森病细胞损伤模型有保护作用，其作用机制为肉苁蓉提取物通过降低GADD153（生长抑制DNA损伤基因153）蛋白的表达来实现。也有研究发现肉苁蓉提取物能抑制PD小鼠黑质中多巴胺能神经元的减少，并且减少细胞凋亡、降低Bax／Bd-2mRNA及蛋白的比例，也可通过抑制PD大鼠纹状体及海马的细胞外液中单胺类神经递质含有量减少，发挥治疗PD作用［口）。其中B-sitosterol为2种中药的共同有效成分，研究表明其可以影响凋亡、炎症、血管生成等多种信号通路，有着治疗PD的潜在作用。本研究使用网络药理学研究方法，筛选山茱萸-肉苁蓉有效化合物22种，并预测出这些化合物可能作用于帕金森病的19个靶点，包括多巴胺受体（DRD2、DRD3、DRD4）、多巴胺转运体（SLC18A2、SLC6A3），乙酰胆碱酯酶（ACHE）、血管紧张素转化酶（ACE）、蛋白激酶（AKT1）、大麻素受体1（CNR1）、乙醇脱氢酶IC（ADHIC）、5-羟色胺受体（HTRIA，HTR2A）、丁酰胆碱酯酶（BCHE）、超敏反应蛋白（CRP）等，各靶点间有很强的相互作用，主要涉及多巴胺能神经元功能、乙酰胆碱系统、炎症反应、神经毒性等生理病理改变。帕金森病主要病理改变为黑质多巴胺能神经元变性死亡，而多巴胺作为脑内重要的神经递质，主要通过不同亚型的多巴胺受体调控人体运动功能、认知活动等生理或病理过程，其中DRD2表达神经元通路，起到调节运动的作用）；DR的含有量与树突棘密度相关，DA受体的激活可以调节轴突结构，维持大脑正常功能，DR通过调节神经递质释放、调节释放频率等调节神经元的兴奋性；多巴胺转运体在多巴胺（DA）转运过程中发挥了关键作用，当这些信号通路的功能紊乱时可引起帕金森病，因此多巴胺受体、多巴胺转运体靶点为治疗帕金森病的主要靶点。SLC6A3基因编码的多巴胺转运体（dopamine transporter，DAT）在多巴胺（DA）转运过程中发挥了关键作用。ACE主要与血压调节有关，但有研究表明ACE抑制剂可增加纹状体多巴胺水平和减少神经元坏死，对PD模型有保护作用，也是潜在的抑郁治疗靶点（㎡）。最新研究表明血清BChE活性可作为PD生物标志物，与帕金森病也有密切关系［）。CRP主要与炎症相关，而炎症反应与帕金森病的发病和发展具有密切相关性。HTRIA在抑郁症及部分精神系统疾病的发病机制中起着重要的作用，可能是导致帕金森后期合并抑郁症的重要原因（］。由此可以看出上述靶标主要与神经元功能、多巴胺受体及转运体、炎症等诸多因素相关，既说明帕金森病的致病因素复杂，又说明山茱萸-肉苁蓉药对通过调节巴胺能神经元功能和乙酰胆碱系统的功能、抑制炎症、减轻神经毒性等方面治疗帕金森病。为了详细的探究山茱萸-肉苁蓉有效化合物成分治疗PD的生物学过程、分子功能、细胞成分和信号通路，将山茱萸-肉苁蓉与PD相关的19个基因进行GO分析和KEGG分析。通过GO富集分析发现山茱萸-肉苁蓉药对治疗帕金森病主要生物过程（BP）与多巴胺分泌的调节、多巴胺代谢过程的调节、化学性突触传递、突触传递负调控、5-羟色胺受体信号通路、G蛋白偶联受体信号通路、细胞钙离子稳态、行为控制等主要生物过程相关。其中在多巴胺分泌的调节与多巴胺代谢过程的调节与治疗帕金森的相关机制密切相关，因帕金森病主要是多种原因导致多巴胺能神经元损伤、凋亡，最终纹状体内多巴胺浓度下降，导致大脑反馈调节失衡而发病。因此作用于多巴胺能系统的药物，可通过激动多巴胺受体、多巴胺转运体等可有效控制帕金森病（2）。在G蛋白偶联受体信号通路中，有研究发现在PD小鼠模型中，雷诺昔芬与G蛋白偶联雌激素受体30结合发挥抑炎作用，可抑制炎症通路，降低相关炎症因子水平，从而抑制PD的慢性炎症进展。表明G蛋白偶联雌激素受体（GPR30）参与雌激素在PD炎症中具有抗炎、神经保护等作用（）。在5-羟色胺受体信号通路中，范玲玲等2研究发现5-H17受体激动剂可能以多种方式调控着内侧前额叶皮层（mPFC）锥体神经元的电活动，且黑质纹状体通路的退化易导致mPFC锥体和中间神经元上5-HT7受体出现功能紊乱。这为5-HT7受体参与PD病人并发的抑郁、焦虑等症状提供了功能学和细胞学的解释，也为PD治疗开辟了新的研究方向。分析CO富集结果发现山茱英-肉苁蓉的生物过程中主要与DRD2、DRD3、DRD4、SLC18A2、SLC6A3，HTRIA，HTR2A基因相关，说明山菜英-肉苁蓉可能通过对多巴胺受体、5-羟色胺受体这两个靶点来治疗PD。相关研究表明，HTR2A受体的拮抗剂在帕金森病模型上能够减轻左旋多巴所致药物不良反应（；部分DRD2激动剂不仅能改善PD的运动症状，且引起运动障碍和精神性疾病的副作用的概率较低（），说明中药在防治PD中有很好应用前景。GO富集分析中分子功能涉及多巴胺的结合、多巴胺神经递质受体活性，通过Gi／Go耦合、多巴胺神经递质受体活性、酶的结合、乙酰胆碱酯酶活性、胆碱酯酶活性、胆碱结合等。GO富集分析中细胞成分主要涉及轴突、树突、（神经元的）突触、突触后膜、质膜、薄膜、膜筏等，主要涉及神经信号传递、神经元的组成及功能等。通过基因KEGG通路富集分析得出山茱英-肉苁蓉防治PD主要调控多巴胺能神经突触、神经活性配体-受体相互作用、cAMP信号通路、缝隙连接、5-羟色胺能突触、信号通路、帕金森疾病等9条相关信号通路发挥作用，表明山茱萸-肉苁蓉化合物的作用靶点有多条通路，可通过各通路协调作用治疗帕金森病。在多巴胺能神经突触、神经活性配体-受体相互作用、信号通路这3条神经递质相关通路中，可能通过作用于多巴胺受体［、多巴胺转运体、大麻素受体1、5-羟色胺受体来治疗PD，也可能通过增加多巴胺神经元的数量，减轻黑质多-纹状体巴胺能通路的变性，维持多巴胺水平的稳定。在cAMP信号通路中，环核苷酸（cAMP）作为中枢神经系统细胞的第2信使，对神经系统活动起调节作用，包括神经元的存活、树突和轴突的生长、神经元的发育和认知。Wu等［2利用PD模型小鼠进行细胞试验发现，下调miR-200a可导致AKT、cAMP、PKA表达降低，而DRD2、CREB表达升高，说明下调miR-200a通过阻断cAMP／PKA信号通路，可增加DRD2表达，抑制纹状体细胞凋亡进而有效控制PD。韩雪峰等［2］研究发现上调cAMP 信号通路可使列当中 Crenatoside（黄药苷）对D-半乳糖诱导的PC12 神经细胞损伤有明显的保护作用。山茱萸-肉苁蓉的有效化合物可通过调节神经元的发育、神经元的存活、树突和轴突的生长、保护受损神经等生理过程发挥治疗PD的功能。在缝隙连接信号通路中，缝隙连接通道可通过对抗细胞间电阻，实现细胞间的兴奋传递。缝隙连接蛋白43（Cx43）是中枢神经系统（CNS）中含有量较多的连接蛋白，并以缝隙连接（gap junction，GJ）和半通道（hemichannel，HC）的形式存在，并介导细胞内外的信息交流与细胞间的信息交流。大量研究表明Cx43GJ和HC的改变推进了神经退变疾病进程［；PD患者可因黑质胶质细胞激活，导致大量的促炎因子表达（如IL-1B、TNF-a、INF-y），炎症因子最终导致星形胶质细胞Cx43GJ的改变加快PD患者病程进展（）。研究发现川在PD动物模型中，总Cx43mRNA水平与星形胶质细胞Cx43的免疫活性增加明显，表明Cx43HC活性增加与PD的发病相关。山茱萸-肉苁蓉药对的有效成分对PD的治疗可通过抑制促炎因子的表达，减少星形胶质细胞Cx43的改变而发挥作用。综上，本研究使用网络药理学方法对山茱萸-肉苁蓉药对治疗PD的主要化合物、靶点、通路等进行详细分析，初步验证了山茱英-肉苁蓉药对治疗PD的主要机制，为下一步进行深入研究其作用机制提供理论基础。本研究结论仅依靠网络药理学方法对相关数据库进行挖掘得出，虽然通过相关文献验证了结论的可靠性，但下一步仍需通过动物实验验证其主要作用机理，以期为临床治疗PD提供思路。

注：列表1为山茱英-肉苁蓉靶点；列表2为帕金森疾病靶点。图1 韦恩图注：红色节点为药物；绿色节点为山茱英-肉苁蓉化合物：蓝色节点为作用靶点。图2 药物-化合物-靶点互作网络图图3 山茱萸-肉苁蓉靶点的蛋白互作网络图2.7 山莱萸-肉苁蓉对帕金森病作用 靶点的GO富集分析和KEGG 通路富集分对山茱英-肉苁蓉作用于帕金森的19个相关靶点通过David数据库进行分析，主要包括3方面，即生物过程、分子功能、细胞成分，取P（P＜0.05）值排列前15的条目所对应靶点具有的功能信息，使用GmphPad Piism7软件将筛选的条目制作成可视化条形图，见图4。再对上述19个靶点进行KECG通路富集分析，得到P＜0.05的通路有9条，通过Omieshare软件进行可视化分析，结果见图5。图4 GO 富集分析4讨论研究发现山茱萸中主要含有环烯醚萜苷类、鞣质、黄酮、有机酸、多糖类等多种成分”。徐一达川最新研究发现山茱萸中的马钱苷不仅抑制PD小鼠纹状体内多巴胺和TH表达，也抑制小鼠黑质内小胶质细胞和星形胶质细胞的活性，使caspae-3、TNF-a及其上游调控因子NF-kB、p38和c-Abl的表达下降，主要机制可能是马钱苷抑制胶质细胞的聚集及激活、抑制炎症因子的表达、通过c-Abl-p38-NF＊B通路来抑制细胞死亡，同时可以影响细胞的自噬来增强神经细胞的生存能力，进而起到治疗PD的作用。肉苁蓉含有苯乙醇苷类、环烯醚萜苷、木质素类等多种成分，其有效成分可以产生抑制神经细胞凋亡、增强免疫、抗氧化、抗衰老等作用（。王虎等［间］研究肉苁蓉提取物对帕金

于迎春，赵阳，梁素萍，郑景辉＊（广西中医药大学附属瑞康医院，广西南宁530001）摘要：目的 使用网络药理学方法对山茱英-肉苁蓉治疗帕金森病的作用机制进行研究。方法 依据中药系统药理学技术平台（TCMSP）数据库以化合物的口服药物生物利用度（OB）、类药性（DL）和血脑屏障通透性（BBB）为标准筛选山茱萸-肉苁蓉的化合物，运用BATMAN-TCM（中药分子机制生物信息学分析工具）对筛选出的化合物可能作用的靶点进行预测，通过GeneCards数据库检索与帕金森病相关的基因。借助 Cytoscape 3.5.1软件构建药物-化合物。靶点网络图，运用STRING平台构建相关靶点蛋白相互作用网络图，通过生物学信息注释数据库（DAVID）对靶点基因本体（GO）进行富集分析及基因组百科全书（KEGG）进行通路分析。结果 从山茱英-肉苁蓉中共筛选得到21种有效成分，与帕金森病相关的靶点有19个，主要涉及多巴胺能神经元功能、乙酰胆碱系统和炎症等方面的调节作用。主要的KEGG通路为多巴胺能神经突触、神经活性配体-受体相互作用、cAMP信号通路、缝隙连接、5-羟色胺能突触、信号通路、帕金森疾病等。结论 山茱英-肉苁蓉药对治疗帕金森病的可能机制是调控多巴胺能神经突触、神经活性配体-受体相互作用、cAMP信号通路、缝隙连接、5-羟色胺能突触、信号通路等。关键词：山茱萸-肉苁蓉；帕金森病；网络药理学；机制中图分类号：R285.5      文献标志码：B     文章编号：1001-1528（2020）11-3034-07doi:10.3969/j.issn.1001-1528.2020.11.041帕金森病（Parkinson＇sdisease，PD）是一种进行性、多灶性神经退行性疾病，约1％的60岁以上人群受其影响，其发病率随年龄增长逐渐升高。目前，PD的病因未明，其具体发病机制尚不明确，主要认为与神经炎症、氧化应激、基因突变、免疫学异常、细胞凋亡、线粒体损伤等有关1。临床上PD最常用的治疗方案是多巴胺替代疗法，但只控制临床运动症状，不能阻止疾病的进展，且长期的药物治疗可能导致严重的、不可逆的运动并发症。其他治疗方法主要包括外科治疗，如毁损手术、脑深部刺激等，干细胞疗法5），中医针灸、运动疗法、音乐疗法等辅助疗法治疗PD，但均不可以彻底治愈。山茱萸-肉苁蓉药对来源于地黄饮子，出自于《黄帝内经·素问·宣明论方》，为补肾化痰名方，具有滋阴、补阳、开窍化痰之功效，山茱萸、肉苁蓉阴阳并补，共为君药，两药相使为用，发挥功效，其中山茱英具有补益肝肾、收涩固脱等功效，现代药理学研究表明其具有明显的抗氧化、抗炎杀菌、降血糖等功效。肉苁蓉具有补肾阳、益精血、润肠通便之功效，现代药理学研究表明肉苁蓉具有神经细胞保护、抗氧化、抗衰老、调节免疫等作用。目前山茱萸-肉苁蓉药对在临床治疗帕金森病中广泛应用，但其治疗帕金森的确切机制尚不明确，本研究采用网络药理学的方法，通过相关数据库对山茱萸-肉苁蓉药对所包含的有效成分及作用靶点进行筛选，并将其靶点与帕金森疾病靶点进行匹配，筛选出山茱英-肉苁蓉治疗PD相关的关键作用靶点，并进一步分析其治疗PD的物质基础和作用机制。1 材料与方法1.1 山莱萸与肉苁蓉药物成分信息获取及整理 使用中药系统药理学数据库和分析平台（traditional Chinse medicinesystems pharmacology database and analysis platform,TCMSP) 收集中药山茱萸、肉苁蓉的化合物，并以口服生物利用度（oral binavailability，OB）≥30％、类药性（drug likenem， DL）≥0.18，因有研究发现帕金森病患者血脑屏障受损），故设定血脑屏障通透性（BBB）≥-0.85，为限定条件对所收集到的化合物进行筛选，将最终筛选出的化合物建立有效化合物数据库。1.2 山茉萸-肉苁蓉药对作用靶点的预测 运用中药分子机制生物信息学分析工具（a bioinformatios analysis tool formolecular mechanism of traditional Chinese medicine, BATMAN-TCM)(http://bionet.ncpsb.ong/batman-tcm/in-dex.php／Home／Index／index）对运用TCMSP筛选出的山茱英-肉苁蓉药有效化合物作用靶点进行预测。1.3 有关帕金森病相关基因捧选 将“Parkinson＇。disease”作为检索词，通过GeneCands数据库（https：／／www.genecank.org／）检索帕金森病相关靶点。GeneCank数据库通过Gifts算法，能够准确计算靶点与疾病的相关度，并按照相关度进行评分排序。本研究选取其中最低分超过20分的前237位靶点进行研究，其中最高分 146.47分，并摘录相应的靶点的标准基因名。1.4 山茉萸-肉苁蓉对帕金森病作用靶点的预测及PPI网络构建 首先将预测所得的山茱萸-肉苁蓉药对作用靶点与筛选出的帕金森相关发病靶点导入 VENNY21（http：／／bioinfogp．enh esie.es／toots／venny／index.hml），得出两者共同靶点，即可能作用于帕金森病的靶点。后将所得共同靶点与其化合物相对应，使用Cytoscape 3.6.1软件做出化合物-靶点图。并将山茱英-肉苁蓉药对作用于帕金森病的靶点上传至STRING 10.5数据库中（https：／／string-dh.org），选择研究物种为“Homo-sapiens”（智人），设定靶点间最低联系分数为0.4分，隐藏无相互关联的靶点，获得靶点联系网络图，最后将该图导入Cy-toscape 3.6.1 软件中构建PPI网络图。1.5 山茉萸-肉苁蓉对帕金森病作用靶点的CO分析和KEGG分析 将山茱萸-肉苁蓉对帕金森病作用靶点导入DAVID Bioinformatics Resources 6.8数据库（https：／／david． nciferf.gow／summary.jp），选择其中分子功能（moleeular function），生物过程（biologica proces）和细胞成分（celIular component）3项对山茱英-肉苁蓉作用于帕金森病的靶点进行GO富集分析，筛选具有显著差异的生物过程及可靠的靶点通路，并且使用GraphPad Prism 7软件将 CO富集分析满足P＜0.05的结果做成可视化条形图。选择KECG进行靶点基因通路注释分析，将得到的结果且满足P＜0.05作为重要通路用Omicshare（http：／／www.omicsham. com／）制作成可视化气泡图。2 结果2.1 山莱萸-肉苁蓉活性成分的筛选通过TCMSP数据库检索山茱英及肉苁蓉的所有化合物（截止时间至2018年12月），并按照口服生物利用度（oal Noavailability，OB）30％、类药性（drug likeness，DL）≥0.18和血脑屏障通透性（BBB）≥-0.85作为筛选条件，筛选获得山茱萸的潜在活性成分16种，肉苁蓉潜在活性成分6种，见表1。2.2 山莱萸-肉苁蓉化合物作用靶点的预测 将山茱萸-肉苁蓉化合物的Pubehem Cidl代码上传至BATMAN-TCM数据库平台，并设置相似性模型阀值为“Score cutoff＝20”，得到各化合物所对应的潜在靶点，并按照返回靶点的得分顺序排列，选各化合物取前20个靶点，不足20全部纳人，并去除重复靶点后，最终得到山茱英化合物作用靶点164个，肉苁蓉化合物作用靶点94个。2.3 柏金森病发病靶点师选 通过GeneCards 数据库共检索“Parkinson＇sdisease”，共获得5597个可能引起帕金森病相关的靶点，其中Synuclein Alpha类靶点相关度最高（146.47分），本研究选取其中相关度得分≥20分的靶点，共筛选获得237个相关靶点。2.4 山茉萸-肉苁蓉作用于帕金森病靶点预测 将将预测的山茱萸-肉苁蓉化合物靶点及筛选得出帕金森病相关基因靶点，全部以基因名格式导人VENVY2.1软件中，取两者的交集，得出19个化合物与疾病共同靶点，19个具体靶点信息见表2，得出的韦恩图如图1所示。2.5 化合物-靶点网络图的构建 将山茱萸、肉苁蓉药对表1 山茱萸-肉苁蓉药对化合物药物名称 编号化合物名称口服生物利用度OB／％类药性DL血脑屏障通透性 BBB山茱萸 MOL002883油酸乙酯32.40.191.10MOL008457四氢鸭脚木碱32.40.810.33MOL0054812,6,10,14.18-pentamethybcona-2,6,10,14,18-pentaene 44.400.241.99MOL005530羟基莞花素36.470.27-0.44MOL000359谷甾醇36.910.750.87MOL001771poriferast-5-en-3lta-dl36.910.751.14MOL000358β-谷箱醇36.910.750.99MOL005503角豆酮39.660.330.09MOL001494十八碳-9.12-二烯酸乙酯42.000.191.14MOL002879邻苯二甲酸二异辛酯43.590.390.26MOL000449豆晶醇43.830.761.00MOL005557lanosta-8,24-dien-3-o1,3-acetate44.300.821.31MOL001495亚油酸乙酯46.100.201.12MOL0054863.4-dehydradynpen-16-al46.640.490.60MOL005360马尔青久纳醇苯酯57.710.63-0.17MOL005531telocinolufagin69.990.79-0.85肉苁蓉 MOL000358B-谷丽醇36.910.750.99MOL005320花生四烯酸45.570.200.58MOL005384苏齐内酯57.520.560.28MOL007563鹅掌楸树脂醇B二甲醚57.530.810.01MOL000098柳皮素46.430.28-0.77MOL008871  mankine                    37.5      0.69         -0.10表2 山茱萸-肉苁蓉治疗帕金森病的关键靶点表2 山茱萸-肉苁蓉治疗帕金森病的关键靶点编号基因名靶点相关度得分1SLC6A3Solate camier fammly 6mmmber3（多巴胺转运体）81.342DRD2

董法祥，李富有（新疆克拉玛依市碧禾源农业科技开发有限公司，新疆克拉玛依 834014）摘要：为探讨生长年限和采收季节等因素对内苁蓉药材有效成分的影响，通过试验探索肉苁蓉最佳采收年限与采收季节，从而保证肉苁蓉药材中有效成分的稳定性。本研究采用高效液相色谱法，对不同生长年限和采收季节下的人工接种肉苁蓉药材中的松果菊苷和毛蒸糖苷含量进行定量测定，分析生长年限和采收季节对人工接种肉苁蓉药材中活性成分的影响，结果表明：在春季采收3年及3年以上的肉苁蓉为好，此时肉苁蓉中的活性成分较高，品质较好。关键词：肉苁蓉；生长年限；采收季节；人工接种；有效成分肉苁蓉又称大芸，具有抗衰老、补肾壮阳、保护肝脏、增强免疫力等多种功效。梭梭具有耐旱、耐寒、抗盐碱、耐贫瘠等特性，新疆克拉玛依市生态环境脆弱，种植梭梭不仅能防风固沙、改良土壤、恢复植被，还能作为肉苁蓉生长繁殖的寄主，不仅能获得良好的生态效益，也能获得较好的经济效益。松果菊苷和毛蕊花糖苷含量是目前评定肉苁蓉质量的重要指标，《中国药典》（2015版）中关于肉苁蓉药效的描述也以这2个指标来评价肉苁蓉药材的质量＂。新疆克拉玛依市地理条件、气候条件比较适宜肉苁蓉生长。目前，在该地区主要采用人工栽培手段将肉苁蓉种子置于梭梭植株根系附近，使它们形成寄生关系，从而促使肉苁蓉生长和繁殖。本研究以新疆克拉玛依市人工栽培的肉苁蓉为研究对象，通过分析测定不同生长年限下、不同采收季节肉苁蓉中有效成分松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量，探讨生长年限和采收季节等因素对肉苁蓉有效成分的影响，探索肉苁蓉最佳的采收年限与采收季节，从而保证肉苁蓉有效成分的稳定性，以期为肉苁蓉药材质量控制及采收加工提供理论依据。一、材料与方法1．仪器与试剂使用LC98II型高效液相色谱仪进行相关指标的分析，KQ-500DE型数控超声波清洗器（常州科生达超声设备有限公司），中草药粉碎机（曲阜市启航机械有限公司），DHG-9145A型电热鼓风干燥箱（无锡玛瑞特科技有限公司）。甲醇为色谱纯（Promptar Company Lid.），甲酸为分析纯（新疆阜瑞克生物有限公司），水为超纯水。对照品松果菊苷和毛蕊花糖苷购自sigma公司，实验中所用肉苁蓉药材采集于新疆克拉玛依市乌尔禾区人工肉苁蓉种植基地。2．试验方法色谱条件：色谱柱为 Apollo C18（4.6毫米x250毫米，微米）；流动相为甲醇-0.1％甲酸梯度洗脱，甲醇-0.1％甲酸26.5：73.5，保持17分钟，3分钟内换成29.5：705，保持27分钟，流速0.8毫升／分；检测波长333纳米，柱温31℃。对照品溶液的制备：利用万分之一精密天平称取松果菊苷和毛蕊花糖苷对照品1.405毫克、1.009毫克，置于5毫升容量瓶中，50％甲醇溶解并稀释至刻度，制成含松果菊苷、毛蕊花糖苷0.2018毫克／毫升、0.2357毫克／毫升的对照品溶液。供试液的制备和松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量测定参考金虎等方法进行测定。3．试验设计选择2个季节，春季（2018年4月30日）和秋季（2018年8月23日），在新疆克拉玛依市乌尔禾区工肉苁蓉种植基地内，按生长年限的不同，分为半年生、1年生、2年生、3年生和多年生5个处理，在各生长年限肉苁蓉种植地中随机选择3块样地，每块样地面积为667米，直接采挖肉苁蓉。具体方法：在接种区外侧0.5米处向接种区剖挖，先用坎土曼和铁锹挖1个长、宽、深分别为0.5米、0.3米、0.7米的小坑，然后换用小铲逐步向接种区缓挖。待挖到肉苁蓉肉质茎时，手轻刨，找到芦头即寄生点处，此时以接种点为中心，把接种点左右0.5米及上方的土取走，按照“采大留小”原则采收，去土过程中及时采收符合规格、个体长度＞25厘米的肉苁蓉。采挖后的肉苁蓉直接晾晒后切制成0.5-1.0厘米厚的切片，在经烘箱80℃烘干至恒重后，粉碎，过80目筛后测定松果菊苷和毛蕊花糖苷含量。4．数据分析用Excel 365进行相关图表的绘制，用SPSS21.0软件进行方差分析，用Duncan法对测定数据进行多重比较。二、结果与分析以春季和秋季采收的肉苁蓉为样品，按照上述方法测得样品中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量。由下表可知：随着生长年限的不断增加，肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷含量也逐渐增加，其中，3年生及多年生肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷2种有效成分含量最高；与春季相比，秋季采收的肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷含量均低于春季采收的肉苁蓉；采收季节和生长年限对松果菊苷和毛蕊花糖苷有极显著影响（P＜0.01），二者的互作效应对毛蕊花糖苷有极显著影响（P＜0.01），对松果菊苷则无显著影响(P>0.05)。不同生长年限及采收季节肉苁蓉药材中有效成分含量表 （毫克／克）李节生长年限松果萄苷 毛蕊花检并半年生3.40hH7.35 iG1年生7.15F9.44gF春季2年生12.28 dD19.05eD3年生14.81 bB23.95 bB多年生16.22 aA25.22 aA车年生2.03 il5.28jH1年生5.19gG8.69hF2年生10.71eE14.36E秋率3年生13.20cC20.84cC多年生13.62cC20.12 dCSEM6801.29采收季节**¥¥显著性检验生长年限****采放季节x生长年限 NS **注：同列不同小写字母表示差异显著（P＜0.05），不同大写字母表示盖并极显著（P＜0.05）；SEM为标准误差；NS表示差异不显著；＊＊表示P＜0.01中国药典（2015版）对于干燥肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷总量的要求为不少于0.3％，本试验所有处理肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的总含量均符合上述要求。本研究中，春季采收时，肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量随着肉苁蓉生长年限的增加面增加，3年生和多年生处理相比，二者差异极显著（P＜0.01）。而在秋季采收时，3年生和多年生处理相比，肉苁蓉中松果菊苷含量无显著性差异（P＞0.05），毛蕊花糖苷含量甚至有所下降。这可能由于肉苁蓉开花时消耗了大量的营养成分，在秋季采收时使其有效成分大大降低～，但此结果仍需更多研究予以验证。本研究结果表明：随着生长年限的不断增加，肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷含量也逐渐增加；与春季相比，秋季采收的肉苁蓉中，其松果菊苷和毛蕊花糖苷含量均低于春季采收的肉苁蓉；采收季节和生长年限对松果菊苷和毛蕊花糖苷有极显著影响（P＜0.01），二者的互作效应对毛蕊花糖苷有极显著影响（P＜0.01），对松果菊苷则无显著影响（P＞0.05）。综合考虑产量及经济效益的因素下，建议在春季采收3年生及3年生以上的肉苁蓉，此时肉苁蓉中的活性成分较高，品质较好。

杨国宁，毕天琛，赵丹彤124，李怀伟，张裕民（1．山东省菏泽市食品药品检验检测研究院，山东菏泽 274000 2．山东中医药大学药学院，山东济南 250355）摘要：目的 评价不同产地内苁蓉饮片的质量。方法 按照2015年版《中国药典（一部）》相关要求对37个企业生产的46批次样品进行检验，并采用化学计量学等方法分析检验结果，综合评价市售内苁蓉饮片的质量现状。结果46批次样品中，41批次样品符合规定，合格率为89.13％；5批次样品不符合规定，性扶、水分和总灰分不合格；综合化学计量学结果显示，存在样品质量参差不齐、水分普遍较高等问题。结论 市售内苁蓉饮片总体质量一般，需进一步加强监营其生产、流通、使用等环节。关键词：肉苁蓉饮片；质量分析；质量评价；药品监管中图分类号：R932：R284.1：R286.0     文献标识码：A    文章编号：1006-4931（2020）13-0063-03Quality Evaluation and Analysis of Cistanches Herba Decoction Pieces Sold in the MarketYANG Guoning',BI Tianchen'.ZHAO Dantong'.LI Hunirer',ZHANG Yumin'(1 Hese Instiante for Food and Drag Contral,e.Shangdong,China 2740002 Schanl of Phamatcy,Shandong U'nirenity of Traditonal Chinee Medicine.Jinan,Shangdang-China 250355)Abstract: Objective To evaluate the quality of cistanches herba decoction pieces from diffeent producing areas.Methods A total of 46 hatches samples produced by 37 manufactures wee detected acconting to rules of the Chinese Phamacopoeia( Volume 1.2015 edition). Stoichiometry was used to analyze the test results to evaluate the quality status of decoction pieces Results In the 46 batches.41 met the stipulation and the qualification ate of cistanches herba decuction pieces.the qualification rate was 89.13%:5 were unqualified.and the unqualified contents were traits.water and total ash.Comprehensive chemometrics meults showed that there were poblems such as uneven sample quality and generally high water cotert.Condusion There are some problems in the general quality of cistanches herba decoction piecew sold in the market.It is necessary to further strengthen supervision in production.circulation and use.Key words: cistancher herba decoction pieces quality analysis quality evaluation:dng surpervision肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉 Cistanche deseticolaY.C.Ma或德赢vwin登录 Cistanche tubulosa（Schenk） Wight的干燥带鳞叶的肉质茎，始载于《神农本草经》.列为上品，性温，味甘、咸，具有补肾阳、益精血、润肠通便的功效，主要分布于北半球温暖的沙漠、荒漠等干燥地带，如我国内蒙古、新疆、宁夏、甘肃等地＂-”。肉苁蓉含有苯乙醇苷类、苯甲醇苷类、环烯醚萜及其苷类、木质素及其苷类、单萜苷类、糖类、生物碱等化合物12-，具有神经保护、抗疲劳、抗炎镇痛、保护肝脏等生理活性。为全面了解山东省肉苁蓉饮片的整体质量，保障人民用药安全，本研究中对37个生产企业的46批次肉苁蓉饮片的质量进行评价与分析，为肉苁蓉饮片的质量控制和监管提供参考。现报道如下。1 材料与方法2015年版《中国药典（一部）收载的肉苁蓉药材品种包括肉苁蓉片、德赢vwin登录 片、酒苁蓉和酒管花苁蓉4种饮片规格。共抽取样品46批次，其中生产企业2批次、经营单位21批次、医疗机构23批次，抽样地域覆盖全省16个地市。其中，肉苁蓉片24批次、德赢vwin登录 片10批次、酒苁蓉10批次、酒管花苁蓉2批次。样品产地包括新疆（34批次）、内蒙古（11批次）、甘肃（1批次）。标示生产企业37个，包括安徽（18个）、河北（7个）、山东（7个）、江西（2个）、湖北（1个）、河南（1个）、甘肃（1个）。本次抽验样品执行2015年版《中国药典（一部）》相关标准，检验项目包括性状、鉴别、检查、浸出物、含量测定等。2 结果与分析2.1 结果2.1.1 抽验结果共检验46批次样品，其中合格样品41批次，合格率为89.13％；不合格样品5批次，不合格项目为性状、水分和灰分。详见表1。表1 肉苁蓉饮片抽验结果（n＝46）品种名称票物开款款(款)合格批次(款)合格半(%)不合格项内式常片342291.671批次性状、水分、恶友分不合格;1批次水分、恶友分不合格学花购效营片1010100.00汤其学10L70.003批次本分不合格酒学花政ま22100.002.1.2 性状46批次样品中，1批次肉苁蓉片不符合规定。肉苁蓉片均呈不规则形厚片，表面棕褐色或灰棕色，部分可见肉质鳞叶，多已断裂；切面均有排列成波状环纹的点状维管束，维管束呈淡棕色或棕黄色；气微，味甜、微苦。其中1批次样品不符合规定，部分样品表面及切面覆盖白色霜状粉末。气微，味咸、微苦，疑似加盐增重，或切片前未将表面咸味洗净导致。酒苁蓉形如肉苁蓉片，表面黑棕色，切面均有排列成波状环纹的点状维管束，质柔润，略有酒气香，味甜、微苦。德赢vwin登录 片和酒管花苁蓉均符合规定。2.1.3 鉴别46批次样品均符合规定。样品薄层色谱图中，在与松果菊苷和毛蕊花糖苷对照品溶液相应位置上显相同蓝白色斑点。详见图1。图1 肉苁蓉薄层色谱图1．松果葡苷对照品溶液2．毛满花糖苷对照品溶液3．肉苁蓉片供试品溶液4．管花肉苁蒙片供试品溶液5．酒管花苁蓉供试品溶液 6．酒苁蓉供试品溶液2.1.4 检查水分：肉苁蓉片和酒苁蓉水分在9.0％～10.0％范围内，接近标准规定上限值，其中2批次肉苁蓉片、3批次酒苁蓉水分不符合规定；德赢vwin登录 和酒管花苁蓉水分均符合规定。可见，与德赢vwin登录 相比，肉苁蓉水分整体较高，尤其是酒苁蓉，提示应在炮制、运输和贮存过程中注意水分检测和控制。详见图2A。总灰分：肉苁蓉饮片总灰分在4.0％～7.0％范围内，有2批次肉苁蓉片接近上限，2批次超过上限。通过分析采收和炮制过程发现，可能因杂质未彻底洗净等因素形成污染。详见图2B。浸出物：46批次样品均符合规定，且肉苁蓉（肉苁蓉片和酒苁蓉）浸出物含量为59.2％-66.6％［比标准规定最低限度值（35.0％）高出0.7～0.9倍］，普遍高于德赢vwin登录 （德赢vwin登录 片和酒管花苁蓉）的34.0％-48.4％［相对标准规定最低限度值（25.0％）高出0.4～0.9倍］。详见图2C。2.1.5 样品含量测定含量测定结果用松果菊苷和毛蕊花糖苷含量之和表示，46批次样品均符合规定。肉苁蓉（肉苁蓉片和酒苁蓉）含量测定结果均高于标准规定限度最低值（0.30％），分布在0.57％～3.57％范围内；德赢vwin登录 （德赢vwin登录 片和酒管花苁蓉）含量均高于标准规定限度最低值（1.5％），主要分布在1.6％～7.9％范围内。不同样品含量测定结果差异较大，表明样品质量参差不齐。详见图3。A.水分 B.总灰分 C.浸出物图2 肉苁蓉饮片水分、总灰分和浸出物测定结果箱式图A.内苁蓉片  B.管花内苁蓉片  C.酒苁蓉图3 内苁蓉片、管花内苁蓉片、酒苁蓉含量测定分布直方图2.1.5 样品含量测定含量测定结果用松果菊苷和毛蕊花糖苷含量之和表示，46批次样品均符合规定。肉苁蓉（肉苁蓉片和酒苁蓉）含量测定结果均高于标准规定限度最低值（0.30％），分布在0.57％～3.57％范围内；德赢vwin登录 （德赢vwin登录 片和酒管花苁蓉）含量均高于标准规定限度最低值（1.5％），主要分布在1.6％～7.9％范围内。不同样品含量测定结果差异较大，表明样品质量参差不齐。详见图3。2.2 综合析2.2.1 系统聚类分析采用SPSS 19.0统计学软件分析，采用系统聚类分析法，选用组间联接法，以平方Euclidean距离为量度，分析24批次肉苁蓉片样品松果菊苷和毛蕊花糖苷含量，评价不同产地样品间的差异。详见图4。可见，依据所测定成分的含量被聚为2类，样品Y2和Y5聚为I类，其余样品聚为II类。其中，II类又可分为2个亚类：Y4．Y7，Y13．Y16聚为1个亚类，其余聚为另1个亚类。统计结果显示，Y2，Y4，Y5，Y7，Y13，Y16含量测定结果比其他样品略高，且产地均为新疆，表明新疆肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷含量较高。2.2.2 相关性分析采用SPSS 19.0统计学软件，对24批次肉苁蓉片的水分、总灰分、浸出物和含量测定进行相关性分析。结果见表2。总灰分和水分测定结果呈高度正相关，和毛蕊花糖苷含量结果呈正相关，由于肉苁蓉富含苯乙醇苷类、苯甲醇苷类2-等，使其易吸收水分和吸附杂质。松果菊苷、表2 水分、总灰分、浸出物和含量测定结果相关性分析结果(n=24)项目相量 69恶支全 4714+2381H03 总量名＊Pearee 性11.880.3%0.0%300.07路性（项侧）0.0000.000.010620.607惠灰分Parne 相性：1.8910.990.364770.31务性（买） 0.0000.310.590000.307设出费E0 1-0.05-0077-4.062性（日侧） 0.00 0.300.7%1.730.73案子Pearen 相性 0.0060.18-0.651591260计著性（项销） 0.9026510.80.000.000 0.477*-0.077060**1量王备性（民额） 2000.080.700.000.0零金量Ree相性 0.070.30-0.0620.992**071王性（现想） 电话）

殊乡春色不曾浓，才力新兼病思慵。一枕清风闻格磔，半瓶香雪浸苁蓉。——元·王逢《园馆杂书二首·其二》诗人在诗中描绘了异乡的春色并不浓郁，因能力尚可，新兼任了官职，但病情又使我慵惰。枕着随之吹来的清风，听着动听的鸟鸣，看着那半瓶清香美酒，还浸泡着肉苁蓉，那是我治病的良药啊。肉苁蓉它没有根，没有叶子，只有美丽的花朵。若有一天，你走到沙漠里，在梭梭树的下面看到一支支粉红色或紫红色的鲜花，不要认为那是普通的花朵，而是名贵中药肉苁蓉开的花朵。肉苁蓉具有很高的药食两用价值，长期食用可增加体力、增强耐力、抗疲劳，同时又可以增强人类及动物的生育力。中医学认为，肉苁蓉具有补肾壮阳、填精补髓、养血润燥、悦色延年等功效，可以治疗阳痿、遗精、白浊、尿频、腰痛、脚弱、耳鸣、目花、月经愆期、宫寒不孕或肠燥便秘等。《神农本草经疏》谓其“滋补肾精之要药，久肥肥健而轻身”。《本草汇言》记载其“肉苁蓉，养命门，滋肾气，补精血之要药也。男子丹元虚冷而阳道久沉，妇人冲任失调而阴气不治，此乃平补之剂，温而不热，补而不峻，暖而不燥，滑而不泄，故有从容之名”。清代沈青崖《陕西通志》中说：“肉苁蓉，陕西州郡多有之，西人多用作食品。”人们常用肉苁蓉和羊肉、羊肾等搭配做羹煲汤，不仅美味可口，而且有较好的增力解乏作用。现代研究表明，肉苁蓉具有提高免疫力、抗衰老、抗骨质疏松、保护肝脏、保护心脑血管和润肠排毒等作用。

【摘要】　李曰庆教授认为特发性少弱精子症病机为脾肾亏虚，兼夹湿热、血瘀、痰浊等病理变化。治疗以补肾填精，益气健脾为主，配合活血化瘀，疏肝理气治法。用药以“微调阴阳”为主，药效平和，无大辛大热之品，疗效确切。文章主要介绍李教授治疗特发性少弱精子症的用药经验，常用药对有：生地黄—熟地黄—山萸肉、肉苁蓉—黄精、鹿角胶—巴戟天—仙灵脾、生黄芪—茯苓—太子参、丹参—三七—牛膝、水蛭—蜈蚣、白芍—乌药等。【关键词】　特发性少弱精子症；　药对；　李曰庆；　微调阴阳；　补肾填精；　益气健脾育龄夫妇同居１ 年以上，未采取任何避孕措施，女方受孕能力正常，因男方原因而导致女方不能受孕的疾病，称为男性不育症［１］ 。其发生可能与全身性疾病、生殖系统感染、精索静脉曲张、激素水平异常及环境因素等有关，其中无明确病因者称为特发性少弱精子症。现代医学对特发性弱精子症的发病机制研究不明确，所以其更多地倾向于经验性治疗，国内外现代医学相关治疗性研究亦集中于使用左卡尼汀、维生素、雄激素、克罗米芬等药物［２⁃３］ ，但治疗效果差强人意。本病属于中医学“无子”范畴，李曰庆教授认为本病以肾虚为本，与心肝脾密切相关，病机为脾肾亏虚，兼夹湿热、血瘀、痰浊、肝郁等病理变化。在辨证上主张宏观与微观相结合，在治疗上以补肾健脾生精为则，以微调阴阳为法，同时配合疏肝理气、清热利湿、活血化瘀等，用药平和，无燥热寒凉之弊，以微调为主，强调缓以图功，攻补兼施，调和阴阳。李老临床选方多以“六五四二”为原则加减用药［４］ ：“六”指六味地黄丸；“五”指五子衍宗丸；“四”指四物汤、四君子汤、四妙丸；“二” 指二至丸、二仙汤。临床根据此原则随症加减，疗效颇佳。笔者有幸跟随李老长期门诊学习，受益颇多，现将李老治疗少弱精子症的临床常用药对做一浅析，以供同道参考。１　补肾填精为核心临床上很大一部分特发性少弱精子症患者多无明显症状，中医属于“无证可辨”，但李老认为，这种情况也是有肾虚的存在，主张“从肾论治”。《素问·上古天真论篇》曰“丈夫八岁肾气实，发长齿更。二八肾气盛，天癸至，精气溢泻，阴阳和，故能有子”，也指出肾气充足是男性具有生育能力的前提。所以肾虚是特发性少弱精子症的核心病机，李老在补肾时注重阴阳并调，根据肾阴或肾阳的偏重随症加减。例如，李老基本方中包含的五子衍宗丸由枸杞子、菟丝子、覆盆子、车前子、五味子组成，药性平和，无大辛大热之品，全方补中寓泻，补而不腻，阴阳并调，共奏补肾填精之效。１． １　滋补肾阴药对１．１． １　生地黄—熟地黄—山萸肉　李老在滋补肾阴时多喜欢生地黄与熟地黄并用，另外配合六味地黄丸中的另外两种滋补肾阴的药物：酒萸肉、山药（若患者兼有肺脾两脏的不足，常配合山药，因山药具有健脾、补肺、固肾、益精的功效，可肺脾肾三补，且药食同源，可久服之）。生地黄味甘苦而性寒，功能凉血清热、滋阴补肾、生津止渴，熟地黄味甘性微温，长于滋阴补血，益髓填精，两者均可滋阴补肾，但是功效侧重不同，正如《本草纲目》云“地黄生则大寒，而凉血，血热者需用之，熟则微温，而补肾，血衰者需用之”，指出了两者的不同，但是李老将两者合用，既可补肾填精，又可滋阴补血，且寒温并用，药性温和，这也是李老用药的特点之一，平调阴阳，寒温并用，临床常用剂量为１０ ～１５ ｇ。山萸肉味酸、涩，微温，具有补益肝肾、收涩固脱之功，经酒制后，补益肝肾作用增强［５］ 。现代药理研究发现，山萸肉有延缓衰老、抗炎、调节免疫、抗疲劳、保肝等作用［６］ 。《汤液本草》曰：“滑则气脱，涩剂所以收之，山茱萸止小便利，秘精气取其味酸涩以收滑也。”《药性论》言：“止月水不定，补肾气，兴阳道，添精髓，疗耳鸣。” 所以，山萸肉既能益精，又可助阳，长于固涩下焦，为肝肾亏虚、下元不固之要药。与生熟地并用，则肝肾同补、精血互生，且山萸肉微温而不热，是一味平补阴阳的药品，不论阴虚或阳虚，都可配用，李老临床常用到１２ ～ １５ ｇ。临床对于特发性少弱精子症患者阴虚症状明显者，三者合用多用至１５ ｇ，而无症状的患者但是精子密度偏低者，李老常常三者合用并重用，并配合鳖甲、龟板等滋补肾阴的血肉有情之品。１．１． ２　肉苁蓉—黄精　肉苁蓉味甘、咸，性微温，归肾、大肠经，可益精血、润肠道，为滋补精血的要药。《本草汇言》曰：“肉苁蓉……此乃平补之剂，温而不热，补而不峻，暖而不燥，滑而不泄，故有从容之名。”《神农本草经》言：“主五劳七伤，补中，除茎中寒热痛，养五脏。” 黄精甘、平无毒，归肺、脾、肾经，功能补气养阴，健脾，润肺，益肾。本品为平补要药，可补肺脾肾三脏，善补中气、除风湿、安五脏，药性平和，尤适用于特发性少弱精子症而无症状者。李老临床常将二药合用（肉苁蓉１２ ｇ、黄精１５ ｇ），两药均可补五脏（《神农本草经》言肉苁蓉可养五脏，黄精可安五脏），且药性平和，且肉苁蓉厚重下降，直入肾家，温而能润，无燥烈之害，能温养精血而通阳气，两药合用，可温补下焦，滋阴养血且无阳之弊，为李老滋补肾精的常用药对。若患者阴虚症状明显，李老常配合二至丸加味（女贞子１０ ｇ、墨旱莲１０ ｇ）。１． ２　温补肾阳药对１． ２． １　鹿角胶—巴戟天—仙灵脾　鹿角胶味甘、咸、性温，归肝、肾经，可温补肝肾、益精血、止血。《本草纲目》云：“熟用则益肾补虚、强精活血，练霜为膏，则专于滋补矣。”张锡纯则认为鹿角善化瘀生新，熬之成胶其性仍在，故鹿角胶还可补精血而化瘀血。巴戟天味辛、甘，性微温，归肾、肝经。能够补肾助阳、祛风除湿，常用于治疗阳痿不举、小便频数、宫冷不孕、风湿腰膝疼痛、肾虚腰膝酸软等症。《本草汇》言：“巴戟天，为肾经血分药，盖补助元阳则胃气滋长，诸虚自退，其功可居萆薢、石斛之上。”仙灵脾性辛、甘、温，归肝、肾经。具有补肾阳、强筋骨、祛风湿功效。对于具有肾阳虚损，畏寒怕冷的少弱精子症患者，李老常选用此药对配伍（鹿角胶１０ ｇ、巴戟天１５ ｇ、仙灵脾１０ ｇ）。李老临床观察，由于生活方式的改变，目前患者多久坐、贪凉，加之空调等外部寒气的侵袭，气血瘀滞，肾阳虚损的患者逐渐增多，而鹿角胶与巴戟天皆为肾经血分药，且鹿角胶具有活血之性，三者合用，即可温补肾阳，又可活血化瘀，有补而不滞的特点。三者性味多温，李老常选黄柏（１０ ～１２ ｇ）同用，既制其温热，又能补阴。若患者瘀血重者，多配伍三七粉、丹参之品，增强其活血化瘀之效；阳虚明显者，李老常联用仙茅、炒杜仲等增强温补肾阳之力。２　益气健脾药对：生黄芪—茯苓—太子参随着人们工作压力增大，饮食不节，嗜食肥甘厚味，思虑劳倦过度等成了现代病的主要因素，思虑过度、饮食不节，则劳伤心脾，而脾虚气弱也成为特发性少弱精子症的常见病因，患者多出现疲劳、大便不成型、舌质胖大有齿痕等症状，根据脾肾先后天相互滋养的理论，脾虚则生化乏源，五脏之精失水谷精微濡养，肾失封藏，生殖之精则无以化生，而出现精子密度低、活力低等表现，若健脾运胃，则脾气散精，精气藏于肾，先后天相互资生，精血充足，则精子可保持正常的活力密度，而能有子。生黄芪味甘气微温，气薄而味浓，功效补气升阳，利水消肿，为益气健脾之良药。茯苓味甘、淡，性平，擅利水渗湿，健脾，宁心。《本草衍义》言其：“行水之功多，益心脾不可阙也。”太子参味甘微苦，性质平和，归脾肺之经，可益气健脾，生津润肺，本品药性平和偏凉，补中兼清，可防脾虚痰湿瘀热互结。《本草再新》云其：“治气虚肺燥，补脾土，消水肿，化痰止渴。”李老临床常将三药合用（生黄芪２０ ～３０ ｇ、茯苓１５ ｇ、太子参１５ ｇ），共寓益气健脾之功，且太子参药性平和偏凉，黄芪性温，茯苓甘平，一方面太子参可佐制生黄芪之温；另一方面参芪相须为用，健脾益气功效更强，配合茯苓可增强健脾利水之功。另外，中医认为弱精症与气虚推动无力相关，大剂量的生黄芪补气升提的作用可明显提高精子活力，现代研究也发现黄芪的有效成分可增强弱精子症患者精子线粒体的活性［７⁃８］ ，从药理学的角度证实了黄芪对精子活力的提高作用。若患者气虚者，李老常与炙黄芪同用，同时配合石斛、红景天、绞股蓝等提高补气养阴的力度；脾虚痰浊明显者，常配合浙贝母、姜半夏、海藻、昆布等化痰散结之品助之。３　活血化瘀药对特发性少弱精子症患者多病程较长，久病成瘀，加之现代生活方式的改变以及工作压力的增大，气滞血瘀、湿热血瘀的患者随之增多［９］ ，尤其是伴有精索静脉曲张、睾丸微石症、勃起功能障碍的患者，更是考虑有血瘀的存在［１０⁃１２］ ，故而在临床上李老面对久治无明显效果的患者常将“活血化瘀”之法贯穿始中，对本病的远期疗效比较明显。由于活血化瘀药多有耗气伤阴之弊，故李老选用活血化瘀药多具养血之效，或配伍红景天、石斛、太子参等益气养阴之品，以起到活血而不伤正的目的。３． １　丹参—三七—牛膝丹参味苦，微寒，归心、肝经，功效活血祛瘀，通经止痛，清心除烦。“一味丹参，功同四物”，说明丹参不仅有活血之效，兼可补血养血，久服可利人血脉而不伤气血。三七性温，味甘、微苦，归肝、胃经。可散瘀止血，消肿定痛。《本草纲目拾遗》中言“人参补气第一，三七补血第一，味同而功亦等，故称人参三七，为中药之最珍贵者”，指出三七不仅有活血化瘀之功，且兼具补血之效，尤适于血瘀兼有气血虚损者。牛膝味苦酸、性平，具有补益肝肾，强腰膝以及活血、引血下行的作用。李老临床常将三者合用（丹参１５ ｇ、三七３ ～ ６ ｇ、牛膝１０ ～１５ ｇ），若患者无明显瘀血症状，则选用丹参与牛膝配合。丹参与三七都具有补血活血之效，二者合用可化瘀通滞而不伤气血，与牛膝同用，则引药下行，直达病所，使精室血行通畅，败精瘀血得除，精子得新血滋养而活力、密度均可提高。临证时，多与黄芪，党参配伍，在增强活血化瘀力度的同时，顾护正气，使得气血双补，阴阳调和。另外不仅在治疗少弱精子症方面，李老在治疗有关精室之类的疾病时，都常配伍牛膝，以起到引经药的作用，使药效直达下焦精室。３． ２　水蛭—蜈蚣对于血瘀较重，普通活血化瘀药效果一般时，李老常将两药配伍使用（水蛭３ ～ ４ ｇ、蜈蚣４ ｇ）。叶天士在《临证医案指南》中提出“久病入络”学说，强调“初为气结在经，久则血伤入络”。络脉瘀阻，则常规的活血化瘀药难以奏效，无破血之品则不可攻坚。张锡纯云：“水蛭善破瘀血而不伤新血， 凡破血之药多伤气分，惟水蛭味咸专入血分，于气分丝毫无损，且其性迟缓善入，迟缓则生血不伤，善入则坚积易破。”蜈蚣性咸、辛，温，归肝、脾、肺经，可息风镇痉，攻毒散结，通络止痛，李老认为根据其习性判断，其尤善于化瘀通络，故李老常将两药配伍使用，且破瘀通络而不伤正，临床佐以路路通， 威灵仙等品效果更佳。４　疏肝理气药对：白芍—乌药近现代医家在治疗少弱精子症时多从肾论治，而忽略其他脏腑的影响。而李老认为随着时代变迁，生活节奏的加快和压力的增大，肝郁气滞的患者也逐渐增多，长期保持此状态，则易肝郁气滞，肝木乘脾，脾虚不能运化，使肾精不能充养，或肝郁化火，肝胆火盛，肾水亏耗，肾精不足而出现少弱精子症。故李老在辨证时若患者出现以上症状，常配伍一两味滋阴柔肝疏肝的药物，并配合培土生津益肾之品，使肝木柔润，气机调畅。白芍味酸苦，性微寒凉，归肝、脾经，可戢肝火泻胆热、滋阴液利小便、抑浮火制药性，擅养血调经，敛阴止汗，柔肝止痛。张锡纯认为本品味酸，故能入肝以生肝血，味苦，故能入胆而溢胆汁，味酸而兼苦，且又性凉，故善泻肝胆之热。乌药性温，擅行气止痛、温肾散寒［１３］ 。《本草求真》言其：“凡一切病之属于气逆，而见胸腹不快者，皆宜用此。”李老临床常联合用此二药（白芍１５ ｇ、乌药１５ ｇ）滋阴柔肝，理气散结。白芍与乌药配伍，一凉一温，一方面在药性方面可以相互佐制，另一方面两药相伍既可提高白芍滋阴柔肝清火之力，又可增强乌药疏肝行气止痛之功，相辅相成，使气机调畅，肝血足，肾水旺，肾精充，则精液活力密度自然提高。５　验案举隅患者，男，３２ 岁，２０１８ 年８ 月１２ 日初诊。主诉：婚后２年未避孕未育。平素夫妻性生活规律，每周２ ～３ 次，爱人相关检查一般状况好。患者半年前于当地孕前检查被诊断为少弱精子症，其他检查包括男性激素、阴囊超声、染色体等均未见异常，今为进一步治疗求诊。刻下：平素易疲劳，乏力，腰酸，纳可，眠佳，稍怕冷，无口干，稍口苦，阴囊无潮湿，性欲正常，大便不成型，小便正常。平时压力稍大。舌质淡边有齿痕苔薄白，脉细无力。复查精液：４ ｍＬ，完全液化，前向运动精子１８ ％，密度：１３×１０６ ／ ｍＬ。诊断：男性不育症（少弱弱精子症）。辨证：脾肾阳虚，肝郁气滞。治法：健脾补肾，疏肝理气。处方：生地黄１５ ｇ、熟地黄１５ ｇ、山萸肉１２ ｇ、肉苁蓉１２ ｇ、菟丝子１５ ｇ、枸杞子１５ ｇ、五味子１０ ｇ、车前子１０ ｇ、覆盆子１５ ｇ、生黄芪３０ ｇ、丹参１５ ｇ、盐黄柏１２ ｇ、仙灵脾１５ ｇ、鹿角胶１０ ｇ、怀牛膝１０ ｇ、茯苓１５ ｇ、制巴戟天１２ ｇ，３０剂，免煎，温水冲服，早晚各一袋。嘱其忌辛辣油腻，适当运动。２０１８ 年９ 月１０ 日二诊：患者诉疲劳感减轻，现无怕冷症状，口干，平时久坐，运动较少，大便偶尔成型。舌质淡边有齿痕苔薄白脉细。复查精液常规：３ ｍＬ，液化，前向运动精子３２ ％，密度１８×１０６ ／ ｍＬ。前方减鹿角胶，加山药１５ ｇ、太子参１５ ｇ、麦冬１５ ｇ，继服３０ 剂，服法和调护同前。２０１８ 年１０ 月１３ 日三诊：患者诉疲劳感大大减轻，身体无特殊不适，无口干口苦，大便偶不成型，小便正常，舌质淡边有齿痕脉滑。处方：前方加炒白术１２ ｇ、黄精１５ ｇ，继服３０剂，巩固疗效，用法和调护同前。半年后来门诊报喜其妻已自然受孕４ 月余。６　讨论特发性少弱精子症无明确病因，现代医学方法治疗效果一般。中医中药优势明显，李老临证４０ 余年，对本病的辨证和治疗有独特的看法［１４］ ：在辨证方面，强调中西医结合并举，宏观与微观结合辨证，即从宏观方面运用中医四诊合参整体全面把握患者的症状、体征，配合现代医学从微观角度借助仪器在深层组织研究结构变化，而且将现代医学细微阳性体征纳入中医辨证体系，这实际上也是中医四诊合参的延伸。例如针对无症状的少弱精子症患者，属于中医“无症可辨”的范畴，但李老将西医的微观检查如精液常规纳入中医辨证体系，形成特殊的“中医辨证”，根据中医理论“阳化气、阴成形”，精液属水为阴，与精液量和精子密度相关；精气属火为阳，起推动作用，与精子活力有关，故临床精液量和精子密度偏低的患者李老认为是肾阴虚偏重，滋补肾阴药对量则偏重，甚者则添加鳖甲、龟板等滋补肾阴的血肉有情之品；精子活力偏低者，则重用补肾助阳药对，但是慎用附子、桂枝等大辛大热之品，多选用性平或微温之品，如鹿角胶、仙灵脾、巴戟天等。在治疗用药方面，李老坚持以调和阴阳为主，不用大寒大热之品，因过用寒凉之品，则会导致精液活力下降；过用温热之品，虽精子活力一时提高，但长久来看，会导致肾阴亏耗，精子黏稠度大，精液量下降，精液不液化等。故李老常常补肾阴与肾阳之品同用，根据症状两者比例灵活调配，且多用性平之品，正所谓“善补阳者，必阴中求阳，则阳得阴助，而生化无穷；善补阴者，必阳中求阴，则阴得阳升，而泉源不竭”。李老临床以“补肾健脾”为核心，随症兼以活血化瘀、疏肝解郁清热等，以“六五四二”为基本方，随症加减，不拘泥于单纯的补肾填精，前期治疗多以汤药为主，力达药转，直达病所，后期多以丸药缓以图功，攻补兼施，调和阴阳，使阴阳调合则故能有子，并善于使用精简而效专的药对组合，以增强药力，直达病所，临床值得进一步推广。参考文献［１］　李宏军． 特发性男性不育药物治疗的相关问题［Ｊ］． 中国计划生育学杂志，２０１３，２１（４）：２８６⁃２８８．［２］　张华，孙自学，李鹏超，等． 生精通络赞育方治疗特发性弱精子症肾虚瘀阻证５７ 例疗效观察［Ｊ］． 中医杂志，２０１８，５９（６）：４９０⁃４９３．［３］　赵玉，欧阳斌，耿强，等． 补肾健脾法治疗少弱精子症临床有效性的Ｍｅｔａ 分析［Ｊ］． 生殖与避孕，２０１７，３７（１）：５５⁃６０．［４］　宣志华，杨振，轩立华，等． 李曰庆教授“六五四二”方治疗男性少弱精子症的临床经验［Ｊ］． 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摘要目的探究中医药治疗勃起功能障碍方剂的用药规律，分析其治疗过程的分子作用机制和药效物质基础。方法应用中医药整合药理学研究平台v2.0，挖掘《中药成方制剂》中治疗男科勃起功能障碍疾病的方剂，获取疾病治疗的核心药物，分析其化学成方、靶标，进行Gene ontology（GO）富集分析和生物通路分析。结果中药治疗勃起功能障碍方剂中核心药物有13 种；药物靶标分子作用主要有氧化还原酶的激活、药物绑定、催化活性等；中药- 疾病核心蛋白相互作用网络在体内主要参与复合生物合成、PKA 激活、腺苷酸环化酶激活途径等生物过程。结论揭示了中药方剂治疗勃起功能障碍核心药物的活性成分、靶点及网络，阐明了中药药物在治疗勃起功能障碍疾病的分子作用机制。关键词勃起功能障碍； 中药方剂学； 药理学； 药理作用分子作用机制勃起功能障碍（erectile dysfunction，ED），中医称之为阳痿，是临床男科常见的性功能障碍疾病之一[1]。中医学认为阴茎不能勃起,或勃而不坚，或坚而不久,皆属于该病的临床表现[2]。中医药对其防治具有悠久的历史，有着较为完整的理论架构和特有的治疗手段[3]。《中华人民共和国卫生部药品标准———中药成方制剂》(简称《中药成方制剂》)[4]中收录不少于百种的中药方剂，但目前的科学研究中， 对于中药治疗勃起功能障碍的组方用药规律，组方核心药物的挖掘，药物的成分、靶标，分子内在的作用机制等相关研究较少， 未能较好的在微观层面阐明中医药治疗疾病的机理机制。整合药理学是中药现代研究新模式,药理学研究的新领域。由中国中医科学院中药研究所开发的“中医药整合药理学研究平台v2.0（Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional ChineseMedicine v2.0,TCMIP V2.0）”，包含了中药材、中药方剂、中药成分、中药靶标、疾病相关分子等五大数据库资源[5]，可用于揭示中医药理论的科学内涵、挖掘组方用药经验、阐释中药作用原理、分析中药药理效应等研究，为中医药的现代化研究提供强有力的数据支撑和分析平台。本研究基于TCMIPv2.0 平台，分析中医药治疗勃起功能障碍方剂的核心用药，阐释药物的药效物质基础（主要成分、靶点）及作用机制，为临床及科研的深入开展提供一定的理论依据。资料与方法一、方剂收集录入中医药整合药理学研究平台（http：//www.tcmip.cn/）中药方剂数据库中收录了《中药成方制剂》记载的方剂数据，包括方剂名称、药物组成、功效疾病、主治证候等信息。利用该平台，按指定疾病“阳痿”提取数据库中的方剂信息。二、核心药物数据挖掘中药治疗勃起功能障碍的核心药物由“高频次单味药材（药物在所有方剂中出现次数大于20%）”与“高频次药组（药组在所有方剂中出现次数大于20%）”的交集组成。通过中医药整合药理学研究平台“组方用药规律分析”模块，对获取到的方剂进行数据分析，包括处方中所含药物频次统计、组方规律。高频次单味药材的获取，应用“组方中药的频次统计”选项，可一键化获得各味中药的用药频次，选取用药次数大于总方剂数×20%的药物；高频次药组的获取，应用“组方中药的关联性分析”选项，该功能基于关联规则算法，分别设置“2味、3 味、4 味”药组，计算相应药组频次，选择频率大于20%的药组作为数据结果。三、中药化学成分来源在中医药整合药理学研究平台- 中药材数据库，对核心药组药物进行检索，收集所有化学成分，建立中药治疗“勃起功能障碍”核心药组化学成分数据库。四、中药靶标预测及GO 富集分析利用中医药整合药理学研究平台中的“中药（含方剂）靶标预测及功能分析”模块，依次输入核心药组药物名称， 即可对核心药组的药物进行靶标预测及GO富集分析。该模块针对中药化学成分和FDA 上市药物进行相似性打分，获取高可信度（Similar Score>0.8）的中药候选靶标谱，可进一步阐释中药作用机理。五、疾病相关基因集获取TCMIP V2.0 平台整合了疾病“基因相关性数据库” （DisGeNET）、“ 人类表型本体数据库” （HPO）、“Drugbank 数据库”、“治疗靶标数据库”（TTD）等资源，构建起疾病和常见临床表型相关基因数据库。在TCMIP V2.0 平台疾病相关分子集及其功能挖掘模块，以“erectile dysfunction”作为关键词，通过检索可获取勃起功能障碍疾病的相关基因。六、中药- 疾病核心靶标蛋白质相互作用网络及生物通路分析通过整合药理学平台的“中医药关联网络挖掘”模块， 该模块镶嵌了HAPPI、Reactome、OPHID、InAct、HPRD、MINT、DIP、PDZBase 等包含蛋白质- 蛋白质相互作用数据的数据库， 可构建中药与勃起功能障碍核心靶标的蛋白互作网络(protein protein interaction network,PPI network)。应用Cytoscape 3.4 软件绘制网络图。同时， 该模块整合了Reactome （https://reactome.org/）[6]生物通路数据库，可对获得网络中包含的所有基因参与的生物通路进行分析。结果一、中药治疗勃起功能障碍核心药物结果应用平台中的中药方剂数据库，共计获得治疗勃起功能障碍方剂127 首，包含280 味中药材。对各味中药在方剂中出现的频率进行统计，提取频率大于20%的药材从高到低进行列出。分别为枸杞子（72 首，57.6%）、菟丝子（62 首，49.6%）、熟地黄（61 首，48.8%）、淫羊藿（60首，48%）、肉苁蓉（47 首，37.6%）、当归（43 首，34.4%）、人参（42 首，33.6%）、山药（38 首，30.4%）、补骨脂（37首，29.6%）、茯苓（36 首，28.8%）、五味子（36 首，28.8%）、杜仲（35 首，28%）、巴戟天（34 首，27.2%）、黄芪（28 首，22.4%）、牛膝（26 首，20.8%）。药物组合频率大于20%的药组，分析结果如表1 所示。综合高频次单味药与高频次药组结果，确定中药治疗勃起功能障碍的核心药物为枸杞子、熟地黄、肉苁蓉、菟丝子、山药、淫羊藿、杜仲、茯苓、当归、巴戟天、人参、补骨脂、五味子。二、核心药物化学成分基于TCMIP V2.0中的中药材数据库， 依次分析核心药物的化学成分。枸杞子收集到化学成分57 个，主要为多糖、氨基酸、生物碱、挥发油等；熟地黄收集到化学成分12 个、主要为糖类、谷甾醇、核苷等；肉苁蓉收集到50 个化合成分，主要为肉苁蓉苷、生物碱、氨基酸等；菟丝子收集到化学成分8 个，主要为糖苷、胡萝卜素、山奈酚等；山药收集到45 个化合成分，主要为甘露糖、多巴胺、氨基酸等；淫羊藿收集到化学成分27 个，主要为黄酮类化合物、淫羊藿苷、棕榈酸等；杜仲收集到化学成分52 个，主要为黄酮类、环烯醚萜、甾体和萜类等；茯苓收集到33 个化学成分，主要为多糖、脂肪酸、甾醇类等；当归收集到65 个化学成分，主要为挥发油、酚酸类、黄酮类等；巴戟天收集到19 个化学成分，主要为糖类、谷甾醇、胡萝卜苷等；人参收集到158 个化学成分，主要为皂苷类、多糖类、有机酸等；补骨脂收集到32 个化学成分，主要为香豆素类、黄酮类、单萜酚类等；五味子收集到99 个化学成分，主要为木脂素类、有机酸、挥发性油等。三、中药靶标预测及GO 富集分析结果中药化学成分复杂，且已知作用靶点有限，通过获得更多且可靠性高的靶标是研究中药作用原理的关键问题[7]。基于Tcmip V2.0 中的中药（含方剂）靶标预测及功能分析模块可以获得每味核心药物的靶标， 并且对预测出的靶标进行GO 功能富集分析。枸杞子获得靶标基因235 个、熟地黄获得靶标基因656 个、肉苁蓉获得靶标基因326 个、菟丝子获得靶标基因101 个、山药获得靶标基因898 个、淫羊藿获得靶标基因200 个、杜仲获得靶标基因338 个、茯苓获得靶标基因232 个、当归获得靶标基因334 个、巴戟天获得靶标基因235 个、人参获得靶标基因1283 个、补骨脂获得靶标基因255个、五味子获得靶标基因94 个。对各个药物的靶标基因取交集，13 位中药共同作用的靶标基因为AR （雄激素受体） 基因。对核心药物靶点基因进行GO 富集分析，结果如表2 所示。四、疾病相关基因集获取结果基于TCMIP V2.0平台疾病相关分子集及其功能挖掘模块，输入疾病关键词后，共获得勃起功能障碍疾病基因17 个，见表3。五、中药- 疾病蛋白质相互作用网络及生物通路分析结果应用TCMIP V2.0平台中的中医药关联网络挖掘模块，可构建中药靶标与疾病靶标蛋白质互作网络，并可对网络中的基因进行深入的生物通路分析。基于平台中的蛋白数据库， 核心药物与勃起功能障碍疾病构建的核心靶标网络中包含108 个基因， 其中中药基因101 个，疾病基因10 个，共同基因3 个。蛋白互作网络如图1 所示。对核心靶标蛋白互作网络进行生物通路分析，显著富集的前20 条通路结果如图2 所示。讨论由于中医药治疗勃起功能障碍的方剂较多， 配伍较为灵活，靶点众多，对其治疗疾病的作用机制一直是科学研究的重、难点[8]。本研究采用挖掘组方规律与整合药理学的方法，对《中药成方制剂》中治疗男科勃起功能障碍疾病的方剂进行收集， 挖掘方剂核心药物的作用机制和药效物质基础， 并进行了深入的药理学分析， 为中药方剂治疗疾病的机理机制研究提供了新思路。通过对《中药成方制剂》中勃起功能障碍方剂的组方规律分析， 从127 味中药中挖掘出13 味核心药物。其中居于前三位的单味药为枸杞子、菟丝子、熟地黄；前三位药对为枸杞子—菟丝子、枸杞子—熟地黄、熟地黄—菟丝子，与方剂“右归丸”中部分药物相吻合。“右归丸”是治疗阳痿遗精、肾阳不足的经典名方[9]。结合该三味药物的特性可知， 中医对于勃起功能障碍的治疗首选温补肾阳、益气养血之品[10]。对13 味药物进行四气五味归经分析，发现四气中温性药占主体，有9 味药属温性（肉苁蓉、淫羊藿、杜仲、当归、巴戟天、熟地黄、人参、补骨脂、五味子），其余4 味皆属平性（枸杞子、菟丝子、山药、茯苓）；五味中甘味占多数，只有淫羊藿属苦味、补骨脂属辛味，其余药材或属纯甘味，或属甘、苦，甘、咸，甘、辛味。归经分析发现，除当归属心经、肝经、脾经，其余12 味药物皆含肾经，并与肝经、脾经、肺经、心经、大肠经密切相关， 说明药物的作用以肾经为根本，协同体内其他脏器共同作用，产生滋肾壮阳、补血养阴、精气充髓、活血通络等功效，针对勃起功能障碍疾病表现出的肾虚肝郁、气滞血瘀、湿热下注、阴虚火旺等证，发挥特定的治疗作用。对于核心药物化学成分的分析， 再次证明了中药具有多成分，且不同中药具有相同成分的特性[11]。在用药过程中，药物的作用是复杂的多对多关系。以淫羊藿为例，该药物以黄酮类化合物为主要成分，能够影响下丘脑—垂体—性腺轴、肾上腺皮质轴等内分泌系统，其提取液能已被证明能够通过血睾屏障,在生殖系统中发挥作用[12]。在当归、补骨脂、杜仲等中药中也具有黄酮类成分。从而可知，核心药物中所含的某些化学成分与勃起功能障碍疾病密切相关， 为中医临床药物的选择提供了科学依据。进一步对药物化学成分的作用靶标进行分析，发现每位中药的靶标数各不相同，但由于不同中药之间具有相同的化学成分， 以致不同药物具有部分相同的靶标，说明在基因作用层面，药物仍存在协同作用的关系[13]，药物的协同作用有效增强了药效，对于疾病的治疗起着积极促进的作用。13 味核心药物唯一共同作用的靶标为AR（androgen receptor，雄激素受体）基因，该基因与体内雄激素的形成密切相关，是雄激素作用的中介物质，能够使细胞的功能发生改变，具有促进细胞分化和组织器官的发育等功能[14]。以此可推断，13 味核心药物对于勃起功能障碍疾病的治疗， 可能与调控体内某些关键基因（如AR 基因）密切相关。通过对核心药物全部靶点基因的GO 富集分析， 发现药物主要参与氧化还原过程、药物反应脂质代谢过程、类固醇代谢过程、类固醇激素介导的信号通路等一系列生物过程，在线粒体、神经元、髓鞘、突触后膜等细胞位置，起到氧化还原酶的激活、药物绑定、催化活性、核苷酸绑定、核受体的活动等分子作用。通过对中药与疾病核心靶点蛋白相互作网络的构建， 可清晰的看出药物作用靶标与疾病作用靶点之间的复杂网络关系。在已知的药物基因与勃起功能障碍基因之间，存在多对多的作用，既有共同相互作用的基因， 也有独立调控的基因。通过进一步的网络功能分析， 发现蛋白作用网络主要通过复合生物合成、proteinkinase A（PKA）激活、腺苷酸环化酶激活途径、TumorProtein p53 （TP53) 调节代谢、胰高血糖素信号转导中PKA 的激活、胰高血糖素信号在代谢调节中的作用、Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2（VEGFR2）介导的血管通透等生物过程， 在体内产生治疗勃起功能障碍疾病的作用。药物与疾病的作用在微观层面是复杂的，涉及多过程、多成分、多反应，对于药物治疗勃起功能障碍的核心作用过程， 仍需开展深入的实验验证。综上， 本研究利用整合药理学方法从药材—成分—靶标—通路—疾病等不同层面， 深入开展了中药方剂治疗勃起功能障碍方剂核心药物的作用机制研究， 较为清晰的阐明了中药药物在治疗勃起功能障碍疾病过程中发挥的中药作用。同时，本研究也为中药方剂治疗男科疾病的作用机制研究提供新思路与方法，进而推进中医药治疗男科疾病的现代化。参考文献1 徐福松, 章茂森, 赵伟. 中医药防治勃起功能障碍研究进展述评. 江苏中医药2019; 51(5): 1-52 孙自学, 李鹏超. 勃起功能障碍的中医诊疗思路探析. 辽宁中医杂志2019; 46(5): 970-9723 赵文, 王祖龙, 张琦, 等. 阳痿中医辨治溯源. 中医药临床杂志2018; 30(5): 875-8774 中华人民共和国卫生部药典委员会. 中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂(1-20 册). 1989-19985 Xu HY, Zhang YQ, Liu ZM, et al . ETCM: an encyclopaediaof traditional Chinese medicine. Nucleic Acids Res2019; 47(D1): D976-D9826 Fabregat A, Jupe S, Matthews L, et al . The Reactome PathwayKnowledgebase. Nucleic Acids Res 2018; 46(D1):D649-D6557 许海玉, 刘振明, 付岩, 等. 中药整合药理学计算平台的开发与应用. 中国中药杂志2017; 42(18): 3633-36388 张硕. 基于数据挖掘的中医治疗男科病临床用药规律与作用机制研究. 北京中医药大学, 20199 孙自学, 赵帅鹏, 张珈铭, 等. 右归丸治疗男科疾病探析.中医药临床杂志2017; 29(8): 1255-125710 张硕, 吴嘉瑞, 张晓朦, 等. 基于数据挖掘的中医治疗阳痿用药规律分析. 中国实验方剂学杂志2015; 21(22):209-21311 郭倩, 田成旺, 任涛, 等. 中药药效物质基础研究进展. 世界科学技术- 中医药现代化2015; 17(3): 648-65412 詹晶晶. 淫羊藿提取物主要代谢成分在大鼠体内的药代动力学研究. 广州中医药大学, 201813 王勇, 李春, 仇琪, 等. 中药复方多成分多靶点协同增效药理药效评价体系. 中国科学:生命科学2016; 46(8):1029-103214 Fujii S, Kagechika H. Androgen receptor modulators: a reviewof recent patents and reports (2012-2018).Expert OpinTher Pat 2019; 29(6):439-453

【摘要】目的分析《中医方剂大辞典》中治疗阳痿方剂及药物配伍规律，为中医临床用药提供指导和借鉴。方法统计《中医方剂大辞典》收录治疗阳痿的方剂及药物，分别查出其性、味、归经及功效，运用Excel 2010、SPSS 22．0、Weka 3．8、Cytoscape 3．6．1、复杂系统熵聚类等对性、味、归经及功效进行统计分析。结果筛选方中高频药物为肉苁蓉、菟丝子、熟地黄、巴戟天、鹿茸、牛膝、附子、五味子、远志等，多属补虚药，药性多温、平，药味多甘、辛、苦，归经多属肾经、肝经、脾经、心经。根据高频药物的关联规则分析，得到药对配伍规则，如菟丝子—肉苁蓉、巴戟天—肉苁蓉、鹿茸—肉苁蓉、鹿茸—菟丝子、牛膝—肉苁蓉等。通过熵层次聚类挖掘新处方5 首，治法以补益肝肾，健脾养心为主，兼以活血化瘀。结论《中医方剂大辞典》收录治疗阳痿方剂组方以温肾助阳，宁心安神为主，对于当代医家在临床上辨证施治用药有着一定的指导意义。【关键词】中药; 数据挖掘; 中医方剂大辞典; 阳痿; 用药规律; 治疗阳痿是指男性( 除未发育成熟或已到性欲衰退期) 性交时阴茎不能勃起，或勃起不坚，或坚而不久，以致不能完成性交全过程的一种病症。目前，西医将“阳痿”改称为“勃起功能障碍”［1］。阳痿是成年男性的常见病、多发病，目前，中国城市阳痿的患病率达26．1%，随着时代的变迁，生活节奏加快，社会竞争压力激烈，男性面临的压力巨大，导致阳痿的发病有上升和年轻化的趋势［2］。西医对阳痿的发病机制尚无统一认识，治疗本病的主要方法有口服选择性5 型磷酸二酯酶抑制剂、阴茎海绵体注射、睾酮替代治疗、阴茎假体等［3］。这些治疗方法虽能改善阴茎勃起功能，但不能彻底治愈阳痿，亦不能改善阳痿导致的并发症。中医药防治本病历史悠久，治疗方法多样化且疗效佳，故中医治疗阳痿是最佳选择［4］。《中医方剂大辞典》一书收载了上自秦汉，下迄1966 年底，历代许多中医名家治疗阳痿的方剂，现利用数据挖掘技术，分析历代医家治疗阳痿的用药组方规律，以期为临床治疗和研究本病提供可靠的参考依据。1 材料与方法1．1 数据来源及筛选选用《中医方剂大辞典》［5］为研究资料，建立《中医方剂大辞典》数据库，其中收录阳痿处方210首，共包含中药189 味。1．2 数据规范药物名称根据《中药学》［6］和2015 年版《中华人民共和国药典》( 一部) ［7］进行规范，如“破故纸”规范为“补骨脂”，“萸肉”规范为“山茱萸”等。对于同一药物的不同入药部位，如“淫羊藿”“仙灵脾”统一规范为“淫羊藿”。中药名称因品种、地域、炮制等不同而存在差异，为确保数据的可靠性，将异名同药的药物根据《中药学》统一作规范处理，如“生牡蛎”“煅牡蛎”统一作为“牡蛎”收录等。对于《中药学》和《中华人民共和国药典》( 一部) 中没有的药物，如“青盐””雀儿”“粟米”“固脂”“阿芙蓉”等，统计时暂时舍弃。药物功效、药性、药味、归经根据《中药学》规范，如“肉苁蓉”:补虚药，性温，味甘、咸，归肾、大肠经。1．3 统计学方法将符合筛选要求并规范整理后的中药复方药物数据，包括中药药性、药味、功效及归经，采用二分类的量化方法处理，将每味中药按“无= 0，有= 1”进行赋值，录入Excel 2010 软件，建立药物电子数据库，并采用SPSS 20．0 对药物频次进行统计，其中用方频率= 出现频次/中药汤剂复方总数，用药频率=出现频次/总频次。采用Weka 3．8 对药物潜在关联规则进行分析，其中支持度是包含前项A 的记录与总记录的比值;置信度是包含前项A 也包含后项B 的记录数与所有含A 的记录数的比值; 提升度是包含前项A 也包含后项B 的记录数与所有含B 的记录数的比值; IfA then B，则他的支持度为: S = p( A) /p( 总) ; 置信度为: C = p( A and B) /p( A) ; 提升度为: L = p( A andB) /p( B) 。采用Cytoscape 3．6．1 对所得关联规则进行网络视图制作，得到强关联药物组合。在关联规则分析结果的基础上，应用无监督的熵层次聚类算法，进行层次聚类分析。2 结果经上述方法筛选，共纳入《中医方剂大辞典》治疗阳痿处方210 首，涉及中药189 味，累计使用药物总频次2431 次，药性总频次2431 次，药味总频次4923 次，归经总频次6192 次。2．1 高频药物使用分布统计结果显示: 使用频次≥30 的药物分别为肉苁蓉、菟丝子、熟地黄等，共25 味药，以上药物累计使用频次1409 次，累计占药物总频次( 2431 次) 的57．94%。见表1。2．2 高频药物功效分布统计结果显示: 使用频次≥30 的药物类别分别为补虚药、温里药、收涩药等8 类。其中补虚药＞温里药＞收涩药，以上3 种药类的药物累计使用频次1134次，累计占药物总频次( 2431 次) 的46．65%。见表2。2．3 高频药物药性分布统计结果显示: 使用频次≥30 的药物药性分布为温性、平性、热性等4 种。其中温性＞平性＞热性，以上3 种药性的药物累计使用频次1375 次，累计占药性总频次( 2431 次) 的56．56%。见表3。2．4 高频药物药味分布统计结果示: 使用频次≥30 的药物药味分别为甘味、辛味、苦味等7 种。其中甘味＞辛味＞苦味，以上3 种药味的药物累计使用频次1995 次，累计占药味总频次( 4923 次) 的40．52%。见表4。2．5 高频药物归经分布统计结果显示: 使用频次≥30 的药物归经分布为肾经、肝经、脾经、心经等7 条。其中肾经＞肝经＞脾经＞心经，以上4 条归经的药物累计使用频次3085 次，累计占归经总频次( 6192 次) 的49．82%。见表5。2．6 高频药物关联规则找出强规则是关联规则挖掘的目的，其需明确的参数是支持度( Support) 、置信度( Confidence) 和提升度( Lift) 。支持度主要是评估关联的普遍性;置信度主要是评估精确度( 可信度) ; 提升度主要是用于评估规则是否可用的指标。本研究选择以最小支持度10%、最小置信度60%和最大前项数1 进行关联规则分析; 所得药对配伍规则结果，见表6。根据药对的关联规则，采用网络视图的方式将药对关联规则展示出来，见图1。2．7 基于层次聚类的新处方药物规律研究的另一个目标是为了找到更加有效的方剂组合，据此，课题组在关联规则分析结果的基础上，根据筛选出的阳痿方剂数量和不同预读参数，应用无监督的熵层次聚类算法，进行了熵层次聚类分析，共得到治疗阳痿的新方组合5首。见表7。3 讨论本研究对《中医方剂大辞典》所载的治疗阳痿方剂进行了较为深入的挖掘分析，将中药功效、药性、药味及归经等特征性因素进行总结，发现中药特征与其治疗阳痿存在一定的关联规律，以此为临床医生遣方用药提供参考依据。中医有关阳痿的论述，最早可追溯到先秦、秦汉时期，《马王堆汉墓医书》称之为“不能”，至明清时期，多以“阳痿”命名。治疗阳痿，金元之前多从肾论治; 金元时期，李东垣［8］认为前阴疾病与足厥阴肝经密切相关，提出从肝论治阳痿的学术观点，突破了前代仅从肾出发论治阳痿的局限; 随后，不同时期的医家又提出了因证分类论治、多因论治、针药并用等论治阳痿［9］。现代医家李曰庆［10］认为本病的病机是肾虚为本、肝郁为标，本虚标实，治疗时以补肾疏肝为基本原则。徐福松主张三因制宜，强调从心肝脾论治阳痿［11］。秦国政提出阳痿病机多为肾虚肝郁血瘀，主张以疏肝补肾活血法治疗本病［12］。李海松等［13］强调阳痿的最终病理趋势是血瘀，临证之际重视活血化瘀之法的运用。从本研究的文献数据挖掘结果来看，治疗本病多以入肾经、肝经、脾经药物为主，均符合各医家的观点和临床实践用药规律。3．1 高频药物使用分布分析使用频次前3 位的药物有肉苁蓉( 92 次) 、菟丝子( 91 次) 、熟地黄( 78 次) 。肉苁蓉，有温肾壮阳、补益精血、润燥通便之功效，用于治疗男性性功能障碍、女性不孕、便秘等疾病。现药理研究表明，肉苁蓉可促进性激素分泌或表现性激素样作用，具有改善性功能、提高记忆力、抗动脉粥样硬化、抗衰老等作用［14-15］。菟丝子具有补肝益肾、明目止泻、安胎等功效，最新研究表明，菟丝子醇提液可刺激睾酮分泌，菟丝子在治疗男性性功能障碍、心血管疾病中具有良好疗效［16-17］。熟地黄有补血滋阴、填精益髓的功效，药理研究表明熟地黄所含的梓醇、毛蕊花糖苷有保护肾脏的功能; 地黄多糖具有增强免疫、促进造血功能、抗焦虑等作用［18-19］。上述“三药”( 肉苁蓉、菟丝子、熟地黄) 从中医理论阐述为补益肝肾、填精益血等多种功效，通过药理研究发现三药通过作用于血液、内分泌等系统，在男性功能方面均能发挥一定疗效。3．2 高频药物功效分布分析功效频次前3 位的药类有补虚药( 826 次) 、温里药( 195 次) 、收涩药( 113 次) 。各代医家对本病的认识虽有不同，但大多医家均认为阳痿以正虚为本，肝郁、血瘀为标，属本虚标实、虚实夹杂之证，治疗本病应以补益为主，然补虚药多性温，故补虚药使用频次最高，温里药次之。古代医家多持有“一精十血”的观点，认为男性的精液宝贵，若精液外泄过多，会使身体亏虚，故治疗阳痿时，在辨证论治的前提下应适当加入收涩药。3．3 高频药物药性分布分析药性频次前3 位为温性( 932 次) 、平性( 317次) 、热性( 126 次) 。古代医学文献对阳痿的认识，强调本病本虚标实的病机特点，治疗时以补益为主，补益药分为补气药、补血药、补阴药、补阳药，除补阴药外，其它药物药性均偏温热，故温性、平性、热性药物使用频次较高。3．4 高频药物药味分布分析药味频次前3 位为甘( 1087 次) 、辛( 518 次) 、苦( 390 次) 。甘味能补、能和、能缓，可顾护脾胃，扶正祛邪，治病求本，调和诸药; 辛味能散、能行，具有发散、行气、行血的功效，有活血化瘀的功效; 苦味能泄火、燥湿、坚阴，具有清热燥湿、泻火存阴的功效; 甘、苦、辛味药物并用，体现了用药补泻结合，标本兼治，共同达到祛邪而不伤正之功。3．5 高频药物归经分布分析归经频次前4 位为肾经( 1231 次) 、肝经( 745次) 、脾经( 631) 、心经( 478 次) 。中医传统治疗阳痿多从肾论治，认为肝肾同源，肝肾精血互化; 阳痿病位在宗筋，与肝密切相关，同时宗筋的濡养离不开脾胃化生气血; 心脾两脏为“母子”关系，生理上心主血、脾统血，宗筋勃起依赖于心血灌溉、心气推动，与心主神明关系密切［20-22］。故阳痿的发病可从归经规律中看出常用中药紧扣以肾、肝、脾、心功能失调为本，用药归经切合病机。3．6 高频药物关联规则分析当以最小支持度10 %、最小置信度60 %和最大前项数1 进行关联规则分析; 所得药对配伍规则可见，支持度最高的药对菟丝子—肉苁蓉配伍最多，其次是巴戟天—肉苁蓉、鹿茸—肉苁蓉、鹿茸—菟丝子、牛膝—肉苁蓉等; 以上5 组药对共用可有益肾填精、补肝活血之效。以药测方，通过药物关联规则分析可知，使用频次支持度较高的几味中药在临床上应用也颇多。3．7 基于层次聚类的新方组合分析对210 首方剂进行数据挖掘，得到5 个治疗阳痿的新处方。从新处方的药物组成进行分析，治法以补益肝肾，健脾养心为主，兼以活血化瘀。方一治以滋补肝肾、益血养阴; 方二治以补脾益肝、固精助阳; 方三治以活血化瘀、温肾助阳; 方四治以补肾填精、滋阴益髓; 方五治以补肾宁心、活血益肝。通过以上新方提示可知在治疗阳痿时，不能一味补益，应适当运用活血化瘀类药物。4 结语综上所述，本研究通过对《中医方剂大辞典》中治疗阳痿的处方进行药物频数分析、关联关系分析及复杂系统熵聚类分析，得出了古代医家治疗阳痿用药组方的规律及现在可挖掘的新处方。研究结果发现，古代医家治疗阳痿常用肉苁蓉、菟丝子、熟地黄、巴戟天、鹿茸、牛膝、附子、五味子、远志等药物，以温肾助阳，宁心安神为法，选药多温平，且归经多为肾经、肝经、脾经、心经; 多选用菟丝子—肉苁蓉、巴戟天—肉苁蓉、鹿茸—肉苁蓉、鹿茸—菟丝子、牛膝—肉苁蓉等药物组合。对单个药物组合的分析，可以发现其以温肾助阳，补气活血为主。对新处方的药物组成进行分析，治法以补益肝肾，健脾养心为主，兼以活血化瘀，为临床治疗阳痿提供了新思路。前人治疗阳痿多运用益肾温阳之品，活血、安神之品用之较少，通过对新方的组合分析，结合当代人的生活方式、体质分析，现在治疗阳痿，应结合心理等多方面因素，扩大药物的使用范围。通过以上结果分析，对于当代医家在临床上辨证施治用药及开拓治疗新思路有着一定的指导意义。参考文献［1］ 王琦，秦国政．王琦男科学［M］．郑州: 河南科学技术出版社，2007: 265．［2］ 张庆江，朱积川，许清泉．三城市2226 例男性勃起功能流行病学调查［J］．中国男科学杂志，2003，17( 3) : 191-193．［3］ 陈昭典，谭付清．勃起功能障碍治疗的现状与进展［J］．中华男科学杂志，2005，11( 7) : 548-549．［4］ 孙自学，李鹏超．中医药治疗勃起功能障碍的研究进展［J］．中华中医药学刊，2018，36( 3) : 528-530．［5］ 彭怀仁．中医方剂大辞典［M］．北京: 人民卫生出版社，1994．［6］ 陈蔚文．中药学［M］．北京: 中国中医药出版社，2008．［7］ 国家药典委员会．中华人民共和国药典( 一部) ［S］．北京: 中国医药科技出版社，2015: 6．［8］ 李杲．兰室秘藏［M］． 北京: 中医古籍出版社，1986: 15．［9］ 赵文，王祖龙，张琦，等．阳痿中医辨治溯源［J］．中医药临床杂志，2018，30( 5) : 875-877．［10］ 王彬，宣志华，李曰庆．李曰庆从肝肾论治阳痿经验［J］．中国性科学，2013，22( 11) : 49-51．［11］ 金保方，李相如，周翔．徐福松教授辨治阳痿经验［J］．南京中医药大学学报，2008，24( 5) : 292-295．［12］ 汤林，邓洋，袁卓珺．秦国政教授疏肝益肾活血法治疗阳痿的经验［J］．云南中医中药杂志，2015，36( 4) : 1-3．［13］ 李海松，马健雄，王彬，等．阴茎中风探讨［J］．中医杂志，2015，56( 23) : 2064-2066．［14］ 刘忠平，李质馨，田洪艳，等．肉苁蓉对生殖系统影响的研究进展［J］．上海中医药杂志，2015，49( 12) : 84-86．［15］ 吾买尔江·牙合甫，姚刚．肉苁蓉功效的实验研究进展［J］．湖南中医杂志，2016，32( 4) : 193-196．［16］ 林玉榕，郑丽燕． 中药菟丝子药理研究［J］． 生物技术世界，2014，8( 2) : 84．［17］ 夏卉芳，李啸红．菟丝子的药理研究进展［J］．现代医药卫生，2012，28( 3) : 402-403．［18］ 杜珂，高晓霞，王锋，等．基于药效物质基础的熟地黄质－效评价研究进展［J］．中草药，2019，50( 6) : 1477-1484．［19］ 李乃谦．熟地黄活性成分药理作用的研究进展［J］．中国处方药，2017，15( 1) : 14-15．［20］ 陆泽楷，周少虎，翁治委，等．周少虎教授从心肾论治阳痿经验［J］．中国性科学，2018，27( 3) : 98-100．［21］ 孙自学，李鹏超．从肝论治勃起功能障碍［J］．辽宁中医杂志，2018，45( 4) : 701-703．［22］ 李卫强，马玉宝，韩金荣． 马玉宝从心脾论治阳痿经验探析［J］．山西中医，2018，34( 12) : 6-8．

摘要: 目的建立HPLC 法同时测定肉苁蓉属药材中松果菊苷、金石蚕苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、2' － 乙酰金石蚕苷和2' － 乙酰毛蕊花糖苷含量的方法。方法采用岛津Inertsil C18色谱柱( 4． 6 mm × 250 mm，5． 0 μm) ，以乙腈( A ) －0． 1%磷酸水溶液( B ) 为流动相，梯度洗脱。流速为1． 0 mL·min － 1 ，柱温20℃，检测波长为330 nm。结果松果菊苷、金石蚕苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、2' － 乙酰金石蚕苷和2' － 乙酰毛蕊花糖苷6 个成分的进样量分别在0． 240 ～ 2． 400μg ( r = 0． 9993) ，0． 300 ～ 3． 000 μg ( r = 0． 9998) ，0． 072 ～ 0． 720 μg ( r = 0． 9994) ，0． 006 ～ 0． 060 μg( r = 0． 9991) ，0． 150 ～1． 500 μg ( r = 0． 9999) ，0． 030 ～ 0． 300 μg ( r = 0． 9993) 线性关系良好; 平均回收率( n = 3) 在98． 81% ～ 101． 52% 之间，ＲSD 的范围为0． 3% ～ 2． 8%。含量测定结果表明，肉苁蓉和德赢vwin登录 中含量最高的成分依次为松果菊苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷; 肉苁蓉中均含有量较大的2' － 乙酰毛蕊花糖苷; 而德赢vwin登录 中检测不到; 二者均不含金石蚕苷和2'－ 乙酰金石蚕苷。盐生肉苁蓉主要的成分为松果菊苷、毛蕊花糖苷、2' － 乙酰毛蕊花糖苷，还有一定量的金石蚕苷。沙苁蓉的特征性成分为金石蚕苷和2' － 乙酰金石蚕苷，毛蕊花糖苷和2' － 乙酰毛蕊花糖苷含量极低，松果菊苷检测不到。结论建立的HPLC 方法可把肉苁蓉属4 种药材明确区分开来，方法简便、准确且重复性好，可望为肉苁蓉药材和饮片的质量评价和有效控制提供科学依据。关键词: 肉苁蓉; 德赢vwin登录 ; 盐生肉苁蓉; 沙苁蓉; 苯乙醇苷; 松果菊苷; 含量测定肉苁蓉属( Cistanche) 药用植物，我国主要分布有5 种，肉苁蓉C． deserticola、德赢vwin登录 C． tubulosa、沙苁蓉C． sinensis 和盐生肉苁蓉C． salsa 最为常见［1］。肉苁蓉C． deserticola 和德赢vwin登录 C． tubulosa 作为肉苁蓉( Cistanches Herba) 的正品基原植物被我国药典所收载［2］; 而盐生肉苁蓉C． salsa 以及沙苁蓉C． sinensis 在民间也有一定的药用历史，但是多数情况认为盐生肉苁蓉是民间习用品，而沙苁蓉是伪品。文献报道这四种植物的特征性成分均为苯乙醇苷类成分［3 ～ 6］，并且药理研究表明该类化合物是肉苁蓉发挥药理活性的重要物质基础，具有改善学习记忆、抗衰老、抗疲劳、增强机体免疫力等活性［7 ～ 9］。课题组通过市场走访调查发现，以上四种药材在市场均有销售，药材和饮片名肉苁蓉或盐生肉苁蓉; 以沙苁蓉冒充盐生肉苁蓉或肉苁蓉情况时有发生; 也有正品伪品掺杂在一起的情况。本研究收集了肉苁蓉属15 批药材或饮片( 市售12 批，采集3 批) ，在预实验基础上，建立了高效液相色谱法同时测定肉苁蓉属药材和饮片中6 种主要成分: 松果菊苷( echinacoside，1) 、金石蚕苷( poliumoside，2) 、毛蕊花糖苷( acteoside，3) 、异毛蕊花糖苷( isoacteoside，4) 、2' － 乙酰金石蚕苷( 2＇ － acetyl poliumoside，5) 和2' －乙酰毛蕊花糖苷( 2＇－ acetyl acteoside，6) 含量的方法，并对这些药材和饮片进行含量测定，为区分市售肉苁蓉药材的质量，鉴定药材真伪提供科学依据。1 仪器与试药UltiMate 3000 型高效液相色谱仪( Thermo Fisher， chameleon色谱工作站) ，AB － 135S 分析天平、AL240 分析天平( 十万分之一，万分之一，瑞士梅特勒－ 托利多) ，KQ － 500DE 超声仪( 昆山市超声仪器厂) 。对照品松果菊苷和2' － 乙酰毛蕊花糖苷购于上海源叶生物试剂公司，纯度≥98%，供含量测定用; 金石蚕苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷和2' － 乙酰金石蚕苷均为实验室自制，经MS，1H －13C NMＲ 和13C － NMＲ 确定结构，HPLC 峰面积归一化法测得纯度均≥98%( 对照品结构见图1) 。乙腈为色谱纯，水为纯净水，其余试剂均为分析纯。15 批肉苁蓉属药材或饮片为采集或购自药材公司( 见表1) 。2 方法与结果2． 1 溶液的制备2． 1． 1 对照品溶液精密称取对照品松果菊苷、金石蚕苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、2' － 乙酰金石蚕苷和2' － 乙酰毛蕊花糖苷适量，甲醇定容，分别配制成质量浓度为1． 0，2． 5，0． 6，0． 3，5． 0，0． 3mg· mL － 1的单一对照品储备液，并置于4℃的冰箱中保存，备用。2． 1． 2 供试品溶液取药材粉末( 过四号筛) 约0． 1g，精密称定，精密加入70%甲醇溶液25mL，静置30min，称重，超声( 功率500W，频率40 kHz) 提取40min，待冷却至室温后称重，用70% 甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液并用0． 45μm 微孔滤膜过滤，即得。2． 2 色谱条件采用岛津Inertsil C18色谱柱( 250 mm × 4． 6mm，5 μm) ，以乙腈( A ) － 0． 1%磷酸水溶液( B ) 为流动相，梯度洗脱( 0 ～ 8 min， 89% B→85% B; 8 ～ 13 min， 85% B→83% B; 13～ 20 min，83% B→78% B; 20 ～ 36 min，78% B→74% B; 36 ～ 48min， 74%B ) ，流速为1． 0 mL·min － 1 ，柱温20℃，检测波长为330nm，进样量10μL。在该色谱条件下，各组分的分离度均大于1． 5，理论塔板数均大于10000，色谱图见图2。2． 3 方法学考察2． 3． 1 线性关系考察精密吸取“2． 1． 1”项下的单一对照品储备液各1． 20，0． 60，0． 60，0． 10，0． 15，0． 50 mL 置于5 mL 量瓶中，甲醇定容，摇匀，即得混合对照品溶液。分别精密吸取上述混合对照品溶液1，2，4，6，8， 10 μL 注入液相色谱仪，按“2． 2”项下色谱条件进行测定，以进样量X ( μg ) 为横坐标，峰面积Y 为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，线性方程、r 和线性范围见表2。2． 3． 2 精密度试验取药材粉末( S15) ，按“2． 1． 2”项下的方法制备供试品溶液，连续进样6 次，记录峰面积，得出松果菊苷、金石蚕苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、2' － 乙酰金石蚕苷和2' － 乙酰毛蕊花糖苷峰面积的ＲSD 分别为1． 3%，1． 9 %，2． 6 %，3． 0 %，1． 8 %，1 ． 3 % ，表明仪器精密度良好。2． 3． 3 稳定性试验取药材粉末( S15) ，按“2． 1． 2”项下的方法制备供试品溶液，分别于制备溶液后的0，2，4，6，8， 12h 内进样测定，得出松果菊苷、金石蚕苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、2' － 乙酰金石蚕苷和2' － 乙酰毛蕊花糖苷含量的ＲSD 分别为1． 3 %，1． 8 %，2． 4 %，2． 3 %，1． 7 %，1． 7 %，含量表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。2． 3． 4 重复性试验取药材粉末( S15) ，按“2． 1． 2”项下的方法制备供试品溶液，平行制备6 份，进样测定，测得松果菊苷、金石蚕苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、2' － 乙酰金石蚕苷和2' － 乙酰毛蕊花糖苷的平均含量分别为6． 37，9． 89，3． 08，0． 15，2． 08 和2． 97mg·g － 1 ，ＲSD 分别为1． 8 %，2 ． 3 %，3． 0 %，2． 5 %，2 ． 4 %和2． 3 %，表明该方法的重复性良好。2． 3． 5 加样回收率试验取已知含量的药材粉末( S15 ) 约0． 05 g，精密称定，平行称定9 份，分别精密加入相当于药材中6个待测成分含量的80%， 100%， 120% 倍量的对照品溶液，平行测定3 份，按“2． 1． 2”方法制备供试品溶液，进样测定，计算各成分的加样回收率及ＲSD，结果见表3，表明该方法准确度良好。2． 4 样品含量测定分别称取不同批次的药材干燥粉末约0． 1g，精密称定，按“2． 1． 2”项下的方法制备供试品溶液，按“2． 2”项下的色谱条件进行测定，记录峰面积，按回归方程计算6 个化学成分的含量，结果见表4。3 结论与讨论3． 1 提取条件的优选本实验对不同提取方法( 加热回流提取和超声提取) ，提取溶剂( 水、30 % 甲醇、50 % 甲醇、70 % 甲醇、甲醇、30 % 乙醇、50 % 乙醇、70 % 乙醇、乙醇) ，浸泡时间( 0，0． 5，1 h) ，提取时间( 20，30，40，50，60，90 min) ，取样量( 0． 05，0． 10，0． 15，0． 20，0． 25 g) 进行单因素考察，最终确定，称取药材约0． 1g，加70% 甲醇25 ml，浸泡0． 5 h，超声40 min 为最佳提取条件。3． 2 色谱条件的优化通过二极管阵列检测器进行全波长扫描( 210 ～ 400 nm) ，表明在330 nm 处6 个化学成分均有较大吸收，且杂质成分干扰较少，故选择330 nm 为检测波长。在流动相筛选时分别考察了乙腈－ 0． 10% 磷酸水，乙腈－ 0． 15% 磷酸水，乙腈－ 0． 20% 磷酸水流动相系统，样品中各成分色谱峰在乙腈－ 0． 10% 磷酸水流动相系统中分离程度最好，故最终确定此流动相。3． 3 结论本研究在实地收集样品的基础上，结合药材及饮片的性状特征，并通过HPLC 预实验，可基本判断市售肉苁蓉属药材主要有如下几个来源: 两种药典正品肉苁蓉C． deserticola、德赢vwin登录 C． tubulosa; 民间习用品盐生肉苁蓉C． salsa; 非正品沙苁蓉C． sinensis( 民间疗效类似于正品) ; 还有的是正品和非正品掺杂。5 种来源样品在同一色谱条件下的代表性的图谱见图2B ～ 2F。由图2B、2C 和表4 可知，肉苁蓉和德赢vwin登录 中特征性成分以及含量最高的成分是我国药典检测的指标性成分松果菊苷( 1) 和毛蕊花糖苷( 3) ，其次为异毛蕊花糖苷( 4) ，肉苁蓉药材中均含有一定量的2' － 乙酰毛蕊花糖苷( 6) ; 而德赢vwin登录 中检测不到2'－ 乙酰毛蕊花糖苷( 6) ［10， 11］; 二者均不含金石蚕苷和2' － 乙酰金石蚕苷。由图2D 和表4 可知，盐生肉苁蓉含量极高的成分为松果菊苷( 1) 、毛蕊花糖苷( 3) 、2' － 乙酰毛蕊花糖苷( 6) ，还含有一定量的金石蚕苷( 2) 。由图2E 和表4 可知，沙苁蓉的特征性成分为金石蚕苷( 2) 和2' － 乙酰金石蚕苷( 5) ，毛蕊花糖苷( 3) 和2'－ 乙酰毛蕊花糖苷( 6) 含量极低，松果菊苷( 1) 检测不到。市售两批正伪掺杂样品( 图2F，表4) ，6个成分均可检测到。实验结果也表明正品肉苁蓉药材中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量差异也很大，这可能和产地、炮制加工等因素都有关。本实验建立的HPLC 方法可把肉苁蓉属4 种药材明确区分开来，方法简便、准确且重复性好，可望为肉苁蓉药材和饮片的质量评价和有效控制提供科学依据。参考文献:［1］ 国家中医药管理局《中华本草》编委会． 中华本草． 二十卷［M］．上海: 上海科学技术出版社，1999．［2］ 国家药典委员会． 中国药典，一部［S］． 北京: 中国医药科技出版社，2015: 135．［3］ Jiang Y，Li S P，Wang Y T，et al． Differentiation of Herba Cistanchesby fingerprint with high － performance liquid chromatography － diodearray detection － mass spectrometry［J］． J Chromatogr A，2009，1216( 11) : 2156．［4］ Lei L，Jiang Y，Liu X，et al． New Glycosides from Cistanche salsa［J］． Helv Chim Acta，2010，90( 1) : 79．［5］ Liu X M，Li J，Jiang Y，et al． Chemical constituents from Cistanchesinensis ( Orobanchaceae) ［J］． Biochem Syst Ecol，2013，47( 8) : 21．［6］ Tu P F，Shi H M，Song Z H，et al． Chemical constituents of Cistanchesinensis［J］． J Asian Nat Prod Ｒes，2007，9( 1) : 79．［7］ 王晓琴，黄慧，李彩峰，等． 列当属、肉苁蓉属与草苁蓉属药用植物亲缘学初探［J］． 中国中药杂志， 2018，43( 23) : 4608．［8］ Zhu M，Lu C，Li W． Transient exposure to echinacoside is sufficient toactivate Trk signalingand protect neuronal cells from rotenone［J］． JNeurochem，2013，124( 4) : 571．［9］ Li F，Yang X，Yang Y，et al． Antiosteoporotic activity of echinacosidein ovariectomized rats［J］． Phytomedicine，2013，20( 6) : 549．［10］ Morikawa T，Pan Y，Ninomiya K，et al． Acylated phenylethanoid oligoglycosideswith hepatoprotective activity from the desert plantCistanche tubulosa［J］． Bioorgan Med Chem，2010，18( 5) : 1882．［11］ Pan Y N，Morikawa T，Ninomiya K，et al． Bioactive constituents fromchinese natural medicines． XXXVI． Four new acylated phenylethanoidoligoglycosides，kankanosides J1，J2，K1，and K2，from stems ofCistanche tubulosa［J］． Chem Pharm Bull，2010，58( 4) : 575．