对比观察其在培养液中发育情况。( 2) 等体积浓度中药组: 分别添加0． 1%( V/V) 浓度的肉苁蓉与淫羊藿中药至M1液和M2液中，与不添加中药成分空白组M1液、M2液对照，加入早期胚胎，观察胚胎发育情况，判断2种中药成分是否对早期胚胎体外发育有效果。( 3) 不同浓度中药组: 将早期胚胎分别放入到加有0%( 空白对照) 、0． 15% ( V/V) 、0． 2% ( V/V) 肉苁蓉和淫羊藿的M1、M2两种培养液中， 96 孔板培养，判断不同浓度的肉苁蓉及淫羊藿对早期胚胎发育的影响。( 4) 不同组合浓度中药组: 设定2 种中药不同的组合浓度: A: 0． 1%肉苁蓉+0． 1%淫羊藿组; B: 0． 15%肉苁蓉+0． 1%淫羊藿组; C: 0． 2%肉苁蓉+0． 1%淫羊藿组; D: 0． 1%肉苁蓉+ 0． 15%淫羊藿组; E: 0． 1%肉苁蓉+ 0． 2%淫羊藿组; 空白对照组: 不添加中药成分空白组M1液与M2液，加入早期胚胎观察发育情况。1． 3 测定指标1． 3． 1 早期胚胎形态学评级及成活率测定胚胎形态评级参照王敏康等［2］建立的标准，显微镜下选择胞质与透明带完整，无碎片，颜色透亮的Ⅰ级胚胎备用。1． 3． 2 早期胚胎发育情况及发育率测定胚胎发育情况按照小鼠胚胎发育图谱与标准［2］鉴定，记录胚胎所处各个时期发育情况及数目并计算胚胎发育率。1． 4 数据处理所有数据采用SPSS17． 0 进行分析。2 结果与分析2． 1 早期胚胎在2 种培养液中的体外发育情况( 存活情况及发育率)由表1 可以看出在2 种不同培养液中，早期胚胎成活率均较高( P ＞ 0． 05) ，由卵母细胞发育至2 细胞过程中发育率无显著差异( P ＞ 0． 05) ，但2 组培养液桑葚胚与囊胚发育率差异极显著( P ＜ 0． 01) ，表明M16 + 5%FBS + EDTA + 牛磺酸培养液( M2液) 在体外培养早期胚胎时优于M16 + 5%FBS 培养液( M1液) ，特别是在克服2 细胞发育阻滞率上具有显著优势。2． 2 添加2 种中药成分对不同培养液中早期胚胎体外发育的影响由表2 可以看出添加中药后早期胚胎成活率较高，与不添加中药组对比无显著差异( P ＞ 0． 05) ，添加0． 1%肉苁蓉桑葚胚率与囊胚率均显著高于0． 1% 淫羊藿组，差异极显著( P ＜ 0． 01) ，中药组桑葚胚率与囊胚发育率显著高于培养液空白对照组，差异极显著( P ＜ 0． 01) 。说明添加一定浓度中药成分能有效促进胚胎发育，其中以添加0． 1%肉苁蓉效果为最佳。2． 3 2 种中药成分不同添加浓度对鼠胚早期发育的影响由表3 可以看出添加高浓度中药后，胚胎成活率显著降低，与M2液对比有显著差异( P ＜ 0． 05) ，说明高浓度中药会对胚胎活力产生一定副作用，同时过高浓度中药可能会抑制桑葚胚与囊胚发育率，与其他组对比差异极显著( P ＜ 0． 01) 。2． 4 2 种中药不同组合浓度对鼠胚早期发育的影响由表4 可以看出添加高浓度中药组合培养液使早期胚胎成活率、2 细胞发育率也显著降低，与低浓度组合中药和空白对照组相比具有显著差异性( P ＜ 0． 05) ，同时，在桑葚胚发育率及囊胚发育率上，与低浓度组合中药和空白对照组相比具有极显著差异性( P ＜ 0． 01) ，同样说明高浓度中药组合培养液可能对发育率有抑制作用。3 讨论3． 1 添加EDTA 及牛磺酸对胚胎体外发育影响影响胚胎体外发育的因素很多，涉及物种、血清、培养基、培养环境、生长因子等［4 － 5］，其中培养环境是一重要因素，哺乳动物子宫内环境与胚胎体外培养环境有很大差异，体外培养发育的胚胎在发育过程中会产生并累积一些不利于发育的毒性物质，比如自由基、NO 等，这对处于体外发育环境中的胚胎具有不利影响，会降低其成活率及发育率，因此会发生发育阻滞，杨清等［6］研究证明NO 作为一种调节因子参与早期胚胎的发育，当生成过量时对胚胎有损害作用。古丽努尔［7］报道中药成分能在一定程度上消除NO 自由基，同时Ricci［8］报道小鼠正常子宫内含有一种上皮细胞液，当在体外培养环境中添加这种子宫上皮液时能使早期胚胎越过2 细胞发育阻滞。本试验发现在培养液适当添加一定浓度的EDTA与牛磺酸，希望其能替代体内环境中所需的特殊物质，在本实验中其作用也很明显，胚胎体外发育率显著高于对照组，说明EDTA 与牛磺酸在一定程度上清除体外培养环境中的毒性因素，起到了替代子宫内某种特殊物质的作用。这一结果与相关报道［9 － 11］一致。同时有报道表明［12 － 14］，EDTA 和牛磺酸的添加浓度过高会造成胚胎发育率降低甚至死亡，其机理是否是过量化学物质对胚胎发育过程中相关细胞因子产生了变化影响，这将在本人后续试验中验证。3． 2 添加中药及其浓度变化对胚胎体外发育影响在早期胚胎体外培养过程中，适当添加中药可以促使卵母细胞改善胞质成熟质量，促进胚胎的体外发育，肉苁蓉及淫羊藿做为传统壮阳补肾药［15］，具有补肾益精、促进生殖发育的功效，故本试验将2 种滋阴壮阳中药加入培养液中，目的在于研究2 种中药对早期胚胎体外发育的效果，结果表明中药组的胚胎发育率高于空白对照组。与之前报道显示在培养液中添加中药促进胚胎体外发育基本相符［16］。但本试验中肉苁蓉对胚胎体外发育有极显著影响，可能是其有效成分直接或间接对胚胎发育微环境有更好的调节作用，但具体机理还需进一步研究。中药具有安全、低毒等特性，本试验发现中药添加浓度对胚胎体外发育也有较大影响，试验中发现添加合适浓度的中药能促进胚胎体外发育，可能是中药的某些有效成分同样能起到清除体外环境中毒性物质的功效，但其具体影响机理还需进一步研究。添加高浓度中药及高浓度组合中药时对胚胎发育产生副作用，故在临床医学上重要启示，注意用药量的控制来确保用药安全性，这也符合基本用药要求。同时，本实验对无菌环境要求较高，这对实验结果影响也较大。3． 3 在理论和生产中应用前景本试验初步研究了2 种滋阴壮阳类中药对早期胚胎发育的影响，在前人的研究理论基础上创新性研究了2 种中药的全药特性，不局限于某单一有效成分上，同时对2 种中药的组合特性和功能进行了研究，丰富了传统中医用药理论，同时，在生产实践应用也有较大的意义，既能提高动物胚胎的体外发育率，最终体现在获得更高的产仔率，也对2 种中药能更好造福于人类具有一定价值和意义。参考文献:［1］李聚学，魏雁． 影响小鼠超数排卵的若干因素［J］． 湖北农业科学， 2004( 4) : 120-122．［2］王敏康，廉莉，朱子玉，等． 卵母细胞、受精卵及早期胚胎质量判断方法的探讨［J］． 生殖医学杂志， 2002( 6) : 171-175．［3］孙青原． 小鼠胚胎实验操作手册( 第3 版) ［M］． 陈大元译． 北京: 化学工业出版社， 2006．［4］Furnus C C，Dematos D G，Picco S， et al． Metabolic requirements associated with GSH synthesis during in vitro maturationof cattle oocytes［J］． Anim Reprod Sci， 2008， 109( 1) : 88-99．［5］Paul，Booth J，Peter G H，et al． Amino acid depletion and appearance during porcine preimplantation embryo developmentin vitro［J］． Reproduction，2005， 13( 2) : 655-668．［6］杨青，薛立群，刘斌，等． 维生素E 对附植前小鼠胚胎发育与一氧化氮生成的影响［J］． 湖南农业大学学报: 自然科学版， 2003， 29( 4) : 288-290．［7］古丽努尔． 木特列夫，雷丽，屠鹏飞，等． 松果菊苷抗衰老作用机理研究［J］． 生物物理学报， 2004， 20( 3) : 183-187．［8］Ricci E L，Telloli C S，Dalmolin D P，et al． Developmental toxi － cology of monocrotaline physical and neurobehavioral evaluationrat offspring［J］． Toxicol Lett，2010( 96) : 181-183．［9］Hoa N，Myers M P，Douglas T G，et al． Molecular mechanisms of paraptosis induction implications for a non － geneticallymodified tumor vaccine［J］． PlosOne，2009，4( 2) : 4631-4635．［10］Shi J，Xue S J，Shi，et al． Isolation and characterization of leptin from kidney beans( Phaseolus vulgaris) ［J］． Process Bio－ chem，2007，42( 10) : 1436-1438．［11］Barreto R A，Sousa C S，Silva V D A，et al． Monocrotaline pyr － rol is cytotoxic and alters the patterns of GFAP expressionon as － trocyte primary cultures［J］． Toxic in Vitro，2008( 22) : 1191-1194．［12］Erksuz Y，Ceribasi A O，Cevik A，et al． Toxicity of heliotropium dolosum，heliotropium circinatum and se － necio vernalisinparental quail and their progeny，with residue evaluation of eggs［J］． Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences，2008， 32( 6) : 475-482．［13］Song L L，Ge L，Peter P F， et al． Identification of five hepatotoxic pyrrolizidine alkaloids in a commonly used traditional Chinesemedicinal herb，Herba senecionis scandentis［J］． Rapid Communications in Mass Spectrometry，2008， 22( 4) : 591-602．［14］Ohtkae K，Shinada N，Uchida H． Efficient production of omega － 3 fatty acid denatures ( sFat － 1) － transgenic pigs by somaticcell nuclear transfer［J］． Science China( Life Sciences) ，2010( 4) : 457-460．［15］李玉芳，徐芹伟，张丽，等． 中草药肉苁蓉及黄芪对猪早期胚胎体外发育的影响［J］． 江西农业大学学报，2007，29( 5) : 805-808．［16］傅文栋，高建明，陈武，等． 小檗碱及黄芩苷对小鼠2 － 细胞胚胎体外培养效果的初步研究［J］． 中国兽医医药杂志，2005( 24) : 146-150．·1011·

摘要：肉苁蓉为中医补益药物中的常用药物。随着国内外学者对其有效成分及其作用机理的研究‚发现其主要成分肉苁蓉总苷等具有抗氧化、抗凋亡等保护作用。文章就此方面的国内外研究进展做一综述。关键词：肉苁蓉；　抗氧化；　抗哀老；　记忆力；　脑损伤中药肉苁蓉（ＨｅｒｂａＣｉｓｔａｎｃｈｅｓ）为列当科植物肉苁蓉ＣｉｓｔａｎｃｈｅｄｅｓｅｒｔｉｃｏｌａＹ．Ｃ．Ｍａ的干燥带鳞叶的肉质茎‚又名金笋、地精‚习称大芸。性温、味甘、咸。归肾、肠经。为补肾壮阳、润肠通便之要药。始载于《神农本草经》‚被列为上品。有补肾阳、益经血、润肠、通便之功效。主治阳痿、不孕、腰膝酸软、筋骨无力、肠燥便秘等‚是临床常用中药之一［1］。目前从肉苁蓉中分离出的有效成分主要有苯乙醇苷类、环烯醚萜类、木脂素类、多糖、生物碱等［2］。就目前的研究表明‚肉苁蓉具有抗氧化、抗衰老、抗凋亡、抗辐射和改善学习功能等作用‚并且对脑缺血／脑缺血再灌注也有一定的保护作用。本文就近年来国内外对肉苁蓉的脑保护作用研究成果作一综述‚为肉苁蓉的临床应用提供参考。1　抗氧化作用正常集体的氧自由基产生与清除处于动态平衡‚当脑缺血时‚防御系统受损‚同时氧自由基生成增多‚攻击生物膜‚发生脂质过氧化反应‚产生脂质过氧化物丙二醛（ＭＤＡ）‚降低膜流动性‚致使细胞变性‚功能受损。邬利娅·伊明等［3］研究了肉苁蓉总苷（ＧＣｓ）对小鼠脑缺氧的保护作用‚通过利用亚硝酸钠和氰化钾造成急性脑缺氧模型‚发现ＧＣｓ能明显延长亚硝酸钠致脑缺氧小鼠的生存时间‚增加脑缺氧小鼠脑组织中自由基清除酶如超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）的活性‚降低脂质过氧化物丙二醛（ＭＤＡ）的含量。用化学发光法［4］检测ＧＣｓ对Ｏ－2 ·‚ＯＨ· ‚Ｈ2Ｏ2‚1Ｏ2等自由基的清除作用‚发现ＧＣｓ对以上自由基均有明显的清除作用‚对ＯＨ·引发的ＤＮＡ氧化损伤有明显的保护作用。木合布力‚阿布力孜等［5］ 采用人类ＨＬ－60细胞为体外抗氧化实验模型‚以银杏提取物标准品ＥＧＢ761为阳性对照物‚发现ＧＣｓ在0．25ｇ·Ｌ－1的浓度下‚能抑制细胞内ＭＰＯ／ＨＣｌＯ／Ｈ2Ｏ2 氧化系统所诱发的自由基浓度56％‚当ＧＣｓ的浓度提高到0．50和0．75ｇ·Ｌ－1时‚它分别能抑制系统中自由基浓度为62％和67％。其自由基抑制活性强度与阳性对照组ＥＧＢ761类似。2　抗衰老作用衰老既是人体神经系统功能退行性改变的一个重要方面‚也是许多神经系统疾病的初始阶段。衰老是人体正常的生理过程‚但其衰老生理变化涉及到全身多功能系统‚引起其机体代谢紊乱。古力努尔·木特列夫等［6］采用Ｄ－半乳糖所致小鼠亚急性衰老模型‚连续6周服用松果菊苷（ＥＣＨ）能明显修复衰老模型小鼠心、肝、肾、脑组织活性氧物种（ＲＯＳ）损伤‚减低肝组织ＭＤＡ含量‚提高全血谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＳＨ－Ｐｘ）和血清ＳＯＤ活性‚同时能够抑制脑组织ＭＡＯ活性‚改善记忆能力。结果提示‚ＥＣＨ在体内可以通过清除体内ＲＯＳ‚抑制ＲＯＳ的积累‚减少ＲＯＳ对组织细胞的损伤‚从而延缓衰老进程。研究表明肉苁蓉多糖、肉苁蓉总苷［7～9］也具有调节衰老小鼠机体氧化／抗氧化平衡的功能‚消除Ｄ－半乳糖引起自由基产生的增多‚具有抗氧化的作用及延缓衰老的作用。其作用机制可能通过清除自由基或增强自由基清除酶的活性‚抑制膜脂质过氧化机制起到保护海马ＣＡ1区神经细胞超微结构的作用［10］。3　抗凋亡作用凋亡是多种致病因素导致的细胞程序性死亡‚在神经系统发育、神经退行性病变和兴奋性神经元损伤中均起主要作用。蒲小平等［11］采用ＭＴＴ、ＬＤＨ、酪氨酸羟化酶（ＴＨ）及Ｃａｓｐａｓｅ－3的免疫组织化学染色、原位ＴＵＮＥＬ法凋亡细胞检测、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和ＲＴ－ＲＣＲ等分析手段‚发现肉苁蓉苯乙醇苷可通过抑制Ｃａｓｐａｓｅ－3的活性来对抗ＭＰＰ＋致中脑神经细胞凋亡作用。Ｃａｓｐａｓｅ－3在中脑神经细胞凋亡过程中起着关键作用‚对帕金森类病的治疗提供了一个很好的研究方向。ｃａｍｐｎｅｏｓｉｄｅⅠ、ｃａｍｐｎｅｏｓｉｄｅⅡ和ｃａｍｐｎｅｏｓｉｄｅ都是苯乙醇苷类‚研究中发现‚肉苁蓉成分ｃａｍｐｎｅｏｓｉｄｅⅡ对ＭＰＰ＋诱发的大鼠小脑颗粒细胞的抗凋亡作用更强［12］。邓敏等［13］发现ＥＣＨ也能有效地减轻ＴＮＦ－α诱导细胞凋亡的发生‚在1～100ｍｇ·Ｌ－1的剂量范围内‚其神经细胞保护作用呈现一定的剂量依赖关系‚其作用可能与通过抑制细胞内活性氧自由基的生成和Ｃａｓｐａｓｅ－3活性的升高并维持线粒体膜电位处于正常状态有关。4　改善学习记忆ＧＣｓ对学习记忆能力具有一定的保护作用‚可提高ＳＡＭ －Ｐ／8小鼠脑组织总蛋白含量、总抗氧化能力‚降低乙酰胆碱酯酶活性及血清中白介素Ⅱ含量［14］。刘凤霞等［15‚16］ 研究发现ＧＣｓ可分别提高β－淀粉样肽（β－ＡＰ）和喹啉酸（ＱＡ）所致ＡＤ小鼠学习记忆能力。其机制可能与其增强自由基清除酶活性‚减轻脂质过样化反应‚降低脑组织钙含量‚抑制细胞凋亡有关。罗兰［17］也发现ＧＣｓ对三氯化铝（ＡｌＣｌ3）皮下注射（ＳＣ）致小鼠拟ＡＤ模型小鼠学习记忆障碍具有保护作用。ＧＣｓ可抑制机体血小板聚集从而达到预防血管性痴呆（ＶＤ）的作用［18］。有研究发现ＧＣｓ可抑制ＡＣｈＥ活性‚维持脑内乙酰胆碱（ＡＣｈ）的正常水平［19］。5　对脑缺血再灌注损伤的保护作用脑缺血及脑缺血再灌注后ＮＯＳ活性增加‚氧自由基清除酶活性下降‚尤其脑缺血再灌注后这种变化更明显‚而ＧＣｓ62．5‚125‚250ｍｇ／ｋｇ3个剂量均可显著抑制脑组织内ＮＯＳ活性‚提示ＧＣｓ对脑缺血再灌注损伤具有保护作用［20］。詹合琴等［21］通过观察沙鼠脑电图（ＥＥＧ）和大脑皮层组织Ｃａ2＋、Ｎａ＋及水含量等指标‚发现含肉苁蓉药天麻醒脑胶囊可降低沙土鼠脑缺血再灌注损伤后皮层的Ｃａ2＋浓度‚提示该药物可通过防止钙超载来发挥保护神经元因缺血缺氧导致的损伤。王晓雯等［22］研究了对缺血最敏感的海马ＣＡ1区神经细胞在脑缺血及脑缺血再灌注后的病理变化‚结果表明ＧＣｓ组脑梗塞范围百分比显著减少‚明显改善脑缺血及脑缺血再灌注小鼠海马ＣＡ1区脑组织病理形态学变化‚减少凋亡细胞。脑损伤是一种不可逆的生理过程‚而肉苁蓉的脑保护作用受到越来越多学者的关注‚开发一种有效治疗脑损伤的药品已迫在眉睫‚而肉苁蓉是如何在体内代谢‚以及对其代谢产物的研究目前还未见报道‚有待更进一步的研究。参考文献：［1］　杨翠平‚苏薇薇．肉苁蓉研究进展［Ｊ］．中药材‚2001‚24（12）：907．［2］　吴晓春‚史　颖．肉苁蓉的研究与临床应用［Ｊ］．甘肃中医‚2007‚20（12）：49．［3］　邬利娅·伊明‚王晓雯‚早然木·尼亚孜‚等．肉苁蓉总苷对小鼠脑缺氧的保护作用［Ｊ］．新疆医科大学学报‚2003‚26（6）：561．［4］　王晓雯‚蒋晓燕‚邬利娅·伊明‚等．肉苁蓉总苷体外消除自由基及对ＯＨ·引发的ＤＮＡ损伤的保护作用［Ｊ］．中国药学杂志‚2001‚36（1）：29．［5］　木合布力·阿布力孜‚毛新名‚热娜·卡斯木‚等．肉苁蓉总苷在ＨＬ－60细胞中的抗氧化活性研究［Ｊ］．中国药理学通报‚2008‚24（3）：362．［6］　古力努尔·木特列夫‚雷　丽‚屠鹏飞‚等．松果菊苷抗衰老作用机理研究［Ｊ］．生物物理学报‚2004‚20（3）：183．［7］　吴　波‚付玉梅．肉苁蓉总苷对衰老小鼠脂质过氧化的影响［Ｊ］．广州医学院学报‚2004‚32（4）：27．［8］　张　涛‚柳朝阳‚王建杰‚等．肉苁蓉总苷对Ｄ－半乳糖所致衰老模型小鼠免疫功能的影响［Ｊ］．中国老年学杂志‚2004‚24：441．［9］　王新源‚王晓雯‚王雪飞‚等．肉苁蓉总苷对Ｄ－半乳糖脑老化模型小鼠海马超微结构的影响［Ｊ］．中国行为医学科学‚2005‚14（11）：966．［10］　王新源‚王晓雯‚王雪飞‚等．肉苁蓉总苷对Ｄ－半乳糖脑老化模型小鼠的保护作用［Ｊ］．中国行为医学科学‚2004‚13：613．［11］　蒲小平‚李燕云．肉苁蓉苯乙醇苷抗中脑神经元凋亡机制的研究［Ｊ］．中国药理学简讯‚2004‚19（4）：50．［12］　蒲小平‚李晓蓉‚李慧农‚等．肉苁蓉成分ＣａｍｐｎｅｏｓｉｄｅⅡ对神经毒素ＭＰＰ＋诱发细胞凋亡的保护作用［Ｊ］．北京大学学报（医学版）‚2001‚33（3）：217．［13］　邓　敏‚赵金垣‚屠鹏飞‚等．松果菊苷对ＴＮＦα诱导的ＳＨ－ＳＹ5Ｙ细胞凋亡的保护作用［Ｊ］．中国药理学通报‚2005‚21（2）：169．［14］　田　枫‚张　阔‚康爱君‚等．松果菊苷改善ＳＡＭ－Ｐ18小鼠学习记忆能力作用机制初探［Ｊ］．实验动物科学与管理‚2006‚23（2）：14．［15］　刘凤霞‚王晓雯‚罗　兰‚等．肉苁蓉总苷对β－淀粉样肽所致阿尔采末病小鼠模型学习记忆的影响及其机制［Ｊ］．中国药理学通报‚2006‚22（5）：595．［16］　刘凤霞‚王晓雯‚王雪飞．肉苁蓉总苷对喹啉所致Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病小鼠学习记忆的影响及其作用机制［Ｊ］．新疆医科大学学报‚2005‚28（12）：1131．［17］　罗　兰‚王晓雯‚刘凤霞‚等．肉苁蓉总苷对三氧化铝致小鼠学习记忆障碍的保护作用［Ｊ］．中国新药与临床杂志‚2007‚26（1）：33．［18］　皋　聪‚王传社‚巫冠中‚等．肉苁蓉总苷对血管性痴呆大鼠学习记忆的影响及机制研究［Ｊ］．中草药‚2005‚36（12）：1852．［19］　罗　兰‚王晓雯‚杨　梅‚等．肉苁蓉总苷对双侧颈总动脉结扎大鼠学习记忆功能影响及其机制探讨［Ｊ］．中国新药与临床杂志‚2007‚26（6）：401．［20］　孟新珍‚王晓雯‚蒋晓燕‚等．肉苁蓉总苷对清醒小鼠脑缺血再灌注致脑组织生化改变的影响［Ｊ］．中华老年心脑血管病杂志‚2004‚6（1）：16．［21］　詹合琴‚李平法‚沈志强．天麻醒脑胶囊对沙土鼠脑缺血再灌注损伤的影响［Ｊ］．中成药‚2006‚28（8）：1202．［22］　王晓雯‚孟新珍‚奖晓燕‚等．肉苁蓉总苷对清醒小鼠脑缺血再灌注致海马ＣＡ1区脑组织损伤的保护作用［Ｊ］．卒中与神经疾病‚2003‚10（6）：325．

摘　要：观察肉苁蓉活性成分对大鼠大负荷训练导致的骨骼肌自由基氧化损伤的保护作用；将２４只ＳＤ大鼠随机分为安静对照（ＳＣ）组、运动对照（ＴＣ）组、运动＋肉苁蓉（Ｔｃｄ）组和运动＋红景天（ＴＨ）组，ＴＣ组、Ｔｃｄ 组和ＴＨ组采用跑台大负荷训练模型进行训练，第４周末所有组进行跑台力竭运动，运动力竭后即刻处死取大鼠腓肠肌，并进行力竭运动时间、腓肠肌丙二醛（ＭＤＡ）和超氧歧化酶（ＳＯＤ）测试．力竭运动后，Ｔｃｄ 组的ＳＯＤ活性极显著高于ＳＣ组和ＴＣ组（Ｐ ＜０．０１），而ＭＤＡ含量显著低于ＳＣ组和ＴＣ组，Ｔｃｄ 组和ＴＨ组的ＳＯＤ活性和ＭＤＡ含量无显著差异（Ｐ ＞０．０５）．与ＳＣ组比，ＴＣ组ＳＯＤ活性高（Ｐ ＜０．０５）；Ｔｃｄ 组和ＴＨ组可以有效提高力竭运动时间（Ｐ ＜０．０１）．肉苁蓉活性成分有一定的抗氧化作用，有利于力竭运动导致机体组织大量积累的自由基的清除，防止组织氧化损伤．关键词：肉苁蓉活性成分；大负荷训练；氧化损伤运动可以引发内源性自由基生成增加，尤其是急性运动、大负荷运动和力竭运动等会导致机体自由基过度积累，脂质过氧化水平增加．在运动的骨骼肌中，堆积的氧化物所导致的氧化应激会产生运动疲劳的发展，运动引发的自由基增加与运动性肌肉损伤也有关．通过合理的营养膳食、中医药和运动训练等手段来提高机体抗氧化系统或补充抗氧剂进行过度积累的自由基清除，从而增强运动能力、减少运动损伤和运动性疲劳的发生，这一直是运动科学界研究的热点之一．有“沙漠人参”之称的肉苁蓉是极好的中药药材，具有补精血、益肾强筋、润五脏、暖腰膝和治虚劳内伤的功效［１－２］肉苁蓉在传统中医增力药处方中出现率非常高．从肉苁蓉的提取分离６９个的化学成分看，苷类是肉苁蓉的主要活性成分［３］．研究也发现肉苁蓉具有抗氧化、提高机体免疫力、改善智力和延缓衰老等方面的功效，本实验利用肉苁蓉提取物对大负荷训练大鼠进行干预，观察其对大鼠骨骼肌组织氧化损伤的影响．１　材料与方法１．１　材料（１）雄性ＳＤ大鼠（购于广东医学院实验动物中心）２４只，清洁级，鼠龄６周，体重１１０．９～１４６．７ｇ．将实验大鼠按体重进行随机分组分为安静对照组（ＳＣ）、运动对照组（ＴＣ）、运动＋肉苁蓉组（Ｔｃｄ ）和运动＋红景天组（ＴＨ），ＴＣ组，每组各６只．（２）肉苁蓉活性成分：市售的肉苁蓉干样肉质茎，用醇提得到稠膏［４－５］，加溶剂溶解，配置成０．１ｇ／ｍＬ溶液．红景天口服液（市售圣莲牌产品）．（３）实验仪器：紫外可见分光光度计（美国尤尼柯ＵＶ２８００）；小动物跑台（ＤＳＴ７２０２）．（４）试剂：ＳＯＤ和ＭＤＡ的测试试剂盒（南京建成生物工程研究所）．１．２　方法（１）大鼠训练方案参照文献［６－７］进行改进．除ＳＣ组外各组每天下午按照表１方案进行跑台训练，训练后１ｈ后，各组进行灌胃溶液一次，Ｔｃｄ 组每次剂量１ｍＬ／１００ｇ体重，ＴＨ 组每次剂量０．５ｍＬ／１００ｇ体重，其中ＳＣ组和ＴＣ组同时灌胃生理盐水一次．第４周周末对所有组大鼠进行运动力竭运动．力竭标准为采用声、光、电刺激大鼠尾部使其持续运动，连续刺激但超过１０ｍｉｎ仍不能维持原强度工作的，可视为力竭［７］．　（２）骨骼肌的ＳＯＤ和ＭＤＡ的测试：大鼠力竭后立即处死取大鼠腓肠肌１．５ｇ，加入１５ｍＬ冰冷的蒸馏水，用玻璃匀浆器捣碎后成１０％的匀浆，取一定量的匀浆液测定ＳＯＤ的活性和ＭＤＡ的含量，测试方法参照测试试剂盒说明书进行；ＳＯＤ活性定义为：每毫克组织蛋白在１ｍＬ反应液中ＳＯＤ抑制率达５０％所对应的ＳＯＤ量为一个活力单位Ｕ．蛋白质含量采用考马斯亮蓝染色法测定［８］．１．３　数据的统计学处理统计分析采用ＳＰＳＳ　ｆｏｒ　Ｗｉｎｄｏｗｓ１０．０软件分析，所有数值均以均数±标准差（ｍｅａｎ±ＳＤ）表示，多组间样本均数差异显著性用单因素方差分析进行检验，两组间样本均数差异显著性用独立样本ｔ检验进行检验．２　结果２．１　各组大鼠力竭运动时间比较各组大鼠力竭运动时间（见表１）比较表明，Ｔｃｄ 组和ＳＣ、ＴＣ组之间的力竭运动时间有极显著性差异（Ｐ＜０．０１），显示肉苁蓉活性成分可以显著增加大鼠的运动耐力．此外，ＴＣ组与ＳＣ组比较说明运动训练可以有效提高力竭运动时间（Ｐ＜０．０１）．２．２　力竭运动后各组大鼠骨骼肌的ＳＯＤ和ＭＤＡ测试结果比较通过各组力竭运动后测试的大鼠腓肠肌的ＳＯＤ活性和ＭＤＡ的含量比较（如表２），显示Ｔｃｄ 组和ＴＨ组的ＳＯＤ活性极显著高于ＳＣ组和ＴＣ组（Ｐ ＜０．０１），而ＭＤＡ 含量显著低于ＳＣ组和ＴＣ组，Ｔｃｄ 组和ＴＨ 组的ＳＯＤ活性以及ＭＤＡ含量均无显著差异（Ｐ ＞０．０５），说明肉苁蓉的提取的活性成分可以有效提高机体ＳＯＤ活性和降低ＭＤＡ的含量，具有抗氧化功能．与ＳＣ组比，ＴＣ组ＳＯＤ活性高（Ｐ ＜０．０５），说明运动训练一定程度上可以提高抗氧化能力．３　讨　论在正常的生理状态下，机体自由基的不断产生和借以体内抗氧化防御体系进行自由基的清除处于一种动态平衡［９］．所以正常的生理条件下机体自由基浓度比较低，并发挥其特殊的生理功能．但是在运动状态下，不管是短时间的极量运动，还是长时间的亚极量运动，都会引起肌体内的自由基的生产增加，自由基的增多超过了体内抗氧化防御体系自由基的清除能力，那么积累的自由基就会攻击细胞，首先破坏细胞膜结构，产生脂质过氧化的反应［１０］，而且这种反应还会连锁循环，产生更多的自由基，破坏更多的细胞结构．甚至造成运动性疲劳和肌肉损伤．自由基引起的组织氧化损伤是影响运动能力和成绩的一个限制因素．当然不同的运动强度对产生的自由基增量及其引起的组织氧化损伤程度不同．因此，寻求各种适宜的手段来阻止或减小这种不利的反应的发生是研究者长期探讨的问题．许多研究已经发现，通过合理的营养膳食［１１］、中医药［１２］和运动训练［１３］等手段可以有效地提高机体抗氧化系统或进行过度积累的自由基清除，从而阻止或减小自由基引起的组织氧化损伤．体外实验表明肉苁蓉总苷有效地清除自由基，保护ＯＨ·引发的ＤＮＡ 损伤［１４］，动物实验表明肉苁蓉茶可以提高小鼠常压耐缺氧能力［１５］，具有一定的抗疲劳［１６］和抗衰老［１７］作用．本实验通过建立大负荷训练动物模型，并用肉苁蓉醇提物灌胃，发现内苁蓉醇提物灌胃组可以有效延长力竭运动时间，这与孙建等［１１８］报道的小鼠疲劳转棒仪实验停留时间延长一致，但是肉苁蓉灌服成份有差异；从运动后骨骼肌抗氧化实验分析，肉苁蓉醇提物可以有效提高机体运动力竭后大鼠腓肠肌ＳＯＤ活性和降低ＭＤＡ含量，具有显著的抗氧化功能。虽然有关肉苁蓉抗运动性疲劳的研究有少量报道，但还未见从抗骨骼肌运动氧化损伤角度的实验报道。本实验还用红景天产品作为对照，实验证明：红景天含有的活性成份可以有效改善运动过程中自由基的影响［１８］，保护运动疲劳导致的氧化损伤作用［１９］，在营养学强力手段中常作为营养素来提高运动员运动能力，在本实验中肉苁蓉发挥的作用与红景天产品相当。此外，ＴＣ组和ＳＣ组比较发现，运动训练在一定程度上可以提高机体防御和清除自由基的能力，降低组织脂质过氧化损伤的作用，认为其原因是运动训练增加了氧运输系统的能力，组织缺氧相对程度较低，自由基生成较少，而且抗氧化能力得到加强．因此，运动训练，尤其是耐力性有氧训练，以及营养膳食或中医药等其他补剂的联合作用更能够提高机体抗氧化能力，并防止组织氧化损伤．参考文献：［１］杨峻山．沙漠人参－肉苁蓉［Ｊ］．中国药学杂志，２０１１，４６（１２）：８８１．［２］屠鹏飞，姜勇，郭玉海，等．肉苁蓉研究及其产业发展［Ｊ］．中国药学杂志，２０１１，４６（１２）：８８２－８８７．［３］王彦，张耀春，王立为．肉从蓉化学成分及改善智力抗衰老研究［Ｊ］．药物临床，２００４（２）：８－１１．［４］刘晓明，姜勇，孙永强，等．肉苁蓉化学成分研究［Ｊ］．中国药学杂志，２０１１，４６（１４）：１０５３－１０５８．［５］肖崇厚，杨松松，洪筱坤，等．中药化学［Ｍ］．上海：科学技术出版社，２００２．［６］朱梅菊，肖发强．大负荷训练后大鼠红细胞形态学变化及针灸的促恢复作用［Ｊ］．北京体育大学学报，２００６，２９（７）：９２８－９３０．［７］黄海，雷志平，望琨，等．运动人体机能实验学［Ｍ］．北京：人民体育出版社，２００６．［８］李建武，萧能赓，余瑞元，等．生物化学实验原理和方法［Ｍ］．北京：北京大学出版社，２００１．［９］冯伟权，谢敏豪，王香生，等．运动生物化学研究进展［Ｍ］．北京：北京体育大学出版社，２００６．［１０］Ｔｈｏｍａｓ　Ｄ　Ｐ，ｅｔａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｒｅｐｅａｔｅｄ　ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ　ｅｘｅｒｃｉｓｅ　ｏｎ　ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　ＳｐｏｒｔｓＭｅｄ，１９９８，９：２５７．［１１］陈旭，邓玉强，金其贯．运动和大豆多肽对高脂饮食大鼠肝组织抗氧化能力及肝细胞超微结构的影响［Ｊ］．广州体育学院学报，２００８，２８（２）：１１０－１１３．［１２］方明，施洪飞，曹晖，等．玉竹生津鸡汤对大负荷训练男运动员心肌组织损伤保护作用研究［Ｊ］．南京体育学院学报，２０１０，９（４）：２７－２８．［１３］刘洪珍，郭建军．不同有氧耐力训练对肌组织自由基代谢和抗氧化系统的影响［Ｊ］．中国运动医学杂志，２０００，１９（１）：９９－１００．［１４］王晓雯，蒋晓燕，邬利娅，等．肉苁蓉总苷体外清除自由基及对ＯＨ·引发的ＤＮＡ 损伤的保护作用［Ｊ］．中国药学杂志，２００１（１）：２９－３２．［１５］彭亮，覃辉艳，赵鹏，等．肉苁蓉茶对小鼠抗疲劳和耐缺氧能力的影响［Ｊ］．现代预防医学，２０１１，３８（１２）：２３６２－２３６４．［１６］杨宏新，杨勇，闫晓红，等．肉苁蓉抗运动性疲劳机制的实验研究［Ｊ］．中国中医药信息杂志，２００８，１５（４）：２４－２８．［１７］徐辉，魏晓东，欧芹，等．肉苁蓉不同成分抗衰老作用的研究［Ｊ］．黑龙江医药科学，２０１１，３４（１）：１－２．［１８］黎明华，汤长发，欧阳江琼，等．红景天昔对运动后自由基和能量化代谢改变的影响［Ｊ］．中国应用生理学杂志，２０１２，２８（１）：５３－５６．［１９］马莉，蒙东联，黎怀星，等．红景天昔对疲劳小鼠氧化损伤的保护作用［Ｊ］．中西医结合学报，２００９，７（３）：２３７－２４１．

C-NMR数据见表1。以上1 H-NMR和13 C-NMR数据与文献[ 16] 报道的osmanthusideB6(Z/E)一致。化合物12:浅黄色无定形粉末, ESI-MSm/z:785[ M-H] - , TLC经5%FeCl3显色呈蓝灰色, UV365下显亮蓝色荧光。1 H-NMR(500 MHz, DMSO-d6 )δ:0.94(3H, d, J=6.5 Hz, R-CH3 ), 2.68(2H, m, A-β ), 3.86(1H, m, A-α), 4.16(1H, d, J=8.0 Hz, G′-1), 4.33(1H, d, J=8.0 Hz, G-1), 4.69(1H, t, J=9.5 Hz, G-4), 5.00 (1H, s, R-1), 6.18 (1H, d, J=16.0 Hz, E-α), 6.48(1H, dd, J=8.0, 2.0 Hz, A-6),6.62(1H, d, J=7.5 Hz, A-5), 6.74(1H, d, J=7.5Hz, E-5), 6.99(1H, dd, J=7.5, 1.5 Hz, E-6), 7.01(1H, s, E-2), 7.48(1H, d, J=16.0 Hz, E-β )。13 CNMR数据见表1。以上1H-NMR和13 C-NMR数据与文献[ 4]报道的松果菊苷(echinacoside)一致。化合物13:白色针晶。ESI-MSm/z:375[ M -H] -。1 H-NMR(300 MHz, DMSO-d6 )δ:0.94(3H, d,J=7.2 Hz, CH3 ), 2.39(1H, m, H-9), 2.85(1H, m,H-5), 2.95(1H, t, J=8.4 Hz, G-2), 3.41(1H, dd,J=11.4, 5.7 Hz, G-6), 3.65 (1H, m, H-7 ), 4.11(1H, dd, J=10.8, 5.4 Hz, G-6), 4.47(1H, d, J=8.4Hz, G-1), 5.36(1H, d, J=4.2 Hz, H-1), 7.29(1H,s, H-3)。硅胶TLC行为与标准品一致。以上1 HNMR数据与文献[ 17]报道的8-表马钱子酸(8-epiloganicacid)一致。化合物14:白色无定形粉末。ESI-MSm/z:387[ M-H] - 。1 H-NMR(300 MHz, DMSO-d6 )δ:2.01(1H, m, H-6 ), 2.66 ～ 2.73 (2H, m, H-9, H-6),2.94 ～ 3.20(5H, m, H-5, G-2, G-3, G-4, G-5), 3.40(1H, m, G-6), 3.64(3H, s, COOCH3 ), 3.66(1H, m,G-6), 4.00(1H, d, J=14.0 Hz, H-10), 4.11(1H, d,J=14.0 Hz, H-10), 4.52(1H, d, J=7.8 Hz, G-1),5.12(1H, d, J=7.2 Hz, H-1), 5.68 (1H, s, H-7),7.47(1H, s, H-3)。13 C-NMR(75 MHz, DMSO-d6 )δ:34.5 (C-5 ), 38.0 (C-6 ), 45.8 (C-9 ), 51.0(COOCH3), 59.3(C-10), 61.0(G-6), 70.0(G-4),73.3(G-2), 76.6(G-5), 77.2 (G-3), 95.7(C-1),98.6(G-1), 110.9(C-4), 125.4(C-7), 144.1(C-8),151.6(C-3), 166.9 (C-11)。以上1 H-NMR和13 CNMR数据与文献[ 7]报道的京尼平苷(geniposide)一致。化合物15:白色粉末, mp168 ～ 169 ℃。FeCl3反应为阴性。硅胶TLC行为与标准品对照一致。1 H-NMR(300 MHz, DMSO-d6)δ:8.45(1H, s, H-2),8.06(1H, d, J=9.0 Hz, H-5), 7.54(2H, d, J=8.7Hz, H-2′, 6′), 7.24 (1H, s, H-8 ), 7.16 (1H, brd,J=9.0 Hz, H-6), 7.01(2H, d, J=8.7 Hz, H-3′, 5′),5.11(1H, d, J=6.6 Hz), 3.79(3H, s, OCH3 )。13 CNMR(75 MHz, DMSO-d6)δ:174.7(C-4), 161.5(C-7), 159.0(C-4′), 157.0(C-9), 153.6(C-2), 130.1(C-2′, 6′), 127.0(C-5), 124.0(C-1′), 123.4(C-3),118.4(C-10), 115.6(C-6), 113.6(C-3′, 5′), 103.4(C-8), 100.0(C-1″), 77.2(C-5″), 76.5(C-3″), 73.1(C-2″), 69.6(C-4″), 60.6(C-6″), 55.2(OCH3 )。以上1H-NMR和13 C-NMR数据与文献[ 18] 报道的芒柄花苷(ononin)一致。化合物16:无色粉末状结晶。1 H-NMR(300MHz, DMSO-d6 )δ:5.25(1H, dd, J=1.2, 8.1 Hz, H-4), 5.76(2H, s, H-8), 6.86(1H, d, J=8.1 Hz, H-6), 8.03(1H, s, H-3), 10.51(1H, s, H-1)。13C-NMR(75 MHz, DMSO-d6 )δ:62.6 (C-4), 156.9(C-2),157.5 (C-7 ), 173.7 (C-5)。以上1 H-NMR和13 CNMR数据与文献[ 19] 报道的尿囊素(allantoin)一致。化合物17:无色针状结晶, mp168 ～ 169 ℃。5%硫酸乙醇显色为黑灰色, TLC行为与标准品比较, 基本一致, 鉴定为半乳糖醇。REFERENCES[ 1 ] 　Ch.P(2010 )VolI(中国药典2010年版一部)[ S] .2010:126.[ 2 ] 　YANGJS.CistanchesHerba[ J] .ChinPharmJ(中国药学杂志), 2011, 46(12):881.[ 3 ] 　TUPF, JIANGY, GUO YH, etal.ReviewontheresearchprogressandindustrydevelopmentofCistanchesHerba[ J] .ChinPharmJ(中国药学杂志), 2011, 46(12):882 -887.[ 4 ] 　KOBAYASHIH, OGUCHIH, TAKIZAWAN, etal.Newphenylethanoidglycosides from Cistanche tubulosa (SCHENK)Hook.f.I[ J] .ChemPharmBull, 1987, 35 (8):3309-3314.[ 5 ] 　KOBAYASHIH, KARASAWAH, MIYASET, etal.StudiesontheconstituentsofCistanchisHerba.IV[ J] .ChemPharmBull,1984, 32 (10):3880-3885.[ 6 ] 　KOBAYASHIH, KARASAWAH, MIYASET, etal.StudiesontheconstituentsofCistanchisHerba.III[ J] .ChemPharmBull,1984, 32 (8):3009-3014.[ 7 ] 　KOBAYASHIH, KARASAWAH, MIYASET, etal.StudiesontheconstituentsofCistanchisHerba.Ⅵ [ J] .ChemPharmBull,1985, 33 (9):3645-3650.[ 8 ] 　MORIYAA, TUPF, KARASAWAD, etal.PharmacognosticalstudiesofCistanchisHerba(I)[ J] .NatMed, 1995, 49(4):383-393.[ 9 ] 　MORIYAA, TUPF, KARASAWAD, etal.PhamacognosticalstudiesofCistanchisHerba(II)[ J] .NatMed, 1995, 49(4):394-400.[ 10] 　TUPF, HEY P, LOU ZC.StudiesonthechemicalconstituentsofDesertlivingCistanche(Cistanchedeserticola)[ J] .NatProdResDevlop(天然产物研究与开发), 1997, 9(2):7-10.[ 11] 　CHENMH, LIUFS, XUJP.StudiesonthechemicalconstituentsofCistanchedeserticolaY.C.Ma[ J] .ChinaJChinMaterMed(中国中药杂志), 1993, 18 (7):424-426.[ 12] 　XUW H, QIUSX, ZHAOJH, etal.StudiesonthechemicalconstituentsofDesertlivingCistanche(Cistanchedeserticola)[ J] .ChinTraditHerbDrugs(中草药), 1994, 25 (10):509-513.[ 13] 　XUZH, YANGJS, LVRM, etal.StudiesonthechemicalconstituentsofDesertlivingCistanche(Cistanchedeserticola)[ J] .ChinTraditHerbDrugs(中草药), 1999, 30 (4):244-246.[ 14] 　YOSHIZAWAF, DEYAMAT, TAKIZAWAN, etal.TheconstituentsofCistanchetubulosa(SCHRENK)Hook.f.II[ J] .Chem PharmBull, 1990, 38 (7):1927-1930.[ 15] 　LEIL, JIANGY, LIUXM, etal.NewglycosidesfromCistanchesalsa[ J] .HelvChimActa, 2007, 90(1):79-85.[ 16] 　MIYASET, ISHINO M, AKAHORIC, etal.PhenylethanoidglycosidesfromPlantagoasiatica[ J] .Phytochemistry, 1991, 30(6):2015-2018.[ 17] 　SUGIYAMAM, KIKUCHIM.StudiesontheconstituentsofOsmanthusspecies.VI. Structuresofphenylpropanoidglycosidesfrom theleavesofOsmanthusasiaticusnakai[ J] .Chem PharmBull, 1990, 38 (11):2953-2955.[ 18] 　LIUY, ZHAOYY, TUGZ, etal.FlavonoidsfromtherootsofHedysarum gmelinii[ J] .Biochem SystEcol, 2005, 33 (8):809-812.[ 19] 　CUIB, MOTOYUKIN, JUNEIK, etal.ChemicalconstituentsofAstragalisemen[ J] .ChemPharmBull, 1993, 41 (1):178-182.

摘要:目的　研究肉苁蓉(CistanchedeserticolaY.C.Ma)的化学成分。方法　采用多种色谱方法进行分离, 利用光谱数据结合理化分析进行结构鉴定。结果　从肉苁蓉干燥肉质茎70%乙醇提取物中, 分离鉴定了17个化合物。分别为毛蕊花糖苷(1)、2′-乙酰基毛蕊花糖苷(2)、肉苁蓉苷C(3)、肉苁蓉苷D(4)、异毛蕊花糖苷(5)、管花苷B(6)、管花苷E(7)、盐生肉苁蓉苷D(8)、盐生肉苁蓉苷E(9)、plantainosideC(10)、osmanthusideB6(Z/E)(11a/b)、松果菊苷(12)、8-表马钱子酸(13)和京尼平苷(14)、ononin(15)、尿囊素(16)和半乳糖醇(17)。结论　化合物10、11a/b和15为首次从本属植物中分离得到。化合物7 ～ 9为首次从本种植物中分离得到。关键词:肉苁蓉;化学成分;苯乙醇苷肉苁蓉(CistanchedeserticolaY.C.Ma), 又称荒漠肉苁蓉, 为《中国药典》2005版和2010版收载的肉苁蓉的基原植物之一, 也是1985 年版～ 2000年版各版药典收载的肉苁蓉药材的唯一基原植物。具有补肾阳、益精血、润畅通便的功效, 常用于治疗男子阳痿、女子不孕、腰膝冷痛、血枯便秘等症[ 1-3] 。对肉苁蓉的化学成分, 日本学者小林弘美等进行了较系统的研究[ 4-7] , 但其论文是以盐生肉苁蓉[ C.salsa(C.A.Mey)G.Beck]名义发表的, 后经屠鹏飞等鉴定原植物为肉苁蓉(C.deserticola)[ 8-9] 。我国学者尽管也对肉苁蓉的化学成分有过研究, 但不是很系统和深入[ 8-11] 。因此, 为了进一步阐明肉苁蓉的化学物质基础, 同时为其生物活性和质量控制研究提供化合物, 本实验对荒漠肉苁蓉进行了较为系统的化学成分研究。利用多种色谱技术, 从肉苁蓉干燥肉质茎的70%乙醇提取物中, 分离鉴定了17 个化合物。包括:12个苯乙醇苷类化合物, 分别为毛蕊花糖苷(1)、2′-乙酰基毛蕊花糖苷(2)、肉苁蓉苷C(3)、肉苁蓉苷D (4)、异毛蕊花糖苷(5)、管花苷B(6)、管花苷E(7)、盐生肉苁蓉苷D(8)、盐生肉苁蓉苷E(9)、plantainosideC(10)、osmanthusideB6(Z/E)(11a/b)和松果菊苷(12);2个环烯醚萜苷类化合物:8-表马钱子酸(13)和京尼平苷(14);其他类型化合物3个:芒柄花苷(15)、尿囊素(16)和半乳糖醇(17)。化合物10、11a/b和15为首次从本属植物中分离得到;化合物7 ～ 9为首次从本种植物中分离得到。1　仪器与试剂紫外分光光度仪(TU-1901型);核磁共振波谱仪(瓦里安UNITYPLUS500型和JEOLJNM -A300型, TMS作内标);高效液相色谱仪:Waters600高效液相系统, ChromStationTM数据处理系统;冷冻干燥仪(德国产Christalpha2 -4主机)。硅胶包括薄层色谱用硅胶GF254 、硅胶H(10 ～ 40 μm)及柱色谱用硅胶(100 ～ 200目、200 ～ 300 目)均为青岛海洋化工厂产品;反相硅胶(RP-18, Pharmacia公司);SephadexLH-20(Pharmacia公司);聚酰胺薄膜(浙江黄岩市四青生化材料厂)。常规提取分离用溶剂均为分析纯;甲醇、乙腈为色谱纯。肉苁蓉药材采于内蒙古阿拉善左旗, 经北京大学药学院屠鹏飞教授鉴定为列当科植物肉苁蓉(Cistanchedeserticola)带鳞叶的肉质茎。2　提取与分离荒漠肉苁蓉干燥肉质茎20 kg, 用体积分数70%乙醇8倍量热回流提取3次, 60 ℃以下减压回收乙醇, 得稠膏。用水悬浮后, 依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。正丁醇层萃取物(240 g)首先用AB-8型大孔树脂进行粗分, 依次用水, 体积分数20%、40%、60%和95%乙醇进行洗脱。其中水洗脱部位加入适量体积分数95%乙醇, 析出大量白色结晶, 反复重结晶得到化合物17 (4 g)。滤液部分经SephadexLH-20和HPLC纯化后得到化合物14 (800 mg)。大孔树脂体积分数20%乙醇洗脱部位以硅胶柱色谱分离, 依次采用CHCl3 -MeOH-H2 O(9∶1∶0.1 ～ 1∶2∶0)梯度洗脱。流分38 ～ 39合并,用半制备HPLC分离纯化得到化合物11a/b(32mg)及16 (22 mg)。流分50析出大量白色结晶,经甲醇淋洗后, 得到化合物13 (1 g)。流分51 ～ 54合并, 用SephadexLH-20柱色谱分离, 以体积分数10% ～ 50% MeOH水溶液为洗脱剂, 得到26 个流分。流分10 ～ 12经HPLC纯化后, 得到化合物10(21 mg)。流分14 ～ 19 经纯化得化合物4 (10mg)。流分56 ～ 58经SephadexLH-20和HPLC纯化, 得化合物12 (30 mg)。流分10 ～ 13经HPLC纯化得化合物7 (9 mg)。正丁醇层大孔树脂体积分数40%乙醇洗脱部位用SephadexLH-20柱色谱分离, 以体积分数10% ～60%MeOH水溶液进行洗脱, 得到22个流分。流分5～ 7合并, 再次以硅胶柱色谱进行分离, 以CHCl3 -MeOH-H2 O(15∶1∶0.1 ～ 1∶2∶0)不同比例的溶液梯度洗脱, 得到21个流分。其中, 流分4经HPLC纯化后得到化合物15 (19 mg);流分8 ～ 10合并后用半制备型HPLC进行分离得到化合物3 (9 mg), 2 (48 mg),8 (11 mg), 9 (20 mg);流分12 ～ 17合并后经HPLC纯化后得到化合物1 (400 mg);流分10 ～ 16合并, 用硅胶柱色谱进行分离, 以CHCl3 -MeOH-H2 O(15∶1∶0.1 ～ 1∶2∶0)不同比例的溶液梯度洗脱, 得到12个流分。其中流分4 ～ 6合并后用半制备型HPLC进行分离得到化合物5 (90 mg), 6 (480 mg)。3　结构鉴定化合物1:ESI-MSm/z:625[ M -H] - , 浅黄色无定形粉末, TLC经5%FeCl3显色呈蓝灰色, UV365下显亮蓝色荧光。1 H-NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ:0.94 (3H, d, J=6.5 Hz, R-CH3 ), 2.68 (2H, m, A-β), 3.10 (1H, t, J=9.5 Hz, R-4), 3.59 (1H, m, A-α), 3.68 (1H, m, G-6), 3.86 (1H, m, A-α), 4.33(1H, d, J=8.0 Hz, G-1), 4.69 (1H, t, J=9.5 Hz, G-4), 5.00 (1H, s, R-1), 6.18 (1H, d, J=16.0 Hz, E-α), 6.48 (1H, dd, J=8.0, 1.5 Hz, A-6), 6.61 (1H,s, A-2), 6.62 (1H, d, J=7.5 Hz, A-5), 6.74 (1H,brd, J=7.5 Hz, E-5), 6.95 (1H, brd, J=7.5 Hz, E-6), 7.01 (1H, s, E-2), 7.44 (1H, d, J=16.0 Hz, E-β)。13 C-NMR数据见表1。以上1 H-NMR和13C-NMR数据与文献[ 4]报道的毛蕊花糖苷(acteoside)一致。化合物2:ESI-MSm/z:665[ M-H] - , 浅棕色无定形粉末, TLC经5%FeCl3显色呈蓝灰色, UV365下显亮蓝色荧光。1 H-NMR(500 MHz, DMSO-d6 )δ:0.90(3H, d, J=6.0 Hz, R-CH3 ), 1.96 (3H, s, OAc), 2.58(2H, m, A-β ), 3.06 (1H, t, J=9.5 Hz, R-4), 3.88(1H, m, A-α), 3.93 (1H, t, J=9.5 Hz, G-3), 4.59(1H, s, R-1), 4.66 (1H, d, J=8.5 Hz, G-1), 4.80(1H, t, J=9.5 Hz, G-4), 6.21 (1H, d, J=16.0 Hz, E-α), 6.42 (1H, dd, J=8.0, 1.5 Hz, A-6), 6.56 (1H, d,J=1.5 Hz, A-2), 6.60 (1H, d, J=8.0 Hz, A-5), 6.75(1H, d, J=8.5 Hz, E-5), 6.96 (1H, brd, J=8.0 Hz, E-6), 7.02 (1H, d, J=2.0 Hz, E-2), 7.46 (1H, d, J=16.0 Hz, E-β )。13 C-NMR数据见表1。以上1 H-NMR和13 C-NMR数据与文献[ 4]报道的2′-乙酰基毛蕊花糖苷(2′-acetylacteoside)一致。化合物3:ESI-MSm/z:637[ M -H] - , 浅棕色无定形粉末, TLC经5% FeCl3显色呈蓝灰色, UV365下显亮蓝色荧光。1 H-NMR (500 MHz, CD3 OD)δ:1.08 (3H, d, J=6.0 Hz, R-CH3 ), 2.82 (2H, m, A-β ), 3.83 (3H, s, OCH3 ), 4.08 (1H, m, A-α), 4.38(1H, d, J=8.0 Hz, G-1), 5.15 (1H, s, R-1), 6.26(1H, d, J=16.0 Hz, E-α), 6.70 (2H, m, A-6, A-2),6.76 (1H, d, J=8.0 Hz, A-5), 6.84 (1H, brd, J=8.0Hz, E-5), 6.95(1H, d, J=8.0 Hz, E-6), 7.05 (1H,brs, E-2), 7.59 (1H, d, J=16.0 Hz, E-β)。13 C-NMR数据见表1。以上1 H-NMR和13 C-NMR数据与文献[ 5] 报道的肉苁蓉苷C(cistanosideC)一致。化合物4:ESI-MSm/z:651[ M-H] -, 浅棕色无定形粉末, TLC经5%FeCl3显色呈蓝灰色, UV365下显亮蓝色荧光。1 H-NMR(500 MHz, CD3 OD)δ:1.08 (3H, d, J=6.0 Hz, R-CH3 ), 2.82 (2H, m, A-β), 3.83 (3H, s, A-OCH3 ), 3.88 (3H, s, E-OCH3 ),4.06 (1H, m, A-α), 4.38 (1H, d, J=8.0 Hz, G-1),5.19 (1H, s, R-1), 6.36 (1H, d, J=16.0 Hz, E-α),6.70 ～ 6.86 (4H, m, A-6, A-2, A-5, E-5), 7.05 (1H,d, J=8.0 Hz, E-6), 7.19 (1H, brs, E-2), 7.65 (1H,d, J=16.0 Hz, E-β )。13 C-NMR数据见表1。以上1H-NMR和13 C-NMR数据与文献[ 5] 报道的肉苁蓉苷D(cistanosideD)一致。化合物5:ESI-MSm/z:625[ M-H] - , 棕色无定形粉末, TLC经5%FeCl3显色呈蓝灰色, UV365下显亮蓝色荧光。1 H-NMR (300 MHz, DMSO-d6 )δ:1.10(3H, d, J=6.0 Hz, R-CH3 ), 2.69(2H, m, A-β ), 3.59 (1H, m, A-α), 3.80 (1H, m, A-α), 4.28(1H, d, J=8.4 Hz, G-1), 5.05(1H, s, R-1), 6.28(1H, d, J=15.6 Hz, E-α), 6.46(1H, dd, J=8.1,1.8 Hz, A-6), 6.59(1H, brs, A-2), 6.60(1H, brd, A-5), 6.74(1H, brd, J=8.1 Hz, E-5), 6.95(1H, dd,J=8.4, 1.5 Hz, E-6), 7.05(1H, d, J=1.5 Hz, E-2),7.47(1H, d, J=15.9 Hz, E-β )。13 C-NMR数据见表1。以上1 H-NMR和13 C-NMR数据与文献[ 4] 报道的异毛蕊花糖苷(isoacteoside)一致。化合物6:ESI-MSm/z:665[ M-H] -, 浅黄色无定形粉末, TLC经5% FeCl3显色呈蓝灰色, UV365下显亮蓝色荧光。1 H-NMR(500 MHz, CD3 OD)δ:1.23(3H, d, J=6.5 Hz, R-CH3), 1.96(3H, s, OAc),2.66(2H, m, A-β), 3.95(1H, m, A-α), 4.44(1H, d,J=8.0 Hz, G-1), 4.81(1H, s, R-1), 6.28(1H, d, J=16.0 Hz, E-α), 6.49(1H, dd, J=8.0, 2.0 Hz, A-6),6.62(1H, d, J=2.0 Hz, A-2), 6.64(1H, d, J=8.0Hz, A-5), 6.77(1H, d, J=8.0 Hz, E-5), 6.90(1H,dd, J=8.5, 2.0 Hz, E-6), 7.04(1H, d, J=2.0 Hz, E-2), 7.56(1H, d, J=16.0 Hz, E-β )。13 C-NMR数据见表1。以上1 H-NMR和13C-NMR数据与文献[ 4] 报道的管花苷B(tubulosideB)一致。化合物7:棕色无定形粉末, ESI-MSm/z:649[ M-H] -, TLC经5%FeCl3显色呈蓝灰色, UV365下显亮蓝色荧光。1 H-NMR(500 MHz, DMSO-d6 )δ:1.07(3H, d, J=6.0 Hz, R-CH3), 1.87(3H, s, OAc),2.66(2H, m, A-β ), 4.26(1H, d, J=8.0 Hz, G-1),5.02(1H, s, R-1), 6.40(1H, d, J=16.0 Hz, E-α),6.40 ～ 6.60(3H, m, A-6, A-2, A-5), 6.74(2H, d, J=8.0 Hz, E-3, E-5), 6.95(2H, d, J=8.0 Hz, E-2, E-6), 7.46(1H, d, J=16.0 Hz, E-β )。13 C-NMR数据见表1。以上1 H-NMR和13 C-NMR数据与文献[ 12] 报道的管花苷E(tubulosideE)一致。化合物8:ESI-MSm/z:649[ M-H] -, 浅棕色无定形粉末, TLC经5% FeCl3显色呈蓝灰色, UV365下显亮蓝色荧光。1 H-NMR(300 MHz, DMSO-d6 )δ:0.92(3H, d, J=6.0 Hz, R-CH3), 1.98(3H, s, OAc),2.67(2H, m, A-β ), 4.61(1H, s, R-1), 4.62(1H, d,J=8.0 Hz, G-1), 6.63 (2H, d, J=8.1 Hz, A-3, A-5), 6.75(1H, d, J=8.4 Hz, E-5), 6.95 ～ 7.00(3H,m, A-2, A-6, E-6), 7.02(1H, s, E-2), 7.47(1H, d, J=16.0 Hz, E-β )。13 C-NMR数据见表1。以上1 HNMR和13 C-NMR数据与文献[ 13] 报道的盐生肉苁蓉苷D(salsasideD)一致。化合物9:ESI-MSm/z:679[ M -H] - , 浅黄色无定形粉末, TLC经5%FeCl3显色呈蓝灰色, UV365下显亮蓝色荧光。1 H-NMR(500 MHz, DMSO-d6 )δ:0.94(3H, d, J=6.0 Hz, R-CH3 ), 1.87(3H, s, OAc),2.68(2H, m, A-β ), 3.11(1H, t, J=9.0 Hz, R-4),3.48(1H, m, A-α), 3.75(3H, s, OCH3 ), 3.92(1H,m, A-α), 4.36(1H, d, J=7.5 Hz, G-1), 4.72(1H, t,J=9.5 Hz, G-4), 5.04(1H, s, R-1), 6.18(1H, d, J=16.5 Hz, E-α), 6.63 (1H, brd, J=8.0 Hz, A-6),6.69(1H, brd, A-5), 6.75 (1H, brd, J=7.5 Hz, E-5), 6.84(1H, brs, A-2), 6.95(1H, brd, J=7.5 Hz,E-6), 7.02(1H, brs, E-2), 7.46(1H, d, J=16.5 Hz,E-β )。13 C-NMR数据见表1。以上1 H-NMR和13 CNMR数据与文献[ 14] 报道的盐生肉苁蓉苷E(salsasideE)一致。化合物10:ESI-MSm/z:637[ M-H] -, 浅黄色无定形粉末, TLC经5%FeCl3显色呈蓝灰色, UV365下显亮蓝色荧光。1 H-NMR(300 MHz, CD3 OD)δ:1.24(3H, d, J=6.3 Hz, R-CH3 ), 2.23 (2H, m, A-β), 3.77(3H, s, OCH3 ), 4.33(1H, d, J=7.8 Hz, G-1), 5.18(1H, s, R-1), 6.27(1H, d, J=16.0 Hz, E-α), 6.53(1H, dd, J=8.1, 1.5 Hz, A-6), 6.62(1H,d, J=8.1 Hz, A-5), 6.67(1H, d, J=1.5 Hz, A-2),6.80(1H, brd, J=7.5 Hz, E-5), 7.01(1H, brd, J=7.5 Hz, E-6), 7.16(1H, d, J=1.5 Hz, E-2), 7.57(1H, d, J=16.0 Hz, E-β)。13 C-NMR数据见表1。以上1H-NMR和13 C-NMR数据与文献[ 15] 报道的plantainosideC一致。化合物11:ESI-MSm/z:607[ M-H] -, 浅黄色无定形粉末, TLC经5%FeCl3显色呈蓝灰色, UV365下显亮蓝色荧光。1 H-NMR(500 MHz, DMSO-d6 )δ:1.07(3H, d, J=6.0 Hz, R-CH3 ), 2.71 (2H, m, A-β), 4.26(1H, d, J=8.0 Hz, G-1), 5.29 (1H, s, R-1), 5.76(1H, d, J=13.0 Hz, Ea-α), 6.39(1H, d,J=16.0 Hz, Eb-α), 6.59(2H, d, J=8.0 Hz, Ab-3,5), 6.60(2H, d, J=8.0 Hz, Aa-3, 5), 6.73(2H, d,J=8.5 Hz, Ea-3, 5), 6.76(2H, d, J=8.5 Hz, Eb-3,5), 6.84(1H, d, J=13.0 Hz, Ea-β ), 6.97(2H, d,J=8.5 Hz, Aa-2, 6), 6.99(2H, d, J=8.5 Hz, Ab-2,6), 7.49(2H, d, J=8.5 Hz, Eb-2, 6), 7.53(1H, dJ=16.0 Hz, Eb-β ), 7.64(2H, d, J=8.5 Hz, Ea-2,6)。

俞立新＇陈学强 吴群峰！董卫芹！郭松华于健冯炜杨雷傅一峰＇李俊杰罗程1 中国人民解放军第九八医院 浙江 湖州 3130002 浙江中医药大学浙江杭州3100533 浙江省杭州市富阳中医骨伤医院 浙江 杭州 311400摘要 目的：观察肉苁蓉水提物对大鼠骨质疏松性骨折愈合的影响并初步探索其作用机制。方法：将SPF级SD雌性大鼠随机分成对照组、模型组、治疗组，按相关方法造模。骨折造模24h后，对照组和模型组分别予以生理盐水灌胃，治疗组予肉苁蓉水提液灌胃，每日1次，干预2周、6周后腹主动脉取血分离血清检测其中白介素-1β（IL-1β）与转化生长因子-β1（TGF-β1）水平，同时收取骨折标本，固定后行Micro-CT扫描，测量ROI骨痴骨体积分数（BV／TV）等相关参数，再经脱钙、脱水、包理后制成蜡块待用。结果：骨质疏松造模6周后，模型组与治疗组大鼠骨密度均低于对照组（P＜0.05），但治疗组与模型组间差异不明显，治疗组在千预2周、6周后骨密度虽然仍低于对照组，但明显高于模型组（P＜0.05）。Micro-CT扫描显示治疗组BV／TV、Tb．Sp、Tb．N、Tb．Th、SMI在干预后2周、6周 均优于模型组，且对照组BV／TV、Tb．Sp．SMI参数与治疗组差异不明显，而模型组2时间点Micro-CT参数均劣于对照组。干预2周、6周后，比较3组血清IL-1B、TGF-B1水平发现治疗组IL-1β水平2周时均低于其他两组，6周时，虽然治疗组IL-1B水平高于对照组，但仍明显低于模型组（P＜0.05）；TGF-β1水平方面，治疗组在2周、6周时均高于模型组和对照组，且与对照组间差异无统计学意义。结论：依据骨密度、Micro-CT扫描参数分析及血清IL-1B、TGF-B1水平，发现肉苁蓉水提物可促进骨质疏松性骨折愈合，而其机制可能与其可抑制骨质疏松骨折后大鼠血清IL-1B和促进TGF-β1分泌，进而改善骨质疏松、促进骨折愈合有关。关键词 骨质疏松性骨折 肉苁蓉 骨折愈合 大鼠骨质疏松症是一种以骨密度降低与骨组织微细结构破坏，骨脆性增加的一种疾病，患者可在日常生活中受轻微外力下引起骨折，是临床常见病、多发病。且这一类骨折因患者多为老年人，常合并其他疾病，且骨折多为粉碎性，稳定性差，骨折愈合迟缓或不愈合时有发生，存在较高的致残率、致死率。目前有关其治疗主要是通过手术、手法整复联合抗骨质疏松治疗，缺少骨质疏松骨折患者针对性治疗药物，而中药治疗骨质疏松历史悠久，疗效肯定，许多中药被证实既可改善骨质疏松同时还可促进骨折愈合。肉苁蓉属于常用补肾阳代表药，具有补益肝肾作用。中医学认为，肾主骨，骨折治法也多不离补肾益精，现代药理学发现肉苁蓉还具有一定雌激素样作用。本研究拟通过骨密度测量、Micro-CT和血清白介素-1β（IL-1β）、转化生长因子-β1（TGF-B1）水平观察并肉苁蓉水提物对大鼠骨质疏松性骨折愈合的影响并初步探索其内在机制。1 材料与方法1.1 实验动物与试剂器材：体重210～250gSPF级雌性SD大鼠52只，饲养于浙江中医药大学动物实验中心。络合碘，杭州朗索医用消毒剂有限公司，批号20160720；青霉素，华北制药股份有限公司，批号F3117217；IL-1β试剂盒（批号：20160715）、TGF-β1试剂盒（批号：20160722）；双能X线骨密度扫描仪，OSTEOCORE2；Mi-cro-CT,Skyscan1176。1.2 肉苁蓉水提液提取：将碾碎肉苁蓉（浙江中医药大学药厂）10倍超纯水浸泡0.5小时，煎锅煎煮1.5小时，重复提取2次，混合药液旋蒸仪浓缩至浓度1.5g／ml，存放4℃冰箱备用。1.3 造模制备：分述如下。1.3.1 骨质疏松模型：大鼠造模前适应性饲养1周后随机分成对照组、模型组、治疗组，分别16只、18只、18只，每组依2周、6周时间点各分成两小组，治疗组和模型组均1％戊巴比妥钠麻醉（0.4ml／100g）后备皮、消毒、铺巾、切开皮肤后摘除大鼠双侧卵巢，对照组仅切开不摘除卵巢。1.3.2 骨折模型：骨质疏松造模后6周后准备制备骨折模型，各组大鼠麻醉后行股骨中段骨密度测定，完成后取大鼠右侧股骨中段进行备皮、消毒、铺巾、切开，行股骨中段横行骨折造模叫，并以1mm克氏针固定，消毒缝合切口皮肤。1.4 药物千预：造模术后行股骨X线检测，剔除模型制备失败大鼠，并在造模后肌注8万单位青霉素预防感染。术后24h治疗组开始子肉苁蓉水提物灌胃（浓度1.5g／ml，1g／kg，每日1次），对照组与模型组则予同体积生理盐水灌胃。1.5 样本收取：干预后2周、6周后收取大鼠样本，各组大鼠1％戊巴比妥钠麻醉后，腹主动脉取血5～10ml制备血清，储存于-20℃冰箱备用。然后处死大鼠，收取股骨骨折样本，并置于10％中性甲醛固定72小时。1.6 检测指标：分述如下。1.6.1 骨密度：所有骨质疏松造模后大鼠，行骨折造模前均麻醉后行股骨中段骨密度测定。3组大鼠在干预2周、6周后收取样本，样本在固定72小时后再次行骨密度测定。1.6.2 Micro-CT：样本固定72小时后进行Micro-CT扫描，以骨折端上下各200张图片作为感兴趣区域（ROI），扫描角度360°，电流555uA、电压42kV，滤光片A10.2mm，分辨率8.73μm，完成后进行骨痂三维图像重建与分析。检测参数如下：骨体积分数BV／TV、骨小梁模式因子（Tb.Pf）；结构模型指数（SMI）等。1.6.3 血清IL-1β、TGF-β1测定：从-20℃冰箱解冻各组大鼠血清，分别按照IL-1β和TGF-β1试剂盒说明书逐步进行检测。1.7 统计学方法：采用统计分析软件SPSS．19进行处理。实验数据均用以均数士标准差（x±s）表示，3组大鼠骨密度、Micro-CT参数、IL-1B．TGF-β1水平均采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，检验水准为P＜0.05。2 结果2.1 3组骨密度情况：见表1。表1 各组大鼠股骨中段骨密度结果（x±s，g／c㎡）组别 只数02w9对照组 8 0.34±0.020.34±0.030.34±0.02模型组 9 0.23±0.030.22±0.0240.21±0.014治疗组 9 0.22±0.020.24±0.02*40.27±0.02注：与模型组比较，＊P＜0.05；与对照组比较．ΔP＜0.05。2.2 Micro-CT二维截面：矢状位二维截面选取各组各时间点股骨纵轴中心截面图片（见图1），水平面二维截面图则选取骨折线下第100图片进行对比（图2），从图中可见各组骨痂随时间逐渐增多，但在骨折后6周不同程度塑性；同时可见对照组骨痂体积大，6周后骨痂皮质厚实并爬过骨折线，而模型组2周时骨痂骨质较少，6周后骨痂皮质稀松，治疗组2周时骨痂体积虽不大，但骨痂中骨质较模型组多，6周后骨痂塑形较好且骨折线不明显。图1 各组股骨中段失状位截面图2 各组股骨中段水平截面图2 各组股骨中段水平截面2.3 Micro-CT三维重建：股骨中段骨折端骨痂三维重建见图3。从图3可见各组骨折后2周骨痂沿骨折线两端骨膜形成，但各组骨折线仍然清晰，模型组与治疗组尤为明显，而骨折6周后对照组骨痂厚实，多以板状骨小梁为主，骨折线消失，而模型组骨质稀松，骨折线较模糊，但治疗组骨痂骨质较多，骨小梁规则且厚实，骨折线不明显。 图3 骨折端ROI骨痴三维重建2.4 Micro-CT参数指标：运用软件对骨折端骨痂进行 分析得到相关参数见表2。表2 各组Micro-CT参数比较（±s）对照组(n=8)模型组(=8)治疗组(z=8)2w926w2w9BV/TV30.09±2.4654.46±2.2432.39±2.2338.31±1.83436.54±2.5952.73±2.64*Tb.Sp3.71±0.353.61±0.224.18±0.2244.51±0.183.70±0.21*3.56±0.13Tb.N0.33±0.020.33±0.030.16±0.020.15±0.0140.22±0.01*40.24±0.03*Tb.Th0.37±0.010.37±0.020.22±0.0240.21±0.0140.25±0.01*40.27±0.01*4SMI1.69±0.081.70±0.082.62±0.1242.79±0.1042.29±0.19*41.62±0.08注：与模型组比较，＊P＜0.05；与对照组比较，ΔP＜0.05。2.5 血清IL-1β、TGF-β1水平：见表3。表3 各组IL-1B、TGF-β1水平比较（G±s，n＝8）组别IL-18TGF-B12w92x9对照组 319.25±13.31 109.46±3.40130.98±5.8735.65±1.86模型组 333.87±10.35 168.15±4.8397.28±6.21 28,86±1.70治疗组 309.28±6.39 11910±3.56136.96±7.43° 33.90±2.33注：与模型组比较．＊P＜0.05；与对照组比较，ΔP＜0.05。3 讨论近年来，中药淫羊藿、骨碎补及复方（青娥丸、六味地黄丸等）在临床实践中被证实可明显改善骨质疏松症候口，这类中药及复方多以补益肝肾为主，这与骨折中后期补肾续筋原则一致。肉苁蓉始载于《神农本草经》，李时珍曰：“此物补面不峻，故有从容之义”，苁蓉味甘、咸，性温，具有补肾壮阳、填精补髓、养血润燥、悦色延年之功。本研究中，干预2周，6周后治疗组骨密度均高于模型组（P＜0.05），Micro-CT扫描BV／TV参数显示治疗组在干预后两个时间点结果与骨密度测定结果一致，而BV／TV是骨质疏松性骨折愈合评估的重要指标，直接反映骨痂骨质含量，这说明肉苁蓉可能具有促进成骨的作用，分析原因可能与肉苁蓉中有效成分具有上调BMP2作用有关，而BMP2为TGF-β家族中成员之一。并且这一结果也被Micro-CT扫描其他参数（Tb.Sp、Tb.N、Tb.Th、SMI）所印证，Tb.Sp.SMI反映的是骨痂生物力学特性，治疗组中数值明显优于模型组，这也进一步提示肉苁蓉具有改善骨量丢失，促进成骨进面加快骨折愈合的作用。在血清IL-1B、TGF-B1水平方面，干预2周、6周后发现治疗组IL-1β水平2周时均低于其他两组，在6周时，虽然治疗组IL-1β水平高于对照组，但仍明显低于模型组（P＜0.05）；而治疗组TGF-β1水平，在2周、6周时均高于模型组和对照组，且与对照组间差异无统计学意义。而IL-1β水平直接影响破骨细胞的分化与活性，其水平升高将会促进骨吸收，抑制成骨细胞增殖、分化，但TGF-β1则与骨性干细胞增殖、分化、迁移密切相关，具有促进软骨和骨痂形成，加快骨痂塑形的作用，这提示肉苁蓉改善骨量丢失，促进成骨，加快骨折愈合作用可能通过降低骨质疏松性骨折大鼠IL-1β水平、抑制破骨细胞活性实现；此外可能还与肉苁蓉可升高骨折大鼠TGF-β1水平，促进成骨分化与骨痂成熟塑形有关。综上所述，依据骨密度、Micro-CT扫描参数分析及血清IL-1B、TGF-β1水平，发现肉苁蓉水提物可改善骨丢失，促进骨质疏松性骨折愈合，而其机制可能与其可抑制骨质疏松骨折后大鼠血清IL-1B分泌和促进TGF-β1分泌，进而改善骨质蔬松、促进骨折愈合有关。4 参考文献［1］马远征，王以朋，刘强，等，中国老年骨质疏松症诊疗指南（2018）［J］．中国骨质疏松杂志，2018,24（12）：1541-1567．［2］朱刚，孙海斌，徐刚，等，肉苁蓉醇提物对去卵巢骨质疏松大鼠的治疗作用及其机制［J］.吉林大学学报（医学版），2018.44(1):68-72.[3]Karvande A,Khedgikar V.Kushwaha P,et al.Heart-wood extract from Dalbergia sissoo promotes frac ture healing and its application in ovariectomy-in duced osteoporotic rats[J].Journal of Pharmacy and Pharmacology,2017,69(10):1381-1397.[4]Kevin O'Neill,Christopher M S,Nicholas A M,et al.Micro-computed tomography assessment of the pro-gression of fracture healing in mice[J].Bone,2012, (6):1357-1367.［5］姚新苗，史晓林，王健，等，浙江省中医药防治原发性骨质疏松症分级诊疗专家共识（2017）［J］．浙江中医杂志，2018，53(4):237-241.［6］马猛，张志国，马晓辉，单味及复方中药防治骨质疏松症的研究进展［J］．中国医药导刊，2018,20（8）：477-481．［7］张跃全，郑丹红，许建峰，等，荒漠肉苁蓉对快速老化骨质疏松小鼠BMP-2蛋白表达的影响［J］．宁夏医学杂志，2014，36(12):1114-1116.

杨志蓉1.3 2.3 甘世祥 冯书堂朱桂玉（1．贵阳中医学院，贵阳 550002）（2．曲阜师范大学，山东曲阜 273100）（3．中国农业科学院畜牧研究所，北京 100094）摘要：目的 探讨肉苁蓉水提液对猪早期体外发育胚胎中一氧化氮浓度的影响，以研究肉苁蓉促进猪胚胎发育的药理作用。方法 将采集的猪卵母细胞随机分为试验组和对照组，试验组在胚胎培养时在基础液中加入50tg／mL肉苁蓉水提液。将培养至囊胚阶段的胚胎取出，用Griee试剂法测定囊胚细胞中NO含量，结果 细胞中NO含量显著低于对照组（P＜0.05），结论 肉苁蓉水提液减少了胚胎细胞中NO含量，这可能是其促进细胞体外发育的作用机理之一。关键词：肉苁蓉；一氧化氮：体外发育：猪：胚胎中图分类号：R915 文献标识码：A 文章编号：1006-6179（2007）04-0027-03肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉（Citache deseticolaMa）的干燥带鳞片的肉质茎，其味甘、咸，性温。归肾、大肠经。中医学认为其功效主要有温肾壮阳、补肾益精、润肠通便。现代研究表明具有清除氧自由基的作用。一氧化氮（NO）广泛存在于各种细胞中，在哺乳动物的心血管系统、神经系统、免疫系统和生殖系统等正常的生理活动和病理变化中发挥着十分重要的作用。NO在生殖相关过程中扮演了重要角色，包括配子的发生、类固醇激素的生成、卵泡的排卵、卵母细胞的减数分裂和成熟、配子的受精、受精卵的卵裂、胚胎着床及细胞凋亡等等，这已经在大鼠、牛、兔、猪等多种哺乳动物得到了证实。正常的胚胎发育需要NO的调节，也就是说，哺乳动物胚胎在生长过程中自身产生的NO是胚胎正常发育所必需的，并参与胚胎的分裂分化。在胚胎的体外培养过程中，体外培养胚胎的发育率和质量远不如体内胚。其原因很多，是否与胚胎在体外发育过程中产生了的过多NO有关？本试验在对NO前期研究的基础上，对培养到囊胚阶段的胚胎中NO含量进行了测定，观察添加中药是否对胚胎NO含量产生影响，以期揭示肉苁蓉促进胚胎发育的药理机制。1 材料与方法1.1材料1.1.1 主要仪器设备：超净工作台，江苏净化设备有限公司：体视显微镜 SMZ1000，Nikon Japan；二氧化氮培养箱，NUAIRE US：融合仪 ECM 2001．BTXUS：超纯水净化装置 Biocell，Milli-Q.US：酶标仪318-MIC，上海三科精密仪器有限公司。1.1.2 主要药品与试剂：本试验所用试剂除特殊说明外均购自 Sigmm公司。PMSG HCG，宁波市激素制品有限公司：总NO检测试剂盒S0023，碧云天生物技术研究所：RIPA裂解液P0013D，碧云天生物技术研究所。1.1.3 肉苁蓉水提液的制备：取5g肉苁蓉用适量Milli-Q水浸泡30min后，大火煎煮，水沸腾后改为文火煎煮20min：煎煮3次合并煎煮液并定溶至100mL，使其终浓度为每毫升含生药50mg的肉苁蓉水提液：高压灭菌后4℃保存备用。1.2 实验方法1.2.1 卵母细胞的采集：从屠宰场收集刚刚屠宰的猪卵巢，保存在加有30℃～36℃灭菌并添加双抗的生理盐水的洁净保温瓶内，在2～3h内尽快送回实验室，然后用相同温度和同样的生理盐水清洗2～3次，再用带有18号针头的10mL无菌注射器抽取直径2～8mm卵泡中的卵母细胞，2h内抽完。将抽取液缓慢注入置于38℃恒温水浴锅的50mL离心管中，使卵母细胞自然沉降，用滴管吸去上清液。1.2.2 卵母细胞的体外成熟培养：在沉淀好的液体中加入PVA-DPBS，将沉淀物倒入划线的60mm培养皿中，在体视显微镜下用口吸管迅速挑出胞质均匀、且有3层以上完整致密的卵丘细胞包裹的卵丘细胞一卵母细胞复合体（Camulus＂oocytes＂compleses. Cocs），用预热的成熟培养液洗涤3遍，移入成熟培养液中，在39℃、5％CO2培养条件下培养。Cocs先在成熟培养液中培养20h±2h．然后转移到无PMSG和HCG的成熟培养液中培养。1.2.3 卵母细胞的孤雌激活：卵母细胞培养44h后，移入含0.1％的透明质酸酶的小管中，用100L枪头吹打脱去颗粒，获得无颗粒细胞的卵母细胞，然后在显微镜下挑出有第一极体且胞质均匀的卵母细胞用于激活。将形态较好且有第一极体的卵母细胞转移到无钙H-NCSU-23（Hepes bxffered NCSU-23．HN）中洗涤3 遍，再转移到融合液中平衡20s，每批50个左右，放入已经有融合液的融合槽中（电极宽度为500／m。美国BIX），用ECM2001融合仪施加一个30,1.6kV／cm的直流电脉冲来诱导激活。取出处理的卵母细胞，用NCSU-23＋0.4％BSA＋10ng／mL．CB中洗涤3遍后，进行胚胎培养。1.2.4 胚胎培养：将洗涤干净的胚胎移入NCSU-23＋0.4％BSA＋10mg／ml．CB中培养4～6h后，再移入无CB的NCSU-23＋0.4％BSA中，在39℃、5％CO：培养条件下进行培养。培养方法用微滴培养法，液滴的大小为50L，每滴放20～25枚卵，培养144h后进行NO含量测定。1.2.5 NO含量测定：采用硝酸盐还原酶法。按照试剂盒说明书进行操作，根据标准液不同浓度梯度绘制标准曲线，计算回归方程，利用标准曲线方程进行样品NO含量计算。1.3 实验设计202China Academic oumal Electronic试验设试验组和对照组，试验组在胚胎阶段在基础培养基（NCSU-23＋0.4％BSA）中添加50tg／ml浓度的肉苁蓉水提液1L，对照组不添加任何试剂。将培养至囊胚阶段的胚胎取出，按照试剂盒上的操作步骤说明-检测胚胎细胞中NO的含量。1.4 数据处理将试验中获得的数据用士。形式记录，用SPSS11.5软件对数据进行处理，数据采用：检验。2 结果以配的标准液的不同浓度梯度测得其相应的OD值-根据测得的OD值与其对应的浓度梯度，绘制标准曲线，求得回归方程为：y=0.0026x+0.0908(r=0.9578)再根据标准曲线回归方程得出NO含量，见表1。表1 囊胚细胞中 NO含量测定结果组别日NO含量（ml／L）对照组526.33±1.90试验组520.30±0.96注：不同小写字母之间表示差异显著（P＜0.05）。由表中可以看出，经过体外培养到囊胚阶段，胚胎细胞中NO含量均较高，但添加肉苁蓉水提液后其胚胎细胞中NO含量明显降低，与对照组有显著性差异（P＜0.05）。3讨论NO作为一种细胞间及细胞内信息分子，广泛存在于各组织器官的各种细胞中，参与机体的生理，病理调节过程，其在生殖系统中的作用已引起生殖学家的重视。现已确认，NO参与几乎所有生殖活动，在雌性表现为类固醇激素的生成、卵泡发育、排卵和闭锁、卵母细胞的减数分裂成熟、受精、妊娠以及胚胎的发育等。在雄性表现为参与精子的发生、睾酮的分泌和睾丸内血流的调节等生理过程。在大多数组织中，NO作为细胞间信号的传递体是通过激活GC来实现的。现有的资料表明，L-Arg-NO-cGMP通路在人类和动物多种组织和细胞中广泛存在，它代表着一种细胞间信息传递和细胞功能调节的新的信号传导机制。当前在很多研究中都发现NO的作用具有双重性，如Bu等的研究就证明了NO对于卵母细胞的体外成熟就具有双向调节的作用。一方面，NO作为重要的信使分子，参与细胞信号转导过程：另一方面，作为一种自由基，NO又具有细胞毒性，这取决于局部NO的生成量。当局部NO的浓度升高至／mol／L级水平时，它即可与周围的超氧阴离子（O2-）迅速反应，生成过氧亚硝基阴离子（peraxynitrite.ONOO）.ONOO是一种强氧化剂，可 有效地氧化蛋白质巯基、铁硫中心（Fe／s）、锌指结构、硝基化蛋白质的酪氨酸残基，使许多重要的蛋白质或酶失活，影响细胞代谢，并抑制呼吸链酶，破坏线粒体结构，使DNA链断裂，而致细胞死亡，并可启动脂质过氧化，从而导致组织损伤。ONNO在低于生理pH值时，分解为更强的自由基，具有很大的细胞毒性。我们在试验中发现，经过体外培养后，到囊胚阶段细胞中NO含量均超过了＃md／L水平，也就是说其内所含的NO的量已对细胞产生毒性作用。这可能是导致体外培养胚胎发育率和质量不如体内胚的原因之一。因为在体外培养的过程中，不可避免地会产生氧自由基，加之NO不稳定，化学性质活泼，常与氧、超氧自由基或由氧衍生的自由基以及氧合血红蛋白发生反应凹，从而引起对细胞的毒性作用，导致细胞停止发育或死亡。肉苁蓉是中药中的一味补肾药，具有温肾壮阳、补肾益精的功效。在临床上常用于不孕不育症的治疗，其所含的有效成分肉苁蓉总苷、多糖均具有抗氧化、清除体内氧自由基的作用，能对抗胚胎发育过程中所产生的氧自由基，促进胚胎的发育。王晓雯等叫报道了肉苁蓉具有抗氧化作用及对OH·引发的DNA损伤的保护作用。李琳琳等“证实了肉苁蓉总苷的抗脂质过氧化作用，孙云的研究也证明了肉苁蓉具有对抗自由基损伤的作用。本研究在试验组中添加了肉苁蓉水提液，在一定程度上清除了胚胎在体外培养过程中所产生的自由基，减少了NO的生成，从而提高了胚胎体外发育率，这也可能是肉苁蓉促进胚胎体外发育的原因。

罗光明1，黄远亮2（1．同济大学，上海200072；2．同济大学附属东方医院，上海200120）摘要：现代药理学研究证实，补益肾阳类传统中药内苁蓉具有广泛药理作用和丰富的化学成分。肉苁蓉主要活性成分之一松果菊苷具有神经保护、促进新骨形成、抗氧化、抗组织损伤、抗炎等作用，是安全有效的植物雌激素因子，现对其药理作用作一简要综述。关键词：肉苁蓉；松果菊普中图分类号：R285    文献标识码：A    文章编号：1673-2197（2014）17-0058-031 肉苁蓉化学成分及药理作用肉苁蓉Y.C.Ma（C.deserticola）是一种生长于干早和半干旱地区的药用植物，在中国中草药市场存在四种肉苁蓉物种：沙漠肉苁蓉（C.Deserticola）、德赢vwin登录 （C.Tu-bulosa）、盐生肉苁蓉（C.salsa）、沙苁蓉（C.sinensis），通过化学指纹结合基因指纹能鉴别和控制肉苁蓉质量，肉苁蓉属种是常年寄生草药，主要分布于陆地和热荒漠，传统中医主要用作滋补药，主治肾虚、阳痿、女性不育、白带异常，子宫不规则出血过多、老年性便秘等症状，故有“沙漠人参”之称。现代药理学研究已经证实肉苁蓉具有广泛药用功能，包括激素样调节作用、通便、免疫调节、神经保护、抗氧化、抗细胞凋亡、抗损伤、抗炎、抗衰老、抗疲劳活性以及促进骨的形成［.，还可能具有保护心脏并能抗心肌缺血性损伤、预防和治疗高血糖、高血脂症的功能（0。近年来，人们对肉苁蓉的化学成分进行了大量研究，从其中分离出多种化合物，分析鉴定为：挥发油类、苯乙醇苷（phenylethanoid glycosides，PhGs，主要包含松果菊苷和阿克替试）、三十烷醇、咖啡酸糖脂，环烯醚萜类，木脂素类，多羟糖醇、寡糖类、甜菜碱、谷甾醇、胡萝卜苷、甘露醇、硬脂酸，β-谷固醇、胡萝卜甙、琥珀酸、多糖类等。其中，PhGs是治疗肾虚、抗氧化、神经保护的主要活性成分；半乳糖醇、寡糖类是治疗老年性便秘的活性成分；多糖由鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖浓缩而来，多糖是抗衰老、改善机体免疫力的活性成分。Nan等又从塔中栽培荒漠肉苁蓉干燥肉质茎的85％乙醇提取物中分离得到紫丁香苷、去甲基紫丁香苷、松柏苷、苄基葡萄糖苷、烟酰胺、对羟基苯甲酸、对羟基苯乙醇、半乳糖醇等17种化合物。沙漠肉苁蓉中还含有丰富的锰，钾、钙、镁、钠等微量元素，在肉苁蓉不同生长阶段，微量元素含量比例不同。2 松果菊苷（Echinacoside，ECH）松果菊苷是沙漠肉苁蓉主要活性成分之一，从其他药用植物如密蒙花、紫锥花属中也能分离出松果菊苷.町，其具有如下药理作用。2.1 神经保护［m］松果菊苷能逆转保护鱼藤酮、中动脉闭塞、6-羟多巴胺诱导的多巴胺能神经元损伤，短暂接触松果菊苷，即具有足够保护抗鱼藤酮损伤过表达TrkA或TrkB受体的神经元细胞和非神经元细胞的作用，其机制与松果菊苷短暂抑制细胞色素C（cytochrome c）的释放并激活细胞凋亡蛋白酶-3（caspasc-3）有关。松果菊苷也能自由穿过血脑屏障，有可能用于治疗帕金森病、阿尔茨海默病等神经变性疾病及预防和治疗大脑的缺血性疾病。zhao等观察证实，口服松果菊苷治疗7～14天，帕金森病患者步态失调明显改善。松果菊苷还可能通过逆转线粒体功能及细胞测亡，抗TNF-a（肿瘤坏死因子a）诱导的人神经母细胞瘤细胞测亡、促进血管性痴呆鼠脑中胆碱能神经递质水平等途径发挥明显的神经保护效应，可用于干预神经变性疾病。松果菊苷能选择性逆转线粒体功能和细胞凋亡，而对线粒体形态没2.2 骨保护松果菊苷具有维激素样的作用。Yang等（㎡用松果菊苷治疗给药12周，股骨矿物质密度、微结构、生物力学特性得到改善：松果菊苷还显著增加骨保护素（OPG）水平，井降低血清核因子xB配体受体活化剂水平，而对子宫，乳腺无不良反应：松果菊苷能通过增加OPG／RANKL的比例有效安全预防鼠卵果切除术后骨质疏松并抑制骨吸收，是一类新的植物雌激素，是治疗雌激素缺乏诱导的绝经后骨质疏松较有前景的草药㎡。Li等研究证实，0.01～10nmol／L松果菊苷即能明显增加成骨细胞系MC3T3-E1的增殖、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性、1型胶原含量、骨钙素（osteocalein，OCN）水平，增加了成骨细胞矿化，它主要增加 OPG／RNKL比例促进骨形成。Tm等［则研究证实，肉苁蓉提取物对培养的成骨细胞增殖、迁移无任何影响，也不影响骨诱裂，但增加了ALP、骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic proteins-2，BMP-2）、骨桥蛋白（0s-teopontin，OPN）的mRNA表达和骨的矿化，并能预防卵果切除鼠的骨丢失，推断松果菊苷可能是治疗骨质疏松的骨形成因子。2.3 抗损伤、抗氧化松果菊苷能保护急性肺损伤，用于治疗急性呼吸窘迫综合征［］，也能保护由四氯化碳引起的急性鼠肝损伤。经松果菊苷治疗后，肝的组织病理学损伤和凋亡的肝细胞数明显好转，可能主要与抗氧化效应有关㎡，松果菊苷还可Nan等又从塔中栽培荒漠肉苁蓉干燥肉质茎的85％乙醇提取物中分离得到紫丁香苷、去甲基紫丁香苷、松柏苷、苄基葡萄糖苷、烟酰胺、对羟基苯甲酸、对羟基苯乙醇、半乳糖醇等17种化合物。沙漠肉苁蓉中还含有丰富的锰，钾、钙、镁、钠等微量元素，在肉苁蓉不同生长阶段，微量元素含量比例不同。2 松果菊苷（Echinacoside，ECH）松果菊苷是沙漠肉苁蓉主要活性成分之一，从其他药用植物如密蒙花、紫锥花属中也能分离出松果菊苷.町，其具有如下药理作用。2.1 神经保护［m］松果菊苷能逆转保护鱼藤酮、中动脉闭塞、6-羟多巴胺诱导的多巴胺能神经元损伤，短暂接触松果菊苷，即具有足够保护抗鱼藤酮损伤过表达TrkA或TrkB受体的神经元细胞和非神经元细胞的作用，其机制与松果菊苷短暂抑制细胞色素C（cytochrome c）的释放并激活细胞凋亡蛋白酶-3（caspasc-3）有关。松果菊苷也能自由穿过血脑屏障，有可能用于治疗帕金森病、阿尔茨海默病等神经变性疾病及预防和治疗大脑的缺血性疾病。zhao等观察证实，口服松果菊苷治疗7～14天，帕金森病患者步态失调明显改善。松果菊苷还可能通过逆转线粒体功能及细胞测亡，抗TNF-a（肿瘤坏死因子a）诱导的人神经母细胞瘤细胞测亡、促进血管性痴呆鼠脑中胆碱能神经递质水平等途径发挥明显的神经保护效应，可用于干预神经变性疾病。松果菊苷能选择性逆转线粒体功能和细胞凋亡，而对线粒体形态没2.2 骨保护松果菊苷具有维激素样的作用。Yang等（㎡用松果菊苷治疗给药12周，股骨矿物质密度、微结构、生物力学特性得到改善：松果菊苷还显著增加骨保护素（OPG）水平，井降低血清核因子xB配体受体活化剂水平，而对子宫，乳腺无不良反应：松果菊苷能通过增加OPG／RANKL的比例有效安全预防鼠卵果切除术后骨质疏松并抑制骨吸收，是一类新的植物雌激素，是治疗雌激素缺乏诱导的绝经后骨质疏松较有前景的草药㎡。Li等研究证实，0.01～10nmol／L松果菊苷即能明显增加成骨细胞系MC3T3-E1的增殖、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性、1型胶原含量、骨钙素（osteocalein，OCN）水平，增加了成骨细胞矿化，它主要增加 OPG／RNKL比例促进骨形成。Tm等［则研究证实，肉苁蓉提取物对培养的成骨细胞增殖、迁移无任何影响，也不影响骨诱裂，但增加了ALP、骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic proteins-2，BMP-2）、骨桥蛋白（0s-teopontin，OPN）的mRNA表达和骨的矿化，并能预防卵果切除鼠的骨丢失，推断松果菊苷可能是治疗骨质疏松的骨形成因子。2.3 抗损伤、抗氧化松果菊苷能保护急性肺损伤，用于治疗急性呼吸窘迫综合征［］，也能保护由四氯化碳引起的急性鼠肝损伤。经松果菊苷治疗后，肝的组织病理学损伤和凋亡的肝细胞数明显好转，可能主要与抗氧化效应有关㎡，松果菊苷还可能通过上调TTGF-B促进肠上皮细胞增殖，阻止细胞死亡而改善黏膜组织修复。2.4 抗炎、护肤、抗衰老松果菊苷可有效预防硫酸葡聚糖钠诱导的鼠大肠炎，临床用于治疗炎性肠病［。松果菊苷通过诱导I1期细胞保护能力而具有持久的皮肤保护效应C］。松果菊能激发细胞从G1期进入S期和G2期，保护细胞免受DNA损伤可能是其抗衰老的机制。3 结语人们还进行了大量松果菊苷药物代谢动力学研究，建立和验证了在动物血浆中检测松果菊苷浓度的方法，具有高度选择性、敏感性、可重复性，并且易获得高纯度松果菊苷，完全能满足实验研究及临床治疗需要。肉苁蓉及其主要活性成分松果菊苷更广泛的药理作用及临床应用有待进一步研究证实。参考文献：0] WANG T.ZHANG XY.XIE WY.Ctanche deserticola Y. C.Ma."Desert Ginsene:A Review[J].American Joumal of Chinese Medicine:2012.40(6):1123-1141.[2] SHI HM.WANG J.WANG MY.et al ldentifieation of Cistanche species by chemical and inter-simple sequence re-peat fingerprinting[J]Biol Pharm Bull,2009,32(1):142-146.[3] XIONG WT,GU L.WANG C.et aL Anti-hyperglycemie and hypolipidemie effects of Cistanche mbulosa in type 2 din-betie db/db miee[].J Ethnopharmacol,2013.[4] SIU AH-L.KO KM.Heba Chtanche extract enhances ml tochondrial glutathione status and respiration in rat hearts. with possible induction of uncoupling proteins[J].Pharma-ceutical Biology,2010.48(5):512-517.[s] WONG HS.KO KM. Herha Citanches stimulates cellular gluathione redox cyeang by reactive oxygen species gener-ted from mitochondrial respiration in H9e2 cardiomyocytes [J]Pharmaceutical Biology,2013.51(1):64-73.[6] JIANG Y.TU P-F.Analysis of chemical constituents in Cistanche specie[J],Journal of Chromatogmphy A,2009. 1216(11):1970-1979.[7] XUED.ZHANG M.WU X.etal.Active antisenile constit-uents in Citanche deserticola Y. C.Ma[J]Zhongguo Zhong Yao Za Zhi,1995,20(11):687-689,704.[8] CHEN MH.LIU FS.XU JP.Chemical constituents of Cistanche deserticola Y.C.Ma[J]Zhongguo Zhong Yao Za Zhi,1993,18(7):424-426,447.[9]CUI XS,ZHENG L,DU Y,et ad.Mineral dements content of C.deserticola at different growth stages[J]. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi.2011,31(11):3115-3118.[10] ZHU YX.GUO YH.Determination of mineral elements in cistanche and its extractives by ICP-AES[.Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi,2013,33(3);813-816.[11] TAI BH.JUNG BY.CUONG NM.et al. Total Peroxyni-trite Scavenging Capacity of Phenylethancid and Flavonoid

刘显红 郑安敏563300贵州省绥阳县中医院，贵州绥阳dol:10.3969/j.issn.1007-614x.2020.04.077摘要 目的：观察内苁蓉汤治疗便秘的临床疗效。方法：2017-2018年收治便秘患者61例，随机分为两组。治疗组采用肉苁蓉汤治疗，对照组服用多潘立酮片治疗。比较两组疗效。结果：治疗组总有效率显著高于对照组。差异有统计学意义（P＜005）。结论：内苁蓉汤治疗便秘临床疗效显著，且标本兼治。关键调 便秘：中医药疗法；黄元御《四圣心源》内苁蓉Observation on 31 cases of constipation treated by Huangyuanyu Rou Cong Rong DecoctionLiu Xianhong Zheng AnminThe Traditional Chinese Medical Hospital of Suiyang County,Guizhou Province 563300Ahstract Objective To explore the effeet of constipation treated by Hangyuanyu Rou Cong Rong Decoction MethodeFiom 2017 to 2018.61 patients with constipation were selected and randomly divided into two goups.The treatment group was treated with Rou Cong Rong Decoction,the control group was trated with domperidone tablets We compand the efficacy of the two groups.Results:The total effective rate of the treatment group was significanaly higher than that of the contral groupthe difference was statistically significam(P<0.05).Conelusion:The effect of constipation treated by Huangyuanyu Rou Cong Rong Decoction is significant with treating both symptos and symploms simnltaneously.Key words Constipation Traditional Chinese medicine theapy:Huangyuanyu《SiSheng Xin Yn)Bou Cong Rong便秘是危害人类健康的常见病之一、据流行病学调查显示，便秘在我国发病率可高达9％-13％，其中25％-30％为老年性便秘。便秘作为一个独立证候，常并发于各种急、慢性疾病过程中。西医多采用对症治疗，而中医药对便秘的治疗有西医无可比拟的优势。资料与方法2017-2018年收治便秘患者61例，随机分为治疗组31例和对照组30例。治疗组男20例，女11例，年龄18～90岁，平均（73±5.6）岁；病程1～40年。对照组男20例，女10例，年龄18-90岁，平均（72±63）岁；病程1-40年。两组一般资料比较。差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。中医诊断标准：参照2017年国家中医药管理局发布的《中医病症诊断疗效标准》评定。（1）中医诊断：①排便时间延长，2d以上1次，粪便干燥坚硬；②严重者大便艰难，干燥如栗，可伴少腹胀急。神倦乏力，胃纳减退等；③肠道器质性疾病。（2）中医证型诊断标准：脾肾阳虚便秘，表现为大便秘结，面色萎黄无华，时作眩晕、心悸，甚则少腹冷痛。小便清长，畏寒肢冷。舌质淡、苔白润、脉沉迟。纳入标准：①符合2017年国家中医药管理局颁布的《中医病症诊断疗效标准》；②年龄18-90岁：③血、尿、便、生化常规检查在正常范围内。排除标准：①18岁以下，90岁以上：②孕妇；③由药物引起的便秘；④继发于其他疾病的便秘；⑤神经心理障碍导致的便秘。方法：①治疗组给予肉苁蓉汤治疗，方药组成：肉苁蓉20g，麻仁10g，茯苓15g．姜半夏15g。桂枝10g，甘草7g。7剂，水煎服，1剂M，早中晚分服，7d为1个疗程，大便正常后再服1个疗程以巩固疗效。②对照组给予多潘立酮片治疗，1片／次，3次／d，饭前15-30min口服。观察指标：比较两组临床疗效及不良反应发生率。疗效判定标准：①治愈：大便柔软润滑，排出顺畅，每日或隔日1次。②显效：大便变软，容易排出，1次2-3d。③有效：排便问隔时间缩短，排便困难减轻。④无效：临床症状无改善。统计学方法：数据采用统计学软件分析。计数资料采用［（％）表示，x2检验：P＜0.05为差异有统计学意义。结果两组患者临床疗效比较：治疗组总有效率明显优于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。两组患者不良反应比较：治疗组未见明显不良反应，少数患者因害怕服用中药，但经心理蔬导均服用1个疗程以上。典型病例患者，女，76岁，主诉大便干结状如羊粪5年，身体无他疾病。曾在多家医院治疗，服用六味安消胶囊、麻子仁丸、大黄苏大片、番泻叶、生大黄、果导片，其疗效时而有效，时面无效。本次再因大便干结状如羊粪而诊，刻下症见颜面痛苦，站卧不安，腹胀，腹痛，舌淡苔白，舌体胖大，舌边齿痕，脉沉。诊断为阴盛肠结型便秘，予以肉苁蓉汤滋肝润肠，以通大便。患者服用7剂后复诊，自述服用3剂后大便即通，继续服完药物。目前大便通畅，询问是否继续服用，笔者考虑患者年岁已高，便秘5年之久，故再予7剂，后回访大便一直通畅。讨论便秘最早见于《黄帝内经》，称其为“后不利”“大便难”。汉代张仲景则称便秘为“脾约”“闭”“阴结”“阳结”，而到了清代沈金鳌《杂病源流犀烛》才出

石秋慧（西北民族大学化工学院，陕西榆中730100）摘要：肉苁蓉属植物为多年生寄生草本植物，是重要的补益中药，具有多种药理活性，广泛应用于临床。本文简要介绍了文献中对肉苁蓉多糖、总黄酮和苯乙醇苷的化学提取工艺，并针对肉苁蓉对自由基的清除作用做了介绍，为肉苁蓉在化工领域的进一步研究提供参考。关键词：肉苁蓉：多糖：总黄酮；苯乙醇苷；亚硝酸盐：自由基清除作用肉苁蓉属植物为多年生寄生草本植物，我国有5种，分布于内蒙古、宁夏、甘肃、青海以及新疆等地。荒漠肉苁蓉（Cis-tanchedeserticolaY.C.Ma）为列当科（Orotanchaccae）肉苁蓉属 （Cistanche）植物，是重要的补益中药，特产我国西北沙漠地区，素有“沙漠人参”之称。肉苁蓉中有苯乙醇苷类，环烯醚萜类及其苷类，木脂素及其苷类、多糖、挥发油等多种化学成分＂。药理研究表明肉苁蓉可以调节神经系统，抗衰老和抗氧化作用、通便作用等方面药理活性，广泛应用于临床实践。因此，关于肉苁蓉有效成分的提取工艺及清除作用一直是近年来化工领域的研究热点。近年来，众多学者在化工研究中发现肉苁蓉对自由基有清除作用。滕立平等在研究中发现德赢vwin登录 粗多糖对DPPH自由基具有较好的清除作用，这为肉苁蓉多糖通过清除机体内自由基延缓衰老方面的研究提供了理论依据。王晓雯等也在检测中发现肉苁蓉总苷对O，OH，HO，02等自由基的清除作用。随着食品工业的不断发展，不少不法经营者通过加入高浓度的亚硝酸盐来改善肉制品的感观色泽，缩短肉制品的加工时间，面亚硝酸盐是剧毒物质，成人摄入0.2-0.5克即可引起中毒，3克即可致死。同时由亚硝酸盐产生的亚硝胺还能够透过胎盘进入胎几体内，对胎儿有致畸作用，因此积极研究和开发消解亚硝酸盐的天然药物已经成为一个迫切需要解决的问题。有关研究表明，肉苁蓉富含的多种成分能够清除亚硝酸盐，在化工生产中发挥着巨大作用。1肉苁蓉化学成分的提取方法化工生产中，肉苁蓉的提取工艺很多，但传统提取肉苁蓉有效成分的方法成本高、提取效率低、纯度低，亦影响了其生物学效应，降低了肉苁蓉的医学价值。因此，优化其提取工艺并研究其体外对自由基的清除作用，有利于肉苁蓉的进一步开发。1.1提取肉苁蓉多糖王晓琴＂等采用热水浸提法提取肉苁蓉多籍，在研究中发现，各因素对多糖得率的影响依次为浸提温度＞水料比＞浸提时间。最佳提取工艺为以1：15的料水比在85℃下浸提2h，利用该工艺提取肉苁蓉多糖的平均得率为6.7857mg／g。进一步对肉苁蓉多糖提取物抗菌活性研究，发现肉苁蓉多糖提取物对在抗动植物病原菌方面有潜在应用价值。为提取德赢vwin登录 活性成分多糖，滕立平等发现超声-微波协同有最佳提取效果，其次是微波、水浴和超声波。王国卫等在研究肉苁蓉多糖体外抗氧化活性中发现肉苁蓉多糖对超氧阴离子自由基，经自由基和单线态氧均有明显清除作用，在研究过程中进一步发现这种清除作用与多糖浓度呈正相关。1.2提取肉苁蓉总黄酮肖星辉”等采用乙醇-盐双水相萃取法研究荒漠肉苁蓉总黄酮的萃取工艺，采用正交试验法对荒漠肉苁蓉总黄酮的提取工艺进行了优化，确定荒漠肉苁蓉总黄酮最佳提取工艺条件：料液比为1：50（g／ml），提取溶剂为50％的乙醇溶液，提取时间为3.5h，提取温度为90℃，此条件下肉苁蓉中总黄酮平均得率可达到（13.04±0.06）％。徐常永等利用吸附与解吸附的原理，通过静态吸附实验，采用大孔树脂分离纯化肉苁蓉总黄酮，又经动态吸附实验和正交试验得到较佳分离纯化工艺条件。研究发现，该工艺条件稳定性良好，分离纯化前后总黄酬的质量分数明显提高，适合工业化生产。1.3 提取肉苁蓉苯乙醇苷肉苁蓉具有提高免疫力，增强体力抗疲劳，提高记忆力及抗衰老等诸多药理功效，其主要活性成分为苯乙醇苷。以它为指标进行提取，纯化是对其进行化工研究的重点。昊涛”采用正交试验优化德赢vwin登录 苯乙醇苷的提取工艺并利用大孔吸附树脂技术对德赢vwin登录 提取物进行纯化。研究发现，料液比1：12.70％乙醇提取2次，每次1小时为最佳提取工艺，上样液浓度4mg／ml，吸附流速1ml／min，洗脱流速1ml／min。径高比为1：15为最佳纯化工艺。研究还发现，经大孔树脂纯化后，苯乙醇苷含量提高到75.8％，且提取纯化工艺合理，稳定，适合推广应用于实际化工生产。为提高肉苁蓉资源利用率，刘伯言通过超声辅助提取，大孔吸附树脂纯化等方法，对肉苁蓉中苯乙醇苷进行分离纯化。对苯乙醇苷粗提物和纯化物的抗氧化活性进一步研究得知，纯化物表现明显的自由基清除能力和较强的还原力，低浓度的苯乙醇苷相提物和纯化物都能减少对该细胞的损伤。2肉苁蓉的清除作用肉苁蓉总苷能有效地清除自由基，保护OH-引起的DNA氧化损伤。罗齐军等拿24只SD大鼠进行体外实验来研究肉苁蓉活性成分对大鼠大负荷训练导致的骨骼肌自由基氧化损伤的保护作用，发现肉苁蓉成分有一定的抗氧化作用，有利于剧烈运动导致机体组织大量积累的自由基的清除，防止阻止氧化损伤。王晓雯“等采用现代生物化学发光技术，检测发现肉苁蓉总苷对0，OH，HO2，＇O2等自由基的清除作用，并通过C-Phen-H：O：-ViC-DNA发光体系研究发现肉苁蓉总苷具有对OH引起的DNA氧化损伤的保护作用。这些研究都在一定程度上为运动训练提供了理论健康指导。亚硝酸盐具有防腐性，常在食品加工业被添加在香肠和腊肉中作为保色剂，与此同时也对人类健康造成了威胁。高剂量的亚硝酸盐会产生很大毒性，长期使用甚至会导致食道癌和胃癌。众多研究发现肉苁蓉对0，OH．HO2，O2等自由基具有强清除作用，所以人们希望肉苁蓉能够用于工业上亚硝酸根的清除。目前关于荒漠肉苁蓉属植物体外消除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成的文献较少，林敏等在研究肉苁蓉水浴浸提物与超声辅助浸提物在体外模拟胃液pH条件下清除亚硝酸根的最佳提取工艺时发现，肉苁蓉对亚硝酸根有很强的清除能力，并随着浓度的增加清除作用加强，且水浴提取物对亚硝酸根清除作用显著高于超声辅助浸提物。3研究展望肉苁蓉提取液含有多种组成成分，包括VC、多酚、黄酮类化合物、多糖等。本文总结了一些文献中对肉苁蓉多糖，总黄酮和苯乙醇苷的提取方法，也对肉苁蓉的清除作用做了综述。肉苁蓉提取物作为医药化工原料，在医学界发挥着巨大作用。而以肉苁蓉为主原料的保健品也大有兴起之势，但其在临床方面的研究还不够深入。肉苁蓉在化工领域有着巨大的潜力，以期更多学者参与到肉苁蓉的深入研究中，为肉苁蓉相关化工产品的开发利用及提取工艺提供参考依据。参考文献：［门许国青，王晓翠，文迪，等，列当科药用植物研究进展门中国民族医药杂志，2012.10（44）：35-38．（2）吴晓春，史颖，肉苁蓉的研究与临床应用）甘肃中医，2007.20(12):49-51.［林玉娜，罗晓燕，刘莉治，等，血清和尿中亚硝酸盐含量的离子色谱测定法月 职业与健康，2011.27（4）：356＋481．（4］张丽芳，田洪涛，张玉兰，等，健康人体及保健品中乳酸菌和双歧杆菌的抗药性分析具中国食品学报，2009,9（6）：144-151.［5］曾海芙，秦礼康，江萍，食源性乳酸菌外获抗药性的研光进展具食品科学，2004.25（12）189-192问王晓琴，曹礼，未艳萍，肉苁蓉多糖提取工艺及抑菌作用研究［安徽农业科学，2009.37（32）：15855-15856．（7］滕立平，慕龙，罗锋，等．管花肉其蓉粗多糖提取方法及其清除二苯代苦味酰基自由基的效果门贵州农业科学，2011，39(1):66~68.［8］王国卫，赵芳，新疆肉苁蓉多糖清除活性氣自由基1光谱实验室，2011.28（3）：1545-1548．例肖星辉，张肉前，李桂芳，等，双水相萃取荒漠肉苁蓉总黄酮及其抗氧化活性［J］食品研究与开发，2017.38（16）：5-9．［10］徐常水，杨凯，大礼树脂分离纯化内苁蓉总黄酮研究门中国当代医药2016.23（24）：130-134．［11］吴涛，管花肉其蓉总苷的模取、纯化、指纹图谱及改善记忆力研究［D）新疆：新疆大学食品科学系，2010．［12］刘伯言，肉苁蓉苯乙醇苷的提取、纯化和抗氧化活性研完明北京，北京林业大学农产品加工及储藏工程系，2014．［13］罗齐军，王燕山，黄凯乔，肉苁蓉活性成分对大负荷训练大鼠骨骼肌氧化损伤的保护作用［门湛江师范学院学报，2012.33(3):132-135.［14］王晓雯，蒋晓备，邹利娅·伊明，等，肉苁蓉总普体外清除自由基及对OH引发的DNA损伤的保护作用门中国药学杂志，2001,36（1）：29-32．［15］林敏，张鑫，吴冬青，等，肉苁蓉提取液对NO产清除作用的体外实验研究［）食品工业科技，2012.02（53）：126-133．