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  • 1.6 统计学处理数据结果以x±表示,使用SPSS 19.0统计软件进行统计分析,多组间比较采用单因素方差分析,组间的多重比较采用LSD法,P<0.05表示有统计学意义。2 结果与分析2.1 H2O2致兔肾小管上皮细胞形态的改变不同浓度的H2O2作用兔肾小管上皮细胞24h后,显微镜下观察兔肾小管上皮细胞形态,如图1,随着H2O2浓度的增加,形态改变的细胞数量逐渐增多,贴壁细胞数量逐渐减少,部分细胞变长,细胞光泽度减小,体积缩小,H2O2浓度达550μmol·L-',轴突消失,胞膜破裂,细胞皱缩,细胞间隙增大,成片细胞间出现空白。2.2 H2O2对兔肾小管上皮细胞增殖作用的影响分别使用350、400、450、500、550 μmol·L-'H2 O2作用兔肾小管上皮细胞24h,采用MTT法测定吸光度,结果为不同浓度的H2O2对兔肾小管上皮细胞的增殖均有抑制作用,IC,值为439.07μmol·L-,500 μmol·L-'的H2O2作用24h对细胞增殖的抑制作用可达到50%以上,因此选用该浓度作于后续研究。2.3 H2O2对兔肾小管上皮细胞LDH的释放量的影响H2O2作用兔肾小管上皮细胞24h后,采用非放射性细胞毒性检测方法测定细胞上清液及细胞裂解液中LDH反应的OD值,计算细胞LDH释放量,结果见表1.不同浓度的H2O2会引起兔肾小管上皮细胞LDH释放量的增加,且H2O2浓度越高,LDH释放量越大,呈浓度依赖性。H2O2在浓度400mmol·L-时引起细胞LDH释放量超过空白组50%以上,造成细胞重度损伤。表1 H2O2对兔肾小管上皮细胞LDH释放量的影响(x±s.n=4)Tah. 1 Effects of H,O,on LDH release from rabbit RTECS组别药物浓度(μmol·L-)释放量(%)空白对照组-7.850.30实验组3509.68x0.1840013.54=1.29**45016.76=0.36**50024.75=0.94**55031.41=1.33**注:与空白对照组比较*P<0.05**P<0.012.4 H2O2作用兔肾小管上皮细胞后AO/EB荧光染色结果H2O2作用兔肾小管上皮细胞24h后,对细胞进行AO/EB荧光染色,如图2,初步判断H2O2对兔肾小管上皮细胞的作用机制以引起细胞坏死为主。不同浓度的H2O2会引起兔肾小管上皮细胞不同程度的坏死,H2O2浓度小于400μmol·L-时,核染色质着绿色收缩成圆形,判断主要以细胞早期凋亡为主,随着H2O2浓度升高,大于450μmol·L时,呈橘红非圆珠状,坏死细胞数量增多,呈浓度依赖性。2.5 肉苁蓉对H2O2致兔肾小管上皮细胞增殖作用的影响兔肾小管上皮细胞在不同浓度(2、20、200mg-L-')的肉苁蓉水提、醇提物作用下,细胞存活率与无干预正常条件培养的细胞相比无显著差异。如图3,与模型组比较,肉苁蓉醇提物和水提物高浓度组能够显著降低H2O2对兔肾小管上皮细胞增殖的抑制作用(P<0.01)。图2 不同浓度H2O2作用兔肾小管上皮细胞AO/EB染色(100x)Fig,2 AO/EB staining of rabbit RTECs treatedby different concentrations of H2O2(100x) 2.6 肉苁蓉对H2O2致兔肾小管上皮细胞损伤的影响对细胞LDH释放量的影响结果如图4,肉苁蓉醇提物和水提物的高、中、低浓度组均使得H2O2作用后兔肾小管上皮细胞LDH释放量极显著低于模型组LDH的释放量(P<0.01),结果呈浓度依赖性,浓度越高,细胞LDH释放量越低。 注:与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01图4 肉苁蓉对H2O2作用兔肾小管上皮细胞后细胞LDH释放的影响Fig 4 Effect of C. deserticola on H2O2-indueed LDH release from rabbit RTECs3讨论有“沙漠人参”之美誉的肉苁蓉具有极高的药用价值,是中国著名的补益中药《神农本草经》将上品药描述为“上药······主养命以应天,无毒,多服,久服不伤人···”肉苁蓉即被列为上品药,味甘,微温。《名医别录》指出肉苁蓉“味酸、咸,无毒”。之后历代本草对肉苁蓉性味归经的记载基本一致,其性微温,味甘、酸、咸,归肾、大肠经。传统用于肾阳不足、腰膝酸软、筋骨无力等,其药理作用及机制一直是研究重点。现代药理研究表明,肉苁蓉具有抗衰老、提高学习记忆能力、调节免疫功能。广泛用于中医临床处方、中成药和保健产品。氧化应激是某些重大疾病的关键诱因,是由于体内活性氧在形成和清除之间出现失衡,造成组织细胞面临一定程度的氧化损伤。因而对应激反应机制进行深入研究,能够探寻有效预防、改善甚至完全消除应激性疾病的合理途径。氧化应激能够导致体内多种细胞及蛋白质过氧化例,研究选用H2O2作为损伤的外源物之一。具有强烈引发脂质过氧化的作用,引起链式脂质过氧化反应,造成细胞的凋亡和功能失调。目前研究这种外源物的肾毒性及拮抗其肾毒性作用主要是通过建立动物模型,建立体外模型进行相关研究的文献报道相对较少。与肾毒性动物模型比较,体外肾毒性细胞模型具有作用靶点明确,用药周期短,用药量少等优点。通过细胞形态学的改变、外源物对细胞增殖的抑制作用及细胞LDH释放量的改变对外源物诱导的体外肾毒性细胞模型进行研究。不同浓度的H2O2对细胞的形态改变均有明显的影响,随着外源物浓度的增加,发现细胞变形的数量增多。MTT实验是检测活细胞数量的常用方法,在不同浓度肉苁蓉保护兔肾小管上皮细胞免受H2O2损伤的实验中,不同浓度的肉苁蓉明显降低了H2O2对肾小管上皮细胞的抑制率,且具有浓度依赖性,当细胞胞膜2.5 肉苁蓉对H2O2致兔肾小管上皮细胞增殖作用的影响兔肾小管上皮细胞在不同浓度(2、20、200mg-L-')的肉苁蓉水提、醇提物作用下,细胞存活率与无干预正常条件培养的细胞相比无显著差异。如图3,与模型组比较,肉苁蓉醇提物和水提物高浓度组能够显著降低H2O2对兔肾小管上皮细胞增殖的抑制作用(P<0.01)。图2 不同浓度H2O2作用兔肾小管上皮细胞AO/EB染色(100x)Fig,2 AO/EB staining of rabbit RTECs treatedby different concentrations of H2O2(100x) 注:与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01图3 肉苁蓉对H2O2作用兔肾小管上皮细胞后细胞增殖抑制作用的影响Fig 3 Effeet of C. deserticala on the inhibition of H2O2-induced rabbit RTECs proliferation2.6 肉苁蓉对H2O2致兔肾小管上皮细胞损伤的影响对细胞LDH释放量的影响结果如图4,肉苁蓉醇提物和水提物的高、中、低浓度组均使得H2O2作用后兔肾小管上皮细胞LDH释放量极显著低于模型组LDH的释放量(P<0.01),结果呈浓度依赖性,浓度越高,细胞LDH释放量越低。 注:与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01图4 肉苁蓉对H2O2作用兔肾小管上皮细胞后细胞LDH释放的影响Fig 4 Effect of C. deserticola on H2O2-indueed LDH release from rabbit RTECs3讨论有“沙漠人参”之美誉的肉苁蓉具有极高的药用价值,是中国著名的补益中药《神农本草经》将上品药描述为“上药······主养命以应天,无毒,多服,久服不伤人···”肉苁蓉即被列为上品药,味甘,微温。《名医别录》指出肉苁蓉“味酸、咸,无毒”。之后历代本草对肉苁蓉性味归经的记载基本一致,其性微温,味甘、酸、咸,归肾、大肠经。传统用于肾阳不足、腰膝酸软、筋骨无力等,其药理作用及机制一直是研究重点。现代药理研究表明,肉苁蓉具有抗衰老、提高学习记忆能力、调节免疫功能。广泛用于中医临床处方、中成药和保健产品。氧化应激是某些重大疾病的关键诱因,是由于体内活性氧在形成和清除之间出现失衡,造成组织细胞面临一定程度的氧化损伤。因而对应激反应机制进行深入研究,能够探寻有效预防、改善甚至完全消除应激性疾病的合理途径。氧化应激能够导致体内多种细胞及蛋白质过氧化例,研究选用H2O2作为损伤的外源物之一。具有强烈引发脂质过氧化的作用,引起链式脂质过氧化反应,造成细胞的凋亡和功能失调。目前研究这种外源物的肾毒性及拮抗其肾毒性作用主要是通过建立动物模型,建立体外模型进行相关研究的文献报道相对较少。与肾毒性动物模型比较,体外肾毒性细胞模型具有作用靶点明确,用药周期短,用药量少等优点。通过细胞形态学的改变、外源物对细胞增殖的抑制作用及细胞LDH释放量的改变对外源物诱导的体外肾毒性细胞模型进行研究。不同浓度的H2O2对细胞的形态改变均有明显的影响,随着外源物浓度的增加,发现细胞变形的数量增多。MTT实验是检测活细胞数量的常用方法,在不同浓度肉苁蓉保护兔肾小管上皮细胞免受H2O2损伤的实验中,不同浓度的肉苁蓉明显降低了H2O2对肾小管上皮细胞的抑制率,且具有浓度依赖性,当细胞胞膜损伤时,胞内的LDH会释放到培养液中,细胞培养液中LDH含量是检测细胞死亡的一个重要指标。本研究发现H2O2致兔肾小管上皮细胞损伤的模型组细胞培养液中LDH水平明显增加,而经不同浓度肉苁蓉处理之后的实验组细胞培养液中LDH水平明显减少,且存在浓度依赖性。研究结果提示,通过建立H2O2致兔肾小管上皮细胞损伤模型,初步探讨肉苁蓉提取物对肾小管上皮细胞的保护作用,不仅为氧化应激导致的细胞损伤相关研究奠定基础,也为肉苁蓉的开发利用提供基础数据。
  • 张健飞,管静,赵丹,杨晓琴,周英,俸婷婷1.贵州大学药学院,贵州 贵阳 550025:2.贵州大学医学院,贵州 贵阳 550025:3.贵州大学生命科学学院学院,贵州 贵阳 550025:4.贵州大学酿酒与食品工程学院,贵州 贵阳 550025:5.贵州省药食同源植物资源开发工程技术研究中心,贵州 贵阳 550025:6.贵州省药食两用资源应用开发工程实验室,贵州 贵阳 550025)摘要:通过体外培养免肾小管上皮细胞,研究H2O2对细胞增殖作用及肉苁蓉提取物对H2O2致肾小管上皮细胞损伤的影响。通过细胞形态观察,采用MTT法测定H,O2对兔肾小管上皮细胞增殖作用的影响及肉苁蓉水提,醇提物2、20、200mgL-三个剂量组的保护作用,测定细胞LDH释放量,结果表明,随着H,O,浓度的增加,形态改变的细胞数量逐渐增多,贴壁细胞数量逐渐减少,细胞增殖抑制率越大,细胞LDH释放量越多,呈浓度依赖性,肉苁蓉醇提物和水提物高浓度组能够显著降低H2O2对免肾小管上皮细胞增殖的抑制作用(P<0.01),肉苁蓉醇提物和水提物的高、中、低剂量组均能使H,O2作用后兔肾小管上皮细胞LDH释放量极显著低于模型组LDH的释放量(P<0.01),结果呈浓度依赖性。H,O,对兔肾小管上皮细胞增殖具有不同程度的影响,肉苁蓉对H,O2致兔肾小管上皮细胞损伤具有保护作用。关键词:肉苁蓉:兔肾小管上皮细胞:细胞损伤中图分类号:R965.2 文献标识码:A文章编号:1008-0457(2017)06-0044-05      国际DOI编码:10.15958/j.cnki.sdnyswsh.2017.06.008前言肉苁蓉又名疆芸、寸芸、苁蓉、查干告亚,为列当科植物肉苁蓉 Cistanche deserticola Y.C.Ma或管 花肉苁蓉 Cistanche tubulosa(Schenk)Wight的干 燥带鳞叶肉质茎。具有补肾阳、益精血、润肠通便的功效,传统用于肾阳不足、精血亏虚、阳痿不孕、腰膝酸软、筋骨无力、肠燥便秘,为历代使用频度最高的补肾阳药物。H2O2作为一种活性氧形式,具有强烈引发脂质过氧化的作用,几乎可与任何细胞成分发生反应,引起链式脂质过氧化反应,造成细胞的凋亡和功能失调2.。实验主要通过研究肉苁蓉提取物对H2O2致兔肾小管上皮细胞增殖抑制和损伤的影响,初步探讨其对肾小管上皮细胞的保护作用。1 材料与方法1.1 试验药物肉苁蓉购自四川省川南药业有限公司(批号151201)。1.2 动物新西兰大白兔,雄性,20日龄,购自贵州省畜牧研究所实验基地,动物许可证号:SCXK(黔)2012-001.1.3 试剂DMEM/F-12(1:1),Gbico 公司:胎牛血清,浙江天杭生物科技有限公司:二甲亚砜(DMSO),北京鼎国昌盛生物技术有限公司:H2O2,四川金山制药有限公司:胰蛋白酶,Amresco 公司:噻唑蓝(MTT),Genview 公司;非放射性细胞毒性检测试剂盒,Promega公司:无水乙醇,天津富宇精细化工有限公司。1.4 仪器CO2培养箱,3111型,Thermo Fisher Seientifie: 酶标仪,1510型,Thermo Fisher Seientifie:超净工作台,SW-CJ-1FD,苏州净化设备有限公司:倒置荧光显微镜,宁波舜宇:旋转蒸发器,RE-52AA,上海亚荣生化仪器厂;冷冻干燥机,LGJ-12,北京松源华兴科技发展有限公司。1.5 方法1.5.1 肉苁蓉提取物的制备 取肉苁蓉干药材粉碎,精密称取两份药粉各100g,分别加入10倍量蒸馏水和75%乙醇加热回流提取3次,第一次3h,第二次1.5h,第三次1h,合并3次滤液,减压浓缩至浸膏,计算提取物得膏率分别为水提物22.30%,醇提物21.70%,挥去残醇,冷冻干燥机制得肉苁蓉水、醇提取物,密封干燥避光保存待用。1.5.2 细胞培养 参照赵丹等“所述方法构建肾小管上皮细胞模型,分离培养20日龄的兔原代肾小管上皮细胞,待细胞生长至铺满培养皿90%以上,胰酶消化。用含1%胎牛血清的DMEM/F-12完全培养基以每孔1.2x10个细胞接种于96孔板,37℃,5%CO2条件下培养。1.5.3 H2O2致兔肾小管上皮细胞损伤模型的建立 参照1.5.2接种细胞,待细胞稳定培养48h后,采用H2O2进行损伤。设置实验组和空白对照组,每组设置4个复孔,重复三次。实验组:更换含有不同浓度H2O2的完全培养基,H2O2的浓度分别为550、500、450、400、350 μmol·L-,空白对照组:更换完全培养基,37℃,5%CO2条件下继续培养24h.镜检,采集图片。采用MTT 法测定H2O2作用后细胞的增殖情况,于490nm处测定吸光度值(OD值)。采用非放射性细胞毒性检测试剂盒测定H2O2作用后细胞LDH释放量的变化,LDH释放量(%)=上清液LDH量/(上清液LDH量+裂解液LDH量)x100%。AO/EB荧光染色:分别取100μg/mL.AO溶液和100μg/mL.EB溶液各100μL,混匀后每孔加入10μL,立即置于倒置相差荧光显微镜上观察,5min内保持观察视野不变,分别在450±10nm的蓝光和532±10nm的绿光下采集图片,采用荧光采集系统进行荧光合成,获得荧光染色图片。1.5.4 肉苁蓉提取物对H2O2致兔肾小管上皮细胞损伤的影响 按照1.5.2接种细胞,待细胞稳定培养24h后,每孔加入含肉苁蓉提取物完全培养基200ul对细胞进行预保护培养24h.设置实验组,模型组及空白对照组,每组3个复孔,重复三次。实验组和模型组:更换含有400μmol·L-H2O2的完全培养基:空白对照组:为完全培养基。继续培养24h.采用MTT法测定细胞增殖情况,采用非放射性细胞毒性检测试剂盒测定细胞LDH释放量的改变。
  • 尹刚 王贵林 余万桂中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1004-745X(2010)03-0463-03【摘要】目的 研究肉苁蓉提取物对败血症大鼠急性肺损伤(ALI)的影响。方法采用盲肠结扎穿孔术复制败血症模型,观察肺组织病理学变化,测定ALI1生物学指标。结果生理盐水组肺间质水肿,肺泡腔内可见大量细胞浸润和血浆蛋白渗出,肺血管内皮细胞损伤。肺湿/干重比、肺泡灌洗液中中性粒细胞比例、蛋白含量及肺泡通透指数(LPI)、肺毛细血管通透性(PVP)均显著升高.肺组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、髓过氧化物酶(MPO)均显著升高。上述指标肉苁蓉组均较生理盐水组显著下降,结论 肉苁蓉对败血症大鼠ALI具有良好保护作用,其机制可能是通过抑制中性粒细胞在肺组织的浸润,减少氧自由基对肺组织损伤实现的。【关键词】败血症 急性肺损伤 肉苁蓉败血症是临床急危重症,寻求有效治疗药物一直是临床和基础研究的重大难题。败血症的中医病机是正虚邪实,单纯针对机体邪盛采取的攻下疗法是有效治疗措施之一,但仅局限于攻下治疗也难免失之偏颇,重视扶正补虚治疗同等重要。肉苁蓉是传统补益类中药,药理研究证实其具有增强细胞DNA合成率、抗氧自由基等保护功能,笔者实验观察肉苁蓉对败血症肺组织损伤的作用,以求为败血症扶正补虚治疗提供有效探索。1 材料与方法1.1 动物 健康雄性SD大鼠40只,体质量200~250g,由华中科技大学实验动物中心提供,质检号:TJLA-2008-167.随机分为3组:生理盐水组8只,1g/mL肉苁蓉组12只,5g/mL肉苁蓉组12只。实验动物分别采用相应药物常规灌胃15d,每日2次(肉苁蓉提取物由本院中药制剂室提供),给药剂量200mg/kg。实验动物均按文献[1]方法在盲肠结扎穿孔后12min采集标本。1.2 大鼠肺组织学检查 每组取动物肺左叶少许,经10%甲醛固定,石蜡包埋切片,HE染色后,用普通光学显微镜观察,并在此基础上取肺组织制成1m㎡用25%戊二醛溶液固定,然后固定于1%四氧化锇液中,乙醇、丙酮脱水,经Epon81包埋,制备超薄切片后,行铀-铅双重染色,用透射电镜观察。1.3 大鼠肺组织湿/干重比、肺灌洗液中细胞计数比及蛋白含量测定 开胸取出肺脏,称湿重后置烤箱(80℃)烤至衡重,称干重,计算湿/干重比。另一批大鼠开胸后行肺泡灌洗,灌洗液在显微镜下行细胞计数、细胞分类。考马氏亮蓝法测定蛋白含量,计算肺通透指数(肺泡灌洗液蛋白/血浆蛋白,LPI)1.5 大鼠肺组织丙二醛(MDA)的测定 采用硫代巴比妥酸(TBA)法甲测定MDA活性。50ml待测标本加4ml 1.67mol/L的硫酸、0.541%磷钨酸,混匀,3000r/min离心10min,沉淀再同上处理1次,然后加1mL双蒸水、1mLTBA溶液,95℃水浴60min,用5mL正丁醇提取,四乙氧基丙烷作为标准品,终浓度为1nmol/L,荧光分光度计于532nm处测定吸光值。1.6 大鼠肺组织超氧化物歧化酶(SOD)的测定 按文献[4]方法,采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性(试剂盒购自南京建成生物工程研究所)。1.7 大鼠肺组织髓过氧化物酶(MPO)测定 取肺组织于等渗盐水中尽量洗净残血,置于含0.5%十六烷基三甲基溴化铵的磷酸缓冲液(pH6.0)中制成5%的匀浆,按试剂盒说明书操作。1.8 统计学方法 应用SPSS统计软件,计量资料以(±3)表示,采用:检验和x检验。2结果2.1 各组肺组织湿/干重比及肺泡灌洗液中细胞计数比、蛋白含量比较 见表1.生理盐水组肺湿/千重比是著高于肉苁蓉组(P<0.05或0.01),肉苁蓉组肺泡灌洗液中细胞计数比、蛋白含量明显低于生理盐水组(P<0.05或0.01),且随着给药质量浓度增加呈现显著降低。表1 各组大鼠肺组织湿/干重比及肺泡灌洗液中细胞计数比、蛋白含量的比较(x)组别肺组织湿/干重比细胞计数比(%)蛋白含量(mg/L)生理盐水组4.58±0.2055.21x10.24254.88-95.42lg/ml.肉苁蓉组4.28±0.2131.34±12.4662.23±18.965g/ml.肉苁蓉组4.17±0.1627.32±8.28**46.16x11.34与生理盐水组比较,*P<0.01**P<0.01.下同2.2 各组大鼠肺组织形态学改变的比较 大体观察:生理盐水组肺脏体积明显增大,呈暗红色,表面可见不同程度充血水肿,边缘部分大量肺梗死灶:肉苁蓉组肺脏呈浅红色,表面轻度充血水肿,未见明显肺梗死灶,光镜观察示,生理盐水组见肺泡、肺间质充血水肿,肺泡腔内大量弥漫性中性粒细胞浸润,部分有脓肿形成,可见不同程度的肺不张、坏死、代偿性肺气肿、血栓及类似透明膜形成。肉苁蓉组上述病变明显减轻。生理盐水组肺泡上皮细胞肿胀,板层小体排空现象明显,形成大空泡,毛细血管内皮细胞肿胀,内皮细胞之间连续损伤,细胞间隙增宽,毛细血管及肺泡基底膜疏松,增宽,不规则增厚,厚薄不均,肉苁蓉组肺泡上皮细胞肿胀不明显,板层小体排空减轻,形成空泡数量少,体积小,毛细血管内皮细胞之间连接接近正常,基底膜轻度疏松,不规则增厚。5g/ml.肉苁蓉组较1g/mL肉苁蓉组肺组织形态学改变范围更小,肺损伤程度更轻。2.3 各组大鼠LP1和PVP的比较 见表2.生理盐水组LPI和PVP明显高于肉苁蓉组(P<0.05或0.01),肉苁蓉组LPI和PVP降低,具有显著量效关系。2.4 各组大鼠肺组织MDA.SOD.MPO活性的比较 见表3.生理盐水组肺组织中MDA含量显著高于肉苁蓉组,而肉苁蓉组肺组织中SOD活性和MPO活性显著增高(P<0.05或0.01)。表2 各组大鼠LPI和PVP比较(±)组别LP1PVP(x10)(mg/L)生理盐水组5.58±1.126.54±0.861g/mL肉苁蓉组2.53±0.37*3.87±0.725g/ml肉苁蓉组1.86±0.21*3.04=0.40表3 各组大鼠肺组织MDA.SOD、MPO活性比较(至±x)组别MDASODMPO(nmol/mg)(NU/mg)(E/g)生理盐水组3.66±0.6378.15±10.991.55±0.321g/mL.肉苁蓉组1.55±0.4489.60±5.630.48±0.13*5g/mml.肉苁蓉组0.55±0.15*102.39±3.32*0.33±0.12**3讨论多器官衰竭是败血症后期病情不可逆转和死亡率本原因川,保护器官功能对降低败血症临床高死亡率具有重要意义。肺作为多器官衰竭的首发器官,1/3败血症患者死于急性肺损伤(ALI)和急性呼吸窘迫综合症(ARDS)。AL1的主要病理生理机制是大量中性粒细胞在肺组织内聚集和活化,并与血管内皮细胞黏附的同时,转移单电子的还原型辅酶目氧化酶浓度增高而引起呼吸爆发,产生大量氧自由基,通过较强的氧化作用引起细胞膜和膜性结构的损害和功能障碍1。脂质过氧化物反映组织中氧自由基的变化,与肺损伤的程度有直接的量相关口。在机体的酶与非酶抗自由基氧化系统中,SOD的活性与组织损伤度保持良好的相关性m。肉苁蓉组MDA和SOD活性与生理盐水组比较,差异有统计学意义。肉苁蓉具有增强免疫功能,抗衰老,增强细胞DNA 合成率等作用、实验结果表明,肉苁蓉组肺系数、PLT、肺泡灌洗液中性粒细胞比例,肺血管通通性均显著下降,肺组织MDA活性下降、SOD是著上升,MPO活性下降,同时形态学观察发现肺组织损伤程度明显减轻,中性粒细胞浸润减少,且5g/mL肉苁蓉组较1g/mL肉苁蓉组肺损伤程度更轻,存在良好的量效关系。提示肉苁蓉对ALI具有较显著的保护作用。其机制可能为:(1)抑制炎性细胞肺内迁移,减少中性粒细胞等被激活产生的氧自由基,使生物膜得到保护:(2)促进核酸和蛋白质合成,对肺损伤具有保护作用:(3)增强吞噬细胞免疫功能,减轻内毒素造成的肺组织损伤,该实验结果为临床败血症急性肺损伤扶正补虚治疗提供了实验基础。参考文献111 金惠铭,自肠结扎穿孔术后的收血症模型IJ1,中国病理生理杂志,1990.6(2):126-127.121 Zhu WG-Me Callm MO-Levine BAet al. Role of platelet activating factor in panereiltis associated acute lng injry in the rat[].A Pathol:1992-140:971-979.131 汪谦,朱晓峰,赵西龙,现代医学实验方法[M],北京:人民卫生出版社,2007:508.[4] 张秀明,李健斋,魏明竞,现代临床生化检验学[M].北京:人民军医出版社,2008:896罗正曜,体克学[M]天津:天津科学技术出版社,2008:345.
  • 王志强三峡大学医学院,宜昌443002E-mail:hbwangzq@ctgu.edu.cn摘要:本实验观察肉苁蓉对败血症休克模型大鼠急性肺血管通透性损伤的生物学指标的影响,为败血症休克肺损伤治疗提供有效探索,把健康雄性SD大鼠40只随机分为4组:生理盐水组,大黄组,肉苁蓉(1g/mL)组,肉苁蓉(3g/mL)组。各组按剂量进行灌胃,分别灌胃15d,生理盐水每天5mL/kg:大黄水煎剂每天1g/kg:肉苁蓉水煎剂每天1g/kg(含生药1g/mL):肉苁蓉水煎剂每天3g/kg(含生药3g/mL)。采用盲肠结扎穿孔术(CLP)复制败血症休克模型大鼠。观察肉丛蓉提取物对败血症休克模型大鼠肺组织病理学、肺湿干重比、肺泡灌洗液中中性粒细胞比例、蛋白含量及肺泡通透指数、肺毛细血管通透性、肺组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、髓过氧化物酶(MPO)的影响。结果显示,生理盐水组大鼠肺间质水肿,肺泡腔内可见大量细胞浸润和血浆蛋白渗出,肺血管内皮细胞损伤;肺湿干重比、肺泡灌洗液中中性粒细胞比例、蛋白含量及肺泡通透指数、肺毛细血管通透性、MDA、SOD、MPO均显著升高。肉苁蓉给药组上述指标较生理盐水组显著降低;形态学观察显示肺组织损伤程度明显减轻,未见明显肺泡、肺间质充血水肿和中性粒细胞浸润。电镜观察显示肺泡上皮细胞肿胀不明显,板层小体排空减轻,形成空泡数量少,体积小,毛细血管内皮细胞之间连接接近正常,基底膜轻度疏松,不规则增厚。且3g/mL肉苁蓉给药组较1g/mL肉苁蓉给药组的肺损伤程度更轻,存在良好的量效关系。结果表明,肉苁蓉对败血症休克大鼠急性肺损伤具有良好保护作用,其机制可能是通过抑制中性粒细胞在肺组织的浸润,减少氧自由基对肺组织的损伤实现的。关键词:肉苁蓉:败血症;血管通透性;急性肺损伤
  • 王胜男,邢海燕,赵璐璐,高原,谷超,李刚内蒙古医科大学药学院,呼和浩特市,010100目的:研究肉苁蓉的水、醇提取物对昆明小鼠脾虚型便秘的治疗作用。方法:采用番泻叶水煎灌胃7天造成脾虚状态,然后采用饥饱失常法,隔天喂食生大米,14天后建立脾虚型便秘模型。从第15天开始,除对照组外,各组小鼠每天喂饲生大米,自由饮水1次,每次0.5h。同时从第15天开始给药,肉苁蓉水提组给药量为0.10g/20g,醇提组给药量为0.12g/20g。每天给药1次,连续7天。观察小鼠一般生物学特征并计算6小时粪便粒数及重量,以及首粒黑便时间。结果:(1)肉苁蓉不同溶剂提取物对脾虚型便秘小鼠体重的影响:与模型组相比,肉苁蓉水提组、醇提组均能明显提高昆明小鼠体重。(2)计算各组小鼠6小时粪便粒数、重量及首粒黑便时间:肉苁蓉模型组与对照组相比有显著差异,说明造模成功;与模型组相比,肉苁蓉水提组、醇提组均能提高小鼠6小时粪便粒数及重量,并且能够明显缩短首粒黑便的排出时间,但水提组与醇提组之间无明显差别。讨论:通过对比肉苁蓉的不同溶剂提取物,发现其具有潜在的治疗脾虚型便秘的作用。关键词:肉苁蓉,脾虚型便秘,肉苁蓉水提物,肉苁蓉醇提物作者简介:王胜男,女,在读硕士研究生,研究方向:药理学,E-mail:1395951925@qq.com*通讯作者:李刚,男,教授,博士,研究方向:神经药理 新药药理,
  • 【摘要】目的:研究补肾中药肉苁蓉含药血清对骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)定向分化的影响。方法:全骨髓培养法获得原代骨髓间充质干细胞,经胰酶消化传代培养至第4 代,将第4 代BMSCs 以5×106接种于2 块6 孔板,每板3 组孔,分为空白组、地塞米松组、肉苁蓉组,2 d 后换液,加入诱导液。空白组加入含10%胎牛血清(FBS)的L-DMEM 培养基继续培养,地塞米松组在基础培养基中加入诱导剂(含β 甘油磷酸钠10 mmol / L,地塞米松0.1 μmol / L,维生素C 50 mg / L),肉苁蓉组为含10%肉苁蓉含药血清的L-DMEM 培养基。第10 天取出1 块6 孔板做ALKP 染色,另一6 孔板于第20 天做6 孔板茜素红染色。结果:第10 天肉苁蓉组及地塞米松组ALKP 染色阳性,第12 天可见白色钙结节,第20 天茜素红染色阳性。结论:BMSCs 在肉苁蓉含药血清诱导下可向成骨细胞分化,分别作为组织工程的种子细胞和诱导因子对治疗骨质疏松、骨折不愈合将有良好的前景。【关键词】肉苁蓉; 骨髓; 间质干细胞; 成骨细胞; 细胞分化间充质干细胞(MSCs)是一种多潜能成体干细胞,主要存在于骨髓,还存在于胚胎时期间充质来源的骨外组织,如皮肤成纤维细胞、脂肪干细胞、骨骼肌的卫星细胞和血管内皮细胞等。骨髓MSCs(BMSCs)是骨髓基质的组成成分,体外分离培养后,在一定的诱导条件下,具有向成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、脂肪细胞、心肌细胞等多向分化的能力。在骨组织工程的种子细胞来源主要有成骨细胞和BMSCs等。成骨细胞虽然具有良好成骨活性,但来源有限,大量分离获取困难,体外大量扩增的潜力不足,难以满足骨组织工程临床应用的需要;BMSCs 不仅具有良好的成骨细胞分化潜能和高成骨活性, 而且具有强大的增殖潜能, 来源方便, 可以满足自体组织工程,成为研究的重点。中医认为,肾主骨、生髓。现代药理研究表明补肾药物均有不同程度的兴奋垂体-肾上腺-性腺系统作用,与骨代谢密切相关,雌激素有增强成骨作用,雄激素有促进蛋白质合成, 促进骨基质增加及钙磷沉积的作用。肉苁蓉(Herba Cistanches)中苯乙醇总甙、麦角甾苷、甜菜碱均具有雄激素样作用,本实验拟研究补肾中药肉苁蓉含药血清对BMSCs 向成骨细胞分化的影响。1 材料与试剂1. 1 材料1. 1. 1 实验动物SPF 无特定病原体动物(SPF)级SD 大鼠50 只,体重150~200 g,雌雄不限,由广州中医药大学实验中心提供。1. 1. 2 器材75 cm2 培养瓶,96 孔板,6 孔板(Coning),酶标仪(Thermo),CO2培养箱(Heraeus),注射器针头滤器,0.22 μm 滤膜(MILLIpore),SIGMA-3K15 离心机(sigma)。1. 2 试剂L-DMEM 培养基, 南美洲胎牛血清(FBS,海克隆),β 甘油磷酸钠,地塞米松,维生素C,茜素红,MTT(广州威佳),DMSO(sigma),肉苁蓉(产地云南),碱性磷酸酶(ALKP)染液(南京建成生物有限公司),0.25%胰酶(GIBCO 公司)。1. 3 肉苁蓉含药血清的制备与分组方法1. 3. 1 肉苁蓉含药血清的制备取肉苁蓉药材粗粉150 g,加入70%乙醇10 倍量,加热回流2 次,每次1 h,过滤,合并滤液,滤液减压浓缩至300 ml,室温冷却,4 ℃冰箱保存备用。将中药药液稀释至每毫升0.3 g 生药灌胃SD 大鼠,共50 只,每次1 ml,每日2 次,连续给药4 d,最后一次给药后1 h 经腹主动脉采血, 室温静置3 h 后置4 ℃冰箱过夜,2 500 r /min离心20 min, 收集上清液, 针头滤器过滤除菌,置于-20 ℃保存备用。1. 3. 2 分组方法本实验分3 组, 分别为空白组、地塞米松组和肉苁蓉含药血清组。空白组采用含10%FBS 的L-DMEM 培养基培养; 地塞米松组,在空白组基础上加入诱导剂,其最终浓度分别为β 甘油磷酸钠10 mmol / L,地塞米松0.1 μmol / L,维生素C 50 mg / L;肉苁蓉组,采用10%肉苁蓉含药血清的L-DMEM 培养基培养。1. 4 BMSCs 培养与观测方法1. 4. 1 原代BMSCs 的分离培养与扩增SD 大鼠经腹腔10%水合氯醛0.7 ml 麻醉后,75%乙醇浸泡颈部以下躯体5 min,无菌条件下取出双下肢股骨和胫骨,修洁软组织后,咬骨钳修剪骨端,暴露髓腔。10 ml 注射器吸取含10%胎牛血清的L-DMEM 培养基反复冲洗髓腔,至到骨质外观微微透亮。75 cm2 培养瓶收集骨髓冲洗液,放37 ℃、5%CO2孵育箱培养。每3 d 换液1 次。当细胞长满瓶底90%后,0.25%胰酶消化后,以1∶3 比例传代。1. 4. 2 BMSCs 诱导分化取P4 细胞,当细胞长满90%后,0.25%胰酶消化制备细胞悬液, 以细胞密度5×106 接种于2 块6 孔板,每板3 组孔,每孔2 ml。当细胞长满瓶底80%以上后换液, 空白组原培养基继续培养, 地塞米松组与肉苁蓉组分别加入成骨诱导液。1. 4. 3 碱性磷酸酶染色诱导培养第10 天时取出1 块6 孔板,吸去培养基,PBS 清洗2 遍,加入固定液固定10 min 后,加入底物,37 ℃水浴15 min,水洗。再加入苏木素复染10 min,水洗,晾干,镜下观察。1. 4. 4 茜素红染色诱导培养第20 天取出1 块6 孔板,吸去培养基,PBS 清洗3 次,95%乙醇固定10 min,加入0.1%茜素红-Tris-Hcl(pH 8.3)37 ℃,30 min,镜下观察结果。2 结果2. 1 细胞形态学观察BMSCs 为成纤维样细胞,贴壁后成梭形(见图1)。加入诱导液后,空白组细胞无明显变化; 地塞米松组第5 天开始出现细胞成聚集生长,细胞体积增大(见图2);肉苁蓉含药血清组从第3 天开始出现细胞成聚集生长,细胞体积增大(见图3)。12 d 后地塞米松组(见图4)和肉苁蓉组(见图5)见明显结节形成。2. 2 碱性磷酸酶染色诱导第10 天, 经细胞碱性磷酸酶染色,空白组细胞内无色素沉着,地塞米松组及肉苁蓉组可见细胞内蓝色颗粒, 细胞聚集区成紫黑色(见图6、7)。2. 3 茜素红染色第20 天,茜素红染色,空白组细胞间无色素沉积, 地塞米松组及肉苁蓉组可见红色结节堆积(见图8-9)。3 讨论3. 1 肉苁蓉含药血清对BMSCs 诱导作用肉苁蓉具有补中、入肝、滋肾、壮阳、润肠、通便之功效。现代药理研究表明补肾药物均有不同程度的兴奋垂体-肾上腺-性腺系统作用,与骨代谢密切相关,雌激素有增强成骨作用,雄激素有促进蛋白质合成,促进骨基质增加及钙磷沉积的作用[1]。肉苁蓉中苯乙醇总甙、麦角甾苷、甜菜碱均具有雄激素样作用。本实验发现,肉苁蓉含药血清可诱导BMSCs 向成骨细胞分化。尽管目前以单味中药或复方中药诱导BMSCs 向成骨细胞分化取得成功, 但具体分子机制目前还未见相关报道。通过蛋白质组学研究可以分析此过程中相关蛋白质组差异,建立功能蛋白质组学,以期对肾主骨的理论进行新的诠释。3. 2 细胞密度在BMSCs 向成骨细胞分化过程中起着重要作用骨结节的形成除需要成骨诱导剂作用外,还有赖于接种细胞的密度,细胞密度必须达到一定的密度,细胞融合,才能向成骨细胞分化。本实验中当第4 代细胞增殖至90%以上融合时加入诱导剂进行培养,当细胞密度过低时细胞将增殖缓慢,无聚集生长之趋势。在细胞密度不均匀的同一培养孔内,细胞密集区出现了细胞界限不清、结构模糊现象,细胞聚集成团状,AKP 染色及茜素红染色阳性;而在细胞密度较低的区域并无细胞聚集成团状,AKP 染色及茜素红染色阴性。故骨组织工程中采用微载体结合更有效的体外培养方式,如三维培养(RCCS),以获得更多的细胞对细胞移植的成功具有重大影响。3. 3 肉苁蓉含药血清诱导BMSCs 的临床意义骨组织工程学具有广阔的临床应用前景, 成为现代骨科学的研究热点。BMSCs 作为目前最为理想的骨组织工程种子细胞, 对其作用研究的中心任务则是如何使之在尽可能简单的条件下定向分化为成骨细胞,进而转化为成熟的骨细胞。目前对BMSCs 定向分化常用的诱导剂由地塞米松、维生素C、β 甘油磷酸钠组成。而在体外培养中,地塞米松对细胞增殖具有抑制作用[2],与本实验所见相同,临床上地塞米松具有引起感染、骨坏死、骨质疏松等不良反应,将会限制BMSCs 移植后在体内作为诱导剂的应用。肉苁蓉具有补肾、强筋骨的作用,本实验发现肉苁蓉具有促进BMSCs 增殖和诱导BMSCs 向成骨分化的作用。长期的临床应用中,未见肉苁蓉的不良反应, 将其作为体内诱导剂具有广泛的临床应用前景。总之,目前对于BMSCs 作为骨组织工程种子细胞的研究,大多还处于实验阶段,如何能在较短时间内得到足够的BMSCs, 并运用简单的方法诱导其向成骨分化,是目前研究的重点。尽管具有补肾、强筋骨作用的肉苁蓉诱导BMSCs 成骨分化的机制尚有待进一步研究, 但将其作为BMSCs 分化诱导剂,用于MSCs 移植治疗骨折延迟愈合、不愈合、骨坏死等具有光明的前景。参考文献[1] 杨收平. 肾主骨生髓学说的现代理解[J]. 中国中西医结合肾病杂志,2002,3(8):489 490.[2] 袁风红,邹耀红,高恺言,等. 地塞米松对体外人骨髓基质细胞增值及成骨分化的影响[J]. 中华风湿病学杂志,2006,10(8):482 484.
  • 摘要试验以荒漠肉苁蓉为研究对象, 选取聚碳酸酯 (PC)、聚酰胺 (PA) 和玻璃3种包装材料, 通过感官评定和褐变度测定试验, 对肉苁蓉罐头的包装工艺进行分析。结果显示, PC、PA和玻璃这3种材料真空包装的肉苁蓉罐头均在6批样品中的感官评定和褐变度表现出无显著性差异 (p>0.05)。此外, 感官评定和褐变度在3种材料真空包装的肉苁蓉罐头之间也表现出无显著性差异 (p>0.05), 但是玻璃材料包装的肉苁蓉罐头的褐变度和感官度在3种材料中的分值最高。关键词肉苁蓉; 罐头; 聚碳酸酯; 聚酰胺; 玻璃; 真空包装肉苁蓉属(Cistanche hoffmg. Et Link)植物是列当科(Orobanchaceae)的多年生且寄生的草本植物,主要分布在中国西北地区[1],其中内蒙古自治区多分布在阿拉善盟、乌海市、巴彦淖尔市、鄂尔多斯市共4个盟市现辖行政区域。内蒙古肉苁蓉在2015年被原国家质检总局批准实施地理标志产品保护,在2016年,其产量和品质在我国肉苁蓉中位居第一[2-4]。以往的研究表明,荒漠肉苁蓉有抑制脂质过氧化、提高抗氧化酶活性、增强机体耐受能力、提高记忆力和抗辐射等作用[5-9]。此外,肉苁蓉亦可作为食品原料,内蒙古阿拉善荒漠肉苁蓉被国家食品安全风险评估中心(CFSA)认定符合食品安全要求[4]。内蒙古阿拉善荒漠肉苁蓉被国家食品安全风险评估中心(CFSA)认定符合食品安全要求[4]。2020年,国家卫生健康委员会发布了对肉苁蓉等9种物质开展按照传统既是食品又是中药材的物质管理试点工作的通知。由此可见,肉苁蓉具有较高的药用价值和食用价值,目前国内对肉苁蓉的开发多集中在医药方面,将其作为食品加工原料研究相对较少[13]。因此提高肉苁蓉的保藏技术对保持其药用价值和食用保健价值至关重要。现有的保藏手段多以冷藏或沙藏为主,这些技术手段已不能完全满足市场的需求,且保藏过程中与空气接触较多,更容易加速其品质的降低[11-13]。因此,以罐头形式对其进行保藏成为一种新的选择,更是一种新的尝试,相关研究较为缺乏。影响罐头包装工艺流程的因素有很多,其中包装材料是影响罐头品质的首要因素。因此,试验以内蒙古西部地区生产的荒漠肉苁蓉为原料,参照软罐头工艺进行加工制作,在罐头工艺及参数研究的基础上,选取聚碳酸酯(PC)、聚酰胺(PA)和玻璃3种物质作为真空包装材料,通过感官评定和褐变度测定试验,分析其对肉苁蓉罐头品质及包装工艺的影响,进而确定适宜的肉苁蓉罐头包装材料。1 试验材料与方法1.1 试验材料1.1.1 原料及辅料从内蒙古自治区巴彦淖尔等地区采集的新鲜荒漠肉苁蓉,进行清洗处理保存。辅料为糖、食盐、抗坏血酸钠、柠檬酸等,均为市售。1.1.2 仪器与设备1.2 试验方法1.2.1 肉苁蓉罐头制作流程的初步设计参考软罐头制作常规流程,依据前期试验结果,确定肉苁蓉罐头工艺:原料采集→选择和处理→清洗→去皮、护色保脆→切块→包装→排气→密封→杀菌、冷却→贮藏。1.2.2 感官测定根据肉苁蓉罐头感官检测内容和要求,选择24位感官鉴定人员,人员信息如表2所示。主要测定组织形态、色泽、滋味和气味等感官指标[14]。1.2.3 肉苁蓉罐头褐变度测定[15]在肉苁蓉完成高温高压杀菌、色差与感官评价后,将待测肉苁蓉罐头内容物取样,加入5倍体积的缓冲液,然后进行液氮研磨,转入离心管中,以12 000r/min离心10 min,收集上清液,利用分光光度计测定波长在450 nm处的吸光度,结果OD值表示褐变度。1.2.4 数据分析与处理采用SPSS 21.0 单因素方差分析(One-way ANOVA)和多重比较(LSD)进行显著性水平检验(p<0.05)。采用Excel 2010绘图。2 结果与分析2.1 PA材料真空包装对肉苁蓉罐头包装工艺的影响由图1可知,在各组样品之间肉苁蓉罐头褐变度无显著性差异;同时由图2可知,在各批样品之间肉苁蓉罐头感官分值无显著性差异。因此,认为PA包装材料是稳定的。2.2 PC材料真空包装对肉苁蓉罐头包装工艺的影响由图3可知,在各组样品之间肉苁蓉罐头褐变度无显著性差异;同时由图4可知,在各批样品之间肉苁蓉罐头感官分值无显著性差异。因此,认为PA包装材料是稳定的。2.3 玻璃材料真空包装对肉苁蓉罐头包装工艺的影响由图5可知,在各组样品之间肉苁蓉罐头褐变度无显著性差异;同时由图6可知,在各批样品之间肉苁蓉罐头感官分值无显著性差异。因此,认为玻璃包装材料是稳定的。2.4 不同材料之间对肉苁蓉罐头包装工艺影响的差异性分析以上结果显示,褐变度幅度、感官度在以PA、PC和玻璃真空包装的各组肉苁蓉罐头样品之间均表现出无显著性差异。然后,对3种材料之间的褐变度幅度、感官度进行差异性分析,同样发现3种材料之间的褐变度、感官分值也表现出无显著性差异(图7)。但是总体来说,玻璃材料真空包装的肉苁蓉罐头褐变度较低,感官分值较高。3 结论与讨论此次试验分析了聚碳酸酯(PC)、聚酰胺(PA)和玻璃3种材料真空包装肉苁蓉罐头的品质。结果发现,3种材料均可以稳定地保证肉苁蓉罐头的褐变度和感官度,但是这2个指标在3种材料之间并无显著性的差异。这可能是因为影响肉苁蓉罐头品质因素很多,包括原料的成熟度、采收季节等因素,还包括切分、护色、硬化等前处理因素,以及操作工艺中各参数等。对比分析发现,与PC和PA材料相比,玻璃材料真空包装后的肉苁蓉罐头的褐变度和感官度分值最高。这可能与感官评定的人员或者消费者群体对于传统玻璃材料包装的罐头更于倾向有关。因此,针对市场需求和消费需要选择优质原料、科学合理的预处理方法和工艺参数,是优质肉苁蓉罐头的质量保证。制作优质的肉苁蓉罐头还需要对各部分工艺参数做进一步深入研究。参考文献:[1] 刘媖心. 中国沙漠植物志[M]. 北京: 科学出版社, 1985.[2] 乔海峰. 肉苁蓉寄生生长与产量品质形成研究[D]. 呼和浩特: 内蒙古农业大学, 2011.[3] 温都苏. 中国肉苁蓉属的分类学研究及其寄主植物的确定[D]. 呼和浩特: 内蒙古农业大学, 2008.[4] 陈志豪, 朱效兵, 夏美茹, 等. 肉苁蓉的营养保健特性及加工应用[J]. 现代食品, 2019(5): 123-126, 130.[5] 景富春, 陈虹. 肉苁蓉的神经保护作用研究进展[J]. 时珍国医国药, 2006, 17(10): 1878-1879.[6] 吴晓春, 史颖. 肉苁蓉的研究与临床应用[J]. 甘肃中医,2008, 20(12): 49-51.[7] JIANG Y, TU P F. Analysis of chemical constituents inCistanche species[J]. Journal of Chromatography A, 2009,1216(11): 1970-1979.[8] 侯志华, 常国文. 肉苁蓉的药理学研究进展[J]. 中国民族医药杂志, 2003, 10(4): 50-51.[9] TU P F, SONG Z H, SHI H M, et al. Arylethyl(phenylethanoid) glycosides and oligosaccharide from thestem of Cistanche tubulosa[J]. Helvetica Chimica Acta, 2006,89(5): 927-935.[10] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2015.[11] 张红燕. 包装方式对肉苁蓉品质影响及肉苁蓉种子休眠特性研究[D]. 兰州: 甘肃农业大学, 2016.[12] 葛锋, 王晓东, 赵兵, 等. 肉苁蓉愈伤组织的超低温保藏方法[J]. 过程工程学报, 2006(5): 794-798.[13] 张红燕, 郭晔红, 贺斌, 等. 温度和包装方式对鲜品肉苁蓉抗氧化酶活性的影响[J]. 中药材, 2016(5): 1019-1023.[14] 高家敏, 刘彤彤, 李红霞, 等. 肉苁蓉保健食品原料的质量研究[J]. 食品安全质量检测学报, 2020, 11: 3637-3641.[15] 朱效兵, 徐瑞年, 夏美茹, 等. 肉苁蓉软罐头品质测定与分析[J]. 农产品加工, 2020, 11: 57-61.
  • [摘要] 目的: 探讨咖啡酸类小分子肉苁蓉苷F 与牛血清白蛋白的结合反应特性。方法: 运用荧光光谱( FS) 、紫外-可见光谱( UV) 和圆二色谱( CD) 法探讨了生理条件下肉苁蓉苷F( 该化合物为作者首次从紫珠属植物中分离得到,简记为CF) 与牛血清白蛋白( BSA) 的相互作用。结果: 计算得到CF-BSA 的静态表观结合常数( Ka) ,结合位点数( n) ,能量转移效率( E) ,空间距离( r) ,热力学参数ΔG,ΔH,ΔS,与CF 作用前后BSA 中α-螺旋结构含量的变化,明确了CF 在BSA 上的结合位置,分析了几种常见金属离子对CF 与BSA 相互作用的影响。结论: CF 与BSA 形成基态复合物可导致BSA 内源荧光猝灭,其在BSA 上的结合位点数约为1, 25 ℃时的结合常数Ka为4. 36 × 104 L·mol - 1 ,二者之间的空间距离r 为3. 09 nm,结合过程主要表现为氢键作用,CF 在BSA 上的作用位点为site I,Mg2 + ,Fe3 + ,Cu2 + ,Zn2 + 的存在增强了CF 与BSA 的结合作用。猝灭机制主要为静态猝灭和非辐射能量转移。CD 光谱表明CF 对BSA 的空间构型改变有一定的影响。[关键词] 肉苁蓉苷F; 牛血清白蛋白; 荧光猝灭; 作用位点血清白蛋白作为生命体血浆中最丰富的载体,具有贮运内源性代谢产物和外源性小分子等重要生理功能,是药物发挥药效的重要载体和靶分子。药物进入血液后,首先通过血浆的结合和贮存,然后在体内运输,达到受体部位、进而发生药理作用。因此,研究中药小分子与血清白蛋白相互作用,有助于了解药物在体内的运输和代谢机制,对于阐明药物作用机制具有重要的理论意义。荧光光谱、紫外-可见光谱和圆二色谱是研究药物与蛋白质相互作用的重要手段[1]。咖啡酸类衍生物具有抗菌、抗病毒及增强机体免疫等功能。然而,这类中药小分子与蛋白的结合研究鲜有报道,查阅文献仅发现咖啡酸[2]、氯原酸[3]分别与蛋白的相互结合研究。由于这2 个小分子结构中不含糖基,因此研究结果未涉及糖基对该类药物与蛋白结合的影响。本文采用荧光、紫外-可见、圆二色谱法研究了生理条件下结构中含双糖的咖啡酸类小分子肉苁蓉苷F( 该化合物为作者首次从紫珠属植物中分离得到,简记为CF,结构见图1)与BSA 的相互作用,测定了荧光猝灭常数,结合常数,能量转移效率,荧光给体与受体之间的距离及CF 在BSA 上的作用位点,同时研究了Mg2 + ,Fe3 + ,Cu2 + ,Zn2 + 金属离子对CF 与BSA 结合作用的影响。这些研究旨在为进一步探讨CF 在生命体内的运输和代谢作用机制提供理论参考依据。1 材料与方法1 材料F2500 荧光光度计( Hitachi 公司) ,UV1000 紫外-可见光谱仪( 上海天美科学仪器有限公司) ,pHS-25 型pH 计( 上海精密科学仪器有限公司) ,DKB-501A 型超级恒温水槽( 上海森信实验仪器有限公司) ,CHIRASCAN 圆二色光谱仪( 英国应用光物理公司) ,VG ZAB-HS 质谱仪( 英国VG 公司) ,AVANCE-400 超导核磁共振仪( 瑞士Bruker 公司) ,伊利特P 230 双泵高效液相色谱仪( 大连伊利特分析仪器有限公司) 。CF( 从紫珠属植物藤紫珠中分离得到,经MS,NMR 确定结构,HPLC-UV 面积归一化法测定纯度大于98%) 溶液: 准确称取0. 015 6 g CF,蒸馏水溶解,定容于25 mL 量瓶,配制成浓度为1. 28 × 10 - 3mol·L - 1的溶液,4℃以下避光保存。BSA( Sigma 公司,纯度99%) 溶液: 准确称取0. 068 0 g BSA,蒸馏水溶解,定容于50 mL 量瓶,配制成2. 0 × 10 - 5 mol·L - 1溶液,4℃以下避光保存。保泰松( 百灵威有限公司,纯度99%) 和布洛芬( 百灵威有限公司,纯度98%) 溶液: 分别称取保泰松0. 015 4 g 和布洛芬0. 010 3 g,20 mL 乙醇溶解,转移至50 mL 量瓶中,蒸馏水稀释至刻度,分别配制成浓度为1. 00 × 10 - 3 mol·L - 1 的保泰松和布洛芬储备液,避光保存。实验过程中所用试剂均为分析纯,水为双蒸水。1. 2 荧光光谱测定移取浓度为2. 0 × 10 - 5 mol·L - 1的BSA 溶液50 μL 于4 mL 石英吸收池中,加入pH 7. 40 的Tris-HCl 缓冲液2. 5 mL。用微量注射器进行荧光滴定,每次加入10 μL CF 溶液后,混合均匀,静置5 min,以280 nm 为激发波长,入射和发射狭缝分别为5 nm,在荧光光度计上记录300 ~ 500nm 的发射光谱。并在Δλ 为15,60 nm 分别测量BSA 同步荧光光谱。1. 3 能量转移的测定分别测量300 ~ 500 nm 处的1. 0 × 10 - 5 mol·L - 1BSA 及其与CF 摩尔比为1∶1 时体系的荧光光谱( 荧光实验条件同上) ,以及300 ~ 500 nm 处1. 0 × 10 - 5 mol·L - 1 CF 的紫外-可见吸收光谱。1. 4 紫外光谱的测定移取浓度为2. 0 × 10 - 5 mol·L - 1的BSA 溶液1. 3 mL 于比色皿中,加入Tris-HCl 缓冲液1. 3 mL,用微量注射器进行紫外滴定,每次加入10 μL CF 溶液,混合均匀,静置5 min,分别测其200 ~ 500 nm 溶液紫外-可见吸收光谱,狭缝宽0. 5 nm,Tris-HCl 缓冲液为参比溶液。1. 5 圆二色谱的测定25 ℃下测定200 ~ 250 nm处CF 与BSA 作用前后的CD 光谱。所测BSA 浓度为2. 0 × 10 - 6 mol·L - 1,池径为1 mm,每份溶液平均扫描3 次。实验结果用摩尔椭圆率( [θ]) 表示,Tris-HCl 缓冲液为参比溶液。1. 6 竞争试验在石英吸收池中固定标记物( 保泰松或布洛芬) 和BSA 的浓度均为1. 13 × 10 - 6 mol·L - 1,每次加入2 μL CF 溶液, 25 ℃下分别测量在不同标记物存在下的BSA 和CF 相互作用的荧光光谱。1. 7 金属离子的影响将金属离子和CF 溶液混合,浓度均为1. 2 × 10 - 3 mol·L - 1,用微量注射器每次移取10 μL 混合液,加入到浓度为4. 0 × 10 - 7 mol·L - 1的BSA 溶液中进行荧光滴定。2 结果与讨论2. 1 肉苁蓉苷F 对BSA 的荧光猝灭作用BSA 分子是内源性荧光物质,在280 nm 激发波长下,BSA的最大发射波长为340 nm,同时考察了CF 在此条件下无荧光峰干扰,结果见图2。在实验条件下保持BSA 浓度不变,随着CF 浓度的不断增加,BSA 在340 nm 处荧光发射峰强度有规律减弱,荧光猝灭渐趋饱和,并且最大荧光发射峰发生红移,从340 nm红移至343 nm,表明BSA 中212 位色氨酸残基附近亲水性增强[4],这可能是因为CF 含有葡萄糖和鼠李糖2 个糖基,极性强,水溶性好,在与BSA 结合后,使得BSA 中212 位色氨酸所处环境极性增大。同时, 462 nm 处CF 的荧光发射峰强度增大,表明CF 与BSA 之间发生相互作用,而且发生了能量转移。等发射点的存在( 423 nm) 表明为静态猝灭。由于“内滤光效应”会引起物质荧光强度降低,Steiner[5-6]等提出,如果药物在激发和发射波长处吸收值不超过0. 3 时,内滤光效应用如下公式进行校正。Fcorr = Fobs × e( Aex + Aem) /2 ( 1)Fcorr和Fobs分别代表校正后和观察到的荧光强度,Aex和Aem则是CF 在激发和发射波长处的吸收值,本文采用此公式对内滤光效应予以校正。2. 2 猝灭机制药物分子对蛋白荧光猝灭主要可分为动态猝灭和静态猝灭。动态猝灭作用过程遵循Stern-Volmer 方程[7-8]。F0 /F = 1 + Ksv[Q] = 1 + Kqτ0[Q] ( 2)式中F0和F 分别为不存在和存在药物时BSA的荧光强度; Ksv为动态猝灭常数; Kq为双分子猝灭速率常数; τ0为蛋白荧光寿命( 约10 - 8 s) [9]; [Q]为药物浓度。BSA 的Stern-Volmer 曲线见图3。根据Stern-Volmer 方程结合图3,分别求出了不同温度下CF 对BSA 的猝灭速率常数Kq,见表1。由于各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭常数为2. 0 × 1010 L·mol - 1·s - 1[9],从表1 中可看出CF 对BSA 猝灭过程的Kq远大于扩散碰撞猝灭常数,并且随着温度升高,Ksv减小,所以推测猝灭不是由动态碰撞引起的,而是由于形成复合物引起的静态猝灭。数据计算过程中统一读取340 nm 下的荧光强度。2. 3 结合参数当荧光物质与药物分子之间形成不发荧光的复合物时,可利用许多公式,如对数方程、lineweaver-Burk 方程、Scatchard 方程等来计算药物小分子与BSA 相互作用的结合常数和结合位点数。由于荧光猝灭实验中所采用的最小CF 浓度为BSA 浓度的12. 5 倍,最大的为87. 5 倍,所以采用对数方程关系式[10-11]计算蛋白与CF 相互作用的结合常数Ka和结合位点数n 是理想的,公式如下。lg[( F0 - F) /F] = lgKa + nlg[Q] ( 3)根据式( 3) 并结合双对数曲线图4 可以得到CF与BSA 结合后的Ka和n,见表1。Ka数据的数量级为104,说明CF 与BSA 之间属于高亲合作用范畴。Ka和n 结果证实在生物体内CF 能够被牛血清白蛋白所转运和贮存。在所研究的药物浓度区域范围内,CF 在BSA 分子上平均具有1. 02 个结合位点,表明1 mol BSA 约与1 mol CF 分子结合。2. 4 作用类型药物小分子和生物大分子之间的作用力主要包括氢键、范德华力、静电、疏水作用力图4 CF 的双对数曲线Fig. 4 Double-lg plots for CF等。根据反应前后热力学焓变ΔH 和熵变ΔS 的相对大小,可以判断药物与蛋白质之间的主要作用力类型。当温度变化范围不大的时候,ΔH 可视为常数,根据如下式子可计算出小分子与生物大分子作用的有关热力学参数。其中,ΔH 为焓变; ΔS 为熵变; ΔG 为吉布斯自由能变; T 为摄氏温度; Ka为不同温度下的结合常数,R为理想气体常数。根据上述热力学公式结合图5 可以得到CF 与BSA 结合过程的ΔH,ΔS,ΔG,见表1。ΔG < 0 表明CF 与BSA 的结合属于自发过程,ΔH < 0,ΔS < 0 说明CF 与BSA 之间的作用力主要表现为氢键结合[12]。ΔS < 0 可认为自发过程的实现主要来自于ΔH 对ΔG 的贡献,即CF 与BSA 的结合是热驱动过程。原因可能是CF 结构中富含-OH,可与BSA 上的极性基团-NH2,-OH 等生成氢键,这种作用力随着温度的升高而减弱。另外,由于CF 含有咖啡酰基芳香环结构,所以其与蛋白相互作用过程中,二者之间的疏水作用力是不能忽略的。2. 5 能量转移25 ℃ 时测量CF 的紫外-可见吸收光谱和BSA 的荧光光谱,2 个光谱有一定程度重叠,见图6,说明CF 与BSA 之间发生了非辐射能量转移。根据Frster 非辐射能量转移理论[13],可粗略计算出能量转移效率E 为0. 29,CF 与BSA分子中色氨酸残基之间的距离r 为3. 09 nm,该值小于7 nm,表明CF 能够插入BSA 分子内部,形成稳定的非共价复合物。因此,静态猝灭和非辐射能量转移是导致CF 对BSA 荧光猝灭的两大主要原因。2. 6 紫外图谱BSA 对CF 紫外吸收的影响见图7。CF 在333 nm 处有最大吸收峰。固定BSA 浓度,逐渐加入CF 溶液,发现333 nm 最大吸收峰消失,当溶液中CF 浓度远大于BSA 浓度时,333 nm峰位逐渐增加,该现象表明CF 与BSA 之间发生相互作用,与荧光实验结果相吻合。2. 7 同步荧光光谱利用同步荧光光谱技术可以了解药物分子对蛋白质构象的影响,即通过选择合适的波长差可以将在普通荧光光谱上相互重叠的荧光峰分开,固定Δλ = 15 nm 和Δλ = 60 nm 所作出的同步荧光光谱分别表现出蛋白质的酪氨酸残基和色氨酸残基的光谱特性。25 ℃下CF 与BSA 结合过程的同步荧光扫描图见图8。BSA 分子的酪氨酸和色氨酸残基的同步荧光发射强度随着CF 浓度的增加而下降,表明CF 对BSA 分子内的酪氨酸和色氨酸残基的荧光均有猝灭; 但随着CF 的加入在荧光最大发射峰280, 286 nm 处未看到明显的峰移动,表明CF 和BSA 结合过程中对BSA 中色氨酸、酪氨酸残基附近的微环境影响不大[1]2. 8 圆二色谱25 ℃ 时CF 与BSA 体系的圆二色谱图见图9。BSA 在远紫外区208,222 nm 处有2 个负峰。当加入一定量CF 后,BSA 在208,222 nm 处的摩尔椭圆率降低,但形状和肩峰的位置未发生明显移动。这种结果的产生可能是因为CF 与BSA 结合形成复合物,对血清蛋白的α-螺旋结构产生了影响,但其二级结构仍以α-螺旋为主。以CD 谱208 nm 处的摩尔椭圆率按式( 6) 粗略计算与CF 作用前后BSA 中α-螺旋结构含量[14]。α = { ( -[θ]208 - 4 000) - ( 33 000 - 4 000) } × 100%( 6)计算结果表明,当CF 与BSA 浓度比为10 ∶ 1时,BSA 中α-螺旋二级结构含量由55. 67% 下降为49. 32%。2. 9 位点试验竞争结合实验常用来确定药物在蛋白质上的作用位点。从CF 与BSA 的结合常数Ka,可看出CF 与BSA 的一个作用位点有很强的相互作用。蛋白质主要有2 个结合位点siteⅠ,siteⅡ[15]。为了确定CF 在BSA 上的结合位置,选择保泰松、布洛芬分别为siteⅠ, siteⅡ的标记物加入到CF-BSA 体系进行竞争实验。运用式( 2) 计算结果显示,在保泰松或布洛芬存在的情况下,CF 与BSA 的结合常数在25 ℃时分别为2. 38 × 104, 3. 57 × 104 L·mol - 1。数据表明在保泰松存在的条件下,CF 与BSA 的结合常数明显减小,而布洛芬的存在对CF 与BSA 结合常数的影响较小,该结果说明CF 主要与保泰松竞争性结合BSA 上同一位点,而与布洛芬发生竞争性结合几率较小。所以CF 在BSA 分子上的结合位点主要与保泰松的结合位点一致,结合在疏水腔siteⅠ[16]。2. 10 金属离子对药物和BSA 相互作用的影响本文运用式( 2) 研究了在25 ℃时4 种金属离子对CF 与BSA 结合常数的影响,结果见表2。金属离子Cu2 + ,Fe3 + ,Mg2 + ,Zn2 + 的存在均增强了CF 与BSA的结合常数,其原因可能是金属离子与CF 形成配合物的疏水性更强,易与BSA 相互作用,使得CF 与BSA 的结合常数增大[17]。结合常数的增大在一定程度上可缓冲血浆中药物的浓度,从而有利于延长药物作用的持续时间。3 讨论药物在体内主要与白蛋白、α-酸性糖蛋白、脂蛋白等结合,其中,大多数酸性药物主要与白蛋白结合[18]。CF 作为酸性药物,在体内应该主要与白蛋白结合。对比文献[2]中咖啡酸和BSA 的结合常数Ka( 数量级为105 ) 与CF 和BSA 的结合常数Ka( 数量级为104 ) ,发现分子结构中含糖基会使蛋白与药物的结合常数下降。原因一可能是小分子含糖基后会导致小分子极性增大,从而不利于分子通过疏水作用结合到蛋白疏水腔siteⅠ,该结论与位点实验的结果是相吻合的; 其二,小分子含糖基后会导致小分子体积增大,也不利于该分子被蛋白siteⅠ“口袋”俘获。从药代动力学的角度来分析,结构中含糖基的小分子降低了其与蛋白的结合常数,而结合常数的减小有利于药物在体内的释放,且使药物在体内的半衰期时间缩短。采用光谱学方法主要研究了生理条件下中药小分子肉苁蓉苷F 与BSA 的结合常数、结合位点数、结合作用力、作用位点、能量转移效率及猝灭机制。实验结果表明肉苁蓉苷F 不仅可以被牛血清白蛋白所贮存、运载,而且它对蛋白的二级构象有一定影响,这很可能是咖啡酸类药物具有明显抗菌、抗病毒等活性的理论依据之一。[参考文献][1] Guo X J,Jing K,Guo C,et al. The investigation of the interactionbetween oxybutynin hydrochloride and bovine serum albuminby spectroscopic methods[J]. J Lumin,2010,130: 2281.[2] Liu Q W,Xu H,Li G H,et al. Insight into Interction of caffeicacid with bovine serum albumin[J]. Food Sci,2010,31: 24.[3] Yang M M,Yang P,Zhang L W. Interaction of caffeoyl drugwith bovine serum albumin by fluorescence spectrometry[J].Chin Sci Bull,1994,39: 31.[4] Bi S Y,Yan L L,Wang B B,et al. Spectroscopic and voltammetriccharacterizations of interaction of two local anesthetics withbovine serum albumin[J]. J Lumin,2011,131: 866.[5] Lerman L S. Structural considerations in the interaction of DNAand acridines[J]. J Mol Biol,1961,3: 18.[6 ] Stiner R T,Weintyb L. Excited states of protein and nucleic acid[M]. New York: Plenum Press,1971: 40.[7] Chen G Z,Huang X Z,Xu J G,et al. Fluorescence analyticalmethod[M]. Beijing: Science Press,1990: 122.[8] Dewey T G. Biophysical and biochemical aspects of fluorescencespectroscopy[M]. New York: Plenum,1991: 1.[9] Eckenhoff R G,Johansson J S. Molecular interactions betweeninhaled anesthetics and proteins[J]. Pharmacol Rev,1997,49:343.[10] Zhao H W,Ge M,Zhang Z X,et al. Spectroscopic studies onthe interaction between riboflavin and albumins[J]. SpectrochimActa Part A,2006,65: 811.[11] Li G Z,Liu Y M,Guo X Y,et al. Study on the interaction betweenbovine serum albumins and topotecan hydrochloride or irinotecanhydrochloride[J]. Acta Chim Sin,2006,64: 679.[12] Ross D P,Subramanian S. Thermodynamics of protein associationreactions: forces contributing to stability[J]. Biochemistry,1981,20: 3096.[13] Frster T. Modern quantum chemistry[M]. New York: AcademicPress,1996.[14] Belal H M Hussein. Spectroscopic studies of 7,8-dihydroxy-4-methylcoumarin and its interaction with bovine serum albumin[J]. J Lumin,2011,131: 900.[15] Sudlow G,Birkett D J,Wade D N. Further characterization ofspecific drug binding site on human serum albumin[J]. MolPharmacol,1976,12: 1052.[16] Tian J N,Liu J Q,Hu Z D,et al. Interaction of wogonin withbovine serum albumin[J]. Biorg Med Chem,2005,13: 4124.[17] Sun Y T,Zhang Y P,Bi S Y,et al. Studies on the interactionfor bovine serum albumins with phenylbutazone and ibuprofen byfluorescence spectrometry[J]. Chem J Chin Univ,2009,30:1095.[18] Song M,Hang T J,Wang Y,et al. Determination of oleanolicacid in human plasma and study of its pharmacokinetics in Chinesehealthy male volunteers by HPLC tandem mass spectrometry[J]. J Pharm Biomed Anal,2006,40: 190.
  • 摘要:目的 研究肉苁蓉复方颗粒对大鼠骨质疏松症的治疗作用,为治疗骨质疏松提供药效依据。方法 将肉苁蓉、菊粉与硫酸软骨素组成复方制剂,作用于去卵巢所致骨质疏松大鼠。结果 通过肉苁蓉复方颗粒进行治疗后,可使大鼠体重增长缓慢,显著提高股骨干质量、骨密度,降低血清中碱性磷酸酶、骨钙素、组织蛋白酶K 和脱氧吡啶啉含量,抑制白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α 的表达,促进骨形态发生蛋白-2 的表达。结论 肉苁蓉复方颗粒可以显著改善去卵巢大鼠骨质疏松的状态,抑制骨量的继续丢失。关键词:肉苁蓉;骨质疏松;骨量;白细胞介素-6;骨形态发生蛋白-2骨质疏松症是一种内分泌、营养、免疫、遗传多种复合因素引起的代谢性疾病,大部分患者属于原发性骨质疏松,主要是因年龄增加所致,在老年人、绝经后妇女和恶性肿瘤患者中发生率较高。因此,研究防治骨质疏松的药物极为重要。  研究表明,肉苁蓉能提高性激素水平[1-2]、促进骨形成[3-5]、抑制骨吸收[6];菊粉可以增加钙结合蛋白的表达与磷的生物利用度、提高钙吸收与全身骨骼矿物质参数[7-8];硫酸软骨素能促进成骨细胞增生和新骨形成[9]。本研究将肉苁蓉、菊粉与硫酸软骨素组成复方制剂,研究以去卵巢所致骨质疏松大鼠为对象,观察由上述复方制剂增加动物骨密度及相关蛋白表达的效果,为治疗和预防骨质疏松的作用提供依据。1 材料  肉苁蓉(经北京中医药大学鉴定为肉苁蓉Cistanche deserticola Y.C.Ma),菊粉(比利时BENEOORAFTI),硫酸软骨素钠片(四川省尚善堂制药有限公司),注射用青霉素钠(华北制药股份有限公司),戊酸雌二醇(拜耳医药保健有限公司广州分公司),骨钙素(BGP)试剂盒(上海联硕生物科技有限公司),碱性磷酸酶(ALP)ELISA 试剂盒(上海联硕生物科技有限公司),BMP-2 抗体(北京四正柏生物科技有限公司4AK201716F),组织蛋白酶K(CK)试剂盒(上海远慕生物科技有限公司),脱氧吡啶啉(DPD)ELISA 检测试剂盒(上海研域仪器设备有限公司),白细胞介素-6(IL-6)检测试剂盒、肿瘤坏死因子-α (TNF-α )检测试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司),戊巴比妥钠(德国默克公司,批号:20160411),甘油醛-3- 磷酸脱氢酶(GAPDH)(上海颖心实验室,批号:TX20149)。NORLAND-Stratec 周围型双能X 线骨密度仪(北京迈尔思瀛海威医疗技术有限公司);离心机(北京京立离心机有限公司);电子天平(梅特勒- 托利多仪器有限公司)。  Wistar 大鼠[ 北京维通利华动物技术有限公司提供,SPF 级健康雌性大鼠,实验单位使用许可证号:SYXK(京)2010-0025], 体质量(300±20)g。所有动物均放置于恒温、清洁的环境中。温度(22±2)℃,相对湿度(65±5)℃,光照12 h,黑暗12 h,动物自由摄食、摄水。2 方法2.1 肉苁蓉复方颗粒的制备  肉苁蓉200 g,粉碎,按照料液比1 ∶ 20 加入提取液(70% 乙醇),在50 ℃条件下,提取时间为50 min,重复提取两次,提取液回收溶剂并浓缩,烘干得到肉苁蓉浸膏,与300 g 菊粉、硫酸软骨素25 g 混合均匀后,通过传统的湿法制粒制成颗粒。2.1 大鼠骨质疏松模型的建立  将大鼠按体质量随机分为6 个组,每组10 只,分别为假手术组(0.5%CMC-Na,10 mL·kg- 1),去卵巢模型组(0.5%CMC-Na,10 mL·kg- 1),戊酸雌二醇阳性对照组(1 mg·kg- 1),肉苁蓉复方颗粒高、中、低剂量组1100、550、275 mg·kg- 1(给药剂量分别为处方剂量的2 倍、1 倍、0.5 倍)。  手术前称重,按照30 mg·kg- 1 剂量,经腹腔注射戊巴比妥钠溶液实施麻醉,待大鼠麻醉起效后,腹位固定后于腹中线距阴道口3 ~ 4 cm 除去毛,分别用碘酒和酒精消毒,待稍干后切开皮肤和腹肌约2 ~ 3 cm,切口视野可见白色脂肪,拨开脂肪层找到子宫后,轻轻将一侧子宫角拉出,在其末端可见被脂肪团包裹的卵巢,然后将卵巢下端输卵管用丝线结扎,切除双侧卵巢,顺势将子宫角送回腹腔中,同法剪除另侧卵巢。其中假手术组仅仅切除卵巢附近的部分脂肪组织,不结扎输卵管、不切除卵巢,缝合切口,再次消毒,术后腹腔注射青霉素钠,1 次·d- 1,连续3 d,防止术后感染。术后大鼠的活动正常。术后观察7 d,然后开始每日下午灌胃给予对应药物,每周称重一次,12 周后大鼠灌胃结束。2.2 检测指标2.2.1 体质量 每周测定大鼠体质量一次,据此调整灌胃量。2.2.2 股骨干质量测定 大鼠喂养12 周后处死,剥离出左、右股骨。取左侧股骨于105 ℃烤箱中烤至恒重,称定股骨干质量。2.2.3 骨密度测定 用美国NORLAND-Stratec周围型双能X 线骨密度仪(PDEXA)测定右侧股骨重点及股骨远心端的BMD 值(g·cm- 2)。2.2.4 大鼠血清中ALP、BGP、CK、DPD、IL-6和TNF-α 的测定 给药12 周后,麻醉大鼠,腹部下部开口,暴露腹主动脉,使用一次性采血针与配套的采血管,与腹主动脉下部Y 字岔口处进针取血,每只大鼠约取5 mL 全血。室温静置4 h,使血液完全凝固,3500 r·min- 1 离心10 min,取血清。按照试剂盒说明,测定血清中ALP、BGP、CK、DPD、IL-6 和TNF-α 水平。2.2.5 BMP-2 表达的测定 留取完整的右股骨段,并迅速投入液氮中,后转移至- 80 ℃保存,用于提取蛋白;用裂解液超声提取总蛋白后,Western blot 法测定BMP-2 表达。2.3 统计学分析  采用SPSS 20.0 软件进行统计分析,计量资料采用方差分析方法,均以x±s 表示,P < 0.05为差异有统计学意义。3 结果3.1 大鼠体质量及骨参数变化  如表1 所示,相比较于模型组,肉苁蓉复方颗粒高剂量组、中剂量组(P < 0.01,P < 0.05)大鼠体质量增加量显著降低,表明肉苁蓉复方颗粒高、中剂量组对雌激素缺失导致骨髓间质细胞转化为脂肪细胞,具有良好的抑制作用,其中肉苁蓉复方颗粒高、中剂量组股骨干质量、BMD显著高于模型组(P < 0.05,P < 0.01),表明肉苁蓉复方颗粒高、中剂量组具有提高大鼠BMD及股骨干质量的作用。3.2 大鼠血清指标变化3.2.1 血清中ALP、BGP 水平 如表2 所示,与假手术组比较,模型组大鼠由于雌激素的缺失会代偿性增加ALP 和BGP 的分泌,其在血清中含量明显升高(P < 0.01)。与模型组比较,肉苁蓉复方颗粒高、中剂量组大鼠血清ALP 和BGP 水平显著降低(P < 0.05,P < 0.01),表明高、中剂量肉苁蓉给药组能够有效地逆转ALP 和BGP升高的趋势,起到治疗骨质疏松的作用。阳性对照组大鼠的ALP(P < 0.05) 和BGP 显著降低(P < 0.01)。3.2.2 血清中CK 和DPD 含量变化 如图1 所示,与模型组比较,阳性对照组、肉苁蓉复方颗粒高、中剂量组的CK 和DPD 酶活力水平显著性降低(P < 0.05,P < 0.01),肉苁蓉复方颗粒通过抑制CK 和DPD 酶的活力,从而抑制骨吸收。3.2.3 血清中IL-6 和TNF-α 含量变化 如图2 所示,与模型组比较,肉苁蓉复方颗粒高、中剂量组的IL-6、TNF-α 水平减少(P < 0.01),抑制水平接近阳性对照组,表明肉苁蓉复方颗粒通过调节IL-6、TNF-α 的表达,降低破骨细胞增殖,抑制骨吸收。3.3 大鼠BMP-2 蛋白表达  如图3 所示,骨组织中可检测到BMP-2 蛋白表达,模型组的蛋白条明显低于假手术组,说明去势大鼠的BMP-2 表达减少,肉苁蓉复方颗粒高、中剂量组BMP-2 蛋白表达高于模型组,接近阳性对照组,说明肉苁蓉复方颗粒可增强BMP-2蛋白表达,其中中剂量组的效果最好。4 讨论  去势大鼠骨质疏松模型是研究动物骨质疏松采用的一种模型,去卵巢大鼠是研究绝经后妇女骨质疏松的一个常用动物模型,具有手术简单,重复性、稳定性好等优点[10]。因此,采用此模型能比较客观地评价肉苁蓉复方颗粒对骨质疏松症的治疗作用。  在肉苁蓉复方颗粒对骨参数的影响实验中,模型组大鼠骨密度明显下降,破骨细胞和成骨细胞无法保持平衡,骨量快速丢失。通过肉苁蓉复方颗粒进行治疗后,可显著提高骨密度、股骨干质量,改善去卵巢大鼠骨质疏松的状态,抑制骨量的继续丢失。  ALP 作为成骨细胞分泌物,其与血液中的钙离子相互作用,促进骨质的合成,可反映成骨细胞的活性[1,11],ALP 促进有机磷酸化合物分解为无机磷酸离子,使磷酸离子与钙离子结合沉淀于骨内,BGP 也是由成骨细胞分泌,是骨形成和骨重建的反映指标之一[12-13],两者均可反映成骨细胞的活性[14-15],ALP 和BGP 水平越高,说明体内越缺钙[16]。本研究中,通过手术去卵巢处理,构建骨质疏松大鼠模型,发现模型组大鼠ALP 和BGP 含量升高,而肉苁蓉复方颗粒高、中剂量组可显著降低其含量,说明肉苁蓉复方颗粒高、中剂量可以有效调节骨代谢平衡,抑制骨吸收,治疗骨质疏松。  BMP2/Smad 信号通路可以调控成骨细胞的全部过程,其功能障碍会引起骨量降低和骨形成减少,导致骨质疏松症发生[17]。BMP2 是经典BMPs/Smad 通路的重要配体[18-20],BMP2 是BMPs 家族中非常重要的一个亚型,其可以刺激间充质干细胞分化为成骨细胞,促进成骨细胞转化为骨细胞,是促进骨形成和诱导成骨细胞分化的重要的信号分子之一[21-23]。本研究中,发现模型组大鼠的BMP-2 蛋白表达明显降低,说明BMP2/Smad 通路的信号传递减弱,影响成骨细胞分化,进而影响骨密度水平,肉苁蓉复方颗粒高、中剂量组可以上调BMP-2 蛋白水平,蛋白表达水平接近阳性对照组,进而调节BMP2/Smad通路的信号传递,促进成骨细胞分化,起到治疗骨质疏松的作用。  CK 是组织蛋白酶溶酶体蛋白酶家族的半胱氨酸蛋白酶成员。它被认为可降解骨基质蛋白,骨桥蛋白和骨粘连蛋白[24],血清中的CK 是骨吸收的典型标志物[25],其过度表达会增加松质骨转换,阻止CK 表达可抑制骨吸收,有利于骨基质的稳定性[26]。DPD 也是典型的骨吸收标志物[27-28],当骨吸收作用增强,成熟的Ⅰ型骨胶原分解,DPD 作为降解产物被释放到血液中,DPD具有组织特异性,不受饮食影响,其只在骨吸收及骨溶解时才被释放入血。因此,血清DPD 水平升高,说明骨吸收增强[29],本研究发现,发现模型组大鼠的CK 和DPD 含量升高,说明骨吸收增强,肉苁蓉复方颗粒高、中剂量组可以显著性降低CK 和DPD 含量,接近阳性对照组,抑制骨吸收,从而有效对抗骨质疏松的发生。  细胞因子IL-6、TNF-α 是调节骨吸收的关键因素[30],IL-6 作为一种生物活性因子,可通过多种方式参与到成骨细胞和破骨细胞的功能调控,是促进破骨细胞增殖分化的重要因子[31],IL-6 可以通过SHP2/P13K/Akt2 和SHP2/MEK/ERK 通路抑制成骨细胞分化,TNF-α 是促进骨吸收的细胞因子[32],可作用于前体破骨细胞,使其分化为破骨细胞,促进破骨细胞生成,增强骨吸收。TNF-α 还可通过影响OPG/RANKL/RANK 信号系统,以旁分泌的方式调节破骨细胞活化,刺激骨吸收[16]。本研究发现,模型组大鼠的IL-6、TNF-α 水平显著升高,说明模型组大鼠骨吸收增强,骨质遭到破坏,而肉苁蓉复方颗粒高、中剂量组可显著降低的IL-6、TNF-α 水平,接近阳性对照组水平,说明肉苁蓉复方颗粒高、中剂量可以抑制大鼠体内IL-6、TNF-α 的表达,通过影响SHP2/MEK/ERK、SHP2/P13K/Akt2 和OPG/RANKL/RANK 通路,降低破骨细胞增殖,抑制骨吸收,有效治疗骨质疏松。近年来,许多研究证明补肾类中药在治疗老年性骨质疏松症的研究中取得了较满意的结果,本方针对中老年人全身性骨量减少,骨密度损失及骨组织的微观结构退化所致的骨脆性增加、骨密度降低、骨折危险性增加的特点,选用具有补肾壮阳、补精益髓功效的肉苁蓉,辅以具有促进钙和矿质吸收,降低骨代谢过程作用的菊粉及促进成骨细胞增生和新骨形成的硫酸软骨素,有效改善了去卵巢大鼠骨质疏松的状态,为治疗和预防骨质疏松的作用提供依据。参考文献[1] 朱刚,孙海斌,徐刚.肉苁蓉醇提物对去卵巢骨质疏松大鼠的治疗作用及其机制[J]. 吉林大学学报(医学版),2018,44(1):68-72.[2] 李媛,宋媛媛,张洪泉.肉苁蓉的化学成分及药理作用研究进展[J]. 中国野生植物资源,2010,29(1):7-11.[3] 张跃全,郑丹红,许建峰,等. 荒漠肉苁蓉对快速老化骨质疏松小鼠BMP-2 蛋白表达的影响[J]. 宁夏医学杂志,2014,36(12):1114-1116.[4] 赖青海,王琳琳,丁辉,等. 肉苁蓉治疗骨质疏松症研究进展[J]. 辽宁中医药大学学报,2016,18(3):102-104.[5] Li F,Yang Y,Zhu P,et al. Echinacoside promotes boneregeneration by increasing OPG/RANKL ratio in MC3T3-E1cells [J]. Fitoterapia,2012,83(8):1443-1450.[6] Yang XL,Li F,Yang YN,et al. Efficacy and safety ofechinacoside in a rat osteopenia model [J]. Evid Based ComplementAlternat Med,2013,2013:926-928.[7] 刘小杰,赵允,童纪峰. 菊粉与骨健康的研究[J]. 中国食品添加剂,2008(z1):151-153.[8] 林金莺,周勇强,赖子尼. 菊粉的功能与应用[J]. 广州化工,1999,27(4):8-10.[9] Nishimoto S,Takagi M,Wakitani S,et al. Effect ofchondroitin sulfate and hyaluronic acid on gene expressionin a three-dimensional culture of chondrocytes [J]. J BiosciBioeng,2005,100(1):123-126.[10] 张雅蓉,唐舸,刘杉,等. 5 种常用大鼠骨质疏松动物模型的特点[J]. 国际口腔医学杂志,2013,40(5):629-633.[11] 陈宇,薛志远,师志强,等. 红芪活性组分抗骨质疏松作用的谱效关系研究[J]. 中草药,2018,49(1):160-166.[12] 刘江,陆加寿,马凌川,等. 定量CT 与血清骨钙素水平联合诊断老年女性骨质疏松的临床价值分析[J]. 国际检验医学杂志,2019,40(12):1520-1523.[13] 侯娜,孙晓娟. 枸杞提取物对骨质疏松症大鼠的改善作用[J]. 现代食品科技,2019,35(11):37-44,108.[14] 李然,黄瀚,刘立萍,等. 左归丸对去卵巢大鼠骨组织降钙素受体蛋白表达的影响[J]. 中华中医药学刊,2018,36(12):2993-2995.[15] 孙英莲,王英军. 壮骨胶囊含药血清对小鼠成骨细胞增殖及碱性磷酸酶、骨钙素合成的影响[J]. 吉林中医药,2019,39(6):797-800.[16] 刘跃辉,张波,李伟,等. 杜仲叶醇提取物对去卵巢骨质疏松大鼠骨代谢生化指标、骨密度、IL-6 及TNF-α的影响[J]. 中医学报,2018,33(3):445-448.[17] 林晓芳, 方芳, 彭志强, 等. Wnt/β -catenin 与BMP-2/Smads 信号通路及其相互作用对骨质疏松疾病的影响[J]. 浙江中医药大学学报,2019,43(7):711-717.[18] 柴爽,王吉利,黄佳纯,等. 补肾健脾活血方对去卵巢大鼠BMP2/Smad 信号通路的影响[J]. 中国实验方剂学杂志,2018,24(20):129-133.[19] 郑红,唐薇,角建林,等. 槲皮素通过促进成骨分化治疗去势骨质疏松症大鼠的分子机制[J]. 中药药理与临床,2017,33(5):16-20.[20] 招文华,沈耿杨,任辉,等. 骨碎补活性单体成分调控骨质疏松症相关信号通路的研究进展[J]. 中国骨质疏松杂志,2017,23(1):122-129,140.[21] 龚伟,郑洪新,杨鸫祥,等. 鹿茸不同组分对去卵巢骨质疏松症大鼠骨组织的作用及其机制[J]. 中国实验方剂学杂志,2019,25(20):36-42.[22] 李威,姚新苗,李晓亚,等. 益骨汤对骨质疏松大鼠骨密度及BMP-2 信号通路的影响[J]. 云南中医学院学报,2016,39(6):5-9.[23] 徐陆晨,李运峰. 骨质疏松性骨折药物治疗的研究进展[J]. 中国骨质疏松杂志,2017,23(7):947-953.[24] 梁维萍. 靶向组织蛋白酶K 抑制小鼠前列腺癌骨转移和骨破坏的研究[D]. 南宁:广西医科大学,2019.[25] 马如风,莫芳芳,牛建昭,等. 姜黄素通过调节组织蛋白酶K 改善高脂诱导C57BL/6J 小鼠骨结构和骨质量的实验研究[J]. 中国药理学通报,2017,33(10):1446-1451.[26] 朱媛媛,郭海英,孙振双,等. 温肾固疏方对去势大鼠骨组织中Ⅰ型胶原及组织蛋白酶K 表达的影响[J]. 中国骨质疏松杂志,2019,25(4):533-538,545.[27] 刘明,宣振华,张永萍,等. 新仙灵骨葆胶囊对去卵巢骨质疏松大鼠的影响[J]. 中药新药与临床药理,2018,29(4):399-403.[28] 马晓龙,刘强,吴斗,等. 骨转换标志物在骨质疏松诊治中的分析评价及临床应用前景[J]. 中华老年骨科与康复电子杂志,2018,4(1):52-56.[29] 唐三元,谭文成,杨辉,等. 多种骨代谢生化指标联合预测老年骨质疏松性髋部骨折风险的意义[J]. 中国矫形外科杂志,2015,23(18):1653-1656.[30] 邱奕雁,朱峰,蓝涛,等. IL-6,IL-1β 及TNF-α 与大鼠骨质疏松形成的关系[J]. 现代生物医学进展,2016,16(18):3448-3451.[31] 范名月,李彦. 阿托伐他汀联合阿仑膦酸钠治疗老年性骨质疏松症的效果及对患者肿瘤坏死因子α 和白细胞介素6 的影响[J]. 中国综合临床,2017,33(4):345-349.[32] 陈鹏,李杨,胡伟文,等. 绝经后骨质疏松症TNF-α 通过激活NF-κ B 促进RANKL 诱导的破骨细胞形成[J]. 基因组学与应用生物学,2019,38(2):960-965.
  • [提 要] 目的:寻找肉苁蓉的通便有效成分。方法:采用不同溶剂提取、分离及重结晶等方法将肉苁蓉分为半乳糖醇等4 个组份,进行对小鼠通便时间的影响实验。结果:半乳糖醇具有显著的缩短通便时间作用,其他各组份作用不显著。结论:半乳糖醇为肉苁蓉的主要通便有效成分。[关键词] 肉苁蓉 半乳糖醇 通便中医临床实践证明肉苁蓉具有良好的润肠通便功能,前文[1、2]已报道该药通便功能及有关作用机理的现代药理实验研究。本文报告肉苁蓉各部位的初步提取、分离及各部位供试样液通便的实验结果。1 实验材料1.1 药材肉苁蓉原药材购于内蒙古阿拉善盟,特级品。经北京大学药学院屠鹏飞鉴定为列当科植物肉苁蓉(CistanchedeserticoleY.C.Ma),也称荒漠肉苁蓉。1.2 供试液取原药材,低温烘干,打成粗末,按图1 流程提取分离,分别得半乳糖醇结晶、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、剩余水溶物。实验前用蒸馏水配成供试液(内含1%CMC-Na 和1%曙红),药液浓度除β-半乳糖醇外,其余各供试液中提取物含量均相当于原药材量100%。1.3 动物昆明种小白鼠,同性,购于中国医学科学院动物中心。动物级别:二级。2 方法与结果2.1 对小鼠通便时间的影响选用体重18~20g健康小鼠60 只,按体重随机分成5组,每组12 只。给药前2h 断食断水,将小鼠分置单只饲养笼中,各组按0.5mL/只灌胃供试液,记录给药时间和小鼠排出第1粒红色粪便时间,后者减去前者为该鼠的通便时间。实验共做2 批,结果见表1、表2。两批结果表明肉苁蓉分离成分半乳糖醇具有显著的缩短通便时间作用,其它各组作用不显著。2.2 加倍剂量对小鼠通便时间的影响上述实验中除分离成分半乳糖醇外,无显著通便作用的组份将剂量加倍后再进行对小鼠通便时间影响的实验,方法同上。实验共做两批,结果见表3、表4。实验结果显示正丁醇提取物等组份虽加大剂量1 倍仍未见显著缩短通便时间的作用。3 结论实验结果表明,在肉苁蓉初步分离的四部分提取物中,只有醇溶部份半乳糖醇具有确切的通便作用,其他提取部分均无明显的通便作用。第2 批实验确认了第1 批实验的结果。在两批实验的基础上,我们又将乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和剩余水溶物部分增加1 倍剂量,再次进行通便实验,仍未见这些提取物具有通便作用。以上实验结果说明肉苁蓉所含有的半乳糖醇成分为肉苁蓉的主要通便有效成分。以往文章中报道的钠、镁、硫酸根等无机离子在肉苁蓉的整体通便作用中可能只起辅助作用。参 考 文 献1 张百舜,鲁学书,张润珍.锁阳和肉苁蓉的通便作用比较.中医杂志,1991,32(7):392 张百舜,李 川,鲁学书,等.肉苁蓉的通便作用.中药材,1992,15(7):333 屠鹏飞,何燕萍.栽培肉苁蓉的化学成分研究.天然产物研究与开发,1997,9(2):7

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