摘 要：肉苁蓉为国家二级保护植物，含多种活性成分，多糖是其主要活性成分之一。本文综述了肉苁蓉多糖的免疫调节、抗衰老、改善脾虚、抗病毒抗肿瘤、促进造血等方面的药理作用及作用机制，以冀为其合理利用提供帮助。关键词：肉苁蓉多糖；提取工艺；药理作用；作用机制肉苁蓉属于补阳类中药，功效极好，素有“沙漠人参”的美誉[1]，近20年受到国内外的普遍关注，由于来源短缺，已被列为国家二级保护植物。研究表明[2]，多数药用植物的多糖都具有显著的生物活性，如免疫调节、抗衰老、抗炎保肝、抗肿瘤等。本文主要针对肉苁蓉多糖的药理作用及作用机制进行综述，以冀为其合理利用提供帮助。1 研究背景1.1 肉苁蓉种质资源肉苁蓉原植物为列当科植物肉苁蓉属的寄生植物，全世界约有20种，我国肉苁蓉属植物主要分布于西北地区的沙漠地区。经过20多年的野外调研和大量标本比较[3-5]，确定我国肉苁蓉有5种，分别为荒漠肉苁蓉（C. deserticola Y. C. Ma），分布于内蒙古、甘肃及新疆的部分地区，寄生在梭梭和白梭梭的根部；沙苁蓉（C. sinensis G. Beck)，分布于内蒙古、宁夏、青海、甘肃等地，常见寄主有红砂、珍珠柴、沙冬青、藏锦鸡儿、霸王、四合木、锦刺等；德赢vwin登录 [C. tubulosa (Schenk) R. Wight]，分布于新疆南疆，寄生于柽柳属植物根上；盐生肉苁蓉[C. salsa (C. A.Mey.) G. Beck]，分布于内蒙古、宁夏、青海、甘肃和新疆等地，寄主较多，如盐爪爪、细枝盐爪爪、凸尖盐爪爪、红砂、珍珠柴、襄果碱蓬、白刺、芨芨草等；白花盐苁蓉（C. salsa var. albifl ora P. F. Tuet Z. C.Lou），分布于宁夏、新疆，寄生于珍珠柴的根部。1.2 化学成分屠鹏飞[6]等对国产肉苁蓉属植物的化学成分进行了系统研究，共分离鉴定了101个化合物，发现不同种质的肉苁蓉的化学成分在组成上没有显著差异，含量差异显著的成分主要是苯乙醇苷类。还通过免疫调节活性跟踪的方法，首次系统研究了荒漠肉苁蓉多糖，分离鉴定了17个新多糖。由此可见，肉苁蓉所含的多糖种类丰富，值得我们深入了解并探索其药理作用及作用机理。1.3 提取工艺对多糖类化合物一般采取热水浸提法或在水提法的基础上辅助微波、超声、酶解等工艺进行粗提。早期曾群力[7]用热乙醇浸渍粉碎后的肉苁蓉，再用沸水抽提，经乙醇沉淀、中性酶结合Sevag法脱蛋白、DEAE-Sephadex A-50阴离子交换层析、SephacrylS-200凝胶过滤层析，得到肉苁蓉多糖。为更好地开发利用肉苁蓉，科研人员不断寻找节能省时、提取率高的肉苁蓉多糖提取新工艺。如肖道安[8]通过正交法优选用吐温60协同超声提取肉苁蓉多糖的工艺，效果很好；滕立平等[9]通过比较4种不同的提取方法，发现超声-微波协同提取效果最佳。2 肉苁蓉多糖的药理作用及作用机制2.1 免疫活性调节肉苁蓉多糖具有促进机体产生白介素2（IL-2）、促进免疫细胞增殖、促进网状内皮系统吞噬、促进胸腺成熟细胞向外周释放等作用[10]。2.1.1 促进淋巴细胞增殖 曾群力等[7]用噻唑蓝（MTT）比色体外观察法发现，肉苁蓉多糖通过促进淋巴细胞内Ca2+释放，引起胞内Ca2+浓度升高，刺激IL-2基因表达，促进T淋巴细胞增殖。较高浓度的肉苁蓉多糖既可对抗高浓度肿瘤坏死因子β（TNF-β）对淋巴细胞增殖的抑制作用，又可协同低浓度TNF-β对淋巴细胞的增殖产生促进作用，还能对抗异丙肾上腺素（ISO）、地塞米松（DEX）对淋巴细胞增殖的抑制作用。王成荣等[11]研究证实，肉苁蓉多糖能促进脾淋巴细胞增殖，增强T细胞分泌IL-2的能力。2.1.2 增强吞噬细胞活性 张涛等[12]的研究显示肉苁蓉多糖能通过增强THP-1细胞的吞噬力和促进细胞因子释放调节免疫功能，与蔡润兰等[13]实验结果一致。此外，王翔岩等[14]发现肉苁蓉多糖可明显提高巨噬细胞吞噬及分泌功能。2.2 抗衰老目前，人们对衰老机制的研究逐渐深入，产生了如自由基、端粒、基因、线粒体等学说[15]。肉苁蓉多糖通过多种途径，产生抗衰老作用。2.2.1 清除自由基 生物体在代谢过程中会产生多种自由基，自由基能扰乱蛋白质正常代谢、加快脂质过氧化，甚至能破坏碱基。多年研究表明，自由基是衰老的主要原因。王国卫等[16]研究表明，新疆肉苁蓉多糖为一种功效显著的天然抗氧化剂，可清除超氧自由基、羟自由基、单线态氧等多种自由基，且清除作用与多糖浓度呈正相关性。孙云等[17]研究肉苁蓉多糖对衰老小鼠肺一氧化氮和细胞凋亡的影响，结果表明，肉苁蓉多糖可显著提高血清和肺的超氧化物歧化酶（SOD）活性并降低一氧化氮浓度，抑制肺组织细胞凋亡，从而延缓肺衰老，且此效果与剂量有关，高、中、低3种剂量，高剂量效果最佳。吴波等[18]研究肉苁蓉多糖对D-半乳糖所致小鼠衰老模型的作用，观察到肉苁蓉多糖能不同程度地增加血清、肝中SOD的活性，从而使脂质过氧化物（LPO）明显降低。此结论与孙云等[19]、王晓雯[20]等的研究结果相符。此外，王希尧[21]发现，肉苁蓉多糖能增加羟脯氨酸和胶原纤维的产生，减少体内脂褐质的堆积，从而延缓皮肤衰老。2.2.2 对端粒酶活性的影响 张洪泉[22]发现足够剂量的肉苁蓉多糖可使小鼠心、脑组织的端粒酶低活性恢复至正常水平，从而延缓组织细胞的衰老，同时对肝脏组织无显著影响。2.2.3 对线粒体的作用 线粒体是细胞内主要耗氧部位，是产生自由基的主要场所。徐辉等[23]发现，肉苁蓉多糖可显著提高D-半乳糖致衰模型大鼠肝线粒体膜流动性及呼吸链复合体I+III、II+III活性，显著降低肝线粒体丙二醛（MDA）含量、磷脂酶A2（PLA2活性），从而提高线粒体的抗氧化能力、改善线粒体的能量代谢，延缓衰老。2.3 对学习记忆障碍模型的影响尹若熙等[24]研究表明，肉苁蓉多糖可显著提高东莨菪碱所致学习记忆障碍模型小鼠突触素（SYP）和生长相关蛋白43（GAP-43）的表达，增多海马区突触数量，增强神经突触的可塑性，缓解学习障碍表现。马慧等[25]观察到肉苁蓉多糖可增加D-半乳糖所致衰老小鼠脑组织SOD活性，减少MDA含量，改善脑组织神经元损伤，并激活cAMP-PKA-CREB信号通路，以改善学习记忆障碍。尹刚等[26]观察发现，肉苁蓉多糖可通过增加Bcl-2的表达，降低caspase-3的表达，抑制海马神经元凋亡，改善阿尔茨海默病模型大鼠的学习记忆能力。2.4 对脾虚模型的作用石惠芳等[27]研究了肉苁蓉多糖对大黄所致脾虚泄泻大鼠模型的影响，结果表明，肉苁蓉多糖可升高脾虚模型组的胃蛋白酶和唾液淀粉酶等消化酶的活性，缓解大鼠饲料消耗量和体重增长率下降的情况，显著改善消化功能；临床上对消化功能紊乱疾病的治疗有良好作用。许正新等[28]研究表明，肉苁蓉多糖对四氯化碳所致肝郁性脾虚小鼠的体重下降有明显的恢复作用。2.5 抗病毒抗肿瘤作用王成荣等[11]发现肉苁蓉多糖能显著增加外周血中干扰素γ（IFN-γ）的含量， IFN-γ与细胞表面的相应受体结合后可诱导细胞合成抗病毒蛋白，从而抑制病毒的繁殖；IFN-γ还可增强或发动宿主对肿瘤细胞的免疫反应，促进免疫细胞产生细胞毒性作用，杀伤肿瘤细胞。张洪泉等[29]观察到肉苁蓉多糖能明显抑制lewis肺癌和S180肉瘤，可能是通过提高自然杀伤细胞（NKC）和IL-2的活性实现的。目前肉苁蓉多糖已成为肿瘤治疗的辅助药物[30]，但具体作用机制还有待研究。2.6 对造血系统的影响陈志伟等[31]研究了肉苁蓉多糖对骨髓抑制性贫血小鼠造血的调控作用，结果表明，肉苁蓉多糖能明显促进骨髓G0/G1期细胞向S期细胞及S期细胞向G2/M期细胞的转化，可促进巨核系、红系造血祖细胞的增殖与分化，减轻骨髓抑制，促进造血。3 研究前景展望肉苁蓉多糖具有免疫调节、抗衰老、改善脾虚、抗病毒抗肿瘤、促进造血等多方面的药理作用，值得进一步研究和开发。扩大肉苁蓉多糖的开发与利用，还需对肉苁蓉的资源分布、生物学特性、栽培技术、化学成分、药理作用、加工提取等多方面进行深入研究。参考文献[1] 成喜雨, 郭斌, 倪文, 等. 肉苁蓉研究进展[J]. 天然产物研究与开发, 2005, 17(2): 235-241.[2] 陶遵威, 郑夺, 邸明磊, 等. 植物多糖的研究进展[J]. 药物评价研究, 2010, 33(2): 148-152.[3] 马毓泉. 内蒙古肉苁蓉属（Cistanche）植物的初步研究[J]. 内蒙古大学学报: 自然科学版, 1960, 11(1): 61-69.[4] 马毓泉. 内蒙古肉苁蓉属订正[J]. 内蒙古大学学报: 自然科学版,1977, 23(1): 69-75.[5] 张志耘. 中国列当科的研究（一）[J]. 植物研究, 1984, 4(4):111-119.[6] 屠鹏飞, 姜勇, 郭玉海, 等. 肉苁蓉研究及其产业发展[J]. 中国药学杂志, 2011, 46(12): 882-887.[7] 曾群力, 郑一凡, 吕志良. 肉苁蓉多糖的免疫活性作用及机制[J]. 浙江大学学报（医学版）, 2002, 31(4): 60-63.[8] 肖道安. 肉苁蓉多糖的提取工艺优化[J]. 世界科学技术-中医药现代化, 2014, 16(4): 928-931.[9] 滕立平, 慕龙, 罗锋，等. 德赢vwin登录 粗多糖提取方法及其清除二苯代苦味酰基自由基的效果[J]. 贵州农业科学, 2011, 39(1):66-68.[10] 朱咏华, 罗泽民. 肉苁蓉的研究进展及前景分析[J]. 湖南林业科技, 2000, 27(4): 20-23.[11] 王成蓉, 吴金华, 涂丽蓉，等. 肉苁蓉多糖对鸡免疫ND苗后血液中T淋巴细胞及IFN-γ活性的影响[J]. 四川畜牧兽医, 2008,(8): 29-30, 32.[12] 张涛, 许文胜, 贾彦斌, 等. 肉苁蓉多糖对THP-1细胞吞噬作用的影响及其机理研究[J]. 生命科学研究, 2013, 17(2): 148-150,155.[13] Cai R L, Yang M H, Shi Y, et al. 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摘　要：采用超声酶法辅助提取肉苁蓉粗多糖，并用季铵盐沉淀法对肉苁蓉粗多糖进行精制，获得肉苁蓉精制多糖（ＵＣＥＰ１）；以ＵＣＥＰ１和硫酸锌为原料，制备了肉苁蓉多糖锌配合物（ＵＣＥＰ１－Ｚｎ），对其结构进行了表征，并研究其抗氧化活性．结果表明，肉苁蓉粗多糖收率及含量分别为２２．３１％和４８．５０％，ＵＣＥＰ１中多糖含量为７０．１３％；ＵＣＥＰ１－Ｚｎ中－ＯＨ和－ＣＯＯ－ 和Ｚｎ２＋ 发生了配位，其中锌含量为７．５７％，且多糖链构象及多糖分子表面形貌发生变化；ＵＣＥＰ１－Ｚｎ的抗氧化能力显著高于ＵＣＥＰ１，且对ＡＢＴＳ＋ 自由基清除活性最好．该研究可为肉苁蓉多糖、新型锌营养素补充剂以及锌功能配合物的研究和利用提供参考．关键词：肉苁蓉；多糖；锌；配合物；结构表征；抗氧化活性德赢vwin登录 （Ｃｉｓｔａｎｃｈｅ　ｔｕｂｕｌｏｓａ （Ｓｃｈｒｅｎｋ）Ｒ．Ｗｉｇｈｔ）属列当科寄生植物，主要分布于非洲北部和亚洲西部［１］．它干燥带鳞叶的肉质茎中的活性物质（如多糖）能够促进血液循环、治疗阳痿、腰痛和不孕不育等疾病［２］．多糖主要存在于动物、植物和微生物中，具有较高的安全性、低毒性、可降解性和高度生物相容性．多糖因具有抗肿瘤、抗氧化、降血糖、提高免疫等生物活性［３－９］，而引起人们的广泛关注．微量元素是人体所需营养成分中的重要组成部分，是生命体消化过程中能量转换和组织构成的重要因素，其中锌是生物正常生长发育所必须的微量元素之一，是人体内酶的激活剂，对维持人体正常生理功能，提高免疫力，促进身体与智力发育具有重要的作用［１０］．本文作者采用肉苁蓉精制多糖（ＵＣＥＰ１）与锌（ＩＩ）制备肉苁蓉多糖锌配合物（ＵＣＥＰ１－Ｚｎ），对肉苁蓉多糖及其锌配合物进行结构表征，并研究其抗氧化活性，该研究可为肉苁蓉多糖、新型锌营养素补充剂以及锌功能配合物的研究和利用提供参考．１　实验部分１．１　仪器和试剂Ｎｉｃｏｌｅｔ　４７０ 傅立叶变换红外光谱仪，美国Ｎｉｃｏｌｅｔ公司；ＪＡＳＣＯ　Ｊ－８１０－１５０Ｓ圆二色谱仪，日本ＪＡＳＣＯ公司；ＭＦＰ－３Ｄ扫描探针显微镜，美国Ａｓｙｌｕｍ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ公司；ＪＳＭ－７００１Ｆ型热场发射扫描电子显微镜，日本电子株式会社（ＪＥＯＬ）；ＢＤＸ３３００Ｘ射线衍射仪．肉苁蓉茎购于新疆草本植物市场，经镇江食品药品监督管理局主任中药师陈黎鉴定为列当科苁蓉属德赢vwin登录 ；硫酸锌、十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）、乙二胺四乙酸二钠、氨水、氯化铵、铬黑Ｔ、无水乙醇、９５％乙醇、邻二氮菲、七水合硫酸亚铁、３０％双氧水、过硫酸钾（Ｋ２Ｓ２Ｏ８）、氯化钠、磷酸二氢钠（ＮａＨ２ＰＯ４）、磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４）均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；ＤＰＰＨ、ＡＢＴＳ购自Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ公司．１．２　实验方法１．２．１　肉苁蓉粗多糖的超声纤维素酶法提取及精制超声酶法辅助提取肉苁蓉多糖：准确称取１０．０ｇ肉苁蓉粉末，置于５００ｍＬ圆底烧瓶中，加入２．５％（ｇ／ｍＬ）纤维素酶，按料液比１∶３０（ｇ／ｍＬ）加入去离子水，调ｐＨ 为６．０，设定超声温度为５０℃，超声酶解０．５ｈ．提取结束后，１００℃冷凝回流，搅拌提取２ｈ．４　０００ｒｐｍ 离心１０ｍｉｎ，旋转蒸发，醇沉．离心得沉淀，挥醇，冷冻干燥得肉苁蓉粗多糖（ＵＣＥＰ）．实验平行３次，按公式（１）计算多糖得率并采用苯酚硫酸法测定其含量［１１］．三氯乙酸法脱蛋白：在冰浴、搅拌的条件下向ＵＣＥＰ溶液中逐滴加入１５％的三氯乙酸，使其多糖溶液ｐＨ＝１，４℃静置４ｈ，４　５００ｒｐｍ 离心２０ｍｉｎ，收集上清液，在波长１９０～４００ｎｍ 范围内扫描，观测２８０和２６０ｎｍ 处是否有吸收峰．将脱蛋白后的多糖溶液用透析袋流水透析４８ｈ，双蒸水透析４８ｈ，冷冻干燥得到肉苁蓉多糖．季铵盐沉淀法精制肉苁蓉多糖：将３％（ｇ／ｍＬ）的ＣＴＡＢ溶液等体积加入０．８％（质量浓度）的肉苁蓉粗多糖溶液中，静置１２ｈ，１０　０００ｒｐｍ 离心５ｍｉｎ，收集上清液，醇沉，４ ℃静置１２ｈ，４　０００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ收集沉淀．沉淀经溶解、透析、冻干后得到精制多糖ＵＣＥＰ１，测定其多糖含量．１．２．２　肉苁蓉多糖锌的制备准确称取０．２５ｇ　ＵＣＥＰ１置于１００ｍＬ圆底烧瓶中，加入２５ｍＬ去离子水使多糖溶解．加入等体积的０．４５ｍｏｌ／Ｌ硫酸锌溶液，室温搅拌反应４ｈ，将反应液流水透析２４ｈ，双蒸水透析２４ｈ．收集透析后的液体，冷冻干燥，即得ＵＣＥＰ１－Ｚｎ［１２］．１．２．３　肉苁蓉多糖及其锌配合物的结构表征取适量干燥的ＵＣＥＰ１和ＵＣＥＰ１－Ｚｎ样品，与烘干的ＫＢｒ粉末以１∶１００混合研磨均匀，压片，使用红外光谱（ＦＴ－ＩＲ），在波长在４００～４　０００ｃｍ－１范围内扫描分析峰位置的变化，并在室温下用Ｘ射线衍射仪（ＸＲＤ）记录峰强度与峰位置的变化，Ｘ射线源为高强度Ｃｕ　Ｋα线，测试电压为４０ｋＶ，电流为３０ｍＡ，ＲＳ为０．３ｍｍ，ＤＳ和ＳＳ为１°，扫描速率为７°／ｍｉｎ，扫描范围为５°～９０°．使用ＥＤＴＡ滴定法测定ＵＣＥＰ１－Ｚｎ中锌的含量，锌含量按公式（２）计算：将ＵＣＥＰ１和ＵＣＥＰ１－Ｚｎ配制成１００ｍｇ／Ｌ的溶液，采用圆二色谱仪（ＣＤ）进行测定，将色谱仪参数设定为：扫描波长１９０～２５０ｎｍ，带宽２．５ｎｍ，时间常数２ｓ，扫描速率５０ｎｍ／ｍｉｎ．取３．０～５．０μＬ样品液滴在新鲜解离的云母片上，室温干燥２ｈ．采用原子力显微镜（ＡＦＭ）于室温下直接观测多糖的分子形貌，接触作用力控制在３～４ｎＮ 量级范围内，共振频率为２．０ｋＨｚ．将ＵＣＥＰ１和ＵＣＥＰ１－Ｚｎ样品粘着于样品盘上，置于真空喷镀仪内镀导电金膜，采用热场发射扫描电子显微镜（ＳＥＭ）观察．１．２．４　肉苁蓉多糖及其锌配合物的抗氧化活性清除ＤＰＰＨ、ＯＨ 和ＡＢＴＳ＋ 自由基能力的测定分别参考文献［１３］、［１４］和［１５］进行．２　结果与讨论２．１　肉苁蓉多糖的超声酶法提取及精制在本文工艺下，超声酶法辅助提取肉苁蓉多糖的得率为２２．３１％，多糖含量为４８．５０％．除蛋白后的肉苁蓉多糖溶液在波长２６０和２８０ｎｍ处无吸收．经过季铵盐沉淀后，精制多糖ＵＣＥＰ１中多糖含量为７０．１３％，比粗多糖含量提高了４４．５９％．２．２　肉苁蓉多糖及其锌配合物的结构表征图１为ＵＣＥＰ１与ＵＣＥＰ１－Ｚｎ的红外光谱．如图所示，ＵＣＥＰ１位于３　３８７ｃｍ－１处的宽峰是－ＯＨ的伸缩振动吸收峰，位于１　６３７ｃｍ－１ 处的峰为－ＣＯＯ－ 的反对称伸缩振动峰．ＵＣＥＰ１－Ｚｎ的红外光谱与ＵＣＥＰ１相比主要差别为：１）ＵＣＥＰ１位于３　３８７ｃｍ－１左右处的宽峰是－ＯＨ 的伸缩振动峰，ＵＣＥＰ１－Ｚｎ 中该吸收峰移至３　３７５ｃｍ－１，表明ＵＣＥＰ１中的－ＯＨ 参与了与Ｚｎ２＋ 的配位；２）ＵＣＥＰ１位于１　６３７ｃｍ－１的峰是－ＣＯＯ－ 的反对称伸缩振动峰，ＵＣＥＰ１－Ｚｎ中该峰向低波数位移至１　６３１ｃｍ－１，表明多糖链中－ＣＯＯ－ 参与了与Ｚｎ２＋的配位．图２是ＵＣＥＰ１与ＵＣＥＰ１－Ｚｎ的ＸＲＤ 图谱．根据标准图谱（ＰＤＦ＃２２－１０１９）可知，ＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ的ＸＲＤ图谱共有６个强锐峰，分别位于衍射角２θ 值为１９．８９°、２０．９８°、２１．６０°、２５．８８°、３１．０３°和３３．５４°处，此外２θ位于１０°～９０°之间还存在一些小峰．由图可知，ＵＣＥＰ１有３个峰，分别位于２θ 值为１２．９８°、２９．７２°与４２．８８°处．相比２９．７２°和４２．８８°处的两个宽峰，２θ 位于１２．９８°的峰相对较为尖锐．多糖锌ＵＣＥＰ１－Ｚｎ的强锐峰位于１３．３５°，其原因是ＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ 加入后与肉苁蓉多糖发生配位作用，形成了多糖锌配合物，从而使得原本的晶格参数发生变化，其２θ 由１２．９８°变化为１３．３５°．且ＵＣＥＰ１－Ｚｎ的ＸＲＤ图谱中没有发现ＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ 的特征衍射峰，表明Ｚｎ２＋ 与ＵＣＥＰ１发生配位作用，并且Ｚｎ２＋在糖链上高度分散．采用络合滴定法测定肉苁蓉多糖锌ＵＣＥＰ１－Ｚｎ中的锌含量，其值为７．５７％．李志洲等［１０］研究了牛肝菌多糖锌配合物的制备，测得锌配合物中锌含量为２．６４％，低于本文中合成的肉苁蓉多糖锌中的锌含量．图３为ＵＣＥＰ１与ＵＣＥＰ１－Ｚｎ在１９０～３００ｎｍ范围内的圆二色谱图．如图所示，与ＵＣＥＰ１相比，ＵＣＥＰ１－Ｚｎ在２１０～２２０ｎｍ 之间的峰值明显降低，此现象说明多糖与锌形成配合物，使得多糖分子的不对称性增加，导致多糖链的构象发生了变化．４Ａ与４Ｂ分别为ＵＣＥＰ１与ＵＣＥＰ１－Ｚｎ在水溶液中的原子力显微电镜照片．在低浓度下，ＵＣＥＰ１多糖分子为均一颗粒状，且分子间具有柔顺性，而ＵＣＥＰ１－Ｚｎ分子有着可辨别的单个聚合物，其分子间不是简单的叠加，而是分子间的相互作用．图５Ａ和５Ｂ分别为ＵＣＥＰ１及ＵＣＥＰ１－Ｚｎ的扫描电镜图．如图５所示，ＵＣＥＰ１及ＵＣＥＰ１－Ｚｎ的表面形貌发生了明显变化，由图５Ａ可知，肉苁蓉多糖以纤维棒状结构存在，纤维棒状表面光滑．当多糖与锌发生配合作用后（图５Ｂ）其表面变粗糙，且通过图６的能谱分析可知其表面结合了锌．２．３　ＵＣＥＰ１－Ｚｎ的抗氧化活性清除ＤＰＰＨ·能力测试如图７所示，在５０～１　０００ｍｇ／Ｌ范围内，ＵＣＥＰ１－Ｚｎ对ＤＰＰＨ·的清除能力高于ＵＣＥＰ１；当浓度为１　０００ ｍｇ／Ｌ 时，ＵＣＥＰ１－Ｚｎ对ＤＰＰＨ·清除率达到３３．７１％，比配合前的多糖清除率提高１６．２４％．清除·ＯＨ 能力测定如图８所示，在５０～１　０００ｍｇ／Ｌ 范围内，ＵＣＥＰ１－Ｚｎ对ＯＨ·的清除能力高于ＵＣＥＰ１；当浓度为１　０００ｍｇ／Ｌ 时，ＵＣＥＰ１－Ｚｎ对·ＯＨ 清除率达到３４．４９％，比ＵＣＥＰ１清除率高１８．７２％．清除ＡＢＴＳ＋能力测试如图９所示，在５０～１　０００ｍｇ／Ｌ范围内，ＵＣＥＰ１－Ｚｎ对ＡＢＴＳ＋ 的清除能力高于ＵＣＥＰ１；当浓度为１　０００ｍｇ／Ｌ时，ＵＣＥＰ１－Ｚｎ对ＡＢＴＳ＋ 清除率达到３６．８３％，比ＵＣＥＰ１的清除率高１８．８０％．ＵＣＥＰ１中含有羟基和羧基，作为给电子体，能与自由基作用达到清除自由基的效果，而ＵＣＥＰ１与锌配位后，其羟基和羧基的给电子作用减弱，但清除自由基的能力反而增大，可能是ＵＣＥＰ１与锌配合后，使配位部分与暴露的活性基团协同作用，促进与自由基的作用，因而清除自由基的能力增大［１６］；另一方面，ＵＣＥＰ１与锌配合后，与自由基反应生成的中间体可能更加稳定，导致清除自由基的能力增大［１７］．３　结论采用超声酶法辅助提取肉苁蓉粗多糖，其多糖得率及含量分别为２２．３１％和４８．５０％．经铵盐沉淀法精制获得肉苁蓉精制多糖（ＵＣＥＰ１），其多糖含量达７０．１３％．得到的肉苁蓉多糖锌配合物ＵＣＥＰ１－Ｚｎ，ＵＣＥＰ１中－ＯＨ 和－ＣＯＯ－ 与Ｚｎ２＋ 发生了配位，ＥＤＴＡ滴定法分析其锌含量为７．５７％．ＵＣＥＰ１－Ｚｎ形成后，多糖链构象及多糖分子表面形貌发生变化．体外抗氧化活性研究表明，ＵＣＥＰ１－Ｚｎ的抗氧化能力显著高于ＵＣＥＰ１，且对ＡＢＴＳ＋ 自由基清除活性最高．该研究可为肉苁蓉多糖、新型锌营养素补充剂以及锌功能配合物的研究和利用提供参考．参考文献：［１］ＫＯＢＡＹＡＳＨＩ　Ｈ，ＯＧＵＣＨＩ　Ｈ，ＴＡＫＩＺＡＷＡ　Ｎ，ｅｔ　ａｌ．Ｎｅｗ　ｐｈｅｎｙｌｅｔｈａｎｏｉｄ　ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ　ｆｒｏｍｃｉｓｔａｎｃｈｅ　ｔｕｂｕｌｏｓａ（Ｓｃｈｒｅｎｋ）Ｈｏｏｋ．Ｆ．Ｉ．［Ｊ］．Ｃｈｅｍ　Ｐｈａｒｍ　Ｂｕｌｌ，１９８７，３５（８）：３３０９－３３１４．［２］Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ．Ｃｉｓｔａｎｃｈｅ　Ｈｅｒｂａ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｅｏｐｌｅ＇ｓ　Ｒｅｐｕｂｌｉｃ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ［Ｍ］．Ｂｅｉｊｉｎｇ：Ｃｈｉｎａ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｒｅｓｓ，２０１０：１２６．［３］王翔岩，齐云，蔡润兰，等．肉苁蓉多糖的促淋巴细胞增殖作用［Ｊ］．中国实验动物学报，２００９，１７（６）：４２４－４２７．［４］木下刚．肉苁蓉多糖的药理学研究［Ｊ］．生药学杂志，１９８６（３）：３２５－３３２．［５］王晓琴，曹礼，朱艳萍．肉苁蓉多糖提取工艺及抑菌作用研究［Ｊ］．安徽农业科学，２００９，３７（３２）：１５８５５－１５８５６．［６］ＭＡ　Ｇ　Ｘ，ＹＡＮＧ　Ｗ　Ｊ，ＭＡＲＩＧＡ　Ａ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｎｔｉｔｕｍｏｒ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ　ｅｒｙｎｇｉｉ　ｒｅｓｉｄｕｅ［Ｊ］．ＣａｒｂｏｈｙｄＰｏｌｙｍ，２０１４，１１４：２９７－３０５．［７］ＴＡＨＭＯＵＺＩ　Ｓ，ＧＨＯＤＳＩ　Ｍ．Ｏｐｔｉｍｕｍ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｆｒｏｍ　ｍｏｔｈｅｒｗｏｒｔ　ｌｅａｆ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｎｄ　ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ［Ｊ］．Ｃａｒｂｏｈｙｄ　Ｐｏｌｙｍ，２０１４，１１２：３９６－４０３．［８］ＺＨＵ　Ｊ，ＬＩＵ　Ｗ，ＹＵ　Ｊ　Ｐ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ａ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅｆｒｕｉｔ　ｏｆ　Ｌｙｃｉｕｍ　ｂａｒｂａｒｕｍ　Ｌ ［Ｊ］．Ｃａｒｂｏｈｙｄ　Ｐｏｌｙｍ，２０１３，９８：８－１６．［９］ＪＩＡＮＧ　Ｃ　Ｘ，ＺＨＡＯ　Ｌ，ＬＩ　Ｓ　Ｌ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｆｒｏｍ　Ｇｌｏｓｓａｕｌａｘ　ｄｉｄｙｍａ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ　Ｔｏｘｉｃｏｌ，２０１３，６２：２２６－２３０．［１０］李志洲．美味牛肝菌多糖锌配合物的制备［Ｊ］．食品研究与开发，２０１０，３１（３）：１２３－１２５．［１１］ＤＵＢＯＩＳ　Ｍ．ＧＩＬＬＥ　Ｋ　Ａ．ＨＡＭＩＬＴＯＮ　Ｊ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｕｇａｒｓ　ａｎｄ　ｒｅｌａｔｅｄｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ［Ｊ］．Ａｎａｌ　Ｃｈｅｍ，１９５６，２８：３５０－３５６．［１２］李兴艳，张丙云，尚永彪．正交试验优化酵母多糖锌配合物的制备及其对尿素的吸附性能［Ｊ］．食品科学，２０１３，３４（１４）：５７－６２．［１３］ＳＯＵＺＡ　Ｂ　Ｗ　Ｓ，ＣＥＲＱＵＥＩＲＡ　Ｍ　Ａ，ＢＯＵＲＢＯＮ　Ａ　Ｉ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ａｃｔｉｖｉｔｙｏｆ　ｓｕｌｆａｔｅｄ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｒｅｄ　ｓｅａｗｅｅｄＧｒａｃｉｌａｒｉａｂｉｒｄｉａｅ ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ　Ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄ，２０１２，２７：２８７－２９２．［１４］ＪＩＮ　Ｍ，ＣＡＩ　Ｙ，ＬＩ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．１，１０－Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ－Ｆｅ２＋ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ａｓｓａｙ　ｏｆ　ｈｙｄｒｏｘｙｌ　ｒａｄｉｃａｌ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　Ｈ２Ｏ２／Ｆｅ２＋［Ｊ］．Ｐｒｏｇ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ，１９９６，２３：５５３－５５５．［１５］ＷＯＯＴＴＯＮ－ＢＥＡＲＤ　Ｐ，ＭＯＲＡＮ　Ａ，ＲＹＡＮ　Ｌ．Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｔｏｔａｌ　ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　２３ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙ　ａｖａｉｌａｂｌｅ　ｖｅｇｅｔａｂｌｅ　ｊｕｉｃｅｓｂｅｆｏｒｅ　ａｎｄ　ａｆｔｅｒ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ＦＲＡＰ，ＤＰＰＨ，ＡＢＴＳ　ａｎｄ　Ｆｏｌｉｎ－Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ　ｍｅｔｈｏｄｓ［Ｊ］．ＦｏｏｄＲｅｓ　Ｉｎｔ，２０１１，４４：２１７－２２４．［１６］王元凤，金征宇，魏新林．茶多糖金属络合物的制备及清除自由基活性研究［Ｊ］．天然产物研究与开发，２００９，２１：３８２－３８７．［１７］吴新建，林素英，李荣华．槲皮素与３ｄ－过渡金属二价离子的配位反应研究［Ｊ］．福建师范大学学报：自然科学版，２００７，２３（６）：６８－７１．

摘要: 优选肉苁蓉多糖的脱蛋白工艺，为肉苁蓉多糖纯化提供试验依据。以脱蛋白率为指标，比较Sevag 法、酶法及酶－ Sevag 联合法对肉苁蓉粗多糖的脱蛋白效果，采用正交试验优选最佳工艺。结果表明，Sevag 法优于酶法和酶－Sevag 联合法，Sevag 法脱蛋白的最佳工艺为: 三氯甲烷与正丁醇的体积配合比4 ∶ 1，料液体积比1 ∶ 3，搅拌40 min，脱蛋白4 次。在该工艺下平均脱蛋白率为87． 11%，ＲSD 为1． 34%; 平均多糖保留率为83． 05%，ＲSD 为1. 54%。试验证明该工艺稳定可靠，适用于肉苁蓉多糖的纯化。关键词: 肉苁蓉多糖; 脱蛋白; Sevag 法; 酶法; 酶－ Sevag 联合法; 正交试验肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉( Cistanche deserticola Y． C．Ma) 或德赢vwin登录 ［C． tubulosa ( Schrenk) Ｒ． Wight］的干燥带鳞叶的肉质茎，具有补肾阳、益精血、润肠通便和延缓衰老等功效［1］。肉苁蓉多糖是肉苁蓉的主要活性成分之一，有研究表明肉苁蓉多糖具有延缓衰老、增强机体免疫功能，促进人体外成纤维细胞的生长及促进创伤愈合等生理活性作用［2］。植物多糖通常还有较多的蛋白质，会影响多糖的活性，所以须对多糖进行脱蛋白以达到对纯化多糖的目的。目前，多糖脱蛋白的方法主要有Sevag 法、三氯乙酸法、酶法等［3］。如殷洪梅等采用Sevag 法对金银花多糖进行脱蛋白研究［4］; 龚力民等对Sevag 法、酶法及酶－ Sevag 联合法脱五倍子多糖蛋白进行比较［5］; 蔡彬新等采用三氯乙酸法脱除海地瓜多糖中的蛋白质［6］。本试验通过3 种不同的方法单独或联合对肉苁蓉粗多糖进行脱蛋白研究，并对其脱蛋白工艺进行优化，以期获得高纯度肉苁蓉多糖，为肉苁蓉制剂及其保健品开发提供科学的依据。1 材料与方法1． 1 材料与仪器肉苁蓉，购自江西诚欣医药有限公司; 木瓜蛋白酶( 食品级) ，河南郑州绿源生物科技有限公司; 其他化学试剂均为分析纯; 试验用水为蒸馏水。电子分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司; 电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司; T6 新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用有限责任公司; 数显恒温水浴锅，江苏常州国华电器有限公司; Bq5200B 型超声波清洗器，江苏省昆山市超声仪器有限公司; SHZ － IIIB 循环水真空水泵，上海仪表集团供销公司。1． 2 试验方法1． 2． 1 肉苁蓉粗多糖的提取工艺流程肉苁蓉粗多糖的提取工艺流程如图1 所示。1． 2． 2 肉苁蓉多糖含量的测定1． 2． 2． 1 葡萄糖标准曲线方程的建立以葡萄糖为对照品，采用苯酚－ 硫酸法［7］测定肉苁蓉多糖含量，其标准曲线方程为D = 14． 017ρ + 0． 000 2，r2 = 0． 997 5，ρ 为多糖溶液的质量浓度，线性范围为0． 01 ～ 0． 05 mg /mL。1． 2． 2． 2 多糖保留率的计算多糖保留率= ρ2 /ρ1 × 100%。( 1)式中: ρ1为脱蛋白前粗多糖中肉苁蓉多糖的质量浓度; ρ2为精制后肉苁蓉多糖的质量浓度。1． 2． 3 蛋白质含量测定1． 2． 3． 1 蛋白质标准曲线方程的建立以牛血清白蛋白为对照品，采用考马斯亮蓝法［8］测定蛋白质含量，其标准曲线方程为D = 8． 097ρ + 0． 029 8，r 2 = 0． 995 4，ρ 代表蛋白质溶液的质量浓度，线性范围为0． 02 ～ 0． 10 mg /mL。1． 2． 3． 2 蛋白质脱除率的计算蛋白质脱除率= ( ω1 － ω2) /ω1 × 100%。( 2)式中: ωj为脱蛋白前粗多糖中蛋白质的质量分数; ω2为精制后蛋白质的质量分数。1． 2． 4 肉苁蓉多糖脱蛋白方法1． 2． 4． 1 Sevag 法脱蛋白取“1． 2． 1”节下制备的粗多糖2 g 溶于50 mL 水中，加入12． 5 mL 的Sevag 试剂( V三氯甲烷∶ V正丁醇= 4 ∶ 1) ，磁力搅拌30 min 后离心10 min; 弃去沉淀，上清液用3 倍体积量的95%乙醇沉淀，沉淀经洗涤干燥后得精制多糖，测定精制多糖中的多糖含量和蛋白质含量。1． 2． 4． 2 酶法脱蛋白取“1． 2． 1”节下制备的粗多糖2 g 溶于50 mL 水中，加入10 mg 木瓜蛋白酶，于60 ℃下酶解2 h，离心10 min; 弃去沉淀，上清液用3 倍体积量的95% 乙醇沉淀，沉淀经洗涤干燥后得精制多糖，测定精制多糖中的多糖含量和蛋白质含量。1． 2． 4． 3 酶－ Sevag 联合法脱蛋白按上述酶法制备得到的上清液加入1 /4 量的Sevag 试剂，再搅拌和离心处理后制备精制多糖，测定精制多糖中的多糖含量和蛋白质含量。1． 2． 5 肉苁蓉多糖脱蛋白工艺优化影响Sevag 法脱蛋白的因素主要有三氯甲烷与正丁醇的体积比( V三氯甲烷∶ V正丁醇) 、料液比( Sevag 试剂与多糖溶液体积比) 、搅拌时间和脱蛋白次数。选择各因素的3 个水平值，按Sevag 法脱蛋白工艺进行L9( 34 )正交试验( 表1) ，试验结果以脱蛋白率为判断依据，以综合评价作为参考。综合评价率采用综合加权评分法，评分公式为:综合评价率= ( 脱蛋白率+ 多糖保留率) × 50%。从表2 可知，Sevag 法和酶－ Sevag 联合法脱蛋白的效率相对较高，而酶法多糖的保留率相对较高。这可能是因为肉苁蓉多糖中的蛋白质以游离型居多，结合型较少，Sevag 法能更加有效地除去游离型蛋白质，而酶法主要酶解结合型蛋白质。2 个因素综合考虑，Sevag 法更适合于肉苁蓉多糖的脱蛋白工艺。2． 2 Sevag 法正交试验结果由表3 的极差分析可知，Sevag 法各因素对肉苁蓉多糖脱蛋白的影响顺序依次为A ＞ C ＞ D ＞ B，即三氯甲烷与正丁醇的体积比影响最大，其次为搅拌时间、脱蛋白次数、料液比。Sevag 法脱蛋白的最佳工艺为A2B1C3D3，即三氯甲烷与正丁醇的体积比为4 ∶ 1，料液体积比为1 ∶ 3，搅拌时间40 min，脱蛋白次数4 次。这主要是因为随着搅拌时间的增加，Sevag 试剂与蛋白质结合增多，脱蛋白率提高; 脱蛋白次数的增加固然能提高脱蛋白率，但是多糖损失得也会更多，可能会造成综合效果不佳。对上述最佳工艺进行验证，重复操作3 次，得出该工艺下平均脱蛋白率为87． 11%，ＲSD 为1． 34%; 平均多糖保留率为83． 05%，ＲSD 为1． 54%。结果表明该工艺脱蛋白率高，综合效果良好。3 结论Sevag 法适用于肉苁蓉多糖脱蛋白工艺，通过正交试验优选出肉苁蓉脱蛋白的最佳工艺为: 三氯甲烷与正丁醇的体积配合比4 ∶ 1，料液体积比1 ∶ 3，搅拌40 min，脱蛋白4 次。在该工艺水平下平均脱蛋白率为87． 11%，ＲSD 为1． 34%; 平均多糖保留率为83． 05%，ＲSD 为1． 54%。试验证明该工艺稳定可靠，适用于肉苁蓉多糖的纯化。参考文献:［1］国家药典委员会． 中华人民共和国药典［M］． 北京: 中国医药科技出版社，2010: 126．［2］Schepetkin I A，Quinn M T． Botanical polysaccharides: macrophageimmunomodulation and therapeutic potential［J］． International Immunopharmacology，2006，6( 3) : 317 － 333．［3］卢艳花． 中药有效成分提取分离技术［M］． 北京: 化学工业出版社，2005: 298．［4］殷洪梅，尚强，萧伟． 金银花多糖脱蛋白方法的研究［J］． 中草药，2010，41( 4) : 584 － 586．［5］龚力民，刘伟，张楚晗，等． 五倍子多糖脱蛋白方法的研究［J］．湖南中医药大学学报，2013，33( 3) : 44 － 46．［6］蔡彬新，吴成业，刘淑集． 海地瓜多糖提取条件的优化和脱蛋白的研究［J］． 食品工业科技，2009，30( 10) : 194 － 196，199．［7］麻景梅，宋新波，张丽娟，等． 肉苁蓉多糖含量测定［J］． 辽宁中医药大学学报，2012，14( 8) : 100 － 101．［8］乔茜茜，祁英，孙建忠，等． 啤酒花多糖的提取及脱蛋白工艺研究［J］． 食品工业科技，2012，33( 16) : 251 － 256．

摘要:目的 探讨肉苁蓉多糖通过激活Wnt/β-catenin 信号通路对6-羟多巴胺(6-HODA)所致帕金森病大鼠受损神经的保护作用。方法 将45 只SD 雄性大鼠随机分为假手术组、模型组和肉苁蓉多糖治疗组,采用6-HODA 立体定向微量注射制备帕金森病大鼠模型。第32 天观察实验动物行为学改变,之后将大鼠处死,采用蛋白免疫印迹(Western Blot)检测大鼠脑黑质内Wnt1、β-catenin 蛋白表达;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)mRNA 表达。结果 与假手术组比较,模型组游泳静止时间缩短,自主活动站立次数下降,肉苁蓉多糖治疗后上述两种行为得到恢复;模型组脑黑质内Wnt1、β-catenin 蛋白水平低于假手术组;肉苁蓉多糖治疗组脑黑质内Wnt1、β-catenin 蛋白水平高于模型组(P <0.05);模型组脑黑质内GSK-3βmRNA 高于假手术组;肉苁蓉多糖治疗后,帕金森病大鼠脑黑质内GSK-3βmRNA 水平下降(P <0.05)。结论 肉苁蓉多糖能改善6-HODA 所致帕金森病SD 大鼠模型临床症状,这种作用可能通过激活Wnt/β-catenin 信号通路,抑制GSK-3β活性,进而发挥多巴胺神经保护作用。关键词:帕金森病;肉苁蓉多糖;Wnt/β-catenin 信号通路;神经保护;大鼠帕金森症(Parkinson'sdisease,PD)是世界范围内发病率仅次于阿尔茨海默病的第二大神经系统退行性疾病,临床表现为静止性震颤、肌肉强直、运动迟缓等,病理特征为脑黑质致密部多巴胺神经元损伤,纹状体多巴胺水平下降[1-2]。Wnt/β-catenin 信号通路在中枢神经发育过程中发挥重要作用,该信号通路在PD发病过程中的作用受到越来越多关注[3]。肉苁蓉是列当科植物肉苁蓉的干燥带鳞叶肉质茎,具有神经保护、提高免疫力、抗衰老等多种功能[4]。有研究证实,肉苁蓉的有效成分肉苁蓉多糖(cistanche deserticola polysaccharides,CDPS)通过多种细胞因子调节PD 动物模型的临床症状[5],但CDPS 对Wnt/β-catenin 信号通路是否具有调节作用报道较少。本研究旨在探讨CDPS 能否通过激活Wnt/β-catenin 信号通路对6-羟多巴胺(6-HODA)所致PD 大鼠的受损神经起到保护作用,为PD 提供新的治疗思路和研究靶点。1 材料与方法1.1 实验动物 SPF 级雄性成年SD 大鼠45 只,周龄6~7 周,体重200 g 左右,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。造模前实验动物饲养于SPF 级环境1 周。1.2 实验试剂 肉苁蓉生药由我院中药房提供,提取CDPS;6-HODA、抗坏血酸购自美国Sigma 公司;兔抗Wnt、β-catenin 单抗购自美国Cayman 公司;糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、β-actin 引物由上海生物工程有限公司合成。1.3 PD 大鼠动物模型建立 随机选取SD 大鼠30只,以戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉,将实验动物固定于脑立体定位仪上,沿颅顶正中线切开皮肤,钝性分离头骨外膜,参考大鼠脑定位立体图谱,确定右侧纹状体坐标(前囟前1.0 mm,中线右3.0 mm,硬膜下4.5~5.0 mm),将8 μg 的6-HODA 溶于含0.2% 坏血酸的生理盐水中,使用微量注射器抽取后,以1 μL/min速度注射于上述两个靶点,注射后停针10 min,之后缓慢退针(2~3 min)。建模成功标准:建模1 周后,腹腔注射阿扑吗啡(0.5 mg/kg),诱发大鼠旋转,大鼠恒定向左旋转,且30 min内旋转圈数>210圈视为造模成功。1.4 实验动物分组及干预方法 将45 只大鼠随机分为假手术组(Sham 组)、模型组(PD 组)和肉苁蓉多糖治疗组(CDPS + PD组),各1 5 只,每组进行不同干预。1.4.1 CDPS+PD 组 造模3 周后,每日给予造模成功的SD 大鼠CDPS 灌胃治疗,剂量为1.08 g/(kg·d),连续治疗10 d。1.4.2 PD 组 造模3 周后,每日给予造模成功的SD大鼠与CDPS+PD 组相同体积的生理盐水灌胃处理,连续治疗10 d。1.4.3 Sham 组 手术过程同PD 组,只是注射等体积生理盐水,3 周后每日给予SD 大鼠与CDPS+PD 组相同体积的生理盐水灌胃处理,连续治疗10 d。1.5 实验动物行为学观察1 .5.1 游泳实验 第32天,将SD大鼠置于一个20 cm×20 cm×25 cm体积水缸内,水深10 cm,水温20~22 ℃,安静环境下,记录SD大鼠5 min内静止时间。1.5.2 自主活动实验 第32 天,制作一个30 cm×30cm×15 cm 的有机玻璃盒,底部标注6 cm×6 cm 方格,置于安静、昏暗环境中,统计SD 大鼠5 min 内站立次数,连续观察5 次,取平均值。1.6 组织标本提取 第32 天,将SD 大鼠以戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(40 mg/kg),仰位固定于工作台上,沿腹中线剪开皮肤,暴露腹腔,预冷生理盐水灌注心脏,取脑组织,于-80 ℃条件下保存。1.7 蛋白免疫印迹(Western Blot)检测SD 大鼠脑黑质内Wnt1、β-catenin 蛋白表达 将冻存的脑组织剪成碎块,加入蛋白裂解液,离心后取上清液,电泳分离蛋白,将蛋白转移至硝酸纤维素膜(NC 膜),使用含5%脱脂乳粉的TBST 封闭,按顺序添加一抗、二抗,洗涤NC 膜,增强化学发光法(ECL)显色,胶片扫描后使用Bandscan5.0 软件分析蛋白条带灰度。1.8 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测GSK-3β mRNA 表达 将冻存脑组织加液氮研磨,使用Trizol提取总RNA,行逆转录反应。取2 μL RNA 进行PCR扩增:内参为β-actin,内参引物序列,正向引物:TCGGCTATTCGGCTAGCTAGC;反向引物: TCGGTCGATTAGCTAGCCGCA;GSK-3β mRNA 引物序列,正向引物:TCGATTCGATCGGGCTAGCTA;反向引物:TACGGTAGCGGCTAGCTAGG 。扩增条件:95 ℃预变性2 min,1 个循环;95 ℃变性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,共35个循环;72 ℃总延伸6 min。取5 μL PCR 扩增产物进行电泳,紫外线投射仪下观察电泳条带,分析目的基因和参比基因的条带灰度。1.9 统计学处理 采用SPSS 19.0 软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(x ±s )表示,采用t 检验。以P <0.05 为差异有统计学意义。2 结 果2.1 各组大鼠行为学观察结果比较 与Sham 组比较,PD 组游泳静止时间增加(P <0.05),CDPS+PD组游泳静止时间较PD 组缩短(P <0.05);PD 组自主活动站立次数较Sham 组下降(P <0.05),CDPS+PD 组站立次数明显恢复(P <0.05)。详见表1。2.2 各组大鼠脑黑质内Wnt1 蛋白表达 PD 组大鼠脑黑质内Wnt1 蛋白表达少于Sham 组(P <0.05),且CDPS + PD 组Wnt 1 蛋白水平较PD 组提升(P <0.05)。详见图1。2.3 各组大鼠脑黑质内β-catenin 蛋白表达 PD 组大鼠脑黑质内β-catenin 蛋白水平低于Sham 组(P <0.05),CDPS+PD 组大鼠脑黑质内β-catenin 蛋白水平高于PD 组(P <0.05)。详见图2。2.4 各组大鼠脑黑质内GSK-3βmRNA 表达 PD 组大鼠脑黑质内GSK-3βmRNA 高于Sham 组(P <0.05),CDPS+PD 组脑黑质内GSK-3βmRNA 较PD组下降(P <0.05)。详见图3。3 讨 论PD 是由中脑黑质多巴胺神经元选择性退行性病变引起的[2]。近年来,Wnt 信号通路在PD 中的作用日益重视。Wnt 根据细胞内信号通路不同分为两类,在Wnt/β-catenin 通路中发挥作用的是Wnt1,该通路是所有Wnt 通路中重要的一条[6]。该通路在PD 小鼠模型中脑黑质多巴胺神经元病理生理过程中发挥重要作用[3]。动物实验证实,干扰小鼠中脑β-catenin 严重减弱多巴胺神经元再生能力及多巴胺神经元完整性[7];体外研究证实,Wnt1 在中脑前体细胞中促进其分化为多巴胺神经[8],同时Wnt1 缺失导致多巴胺神经元增殖能力下降[9]。本研究结果可见,6-HODA 所致PD 大鼠脑黑质组织Wnt1 和β-catenin 表达较Sham 组大鼠均较低,说明PD 大鼠脑组织内Wnt1 和β-catenin 作用被阻断,该结果与相关研究[8-9]报道一致。GSK-3β是Wnt/β-catenin 通路重要组成分子,该通路激活后,GSK-3β活性被抑制,从而增加β-catenin稳定性[10]。Gong 等[11]研究发现,6-HODA 能激活GSK-3β,进而导致中枢神经细胞凋亡,同时GSK-3β阻断剂可抑制PD 大鼠神经元凋亡;另有研究报道,中脑多巴胺前体细胞抑制GSK-3β活性可增加β-catenin水平,同时促进多巴胺神经元增殖和分化[12]。本研究结果显示,给予SD 大鼠颅内注射6-HODA 后,GSK-3βmRNA 表达高于Sham 组,说明6-HODA 能激活GSK-3β使其表达上调,同时抑制Wnt/β-catenin通路活性。肉苁蓉具有免疫调节、抗氧化、抗衰老等作用[4]。有研究证实,肉苁蓉的有效成分在中枢神经保护方面发挥重要作用,对脑卒中、PD、阿尔茨海默病等中枢神经退行性疾病具有良好的防治作用[5]。有研究证实,肉苁蓉中苯乙醇总苷能改善PD 小鼠临床症状,提高纹状体内多巴胺水平[13];另有研究发现,松果菊苷(ECH)通过抗氧化作用而减少氧化应激反应,保护多巴胺神经元免受氧化应激损伤[14]。CDPS 是肉苁蓉的一种主要化学成分,其对PD 的防治研究目前报道较少。本研究采用CDPS 干预6-HODA 所致的帕金森SD 大鼠,治疗后SD 大鼠自主活动能力提高,脑黑质内Wnt1 和β-catenin 蛋白表达较PD 组提高,GSK-3β 基因表达受到抑制,说明CDPS 能改善PD 大鼠临床症状,这种作用可能通过激活Wnt/β-catenin 信号通路而产生的。综上所述,CDPS 可改善6-HODA 所致PD 大鼠临床症状,这种作用可能通过激活Wnt/β-catenin 信号通路,抑制GSK-3β活性而发挥多巴胺神经保护作用而实现的。今后将进一步从细胞分子水平探讨肉苁蓉对PD 动物模型中枢神经细胞保护作用的具体机制。参考文献:[1] CALABRESE V,SANTORO A,MONTI D,et al .Aging and Parkinson'sdisease:inflammaging,neuroinflammation and biological remodelingas key factors in pathogenesis [J]. 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　摘要：目的　探讨音猬因子（Ｓｏｎｉｃ　ｈｅｄｇｅｈｏｇ，Ｓｈｈ）通路在实验性自身免疫性脑脊髓炎（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，ＥＡＥ）小鼠发病过程中的作用，及肉苁蓉多糖（ｃｉｓｔａｎｃｈｅ　ｄｅｓｅｒｔｉｃｏｌａ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＣＤＰＳ）能否通过该通路缓解ＥＡＥ小鼠临床症状。方法　给予Ｃ５７ＢＬ／６小鼠皮下注射髓鞘少突细胞糖蛋白３５－５５多肽（ｍｙｅｌｉｎ　ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　３５－５５，ＭＯＧ３５－５５）抗原制备ＥＡＥ动物模型。将６０只小鼠随机分为正常对照组、ＥＡＥ模型组、ＣＤＰＳ治疗组以及ＣＤＰＳ＋Ｓｍｏ受体阻断剂环王巴明（ｃｙｃ）治疗组（以下简称ＣＤＰＳ＋ｃｙｃ治疗组）４组，每组各１５只。观察各组小鼠免疫注射后０～２６ｄ的临床症状评分，采用勒克斯光蓝染色（Ｌｕｘｏｌ　Ｆａｓｔ　Ｂｌｕｅ，ＬＦＢ）检测各组小鼠脊髓组织内髓鞘脱失情况，Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法检测脊髓组织内Ｓｈｈ、碎片蛋白－１（Ｐａｔｃｈｅｄ－１，Ｐｔｃ－１）蛋白表达，采用ＲＴ－ＰＣＲ检测脊髓组织内平滑蛋白（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ，Ｓｍｏ）ｍＲＮＡ、神经胶质瘤相关癌基因１（Ｇｌｉｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｏｎｃｏｇｅｎｅ－１，Ｇｌｉ１）ｍＲＮＡ表达。结果　自ＣＤＰＳ治疗第９天开始，ＣＤＰＳ治疗组小鼠临床症状评分低于ＥＡＥ模型组（Ｐ＜０．０５），而ＣＤＰＳ＋ｃｙｃ治疗组临床症状评分高于ＣＤＰＳ组（Ｐ＜０．０５）。ＣＤＰＳ治疗组小鼠脊髓ＬＦＢ评分较ＥＡＥ模型组降低（ｔ＝９．６４，Ｐ＜０．０１），而ＣＤＰＳ＋ｃｙｃ治疗组其ＬＦＢ评分与ＥＡＥ模型组比较差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。ＥＡＥ模型组小鼠脊髓组织内Ｓｈｈ、Ｐｔｃ－１蛋白以及ＳｍｏｍＲＮＡ、Ｇｌｉ１ｍＲＮＡ表达水平较正常组升高（均Ｐ＜０．０１），经ＣＤＰＳ治疗后，上述因子表达进一步升高（均Ｐ＜０．０１），而经ｃｙｃ干预后，上述因子表达较ＣＤＰＳ治疗组降低（均Ｐ＜０．０１）。结论　ＣＤＰＳ对ＥＡＥ小鼠临床症状有改善作用，其作用途径可能与Ｓｈｈ信号通路有关。关键词：肉苁蓉多糖；脑脊髓炎，自身免疫性，实验性；Ｓｈｈ通路；神经保护多发性硬化（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＭＳ）是一种以中枢神经系统炎性脱髓鞘病变为主要特点的自身免疫性疾病，其主要病理特征为髓鞘脱失、轴索损伤、少突胶质细胞病变，受损后神经细胞的修复和再生对中枢神经系统的功能重建尤为重要［１］。Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｈｈ）信号通路在神经系统的发育过程中起非常重要的作用［２］，音猬因子（ｓｏｎｉｃｈｅｄｇｅｈｏｇ，Ｓｈｈ）是Ｈｈ家族三大配体成员之一，Ｓｈｈ信号通路的主要成分包括Ｓｈｈ配体、跨膜蛋白受体Ｐｔｃ和平滑蛋白（ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ，Ｓｍｏ）及下游转录因子神经胶质瘤相关癌基因（ｇｌｉｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｏｎｃｏｇｅｎｅ，Ｇｌｉ）蛋白等。近年来有报道证实Ｓｈｈ信号通路在促进神经再生、少突胶质细胞发生混合轴突重塑方面有重要作用，对ＭＳ等神经退行性疾病的发生有重要影响［３］。目前临床上治疗ＭＳ的手段主要有糖皮质激素冲击和免疫调节治疗［４］，但疗效并不理想且副作用较大。肉苁蓉多糖（ｃｉｓｔａｎｃｈｅ　ｄｅｓｅｒｔｉｃｏｌａ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＣＤＰＳ）是从肉苁蓉中提取的化学成分，具有免疫调节、抗衰老、抗肿瘤等功能［５］。有研究证实，ＣＤＰＳ能通过多种机制改善帕金森病、缺血性脑卒中小鼠中枢神经功能［６－７］，但其对ＭＳ的受损神经是否具有保护作用尚未可知。本研究观察了ＣＤＰＳ对实验性自身免疫性脑脊髓炎（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，ＥＡＥ）小鼠中枢神经的作用，并探讨其可能机制，为ＭＳ的临床治疗寻找更安全有效的药物。１　材料和方法１．１　实验动物　ＳＰＦ级雌性Ｃ５７ＢＬ／６小鼠６０只，周龄８～１０周，体重１８～２０ｇ，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。建模前将实验动物在ＳＰＦ级环境下饲养１周。将小鼠随机分为正常对照组、ＥＡＥ模型组、ＣＤＰＳ治疗组及ＣＤＰＳ＋Ｓｍｏ受体阻断剂环王巴明（ｃｙｃｌｏｐａｍｉｎｅ，ｃｙｃ；以下简称“ＣＤＰＳ＋ｃｙｃ治疗组”）４组，每组１５只。１．２　主要试剂　髓鞘少突细胞糖蛋白３５－５５多肽（ｍｙｅｌｉｎ　ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　３５－５５，ＭＯＧ３５－５５）购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，完全福氏佐剂（ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄｓ　ａｄｊｕｖａｎｔ，ＣＦＡ）购自美国Ｓｉｇｍａ公司，百日咳毒素（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ　ｔｏｘｉｎ，ＰＴＸ），购自美国Ｓｉｇｍａ公司，ｃｙｃ购自美国Ｃａｙｍａｎ公司，肉苁蓉生药由本院中药房提供，Ｓｍｏ、Ｇｌｉ１、β－ｃａｔｅｎｉｎ引物由上海生工生物工程有限公司合成，Ｓｈｈ、Ｐｔｃ－１、ＧＡＰＤＨ 抗体购自碧云天生物技术研究所。１．３　方法　１．３．１　ＣＤＰＳ提取：肉苁蓉生药片１０ｇ，研磨成碎片，置９５％（体积分数）乙醇中浸泡３ｈ后用纱布过滤，弃滤液，加水反复煎煮３次，２ｈ／次，过滤后合并滤液，减压浓缩体积至原生药溶液体积的２／３，以５０００ｒ／ｍｉｎ（离心半径１５ｃｍ）离心１０ｍｉｎ，弃沉淀，上清液加２～３倍体积９５％（体积分数）乙醇，４℃下静置２４ｈ后以３０００ｒ／ｍｉｎ（离心半径１５ｃｍ）离心２０ｍｉｎ，弃上清液，沉淀经水复溶、脱蛋白透析、冷冻干燥，获取多糖共２．２０ｇ。紫外分光光度计测定多糖含量＞９０％。１．３．２　ＥＡＥ小鼠模型建立［１］：将１０ｍｇ　ＭＯＧ３５－５５溶于２ｍＬ生理盐水，并与含２．５ｍｇ／ｍＬ结核杆菌的ＣＦＡ等体积混合，使用玻璃注射器反复抽打至完全融合，制成油包水样乳剂。以２％（质量浓度）戊巴比妥麻醉按体重３ｍＬ／ｋｇ给予小鼠背部沿脊柱中线两侧分四点皮下注射抗原乳剂０．２ｍＬ，分别于０、４８ｈ给予小鼠腹腔注射ＰＴＸ　２００ｎｇ，建立ＥＡＥ模型。正常对照组小鼠以同法给予背部皮下注射不含ＭＯＧ３５－５５和结核杆菌的乳剂。自免疫当天起，隔天观察并记录小鼠行为特征，采用五分法对小鼠进行神经功能评分［８］：０分，活动正常，无明显临床症状；１分，尾部无力；２分，后肢无力，翻转后可自行恢复；３分，尾部及双后肢瘫痪，翻转后不能自行恢复；４分，四肢瘫痪；５分，濒临死亡或死亡。神经功能评分≥１分即认为发病。共观察２６ｄ。１．３．３　各组干预措施：（１）ＣＤＰＳ＋ｃｙｃ治疗组：自免疫后第１２天起，每天按体重０．５４ｍｇ／ｇ给予ＣＤＰＳ灌胃（ＣＤＰＳ溶于生理盐水），同时按体重１０ｍｇ／ｋｇ腹腔注射ｃｙｃ，连续２周；（２）ＣＤＰＳ治疗组：自免疫后第１２天起，以同法给予等剂量ＣＤＰＳ灌胃，同时腹腔注射等体积的生理盐水，连续２周；（３）ＥＡＥ模型组和正常对照组：按上述方法给予等体积的生理盐水灌胃及腹腔注射，持续２周。１．３．４　组织标本采集：免疫后第２６天，以２％（质量浓度）戊巴比妥麻醉小鼠，预冷生理盐水进行心脏灌注，采集脊髓组织，部分以４％（质量浓度）多聚甲醛固定后制成石蜡切片，剩余组织置－８０℃冷冻保存备用。１．３．５　勒克斯光蓝（Ｌｕｘｏｌ　Ｆａｓｔ　Ｂｌｕｅ，ＬＦＢ）髓鞘染色［９］：将脊髓腰间膨大组织石蜡切片脱蜡，置于固蓝染液中孵育过夜，９５％（体积分数）乙醇中洗脱１ｍｉｎ，０．０５％（质量浓度）碳酸锂溶液洗脱１０ｓ，乙醇梯度脱水，二甲苯浸泡至透明，中性树胶封片。置光学显微镜下观察髓鞘脱失情况：０分，无脱失，髓鞘完整；１分，１个小范围内脱失；２分，２或３个小范围脱失；３分，１～２个大范围脱失；４分，大范围髓鞘脱失累及２０％以上白质区域。１．３．６　脊髓组织Ｓｈｈ、Ｐｔｃ－１ 蛋白表达：采用Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法检测。将冻存脊髓组织剪成碎块，加蛋白裂解液，离心后取上清液，电泳分离蛋白，将蛋白转移至ＮＣ膜，用含５％（质量浓度）脱脂奶粉的ＴＢＳＴ封闭，按顺序添加一抗、二抗，洗涤ＮＣ膜，ＥＣＬ显色，胶片扫描后用Ｂａｎｄｓｃａｎ５．０软件分析蛋白条带灰度与内参条带灰度比值表示蛋白相对表达水平。１．３．７　脊髓组织Ｓｍｏ、Ｇｌｉ１ ｍＲＮＡ 表达：采用ＲＴ－ＰＣＲ检测。将冻存组织在液氮中研磨，加Ｔｒｉｚｏｌ提取总ＲＮＡ，行逆转录反应。取２μＬ　ＲＮＡ进行ＰＣＲ扩增。β－ａｃｔｉｎ内参引物序列：Ｓｅｎｓｅ：３′－ＴＣＧＡＣＴＴＡＧＣＴＡＧＣＣＡＧＣＴＡＡ－５′；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：３′－ＴＣＧＡＴＴＡＣＧＧＣＴＡＧＣＧＣＧＧＣＴ－５′；Ｓｍｏ　ｍＲＮＡ 引物序列：Ｓｅｎｓｅ：３′－ＴＣＧＧＣＴＡＴＴＡＣＧＣＴＴＧＣＴＡＡＣ －５′；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ： ３′－ＴＣＧＧＣＴＴＡＧＣＴＣＧＡＴＴＡＡＣＣＡ－５′；Ｇｌｉ１ ｍＲＮＡ 引物序列：Ｓｅｎｓｅ：３′－ＴＡＴＴＡＧＣＴＴＡＡＣＧＣＴＡＣＣＣＡＡ－５′；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：３′－ＴＣＧＧＣＴＡＧＣＣＡＡＡＴＴＧＣＴＡＧＧ－５′。扩增条件：９５℃ 预变性２ｍｉｎ，１个循环；９５℃变性３０ｓ，５６℃退火３０ｓ，７２℃延伸２ｍｉｎ，共３５个循环；７２℃总延伸６ｍｉｎ。取５μＬ　ＰＣＲ扩增产物进行电泳，紫外线投射仪下观察电泳条带，分析目的基因和内参基因的条带灰度。１．４　统计学处理　采用ＳＰＳＳ１９．０软件进行统计分析，对数据进行正态性和方差齐性检验，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，多组均数间比较采用单因素方差分析，两两比较用ＬＳＤ－ｔ检验。以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。２　结果２．１　临床症状评分　自免疫后第１０天开始，ＥＡＥ小鼠陆续出现临床症状，ＥＡＥ模型组小鼠神经功能评分于２４ｄ达高峰，随后有所缓解；ＣＤＰＳ治疗组小鼠于治疗第９～２６天（免疫后第２０天）开始，其神经功能评分明显低于ＥＡＥ模型组（均Ｐ＜０．０５）；ＣＤＰＳ＋ｃｙｃ治疗组小鼠自治疗第９天（免疫后第２０天）开始，其神经功能评分显著高于ＣＤＰＳ治疗组（均Ｐ＜０．０５），而与ＥＡＥ模型组小鼠比较差异无统计学意义（均Ｐ＞０．０５）。结果见图１。２．２　ＬＦＢ染色　正常组小鼠髓鞘完整，无脱失；ＥＡＥ模型组小鼠髓鞘密度明显下降；ＣＤＰＳ治疗组小鼠髓鞘ＬＦＢ评分低于ＥＡＥ模型组（１．３０±０．２１比２．５８±０．２５；ｔ＝９．６４，Ｐ＜０．０１）；ＣＤＰＳ＋ｃｙｃ治疗组小鼠髓鞘ＬＦＢ评分与ＥＡＥ模型组比较无统计学差异（２．１３±０．３１比２．５８±０．２５；ｔ＝０．８３，Ｐ＞０．０５）。结果见图２。２．３　各组小鼠脊髓Ｓｈｈ和Ｐｔｃ－１蛋白表达　ＥＡＥ模型组小鼠脊髓Ｓｈｈ、Ｐｔｃ－１蛋白表达高于正常对照小鼠（ｔ＝８．９７，Ｐ＜０．０１；ｔ＝１４．２８，Ｐ＜０．０１），ＣＤＰＳ治疗组脊髓Ｓｈｈ、Ｐｔｃ－１蛋白表达高于ＥＡＥ模型组（ｔ＝２１．７７，Ｐ＜０．０１；ｔ＝２４．３３，Ｐ＜０．０１），经ｃｙｃ阻断后，Ｓｈｈ、Ｐｔｃ－１蛋白表达较ＣＤＰＳ治疗组低（ｔ＝１２．０３，Ｐ ＜０．０１；ｔ＝１８．６９，Ｐ ＜０．０１）。结果见图３、４。２．４　各组小鼠脊髓组织Ｓｍｏ　ｍＲＮＡ 和Ｇｌｉ１ｍＲＮＡ 表达　ＥＡＥ 模型组小鼠脊髓组织ＳｍｏｍＲＮＡ 和Ｇｌｉ１ ｍＲＮＡ 表达较正常小鼠高（ｔ＝１０．２８，Ｐ＜０．０１；ｔ＝７．２２，Ｐ＜０．０１），经ＣＤＰＳ治疗后Ｓｍｏ　ｍＲＮＡ和Ｇｌｉ１ｍＲＮＡ表达较ＥＡＥ模型组高（ｔ＝２５．２８，Ｐ＜０．０１；ｔ＝１２．３０，Ｐ＜０．０１），而经ｃｙｃ干预后，其Ｓｍｏ　ｍＲＮＡ 和Ｇｌｉ１ｍＲＮＡ表达水平与ＥＡＥ模型组比较无统计学差异（ｔ＝１．２５，Ｐ＞０．０５；ｔ＝０．９６，Ｐ＞０．０５），但明显低于ＣＤＰＳ治疗组（ｔ＝１８．３３，Ｐ＜０．０１；ｔ＝２１．０１，Ｐ＜０．０１）。结果见图５、６。３　讨论Ｓｈｈ通过与Ｐｔｃ结合可激发Ｓｍｏ活性，继而引发下游信号通路的级联反应，调节细胞的增殖、分化等活动［３］。前期研究证实，在脑卒中［１０］、ＭＳ［１１］、阿尔茨海默病［１２］等中枢神经受损后，Ｓｈｈ信号通路被激活，继而促进神经细胞再生、少突细胞发生和轴突修复，而抑制Ｓｈｈ信号通路则加剧脑损伤。Ｚｈａｎｇ等［１３］研究结果显示，脑活素能激活脑卒中实验大鼠中枢神经Ｓｈｈ通路，从而促进中枢神经再生，改善神经功能；Ｃｈｅｃｈｎｅｖａ等［１４］研究证实Ｓｍｏ受体激动剂能减轻脑缺血性损伤，促进神经功能恢复。Ｙｕ等［１５］研究显示，Ｓｍｏ受体阻断剂ｃｙｃ可抑制Ｓｈｈ信号通路活性，进而导致神经干细胞的增殖活性受到明显抑制。本研究结果发现，ＥＡＥ小鼠中枢神经系统内Ｓｈｈ信号系统分子Ｓｈｈ、Ｐｔｃ－１、Ｓｍｏ和Ｇｌｉ－１的表达明显高于正常小鼠，表明在受损中枢神经内，Ｓｈｈ信号通路被激活，这与前期研究结果一致。肉苁蓉是列当科植物肉苁蓉的干燥带鳞叶的肉茎，具有免疫调节等作用［５］，对神经系统疾病的防治有显著作用［６－７］。有研究证实，肉苁蓉可以对抗神经细胞内氧化应激反应所造成的ＤＮＡ损伤，维持线粒体膜电位正常，抑制神经细胞的凋亡［１６］；同时，肉苁蓉能降低脑缺血后的梗死范围，保护脑组织的缺血性损伤［１７］；肉苁蓉能通过调控帕金森病模型大鼠中脑黑质－纹状体组织内ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ通路的表达，发挥中枢神经细胞保护作用［６］。蔡克瑞等［７］研究发现，ＣＤＰＳ对Ｄ－半乳糖致衰小鼠的脑神经细胞具有保护作用，但目前有关肉苁蓉对ＭＳ中枢神经系统是否具有保护作用尚未见报道。本研究结果显示，给予ＥＡＥ小鼠ＣＤＰＳ干预后，ＥＡＥ小鼠神经功能评分明显低于ＥＡＥ模型小鼠，髓鞘脱失情况亦得到显著改善；进一步探讨肉苁蓉对ＥＡＥ小鼠中枢神经系统Ｓｈｈ信号通路是否有调控作用发现，肉苁蓉能上调ＥＡＥ 小鼠脊髓组织内Ｓｈｈ、Ｐｔｃ－１、Ｓｍｏ和Ｇｌｉ－１的表达，表明ＣＤＰＳ能激活Ｓｈｈ信号通路；当Ｓｈｈ信号通路被ｃｙｃ抑制后，ＣＤＰＳ改善ＥＡＥ小鼠神经功能学及脱髓鞘的作用被抑制，且Ｓｈｈ相关信号分子的表达也较ＣＤＰＳ治疗组下降，表明Ｓｈｈ信号通路在ＣＤＰＳ对ＥＡＥ小鼠的神经保护效应中起到重要作用。综上所述，本研究结果显示ＣＤＰＳ 能改善ＥＡＥ小鼠临床症状，其发挥神经保护作用的途径可能是通过激活Ｓｈｈ信号通路有关。参考文献：［１］刘淑情．苦参素对实验性自身免疫性脑脊髓炎及其并发症视神经炎作用机制的研究［Ｄ］．郑州大学，２０１８．［２］邵帅．Ｓｏｎｉｃ　ｈｅｄｇｅｈｏｇ／ＰＩ３Ｋ／ＡＫｔ信号通路在帕金森病炎症模型中发挥神经保护作用的研究［Ｄ］．广州医科大学，２０１７．［３］赵红，吴晓君，刘赞华，等．局灶性脑缺血大鼠纹状体区域Ｓｈｈ信号通路成分的表达变化及对髓鞘修复的影响［Ｊ］．中风与神经疾病杂志，２０１６，３３（０７）：６２９－６３２．［４］邱伟，徐雁．多发性硬化诊断和治疗中国专家共识（２０１８版）［Ｊ］．中国神经免疫学和神经病学杂志，２０１８，２５（０６）：３８７－３９４．［５］Ｌｉｎ　Ｓ，Ｙｅ　Ｓ，Ｈｕａｎｇ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ｈｏｗ　ｄｏ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ　ｔｈａｔｔｏｎｉｆｙ　ｔｈｅ　ｋｉｄｎｅｙ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ　ｎｅｕｒｏｎ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ＇［Ｊ］．ＮＲＲ，２０１３，８（３０）：２８２０－２８２６．［６］林瑶，杨莎莎，刘婷，等．肉苁蓉对帕金森病模型大鼠ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ蛋白表达的影响［Ｊ］．江西中医药大学学报，２０１９，３１（０１）：８３－８６．［７］蔡克瑞，刘志新，孙晓冬，等．肉苁蓉多糖对Ｄ－半乳糖致衰小鼠脑神经细胞的保护作用及机制［Ｊ］．中国老年学杂志，２０１８，３８（１９）：４７３２－４７３４．［８］Ｌｉ　Ｊ，Ｃｈｅｎ　Ｗ，Ｌｉ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｌｆａｃｔｏｒｙｅｎｓｈｅａｔｈｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ　ｐｒｏｍｏｔｅｓ　ｐａｒｔｉａｌ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｉｎ　ｒａｔｓ　ｗｉｔｈｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　ＣｌｉｎＥｘｐ　Ｐａｔｈｏｌ，２０１５，８（９）：１１１４９－１１１５６．［９］张明亮，刘方洲，吕莹，等．苦参素对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３表达的影响［Ｊ］．中国医院药学杂志，２０１６，３６（２２）：１９７３－１９７６．［１０］Ｊｉｎ　ＹＭ，Ｒａｖｉｖ　Ｎ，Ｂａｒｎｅｔｔ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　Ｓｈｈ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙｉｓ　ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｉｎ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｅｌｌ　ｔｙｐｅｓ　ｉｎ　ｃｏｒｔｉｃａｌ　ｉｓｃｈｅｍｉａ　ａｎｄｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ　ｔｈｅ　ｏｕｔｃｏｍｅ　ｏｆ　ｓｔｒｏｋｅ　ｉｎ　ａｎ　ａｎｉｍａｌ　ｍｏｄｅｌ［Ｊ］．ＰＬｏＳＯｎｅ，２０１５，１０（４）：ｅ０１２４６５７．［１１］ Ｗａｎｇ　Ｙ，Ｉｍｉｔｏｌ　Ｊ，Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．Ｐａｒａｄｏｘｉｃａｌｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｅｕｒａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｐａｔｈｗａｙ　ｓｏｎｉｃ　ｈｅｄｇｅｈｏｇ－ Ｇｌｉ１ ｉｎ　ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ　ａｎｄ　ｍｕｌｔｉｐｌｅｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．［Ｊ］．Ａｎｎ　Ｎｅｕｒｏｌ，２０１０，６４（４）：４１７－４２７．［１２］Ｖａｚｉｎ　Ｔ，Ｂａｌｌ　Ｋ　Ａ，Ｌｕ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｒｔｉｃａｌｇｌｕｔａｍａｔｅｒｇｉｃ　ｎｅｕｒｏｎｓ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ：Ａｍｏｄｅｌ　ｓｙｓｔｅｍ　ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｉｎ　Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ　ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ　Ｄｉｓ，２０１４，６２（８）：６２－７２．［１３］Ｚｈａｎｇ　Ｌ，Ｃｈｏｐｐ　Ｍ，Ｍｅｉｅｒ　ＤＨ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｏｎｉｃ　ｈｅｄｇｅｈｏｇ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ　ｍｅｄｉａｔｅｓ　ｃｅｒｅｂｒｏｌｙｓｉｎ － ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｆｔｅｒ　ｓｔｒｏｋｅ［Ｊ］．Ｓｔｒｏｋｅ，２０１３，４４（７）：１９６５－１９７２．［１４］Ｃｈｅｃｈｎｅｖａ　ＯＶ，Ｍａｙｒｈｏｆｅｒ　Ｆ，Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ　ＤＪ，ｅｔ　ａｌ．Ａｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｇｏｎｉｓｔ　ｉｓ　ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｐｒｏｍｏｔｅｓｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ａｆｔｅｒ　ｉｓｃｈｅｍｉｃ　ｂｒａｉｎ　ｉｎｊｕｒｙ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ　Ｄｉｓ，２０１４，５（１０）：ｅ１４８１．［１５］Ｙｕ　ＰＰ，Ｗａｎｇ　Ｌ，Ｔａｎｇ　ＦＲ，ｅｔ　ａｌ．Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ　ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｄｅｃｒｅａｓｅｓ　ｉｓｃｈｅｍｉｃ　ｉｎｊｕｒｙ　ａｎｄ　ｉｍｐｒｏｖｅｓ　ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｖｉａ　ｓｏｎｉｃ　ｈｅｄｇｅｈｏｇ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ａｆｔｅｒ　ｓｔｒｏｋｅ　ｉｎ　ｒａｔｓ［Ｊ］．ＭｏｌＮｅｕｒｏｂｉｏｌ，２０１６，５４（１）：１－１５．［１６］Ｗａｎｇ　ＹＨ，Ｘｕａｎ　ＺＨ，Ｔｉａｎ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｃｈｉｎａｃｏｓｉｄｅ　ｐｒｏｔｅｃｔｓａｇａｉｎｓｔ　６ － ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｉｎ　ＰＣ１２ｃｅｌｌｓ　ｖｉａｒｅｄｕｃｉｎｇ　ＲＯＳ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｅｖｉｄ－Ｂａｓｅｄ　Ｃｏｍｐｌ　Ａｌｔ，２０１５，２０１５：１８９２３９．Ｅｐｕｂ　２０１５Ｆｅｂ　１８．［１７］Ｃｈｅｎ　Ｊ，Ｚｈｏｕ　ＳＮ，Ｚｈａｎｇ　ＹＭ，ｅｔ　ａｌ．Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ　ｏｆ　ｃｉｓｔａｎｃｈｅｉｍｐｒｏｖｅ　ｌｅａｒｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｍｅｍｏｒｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｔ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｖａｓｃｕｌａｒｄｅｍｅｎｔｉａ［Ｊ］．Ｅｕｒ　Ｒｅｖ　Ｍｅｄ　Ｐｈａｒｍａｃｏ，２０１５，１９（７）：１２３４．

马建玲，陶大勇（1．新疆库尔勒市动物防疫监督站，新疆库尔勒 841000：2：塔里木大学动物科学学院，新疆阿拉尔 843300）摘要：肉苁蓉化学成分复杂，有多种活性作用。本试验利用超声波协助提取、酸提取、醇提取方法提取肉苁蓉生物碱，分刷对小鼠进行灌胃给药，观察内苁蓉提取物对小鼠性激素分泌的影响。结果显示，乙醇提取方法得率最高，肉苁蓉提取物能显著提高小鼠雄激素含量（P＜0.05）。关键词：肉苁蓉；提取物；性激素：雄性小鼠中图分类号：5853.74     文献标志码：A  文章编号：1000-6354（2014）04-0043-03DOI:10.13823/j.cnki.jtcvm.2014.04.014肉苁蓉（Herba Cistanches）属列当科（Orobanchaceae）多 年生高等寄生植物，又名苁蓉、大芸、金笋、地精，是我国名贵中药，主要生长在我国沙漠地带，被誉为“沙漠人参”，肉苁蓉具有补肾壮阳、填精补髓、养血润燥、悦色延年等功效，主治男子阳痿、女子不孕、带下、血前、腰膝冷痛、血枯便秘等症。日前，人们已经从肉苁蓉中分离鉴定出40余种成分，主要的生物活性成分是苯乙醇苷类化合物（PEC）、多糖、生物碱中，肉苁蓉苯乙醇苷粗提取物中除苯乙醇化合外，还含有大量的脂质、鞣质、色素以及无机盐类等，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗衰老、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、增强记忆、助阳等作用中，近年来，国内外学者已对肉苁蓉的形态学、生理学、植物成分功能及人工栽培等方面进行相关研究，但对动物助阳作用的相关研究报道鲜见，因面。有必要从动物实验角度来分析肉苁蓉的助阳机理。1 材料与方法1.1 材料肉苁蓉由塔里木大学动物科学学院陶大勇教授提供。雄性小白鼠由塔里木大学动物科学学院实验基地提供。1.2 仪器与药品KQ-400KDE型高功率数控超声仪：ECH-1型电子控温加热板：旋转蒸发仪RE-52AA：DZF-6051型真空干燥箱：SHB-III型循环水式多用真空泵：T6紫外可见分光光度计：电子分析天平：激素检测试剂盒：阳离子交换树脂：乙醇：HC1：正丁醇：氨水：碘化铋钾试剂；硫酸：吐温-80等。1.3 提取方法1.3.1 超声波协助提取法 称取500g肉苁蓉筛选后样品，放入5L广口瓶中，分2次加入2000ml蒸馏水，每次1000L，浸泡1h后置于超声仪中超声提取。温度设定为20℃，时间为20min。将提取液置于真空泵中抽滤，将提取的2000ml提取液置加热板上，190℃加热浓缩到200mL以内。将浓缩后的提取液置500mL分液漏斗中，用等量正丁醇萃取，每隔3h更换一次萃取液，反复5次。将正丁醇回收，在500mL分液漏斗中加入200mL回收正丁醇和200ml硫酸，3h更换一次液体，反复5次。将萃取后的下层液体分装3个小烧杯中，置电子控温加热板上，70℃蒸干，备用。1.3.2 酸提取法 称取500g肉苁蓉筛选后样品放入5L广口瓶中，加入1000ml0.1mol的HC中浸泡24h，真空泵中抽滤。再加入1000ml．0.1mol的HC1浸泡24h，抽滤。将酸浸泡过的滤液经阳离子交换柯脂处理。先将浸泡液用1mol氨水洗涤至碱性，再用蒸馏水洗涤至中性，后用0.1 mol 盐酸洗涤至酸性（用pH试纸测定）。最后用1mol的氨水清洗，待清洗液为碱性时用试管接取清洗液，每盛一试管即取出一滴滴在薄层层析用的硅胶板上，再加一滴碘化锦钾试剂、持出现红色晕圈时开始收集，直到晕圈消失为止。把收集到的液体分装到5个小烧杯中，置于真空干燥箱中，70℃真空干燥，备用。1.3.3 醇提取法 称取筛选后肉苁蓉样品500g，放入5L广口瓶中，加入2000ml75％乙醇，分3次浸泡24h，于循环水式多用真空泵中抽滤。将滤液于旋转蒸发仪中，温度65℃，蒸发12h。再把提取液置循环水式多用真空泵中抽滤。滤液放入旋转蒸发仪中蒸发，转速设定为30t／min。温度60℃例，将剩余液体分装3个平腿，置真空干燥箱中．70℃真空干燥，备用。1.4 动物分组及用药随机选取健康雄性小白鼠16只，随机分成4组，每组4只。第1组为对照组，其余3组为试验组，将3种不同提取方法提取的生物碱溶于100ml蒸馏水中，用吐温-80助溶，其中对照组用蒸馏水，第2组用超声波协助提取物，第3组用酸提取物，第4组用醇提取物。试验组和对照组均灌胃给药，早晚各1次，每次0.5ml。小鼠自由活动，自由采食，自由饮水。连续给药4周。1.5 米血用药4周后，对照组和试验组小鼠眼球采血，分别放入4个5mL离心管中，3000shmin离心10mim。吸取血清。随即用激素检测试剂盒进行检测。1.6 小鼠质量及活力现察在实验初期和末期分别逐只称重观察小鼠质量变化，每天饲喂时观察小鼠行为变化。1.7 小鼠性激素水平测定方法本试剂盒应用双抗体夹心法测定祥本中小鼠性激素水平。用纯化的小鼠性激素抗体包被微孔板，制成固相抗体，向包被单抗的微孔中依次加入ET.FSH、LH激素，再与标记的激素抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物品色。在酶的催化下转化成蓝色，井在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的性激素水平呈正相关。用酶标仪在450mm波长处测定吸光度值，计算激素含量。2 结果及分析2.1 肉苁蓉生物碱提取率不同提取方法提取肉苁蓉生物碱结果见表1。从表1可以看出，乙醇浸提法效果最佳。表1 肉苁蓉生物碱不同提取方法的提取率／％Table 1 Extract rate of Herba Cistanches alkaloid with different extraction methods/%乙醇提法超产波协助提取法盐酸浸提法0.0800.003 20.002.82.2 小鼠活力观察给药前常规喂养，小鼠安静，嗜睡，未出现争抢食物现象。给药后，小鼠活泼好动，争抢食物，一周后采食量、饮水量增加，排类量也随之增加。2.3 小鼠质量变化肉苁蓉生物碱处理前后小鼠质量变化结果见表2。表2 肉苁蓉生物碱处理前后小鼠质量变化／gTable 2 Mice bodyweight changes before and after treatment/g组别用药载质量用药后质量总增日增重对照组35,462535.79250.3300.0118第2组36.132537,75251.6200.0579第3组36.105038.19002.0850.0745第4组35.375037.07501.7000.0607注：同列数据右肩标不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。Nate Date is se efs wih diffeent superript differed significanaly(P<0.05).从小鼠活力观察和质量变化可以看出，小鼠用药后质量增加明显（P＜0.05），表明肉苁蓉提取物对小鼠机体无明是的毒副作用。2.4 内苁蓉生物碱对小鼠性激素含量的影响肉苁蓉生物碱对小鼠性激素含量影响结果见表3。表3 肉苁蓉生物碱对雄性小似性激素水平的影响Table 3 Effect of Herba Chtanches extract on sex hormone level in male mice组别小以数 第二醇摩丸丽促性腺激素黄体生成素只Paot-Lma-LuaLmu*mL对照组439.8580.8618.7513.45第2组413.28115.8646.4013.10第3组414.66107.5241.2513.23第4组415.25101.7338.7613.31注：同列数据右肩标不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。Natise Date in ane coln ih diferent auperseript differed wignificanly(Pc0.05)由表3可见，试验组小鼠雌二醇水平（E）下降明显（P005，皋丸酮（D）、促性腺激素（FSH）水平升高明显（P＜0.05），黄体生成素含量（LH）变化不显著，提示肉苁蓉提取物对雄性小鼠性激素水平有明显影响，主要作用于E，T.FSH。

张可，马旭，韩淑燕＇，李海霞＇，姜勇＇，马治中＇，韩力2，屠鹏飞！1．北京大学药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室，北京1001912．日本Fancl珠式会社基础研究院，Kanagawa 244-0806，Japan中文摘要：肉苁蓉是最常用的补益、抗衰老中药之一。多部中医药古籍都记载肉苁蓉具有“补精血”、“益髓”、“延年”等功效。但这些临床经验仍未得到系统的、完整的实验研究证实。为了阐明肉苁蓉抗衰老和延长寿命的作用及机理，本课题采用国际上常用的衰老模型，快速老化鼠（senescence accelerated mouse，SAM），系统研究分析肉苁蓉及其有效部位提取物对SAM鼠衰老免疫、平均寿命的作用及其机理。结果显示，肉苁蓉提取物、总寡糖和总苷既能逆转衰老动物SAM-P8小鼠的免疫缺陷，显著增加血液Sca-1阳性细胞，初始性T细胞（Naive T），自然杀伤细胞（natural killer，NK）比例。P＞0.05-0.01．高剂量和中剂量的肉苁蓉提取物能够显著降低血清IL-6的含量，P＜0.05．，又能抑制衰老动物过亢的慢性炎症过程。中剂量（≈150mg／kg）和高剂量（≈450mg／kg）肉苁蓉提取物能够显著延长SAM-P8小鼠的平均寿命，通过Kaplan-Meier 生存寿命分析（Kaplan-Meier survival analysis）.P值均小于0.001。结果说明，肉苁蓉提取物能够延长快速老化鼠（SAM-P8）的平均寿命（averagelife span）。而对各组动物体重，平均摄食量与血压无明显影响。作用机制的研究显示，肉苁蓉提取物（ECD）能显著抑制骨髓单核细胞的死亡，抑制SAM骨髓细胞线粒体ROS的释放，DNA损伤程度显著受到抑制，P＜0.001。改善骨髓间质细胞的形态。促进IL-7的分泌。证明了肉苁蓉不仅有保护衰老骨髓单核细胞，减少死亡的作用，还有显著地促进骨髓细胞增殖的作用。中剂量和高剂量肉苁蓉提取物组对p16，p53与p21均显示显著的抑制作用，肉苁蓉总苷组（ECD-PGs）组也具有明显地抑制p16，p53与p21表达的作用。【关键词】肉苁蓉；免疫衰老；寿命；骨髓；快速老化鼠；

功能性子宫出血是妇科常见病，由内分泌失调所致。我们自1990年以来，以明代王肯堂《证治准绳＞中的肉苁蓉丸（由肉苁蓉、菟丝子、熟地、五味子组成）加味治疗本病58例，取得满意疗效，现报告如下：1 一般资料本组58例．年龄14～20岁者24例．21～44岁者14例．45～53岁者20例。病程6个月～3年。主要临床表现为月经周期系乱·行经期延长，月经量多的异常性子宫出血，子宫出血时间达2周以内者23例．2周至1个月者20例．1个月以上者15例。出血量以市售妇女卫生巾包数计算，每次月经用3～5包者33例，6～8包者20例．8包以上者5例。其中有曾用性激素、止血敏、安络血治疗者19例，中药治疗者8例，刮宫治疗者4例．均无效。本组病例皆由妇科检查，做B超或病理检查，排除器质性病变，确诊为功能性子宫出血。经2～3个周期基础体温（BBT）测定，其中42例呈现不规则单相型。2 治疗方法以补肾固冲任为治则.以肉苁蓉丸加味为基本方：肉苁蓉 菟丝子 熟地 女贞子早莲草 补骨脂 黄精各30g 仙茅淫羊藿各20g 五味子15g。水煎服。10天为1疗程。出血时服用上方剂量．日服1剂，水煎2次，分3次服；血止后逐渐减量1／3～1／2．水煎分2次服-服至2个疗程。临证加减：兼血热者加黄连、栀子；兼气血亏者加党参、阿胶；兼肝郁气滞者加柴胡、佛手：兼察血者加红花、益母草等。3 治疗结果3.1 疗效标准 显效：血止，、经期、经量正常（用卫生巾2包左右），行经天数5～7天．停药后3个月病情未复发者；更年期患者治疗后月经周期延长，经期、经量同上，或稀发至闭经者，BBT呈不典型双相或双相曲线变化。有效：血止，经期缩短为10天以内，经量减少1／3～1／2．停药疗效不能维持3个月．服用上药仍有效者-BBT基本呈不典型双相或双相曲线变化。无效：服药2～3个月后，病情无明显好转.BBT仍呈单相者。3.2 治疗结果 本组58例中显效39例·占67.2％：有效16例-占27.6％；无效3例·占5.2％，总有效率为94.8％，服药止血时间．3剂血止者27例，4剂血止者14例．6剂血止者8例．8剂血止者．4例．10剂血止者2例。血止后逐渐减量，继续服用，巩固疗效，疗程最短者2个疗程，最长者8个疗程。各年龄组疗效见附表。备年龄红疗设表年龄 例数显效有效无效14～20岁 24204021～44岁1486045～53岁 201163合 计 58 39（67-29） 16（27.650） 3（5.20）附 典型病例（略）4、讨 论功能性子宫出血（简称功血）分无排卵型与排卵型，前者约占83％～90％，后者少见。一般为无排卵型功血，多见于青春期或更年期。功血主要原因为下丘脑-垂体一卵巢轴功能紊乱，即下丘脑LHRH（促性腺释放激素）释放，垂体促性腺素的紊乱，靶腺组织LH（黄体生成激素）受体、FSH（促卵泡成熟激素）受体缺乏，肾皮质激素代谢不全等所致。本病属中医崩漏范畴.肾主生殖，为先天之本，肾上通于脑，下连冲任面系胞宫。正常月经有赖于肾气一天癸一冲任一胞宫这一系统的相互调节及制约。肾气控制天癸的功能，肾气全盛，冲任脉通，经血渐盈，应时面下，肾气虚则影响此系统完整性，可致胞宫的功能失调而出现不正常的出血。冲为血海，任主胞胎，隶属于肾，故本病主要病机为肾虚冲任不固。青春期宫血是肾气未充，天癸初至，冲任不盛所致；更年期功血为肾气衰耗，天癸将竭，冲任虚衰而成；育龄期功血多因肝郁肾虚，冲任不调所致。故治疗多拟补肾调摄冲任之剂.方用肉苁蓉丸加味为基本方随证加减，方中肉苁蓉、淫羊藿、仙茅、补骨脂益肾气，温肾阳，固冲任；配菟丝子、熟地、女贞子、旱莲草、黄精滋阴补肾，以增强调摄冲任之功；佐五味子酸收以固摄，滋肾益气；同时旱莲草、熟地又能凉血、止血、补血。如此补肾气，调阴阳，固冲任而兼止血，标本兼顾，塞流与澄源并举，可加速止血，恢复正常月经周期。据现代药理研究表明，肉苁蓉、菟丝子、仙茅、淫羊藿，能使垂体前叶、卵巢、子宫重量明显增加，提高垂体的兴奋性和反应性。五味子、地黄、肉苁蓉、淫羊藿，对垂体一肾上腺皮质轴具有兴奋或调节作用，能保护皮质激素的一些生理效应；同时五味子对中枢神经系统既能增加兴奋性，也加强抑制过程，促进二者的平衡，提高大脑皮层的调节作用，因此有利于下丘脑一垂体一卵巢轴功能的调节。早莲草、地黄、肉苁蓉、补骨脂有良好的止血作用。全方配伍，标本兼固，故疗效颇显。（收稿日期：1995-07-03）

摘要 首次从列当科植物荒溪肉苁蓉Cistanche deserticola Ma新鮮花序的正丁醇萃取物中分离並鉴定了4个化合物，即6-去氧梓醇（6-deoxycatalpol，1）、黑立雕素甙（liriod-endrin，1）、B-表马钱子酸葡萄糖式（8-epiloganie acid，I）和半乳糖醇（W），其成分与肉质茎基本相同，为肉苁蓉花序的开发利用提供了一定的依据。关键调肉苁蓉列当科环烯酸話式木脂素武肉苁蓉为列当科寄生植物荒漠肉苁蓉Cistanche deserticola Ma去花序的肉质茎，具有补肾阳，益精血，润肠通便的功效。由于大量采挖，资源濒于枯竭，被国家列为二级保护植物。为了合理利用肉苁蓉资源，变废为宝，我们对肉苁蓉的花序进行了初步的化学成分研究。从正丁醇萃取部分分离鉴定了4个化合物，分别为6-去氧梓醇（6-deoxycatalpol，I）、黑立脂素甙（liriodendrin，1）、8-表马钱子酸葡萄糖甙（8-epiloganic acid，I）和半乳糖醇（N），以上4种成分都是首次从该部位中分离得到。其化学成分与肉质茎基本一致（1），可考虑作为肉苁蓉资源进行开发利用。1 材料和仪器肉苁蓉C，deserticola Ma的鲜花序系作者在内蒙古阿拉善左旗吉兰泰盐场附近向牧民收购并鉴定。Kofler型熔点测定仪（未校正）；红外光谱仪为：Perkin-Elmet 983G，核磁共振谱仪：＇H-NMR；Bruker 400MHz， ＇C-NMR，JEOL FX-90Q，22.5MHz， 质谱仪 为：ZAB-HS，FAB测定底物为S-GLY；GC-MS；GMS-3000。2 提取和分离肉苁蓉鲜花序15kg，切碎，水蒸气蒸馏，得蒸馏液5L（供GC-MS析用）和水液8L，将水液浓缩到3000ml，用EtOAc萃取（1000mlx3），除去脂溶性成分，萃取后的水液再用BuOH萃取（1000mlx6），将BuOH回收至干，得BuOH萃取物40g。将BuOH萃取物经反复硅胶柱层析，用CHCl1-MeOH（9：1）至CHCI4-MeOH-H2O（6：410.5）程序洗税，得化合物1～N。3 鉴定品1：无色方晶（MeOH），mp204～206°℃； IRvKcm-＇；3400（OH），1640, FAB-MS m/z: 347( M+1)*,364(M+H2O)*,'HNMR(300MHz, D2O)oppm:1.36~1.50( 1H, m, Ca-H ), 2.19( 1H, m,C,-H),2.37(2H, m,Ca,a-H),3.63(1H,C,-H),3.75,4.19(2H,AB systeM,J=13Hz,C16 H),4.73(1H,d,J=8Hz, anomeric H),4.9~5.0(2H,m,C1,-H),6.19 (1H,d,J=6Hz, C,-H),'"CNMRðppm:141.9(C3),108.3(C4),101.1(C'), 96.9(C1),78.7 ( Co' ) , 78.2 ( C2' ), 75.3( C2' ) , 72.0 (C4' ) , 71.4 (C,),64.0（C，），63.1（Co，＇），44.8（C。），36.6（C），33.3（Co）。以上数据与文献C2）中6～去氧梓醇的一致。晶I：白色粉末（MeOH），IRvcm-＇，3400（OH），1590,1495；＂CNMR8ppm,153.5(C', 2,? ) ,138.5 ( C2', ),134.3(C', ),104.9(C',', ,",。"), 103.8(gluC1), 86.1(C2','').77.8(gluC.),77.2(gluC,),75.2 （gluC1），72.4（Ca，．），70.6（gluCa），61.8（gluCa），54.6（C1,8）。以上数据与文献（3）中黑立脂素甙的一致。晶I，无色计晶（MeOH），mp146～149℃，IRvKcm-：3400（OH），2080～2500,1680,1640,1430; FAB-MS m/z:377(M+1)+; 'HNMR,(300MHz,C,D,N) 8ppm;1.16(3H,d,J=7.2Hz,CH3),2.25~2.40(2H,m,C,-H),2.26(1H,m , C,-H), 3.06(1H, s,Ca-H);'"CNMRδppm;169.6(Cn), 150.6( C.),114.5 (C.) , 100.4( C' ), 95.7 (C1), 78.6(C, :', ),74.7(C2'),71.4(C),62.8 （C，＇），44.7（Co），42.3（C，），41.3（C，），30.5（C，），74.3（C1o）。以上数据与文献（4）中8-表马钱子酸葡萄糖甙的一致。晶N：无色针晶（ MеOH ）， mp169～171°℃ ， 1Rvcm-＇， 3280（OH），1440,1075,1010:'HNMR ( 300MHz, C,D,N)δрpm; 3.68(2H, ч, С,ь-H), 3.71~3.82(4H,m,C,--H),3.87(2H,dd,J=11.5,2.7Hz,Ca,-H);ac-NMRδppm，70.8（Ca，4），69.2（C2，s），63.2（C，．）。以上数据与文献（5～7）中半乳糖醇的一致。致谢：本棱波潘室、军事医学科学院波语宣代测信磁共振谱，北京大学波语室代测质谱，本院仪器中心代测红外光谱。

肉苁管肉质肥厚、鳞片均匀、油性充足，药用价值高，滋补疗效强，义生于沙漠附近，有“沙漠人参”之美称，肉苁蓉柔软如肉，性用和缓从客，故名肉苁蓉。《本草纲目》云：“此物补而不峻，故有从客之号。从客，和缓之貌。”《本草原始》云：“皮如松，梢有鳞角，形柔软加肉，故吴普名肉松蓉。”        本品含有甜菜碱，B-谷甾醇、胡萝卜苷，三十烷醇，咖啡酸糖脂、甘露醇，硬脂酸及锌。锰、铁、铜等微量元素、多糖和微量生物碱。肉苁蓉在我国的药用历史已经有2000年，始载于《神农本草经》，在古典《本草经疏》《本草汇言》等诸多古籍中多有记载和论述，是我国传统的名贵中药材、肉苁蓉性味甘，咸温，有补肾阳，益精血，润肠通便等功效，也是历代补肾壮阳类处方中使用频度最高的补益药物之一，适用于男子阳痿、早泄、造精、性欲减退、遗尿，神经衰弱及女子不育，白带过多、月经不调，贫血萎黄等症，同时，肉苁蓉还可治阴血不足、大便秘结、习惯性便秘、肾炎、膀胱炎，膀胱出血，肾出血和高血压等症。既可壮阳，又可补阴，久服可延年益寿。肉苁蓉含有丰富的生物碱，结晶性的中性物质，氨基酸，微量元素，维生素等成分，能显著提高小肠推进速度，缩短通便时间，同时对大肠的水分吸收也有明显的抑制作用，从而促进粪便的湿润和排泄，具有真正的润肠通便作用，肉苁蓉还有抑制脂质过氧化提高抗氧化酶活性，增强机体耐受能力，提高记忆力和抗辐射等作用。苁蓉芡实兔肉汤用料：兔肉100克，肉苁蓉，芡实各30克。做法：1、兔肉洗净，斩件，肉苁蓉略浸，切片：芡实洗净，清水浸半小时。2．把全部用料放入锅内，加清水适量，武火煮沸后，文火煲1小时～2小时，调味供用。功效，补肾涩精，抗衰延寿。适应症：早衰及老年肾虚者。症见筋骨瘦弱，腰膝冷痛，小便频数，或小便混浊，早衰阳痿遗泄，妇女脾肾虚弱之带下。每次6克一15克，适宜性功能衰退的男子目络无 主产于内蒙古，新疆、甘肃和青海等地