在临床应里上加以区分。德赢vwin登录 的高苯乙醇苷有良好的抗氧化和抗衰老作用，药和保健品中,如杏辉天力(杭德赢vwin登录 为原料研制出治疗血药：荒漠肉苁蓉多糖和浸出物含疫力和润肠通便，常用于临床治POS:(784,107)此，不必过分强调两者的质量比RGB:(255,255,255)市场调查中，荒漠肉苁蓉的价格一般是德赢vwin登录 的3倍以上。这与德赢vwin登录 种植周期短，产量大有关。德赢vwin登录 的产量为鲜品4500kg＊hm-2以上，而荒漠肉苁蓉仅为1500kg＊hm-2。同时，德赢vwin登录 在冬季有冻害风险，故应尽量在过冬前采收，种植周期为11～20个月；荒漠肉苁蓉种植周期一般为2-3年以上。近3年来，德赢vwin登录 的价格逐渐升高，已从2017年的18元／kg上升至2020年的32元／kg：与此同时，荒漠肉苁蓉价格则是逐年下降，从2017年的130元／kg降至2020年的95元／kg。分析认为，产生这一现象的主要原因是前几年德赢vwin登录 价格过低，导致栽培面积减少、产量降低，属于市场的正常调整。德赢vwin登录 与荒漠肉苁蓉的价格差异是客观长期存在，与药材质量关系不大。3.2 野生来源与人工种植近年来，随着肉苁蓉栽培技术的进步，野生采挖量已逐年下降。2014年，人工种植肉苁蓉药材产量超过2.3x10kg，占肉苁蓉药材总产量的80％以上。德赢vwin登录 种植周期短、产量大，以栽培品为主：而荒漠肉苁蓉产量仍不理想，大部分来源于野生。刘文静等 利用多元统计学方法分析栽培与野生来源德赢vwin登录 的核磁共振氢谱（＇H-NMR），结果显示，两者差异无统计学意义。杨秀梅等［对新疆荒漠肉苁蓉的研究指出，栽培肉苁蓉的多糖含量显著高于野生品，野生肉苁蓉的松果菊苷含量高于栽培品，但差异均无统计学意义；同时，在对小鼠的免疫活性实验中，两者的差异也无统计学意义。蓉种植采用仿野生栽培，即选择2～3年的栽培或天然梭梭树，挖出根系后人工接种肉苁蓉种子，除了在接种时进行了浇水和粪肥育苗外，除发生特别干旱的情况，生长期间不进行浇水和施肥。在这种人为干预极少种植模式下，肉苁蓉有长达3年甚至更久的时间独自生长，野生和栽培品之间差异无统计学意义。因此，肉苁蓉栽培或野生与药材质量关系不大。3.3 产地因素荒漠肉苁蓉主要分布在内蒙古、新疆北部、青海、甘肃、宁夏5个省区：德赢vwin登录 仅分布于新疆天山以南塔克拉玛干沙漠周围各县，故仅荒漠肉苁蓉需要区分产地。不同产地具有不同的气候、地理环境及独特的生态系统。道地产地出产的肉苁蓉自古以来经临床证实疗效突出、质量优良。黄林芳等对荒漠肉苁蓉的2个主产区新疆北疆和内蒙古阿拉善高原的样品进行了化学及分子地理标识的研究，基于超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱法（UPLC-QTOF／MS）鉴定出16种化合物，在多种聚类分析模式下均可明显分开。同时，2个产区的样品在叶绿体基因psbA-mH序列分析中也能进行区分，说明荒漠肉苁蓉已形成稳定的2种生态型。进而对这2地的年降水量、均温、相对湿度等生态因子进行主成分分析（PCA），推测生态型的差异是肉苁蓉适应不同的生态地理环境产生，即产地因素会使药材在基因表达和生化指标上产生差异，最终可能影响药材质量和临床疗效。赵志红等的研究也证明了这一推测，在松果菊苷、毛蕊花糖苷、苯乙醇总苷、可溶性多糖、半乳糖醇、甜菜碱这6种药效成分的比较中，不同产地的组分含量存在显著性差异，并以道地产区内蒙古的总体水平最高。在商品销售环节中，荒漠肉苁蓉以道地产区内蒙古质量最优，统货价格均在100元／kg以上，其余产地的肉苁蓉药材统货价格为60～90元／kg：德赢vwin登录 未区分产地。从生态地理环境的角度分析，宁夏银川产地与内蒙古阿拉善的地理环境条件非常相似，仅以贺兰山脉相隔，在黄林芳等的结论中，以2种生态型划分时，甘肃和宁夏产地与内蒙古产地同属一类。本课题组对宁夏产肉苁蓉的研究也表明，宁夏产地的荒漠肉苁蓉质量较好。因此，对肉苁蓉产地等级的划分需要调整。秋季。由于春季采收的样品可能抽薹开花，所以传统认为秋季采收优于春季。现代栽培技术推广后，可以在接种时做好标记，理论上营养生长的任何阶段均可采挖。调查发现，德赢vwin登录 多为秋季采挖，荒漠肉苁蓉多为春季出土时采收。一般根据地面的裂缝定位，在附近挖掘。裂缝是肉苁蓉伸长期拱土的痕迹。概述肉苁蓉出土到开花的过程很快，采收不及时会导致药材带有花序。生产中大多掰掉上部花序，下部分作为药用。钱浩等比较发现，秋季采收的肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷含量显著高于春季，4种苯乙醇苷类成分总量也高于春季：春季采收的肉苁蓉中2＇-乙酰基毛蕊花糖苷含量显著高于秋季，但有多批样品指标性成分含量未达到《中国药典》2015年版要求。庞金虎等报道，秋季采收的肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷2个指标成分含量显著高于春季。但是，王雪媛等”测得春季肉苁蓉样品的松果菊苷和毛蕊花糖苷总量达秋季样品的3倍以上，春季毛蕊花糖苷含量约为秋季的30倍，甜菜碱含量约为秋季的2倍，半乳糖醇和可溶性多糖含量在秋季样品中显著高于春季。王夏测得春季德赢vwin登录 样品中苯乙醇苷类、可溶性糖和浸出物含量显著高于秋季样品。这些结论出入如此之大，推测是样品等级不同、样品发育期差异和加工方法不同等原因导致，但文章中均未详细说明样品大小、是否抽薹等信息。从生育期角度分析，肉苁蓉的生育期分为营养生长和生殖生长2个阶段。作为根寄生植物，其营养生长发生在地下，根据接种深度不同可持续1至数年；生殖生长为出土后抽薹开花形成种子，一般在4～6月完成，过程十分迅速。在生殖生长阶段，肉苁蓉肉质茎内的营养物质会被大量消耗，地下茎逐渐枯萎，造成采收后药材干瘪、质硬、柴性增大，有效成分含量也显著低于营养生长株。王信宏等监测了德赢vwin登录 全生育期的松果菊苷、毛蕊花糖苷、甘露醇、可溶性糖及淀粉含量变化，全生育期中生殖生长又细分为了伸长期（出土前和出土后）、现蕾期、开花期和蒴果发育期，结果表明，可溶性糖和淀粉含量均是出土前最高，出土后含量逐渐降低，松果菊苷、毛蕊花糖苷和甘露醇的相对含量均为营养生长阶段最高，整个生殖生长阶段含量逐渐减少：但比较松果菊苷、毛蕊花糖苷和甘露醇的积累量，则是未出土前达到最高，出土后降低，与可溶性糖及淀粉的含量变化趋势相同。且在出土后的伸长期及现蕾期中，虽然有效成分总量降低，但与积累量最高的未出土前差异无统计学意义。故现有的采收方法是科学、可靠的，采收季节对肉苁蓉药材质量无影响。3.5 生长年限和个体大小目前，药材个体大小一般作为等级划分的主要依据。单个个体越大，定价越高，这可能与生长年限有关。如前文所述，肉苁蓉在地下的生长阶段大部分属于营养生长，可溶性糖、淀粉及苯乙醇苷类成分含量不断增加，故随着药材生长时间的增加，植物会积聚更多的营养物质，同时伴随个体不断增大，推测肉苁蓉个大为优。在肉苁蓉生长年限的研究中，赵阳武测定了甘肃武威人工栽培1～4年生肉苁蓉松果菊苷、毛蕊花糖苷、单宁酸和儿茶素含量，并用不同剂量的肉苁蓉水提液对雌雄小鼠进行灌胃实验，分析不同处理对小鼠提高记忆力、抗疲劳、抗氧化、增加体质量及通便效果的影响。不论是含量测定数据，还是药理实验结果，都无明显证据说明生长年限高的肉苁蓉质量更优。在以干质量为变量时，王信宏等网对营养生长阶段单株干质量为20、40、60、80、100、120g的德赢vwin登录 进行研究，结果显示，干质量越大，松果菊苷和毛蕊花糖苷相对含量越小，甘露醇先升高后降低，换算成单个个体的积累量后，毛蕊花糖苷和甘露醇的总量随干质量增加而上升，松果菊苷总量差异无统计学意义。这说明体积越大的药材含有更多的药效成分，但相对含量小于体积小的药材。药效成分的积累和分布研究也验证了这一结论。植物在漫长的地下生长过程中，根茎会分泌一系列次生代谢产物来进行植物和周围环境间的信息交流、信号传导，同时抵抗病虫害的入侵。因此，根茎类药材中次生代谢产物往往皮部含量较高，内部则大多储存营养物质。Hu等测得松果菊苷、总酚含量，1,1-二苯基2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除活性和苯丙胺酸解氨酶（PAL）活性在肉苁蓉中均为鳞片＞形成层环＞底部＞中部＞顶部。彭芳也测得肉苁蓉中5种苯乙醇苷类成分含量的横向分布为皮部显著高于中部和髓部，且皮部和髓部的苯乙醇苷类成分含量最高可相差12倍。故推测次生代谢产物的相对含量可能和根茎表面积呈负相关，而营养物质如淀粉、多糖则可能呈现正相关关系，药效成分总积累量与药材干质量正相关。

“内蒙古肉苁蓉”现已申请成为国际地理标志产品，在质量技术要求中按肉质茎的长度分为4个等级，包括通（统）货：长度在30cm以下：小条：长度为30～60cm；中条：长度为60～100cm；大条：长度在100cm以上。有学者以个体大小和外形对干燥净制后的肉苁蓉分级，荒漠肉苁蓉的主要区分点为肉质茎长度、直径和含杂率，一等品肉质茎长度在30cm以上，直径5cm以上，单株顺直：二等品肉质茎长度＞20cm，直径＞3cm，顺直；三等品肉质茎长度在15cm以上，直径＞2cm，稍弯，杂质在1％以下。德赢vwin登录 的区分点为肉质茎长度和含杂率，一等品肉质茎长度＞20cm，二等品为15～20cm，三等品为10～15cm，杂质在1％以下044。以上给出的分级标准可能是为了便于包装，所以重点放在了长度等外观性状上。但商品等级制定的最终目的是便于销售，肉苁蓉是按斤售卖，因此，建议将个体质量纳入分级标准。燕蔚等对内蒙古阿拉善肉苁蓉药材市场进行实地考察，结合市场售价、市场的实际销售品次分类和外观形状特征，将荒漠肉苁蓉分为了5个等级，未抽薹的肉苁蓉为优质品，共分4个等级，即特等品、一等品、二等品、统货，性状特征为质重、柔韧、鳞片密：抽薹肉苁蓉为次等品，特征为体轻、质硬、断面常有裂隙、鳞片疏；同时，各等级给出了具体的售价（表2）。表2 内蒙古阿拉善荒漠肉苁蓉的等级标准及市场售价等级平均直径/单个个体质量/质地特征每千克市场cm율售价／元特等品>4.0>500质重、柔铺>500一等品3.0-4.0300-500质重、柔额300-500二等品<3.0<300质重、柔韧200-300统货质重、柔韧300次等品质硬、抽薹150彭芳等 [m对宁夏产地采收后的新鲜肉苁蓉进行了分级，并比较各类有效成分的含量，以茎粗、顶粗、鲜质量和肉质茎长度分成了3个等级。由于商品分级一般采用干质量指标，干燥后体积变化很大，但长度不变，按文中提到的肉苁蓉阴干干燥减失质量85％计算后，分级指标见表3。与前文中的分级标准比较，本标准中肉质茎长度的分级指标远高于其他标准，如按陈庆亮等给表4 不同来源肉苁蓉规格等级及价格来源基原规格等级每千克价格／元新疆荒漠肉苁蓉野生140栽培选130栽培统95德赢vwin登录 栽培统35内蒙古荒漠肉苁蓉栽培选150栽培统130德赢vwin登录 栽培选40青海荒漠肉苁蓉栽培统60德赢vwin登录 栽培统304甘肃荒漠肉苁蓉栽培选100进口荒漠肉苁蓉野生1252.2 零售肉苁蓉肉苁蓉（荒漠）在2018年被国家卫生健康委员会列入了《按照传统既是食品又是中药材物质目录》。这表明除了治疗特定疾病外，普通人出于养生保健的需求，亦可日常食用荒漠肉苁蓉。零售肉苁蓉的主要渠道有医院药房、线下药店和线上网店。线下药店和医院药房销售肉苁蓉饮片，作为药品监管，需要满足中国药典》2020年版规定的各项标准，以炮制方法作为规格标准，标明基原、产地和保质期：线上网店销售的则是荒漠肉苁蓉原药材，多从原产地发货，以初级农产品售卖，产地不可溯源，但荒漠肉苁蓉的各种形状特征完整，分级标准更加丰富。具体分级标准和价格见表5．表5 2020年7月调查肉苁蓉零售产品规格种类和价格基原分级标准每千克价格／元荒漠肉苁蓉整根100-200g300-500200-300g500-800300-400g0001-008400-500g1000-1200切片阴干／晒干450鲜干1000基部1200酒制600德赢vwin登录 切片阴干／晒干50-80线下零售渠道主要是药店和医院。消费者从药店购买肉苁蓉多是根据药方和自身需要抓药：医院医生一般按《中国药典》2020年版规定炮制品种开出的分级标准，可能会全部归入一等品等级：干质量的分级指标则相对低于其他标准，按燕蔚等的标准应为二等或统货，可见不同学者制定的标准差异较大。此外，在实际样品分级时，究竞是某一级的全部标准都满足才定为该级别，还是有所侧重，满足某一项指标即可定级，需要进一步的研究。表3 宁夏产地肉苁蓉药材等级划分建议标准等级干质量／g肉质茎长度／cm一级≥139.320250.64二级80.094-139.32046.82-50.64三级<80.094<46.822 药材市场肉苁蓉规格等级及价格调查2.1 批发肉苁蓉目前，肉苁蓉主产于内蒙古、新疆、青海、甘肃、宁夏等地。笔者于2020年7月对安国、亳州、玉林、荷花池四大药材市场的肉苁蓉价数据进行调查和整理，结果见表4。不同药材市场的肉苁蓉价格几乎没有差异。药材市场销售的荒漠肉苁蓉药材，自2018年以后价格波动较小，价格指数稳定。内蒙古作为肉苁蓉的道地产区，所产肉苁蓉价格最高，选货高达150元／kg：新疆肉苁蓉价格次之：青海产肉苁蓉价格最低，仅为60元／kg，不到内蒙古产肉苁蓉的50％。本课题组前期从安国药材市场购买过不同产地的肉苁蓉药材，检测发现青海产肉苁蓉药材个头细小，经鉴定为盐生肉苁蓉C.salsa（C.A.Mey.）G.Beck.. 由于野生和栽培肉苁蓉在性状上不易区分，故药材市场上的野生或栽培这一等级划分标准可能并不准确。另外，部分药材产地来源有待考证，如青海和内蒙古产地的德赢vwin登录 。进口肉苁蓉为野生肉苁蓉，可能为荒漠肉苁蓉和盐生肉苁蓉混合品，主要来源于与我国新疆接壤的哈萨克斯坦。自2000年肉苁蓉被列为《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）附录II物种后，其国际贸易受到管制。根据企业申报与实际执行的进出口数量来看，实际进口量远少于申报进口量，主要原因可能是出口国哈萨克斯坦当地的贸易限制和肉苁蓉价格降低，利润较少。

李代晴＇，徐荣”，何秀丽＇，冯茹＇，徐常青＇，刘同宁，陈君”1．中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所／濒危药材繁育国家工程实验室，北京 100193；2．宁夏永宁县本草苁蓉种植基地，宁夏 银川 750100［摘要］肉苁蓉是我国常用补益类名贵药材，具有补肾阳、益精血、润肠通便等功效。同时，肉苁蓉（荒漠）还被国家卫生健康委员会列入既是食品又是中药材的物质名单，日常使用需求量大。市场上肉苁蓉分级混乱、标准不一、不同商品规格的肉苁蓉价格相差很多。通过对本草典籍、国家标准、行业标准及文献中肉苁蓉规格等级标准进行梳理及对各大药材市场的实际分级情况和商品价格进行调研，分析基原、产地因素、野生来源与人工种植、采收季节、生育期、生长年限和个体大小等与规格等级有关的因素对肉苁蓉药材质量的影响，提出了根据基原区分规格，以产地、生育期和个体大小划分等级的建议标准，以期为肉苁蓉商品规格等级的优化提供参考。［关键词］肉苁蓉：规格：等级：标准：质量：市场调查［中图分类号］R282 ［文献标识码］A ［文章编号］1673-4890（2021）03-0401-48   doi:10.13313/j.issn.1673-4890.20200803006肉苁蓉始载于《神农本草经》，为上品补益类中药，用于肾阳不足、精血亏虚、阳痿不孕、腰膝酸软、筋骨无力、肠燥便秘。且肉苁蓉安全无毒，小剂量长期服用能增力解乏、暖腰壮阳。现代研究表明，肉苁蓉还具有改善心血管功能、提高免疫力、抗衰老等功效，以肉苁蓉为原料开发的保健品如“中国劲酒“汇仁牌骨力康胶囊”也广受认可。《中华人民共和国药典》（以下简称中国药典）2020年版规定肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉Gistanche deserticola Y.C.Ma或德赢vwin登录 C.tubulosa （Schenk）Wight的干燥带鳞叶的肉质茎0。前者是自古以来的肉苁蓉习用物种，也被一些学者建议称为荒漠肉苁蓉：后者是在肉苁蓉资源量降低、扩大药源的考虑下，自《中国药典》2005年版开始收录为基原植物。这2种基原的肉苁蓉在市场上价格差异巨大，最高时可相差近10倍。同一基原的肉苁蓉又可根据产地、大小、栽培或野生划分不同的规格等级。现行的肉苁蓉商品规格等级标准为1984年颁布的《76种药材商品规格标准》。近几十年来，肉苁蓉的产业现状发生了很大的变化。过去肉苁蓉为野生采挖，造成了资源枯竭和生态破坏，亟须发展肉苁蓉栽培技术。1985年，戈建新首次以梭梭为寄主成功进行荒漠肉苁蓉人工种植，20世纪90年代德赢vwin登录 也试种成功，国家已明令禁止采挖野生肉苁蓉。截至2016年，新疆栽培德赢vwin登录 的面积约为1.36x10＊h㎡9。2015年，内蒙古栽培荒漠肉苁蓉的面积约2x10h㎡。据测算，栽培荒漠肉苁蓉的利润在接种后5年即可达440元／h㎡，之后每年平均为354元／hm。目前，有196种中成药以肉苁蓉为原料。以优质的原料投产有助于提高药品的疗效，需要对肉苁蓉的商品规格进行研究，依据品质分级，以实现优质优价。本研究通过综合分析本草典籍、行业标准及文献中肉苁蓉规格等级标准，结合市场调查中肉苁蓉的实际分级情况和商品价格，列举了与其等级规格和价格差异有关的影响因素，分析影响因素与药材质量之间的关系，以期为肉苁蓉商品规格等级的优化提供参考。1 肉苁蓉规格等级标准记载及相关研究1.1 历史文献记载早在公元480年，陶弘景在《本草经集注》中首次对肉苁蓉的等级进行了介绍：“今第一出陇西，形扁广，柔润，多花而味甘。次出北国者，形短而少花。巴东、建平间亦有，而不如也”。此方法按产地划分的等级，第一等出产于甘肃，根据描述推测为荒漠肉苁蓉；第二等产自陕西、山西一带，体型小，花序少，可能为盐生肉苁蓉：第三等产自四川《新修本草》中解释其为“草苁蓉”，考证为列当 Orobanche coerulescens Steph，盐生肉苁蓉和列当现已不作为肉苁蓉基原植物。宋代苏颂例的《本草图经》亦对产地优劣有少量阐述：“生河西山谷及代郡雁门，今陕西州郡多有之，然不及西羌界中来者，肉浓而力紧”，说的也是当时山西、内蒙古、河北蔚县及陕西北部一带的肉苁蓉出产较多，但不如甘肃地区（西羌）产的肉质多且药力强。可见宋代肉苁蓉仍以产地作为分级标准。至清代《本草从新》记载“长大如臂，重至斤许，有松子鳞甲者良”［00］。2001年《新编中药志》中记载：“以条粗壮、密被鳞片、色暗棕、质柔润者为佳”0。清代以后，个体大小、外观、颜色和质地等性状特征逐渐开始作为肉苁蓉品质评价标准。1984年，原国家医药管理局和卫生部联合制定的《76种药材商品规格标准》中，将肉苁蓉分成甜苁蓉和咸苁蓉2个规格，没有划分等级，全部以统货销售。甜苁蓉即春季采挖后未经盐湖浸泡直接晒干的肉苁蓉，外观与鲜品相差不大，略扁的圆柱形，表面褐色，断面棕褐色，质坚硬或柔韧，气微，味微甜。咸苁蓉为秋季采挖后的新鲜肉苁蓉投入盐湖所得，形状较甜苁蓉更扁，颜色也更深，表面黑褐色，断面黑色或墨绿色，质地柔软，有光泽，味咸。因为秋季肉苁蓉含水量较高，难以干燥，干燥不彻底的肉苁蓉在运输过程中易发霉腐败，因而产地加工用盐浸泡有助于脱水。此外，盐入肾经，也能增加肉苁蓉补肾阳的功效。清代《植物名实图考》记载“肉苁蓉······今药肆所售皆盐制。”［随着干燥工艺的改善和交通运输的便利，目前各产地和市场极少有咸苁蓉销售。1.2 规格等级研究和分级指标面对新的市场现状，2018年中华中医药学会颁布了《中药材商品规格等级 肉苁蓉》0，以肉质茎长度、直径和1kg肉质茎数将肉苁蓉选货规格分为一等和二等2个等级，具体等级信息见表1。表1 肉苁蓉等级划分标准等级 cm cm 个 质地肉质茎长／中部直径／每千克根数／荒漠肉苁蓉 选货 一等>25>3.5<5柔韧二等15-25>2.55-10微有柔性统货>3>2德赢vwin登录 选货 一等15-256-9<5二等10-152.5-55-10统货>5>2.5 

Research Progress of the Development and Application of Cistanche Medicinal Resources陈海燕 Chen Haiyan；郝彩琴 Hao Caiqin；郭鸿雁 Guo Hongyan；冷晓红 Leng Xiaohong（宁夏职业技术学院，银川750021CNingxia Vecational and Technical College.Yinchuan 750021.China)摘要：目的：阐述肉苁蓉资源现状、药理作用及开发利用的价值。方法：查阅相关文献进行总结和归纳。结果：肉苁蓉野生资源较匮乏，人工种植取得可喜成绩。肉苁蓉化学成分较多，含苯乙醇苷类、多糖等多种活性成分，具有补肾阳、益精血、润肠通便、提高免疫力、延缓衰老等多种功效。结论：肉苁蓉植物具有较好的经济效益、生态效益和市场开发前景。Abstract:Objective To describe the status and pharmacological effects of Cistanche melicinal esources and the value of its development.Methods: To accens to eview and summarice the elevant literatre.Resuls:There is lack of Cistanche wild resources,and the atificial plants have achieved gratifying results.The chemical composition of Cistanche is more,its active ingredients,like berurne glycosides,polysaccharides,have many effects,such as,invigorating kaidney yang,supplementing esence and blood,relasing bowel,improving immunity,anti-aging and so on Conelusion:Cistanche plants hawe a better economic and ecological benefit and market devdopment prospects. 引言肉苁蓉（Cistanche deserticola Y.C.Ma）为列当科（Orbanchaceae） 肉苁蓉属（Cistanche）多年生寄生性草本植物，其又名精笋、从蓉、大 德赢vwin登录 （C.tubulona（Schrenk）R.Wight］、盐生肉苁蓉［C.salsa（C.A.芸等，主要寄生于校梭等沙生植物的根部，以干部带鳞叶的肉质茎入 Mey）G.Beck］、沙苁蓉（Csinensis G.Beck）、白花盐苁蓉（C.salsa Var.药。肉苁蓉全草都可入药，其味甘、咸、性温，始载于《神农本草经》，列 albifora P.E.Yu et Z.C.lou），其中白花盐苁蓉为盐生肉苁蓉的一个为上品，能补肾阳，益精血，润肠通便等，素有“沙漠人参”之美誉。历代医家对肉苁蓉的药用价值都给予了极高的评价，东汉《神农本草经》谓其“养五脏，强阴，益精气”：本草经疏》称：“肉苁蓉，滋肾补精血之要药”：李时珍称：“此物补而不峻，故有从容之名”。现代医学研究发现肉苁蓉具有提高机体免疫功能，增强体力和抗疲劳，抗肿瘤，改善性功能障碍，润肠通便，保护肝脏，改善记忆功能障码，防止老年痴呆症，改善脑循环，促进神经细胞生长修复，抗动脉粥样硬化等功效。本文就肉苁蓉的资源现状和研究进展作一综述，以便为进一步开发利用其药用资源提供参考。1 资源状态1.1资源分布 全球有肉苁蓉属植物共约22种，分布于北半球温暖的沙漠、荒漠等干燥地带。在我国主要分布于西北地区的内蒙古、甘肃、宁夏、新疆、青海等5个省区，内蒙为肉苁蓉地道产区之一目前德赢vwin登录 是肉苁蓉的主要基源植物，其次为荒漠肉苁蓉和盐生肉苁蓉，白花盐苁蓉因分布少、产量低，已很难见到。2010年版的《中国药典》收录了荒漠肉苁蓉和德赢vwin登录 为正品药材。1.2资源保护与人工种植 肉苁蓉作为常用补益中药，国内外市场对肉苁蓉药材的需求呈逐年上升趋势，价格也不断上扬。每公斤干品的收购价格已由20世纪80年代末的8-10元上升到现在的300-400元。解放初期，肉苁蓉在我国沙地梭梭林中随处可见。近年来，由于过度滥采滥挖，加之寄生植物繁殖困难，使得野生肉苁蓉资源濒临枯竭，产量每年急剧下降，导致肉苁蓉资源匮乏与市场需求量大的供需矛后加剧。近年来的调查显示，肉苁蓉在我国西部地区分布很广，但野生资源量已不足过去的1％，年产量不足500吨。为保护与合理使用肉苁蓉属植物资源，传承中医文化，开展肉苁蓉规范化、规模化种植基地建设是解决这一矛盾的最有效途径。宁夏为肉苁蓉传统产区之一。现在普遍认为我国肉苁蓉属植物有4种1变种分别为荒漠肉苁蓉（Cistanche deserticola Y．C．Ma．）、变种。我国肉苁蓉的栽培从80年代开始，1985年内蒙、新疆等地开始进行肉苁蓉人工栽培技术研究，先后取得了一些成果。宁夏从1998年开始进行肉苁蓉人工种植技术研究，在腾格里沙漠边缘的沙荒地上探索高效化、集约化、产业化人工种植肉苁蓉技术研究，已成功种植肉苁蓉近3000亩。经研究检测，人工种植肉苁蓉的质量野生肉苁蓉没有区别，品质符合国家药典标准（2010版）码1.3生态效益 肉苁蓉寄主植物-按梭是半荒漠和荒漠地区优良的固沙造林树种，在沙漠地区常形成大面积纯林，有良好的防风固沙作用。如今我国西北地区纷纷将校梭作为生态建设的首选树种进行保护、抚育和人工种植。通过人工种植肉苁蓉，不仅可以恢复荒漠植被，使固沙寄主植物梭梭成为很好的防风固沙屏障，而且还可改善生态环境和沙区农牧民的生活条件，获得显著的生态效益。2 化学成分与药理作用21化学成分 肉苁蓉含多种类型的化学物质。八十年代初，日本科学家从肉苁蓉中发现被命名为“养命因子”的物质。八十年代后期，国内学者对肉苁蓉的化学成分先后进行了系统性研究。迄今为止，已从肉苁蓉属植物中分离鉴定出了69个化合物，主要有苯乙醇苷类、环烯醚菇类、木脂素类、生物碱、多糖等成分。2.1.1苯乙醇苷类 苯乙醇苷化合物属于一种多酚类化合物，是肉苁蓉中主要的活性成分，它在盐生肉苁蓉中含量较高，德赢vwin登录 中含量较低。苯乙醇苷类为补肾阳、提高免疫功能、抗老年痴呆症的活性成分。目前共分离得到22个苯乙醇苷类成分，包括1个单糖苷，14个双糖苷和7个三糖苷。日本学者”从我国内蒙产的盐生肉苁蓉中先后分离出了松果菊苷、类叶升麻苷、2＇-乙酰类叶生麻苷、肉苁蓉苷A、B、C、D、E、F、OsmmtasjdeB共10种。在此之后，我国学者从荒漠肉苁蓉中分出松果菊苷、类叶升麻苷、海胆苷、肉苁蓉苷A、2＇-乙酰类叶升麻苷等。2.1.2 环烯醒菇及其苷类 环烯醒菇类及其苷类是肉苁蓉属植物主要化学成分类别之一，目前从肉苁蓉属植物中分离得到环烯醒菇2个，环烯醒菇作10个列。日本研究者系统分析了我国内蒙产的盐生肉苁蓉，从中分得8-表马钱子酸、8-表去氧马钱子酸、京尼平酸、苁蓉素等10种化合物。罗上风等通过分析荒漠肉苁蓉，从中分得8-表马钱子酸葡萄糖苷，徐文豪等分得8-表钱子苷酸。21.3木脂素及其苷类 到目前为止，从肉苁蓉属植物中分离得到1种木脂素和5种木脂素苷，其中有2种为新木脂素苷。21.4挥发性成分及其他类成分 马熙中等学者研究发现，肉苁蓉中含有挥发性成分，并将其大致分为三类：C16-C28的正构烷烃类，酯类化合物，含氧、含氯化合物。酯类化合物以邻苯二甲酸二丁酯、葵二酸二丁酯和邻苯二甲酸二异辛酯3种为主要成分，而含氧、含氮化合物以丁子香酚为主，其次为香草醛、异丁香酚等。除以上挥发性成分外，肉苁蓉中还含有酚苷、单菇苷、生物碱、多糖、糖苷、描醇、氨基酸、以及铁、锰、锌、铜、钙、镁和磷等无机微量元素，并且铁。锰、锌、铜含量比一般中药高。2.2 药理作用血乳酸、尿素酸的累积，血清尿素氮含量显著降低风，这些药效学研2.2.5调节神经内分泌系统作用 肉苁蓉对人体神经内分泌系统-下丘脑的老化有明显调整作用，可改善“阳虚证”症状者的营养、体质、耐力和抗寒力等，对阳虚患者有明显的强壮作用和治疗作用。陈亚琼等发现肉苁蓉能促进雌性大鼠垂体部分细胞增加，促进卵果孕激素的分泌，增强性腺轴维激素受体，孕激素受体的表达，表明肉苁蓉有参与神经内分泌调节机制的作用。2.2.6保护肝脏作用 肉苁蓉可降低LDH5活性，增加负荷运动小鼠肝糖原含量，促进肝糖原合成，具有保护肝脏和促进体能恢复作用码2.2.7增强记忆力作用 肉苁蓉总苷能改善三氧化铝所致学习记忆障碍，增加脑组织中SOD活性，降低MDA含量，增加脑重系数，对三氯化铝致小鼠学习记忆障碍具有保护作用口。肉苁蓉总苷还有改善氢化可的松导效的肾阳虚小鼠学习记忆障碍，提高小鼠记忆障碍水平的作用。2.2.8其它作用 肉苁蓉除具有上诉功能外，对缺血性心肌具有保护作用，可降低血脂，抗动脉粥样硬化和抗血栓形成。2.3临床应用 肉苁蓉为我国中医用药最广的中草药之一。临床上多用于肾阳不足，精血亏虚所致的痿，不孕，腰膝酸软，筋骨不力，肠燥便秘等。但就目前情况来看，肉苁蓉的临床应用多见于中药配伍，至今研发的肉苁蓉中成药产品很少，今后可利用现代生物医药学等高科技手段，加强这方面的研究开发力度，提高肉苁蓉的使用效率。3讨论与展望肉苁蓉为我国西北干早地区传统名贵中药材，列为国家二级保护植物，并被收入《国际野生植物保护名录》，具有极高的药用价值，在中国已有2000年的药用历史，为历代补肾壮阳处方中使用频度最高的药物。近年来对肉苁蓉的人工种植，化学成分及药理作用的研究都取得了可喜的成绩。肉苁蓉的药用价值虽然很高，但目前只限于基础研究，在新药。保健品、食品、饮品等领域上的开发，应用还是比较欠缺。因此，随着科技的发展和人们对肉苁蓉认识的加深。今后应在其药用基础上，进行更广泛和更深层的研究，扩大肉苁蓉在上述领域的应用，使得这一宝贵资源有更可观的发展前景，从而推动我国这一传统中药的进一步发展。

大连医药科学研究所（116013）  谢继红＊ 高集馥 王瑜郭永沺沈阳药学院中药药理室      吴春福胡茧邹宇宏刘雯摘要 用高效液相色谱电化学检测方法发现肉苁蓉Cistanche deserlicola Y.C.Ma的乙醇提取物给药40d可以增加大鼠下丘脑去甲肾上腺素（NA）和5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）含量，并增加多巴胺（DA）与二羟苯乙酸（DOPAC）比值。对纹状体DOPAC有一定增加作用，而对边缘脑区单胺类神经递质无明显影响。关键词 肉苁蓉 单胺类神经递质 下丘脑 纹状体 大鼠肉苁蓉属补肾壮阳类中药。药理研究表明，它能增强小鼠免疫功能（1），提高阳虚动物DNA合成率（2、3），促进下丘脑-垂体-性腺功能C4），明显延长果蝇寿命（5）。近来报道（6、7），补益方药对老年或阳虚大鼠下丘脑单胺类神经递质含量有影响，但单味补益中药对中枢单胺类神经递质影响的报道尚少。本文研究了肉苁蓉乙醇提取物对正常大鼠脑中单胺类神经递质水平的影响。1 材料与方法1.1 动物：Sprague-Dawley种大鼠，体重180～220g，雌雄兼用，由沈阳药学院实验动物室提供。1.2 给药与取材：大鼠18只，随机分为3组，每组6只。正常对照组每天灌胃生理盐水5ml／kg，给药组分别灌胃肉苁蓉乙醇提取物100、200mg／kg，2次／d，连续40d。末次给药后12h，将大鼠断头取脑，迅速在冰台上分离出下丘脑、纹状体和边缘部分（包括中隔核、优核和嗅核等部分）。称重后加入到350μ1冰冷的0.4mol／L高氯酸溶液中（含0.5mmol／LEDTA，0.01％半胱氨酸）（8），用Teflon匀浆器电动匀浆（500r／min），离心（12000r／min，20min，4℃），取上清液20μl，直接注入高效液相色谱电化学检测系统同时测定单胺类物质及其代谢产物的含量。各物质含量应用外标法计算。1.3 生化测定（8、9）；YSB-I型平流泵为中国科学院上海分院科学仪器厂生产。电化学检测器为瑞士Metrom公司产品，工作电压0.70V，检测灵敏度5nA，色谱柱为YWG-C1，10μm，柱长150mmx4mmφ，泵流速1.2ml／min。流动相组成为乙酸钠（100mmol／L）-柠檬酸（85mmol／L）缓冲液，pH3.7，含离子对B，1.0mmol／L，EDTANa20.2mmol／L，甲醇6％（V／V），G。垂熔漏斗过滤并脱气后使用。1.4 药物与试剂：肉苁蓉购自内蒙古赤峰药材公司，原生药经沈阳药学院孙启时副教授鉴定。多巴胺盐酸盐（DA），去甲肾上腺素（NA），5-羟基吲哚乙酸（5-HIAA）均为瑞士Fluka产品，3,4-二羟基苯乙酸（DOPAC）为Merck产品，5-羟色胺硫酸肌酐（5-HT）为瑞士进口分装品。2 结果2.1 对下丘脑单胺类神经递质水平的影响：肉苁蓉乙醇提取物增加下丘脑NA的含量。大剂量组NA升高呈统计学极显著意义（P＜0.01），5-HIAA水平也有显著升高（P＜0.05）。对5-HT／5-HIAA比值无明显作用，但对DA／DOPAC比值有显著升高作用（P＜0.05）。见表1。表1 肉苁蓉乙醇提取物对大景下丘脑单胶类递质水平的影响（μg／g显组织）（x±SD，n＝6）组别剂量DADOPACDA/DOPAC 5-HT5-HIAA SHT/S-HIAANA(mg/kg·d)对照组0.2±0.050.08±0.025,64±1.41 1,8410.15 0.85±0.15 2.16±0.23 158±1.09自效蓉2000.48±0.060.08±0.015.81±0.67 2,04±0.26 1.02±0.17 2.04±0.35 1,69±0.184000.6±0.0410"0+9007.62±1.20* 2.27±0.30 1.04±0.13*2,19±0.17 1.98±0.19*****P与对照组比较＊P＜0.05 ＊＊P＜0.01（1检验）（下同）2.2 对纹状体和边缘部分单胺类神经递质水平的影响：肉苁蓉乙醇提取物使纹状体DA、LOPAC、NA水平呈一定升高趋势，除小剂量使DOPAC升高呈显著意义外（P＜0.01），其它皆无统计学意义（表2）。对边缘部分内各单胺冲经递质水平及代谢产物几无影响（表表2 肉苁蓉乙醇提取物对大鼠纹状体单胺类递质水平的影响（Fg／g温组织）性别附量DADOPACDA/DOPACNA(mg/kg·d)对照组8,23±1.010.81±0.0710.15±0.840.80±0.19海庆春2000.16±1.320.93±0.16**9.98±1.030.82±0.174000.31±1.120.03±0.2110.17±0.110.96±0.18表3 肉苁蓉乙醇提取物对大鼠边缘系统单胺类递质水平的影响（Fg／g温组织）性别刻量vaDOPACDA/DOPACHT5-HIAAVV1H-9/1HSp+8x/8㎡)(对照组2.00±0.100.30±0.056.67±0.980.95±0.22 0.40±0.092.53±0.32肉供蓉2002,14±0.360.32±0.096,81±0.980.97±0.35 0.46±0.202,28±0.624002.27±0.390.31±0.047.32±0.590.99±0.42 0.40±0.112.41±0.323 讨论本实验세察到肉苁蓉乙醇提取物给药40d能增加大鼠下丘脑NA含量，提高DA／DOPAC比值，表明该药在一定程度上影响下丘脑儿茶酚胺的代谢。陈名道等人观察到含有肉苁蓉的助阳药能使正常及可的松阳虚模型大鼠下丘脑多巴胺水平升高，使其代谢产物DOPAC降低，对NA也呈升高趋势。他们认为助阳药的这种作用似是对单胺氧化酶抑制的结果，而与机体本身状态关系不大（7）。有报道表明，含有肉苁蓉的固真胶囊对老年大鼠脑中单胺氧化酶有显著抑制作用（10）。但单味肉苁蓉是否有抑制单胺氧化酶作用尚需进一步实验研究。众所周知，下丘脑是机体控制内分泌活动的一个重要的神经结构，下丘脑内的单胺类神经递质通过垂体和各靶腺对机体各器官起着重要的调节作用，肉苁蓉试A和C对悬吊应激所致雄性小鼠的性功能低下有对抗作用，肉苁蓉能增强下丘脑-垂体-卵巢的促黄体功能，提高垂体对黄体生成素释放激素的反应和卵巢对黄体生成素的反应（4）。本实验发现，肉苁蓉可升高下丘脑NA水平及DA／DOPAC比值，提示这种作用对垂体内分泌功能可能会产生影响。大量资料表明，激活下丘脑去甲肾上腺素能系统对性行为和促黄体生成素释放有重要影响（11）。NA能促进黄体生成素释放激素的释放。低剂量NA可以易化雌性大鼠的性行为（12），由此可以设想，肉苁蓉对性腺功能的影响，不单纯是对垂体的直接作用，面且有对下丘脑单胺类神经递质作用的参与。性腺功能是中医“肾”职能中一个重要的组成部分。肾虚患者可见血清中垂体激素（13）和性腺激素（14）水平的异常改变。而补肾中药通过影响内分泌功能来调节这些激素的水平以达到治病目的（13,14）。肉苁蓉对下丘脑单胺类神经递质代谢的影响，无疑可直接或间接地调节垂体-性腺功能。这也许能部分地解释该药的补肾补阳功效。肉苁蓉对纹状体DOPAC有显著升高作用，对边缘系统单胺递质代谢未见明显影响。作为补肾中药肉苁蓉这种作用的药理意义尚需深入研究。致谢：本实验得到大连医药科学研究所霍五书教授热情指导和帮助。

摘要:目的　研究肉苁蓉多糖(polysaccharidesofCistanchedeserticola, PCD)对亚急性衰老小鼠组织丙二醛(MDA)含量、端粒酶活性和免疫功能的影响。方法　使用D-半乳糖造成小鼠亚急性衰老模型。硫代巴比妥酸比色法检测MDA含量;PCR-ELISA法检测端粒酶活性;MTT法测定淋巴细胞增殖反应;中性红实验测定小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能;酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定血清中IL-2含量。结果　模型组小鼠心、肝和脑MDA含量明显增加, 端粒酶活性、淋巴细胞增殖反应、腹腔巨噬细胞吞噬功能和外周血IL-2含量均显著下降。给予PCD后, 小鼠心、肝和脑MDA含量明显降低, 心和脑组织端粒酶活性, 淋巴细胞增殖反应、腹腔巨噬细胞吞噬功能和外周血IL-2含量明显升高。结论　PCD能拮抗自由基损伤, 增强衰老小鼠心和脑组织端粒酶活性和机体免疫功能, 对D-半乳糖所致的衰老有一定的改善作用。关键词:肉苁蓉多糖;丙二醛;端粒酶;免疫;衰老肉苁蓉(CistanchedeserticolaY.C.Ma)为列当科植物肉苁蓉的干燥带磷叶的肉质茎, 具有补肝肾、益精气的功用[ 1] 。肉苁蓉多糖(polysaccharidesofCistanchedeserticola, PCD)是从肉苁蓉中分离的粗多糖, 除去水溶性小分子杂质, 经Sevag法脱蛋白质,用水、醇反复处理得PCD[ 2] 。本实验从衰老的免疫学说和端粒学说入手, 采用D-半乳糖衰老小鼠模型, 观察PCD对其心、肝、脑丙二醛(MDA)含量及端粒酶活性的影响, 对其作用机制进行初步探讨。1　材料与方法1.1　动物、药物、试剂及仪器3月龄ICR小鼠, 清洁级, 26 ～ 32 g, 雌雄各半[扬州大学实验动物中心, 实验动物质量合格证号:SCXK(苏)2002-0009] 。室温20 ～ 25 ℃, 自然照明,实验前适应环境饲养1周。PCD由南京野生植物研究所提供, 蒸馏水溶解;D-半乳糖(D-Gal, 上海试剂二厂);端粒酶活性检测试剂盒(美国MB公司);MDA检测试剂盒和小鼠IL-2 ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所)。ELX800UV酶标仪(美国BIO-TEK公司);PT-MR3100D组织匀浆机(瑞士Polytron公司);MODEL550台式冷冻离心机(德国Eppenddorf公司);BP110S电子天秤(德国Sartorius公司)。1.2　动物分组、模型制备及给药按文献[ 3] 方法制备衰老小鼠模型。注射用水配制10%D-Gal, 小鼠颈背部皮下注射10 mL· kg-1每天1次, 连续6周。小鼠随机分为5组:正常对照组、模型对照组、PCD 25、50 和100 mg· kg-1组(PL、PM、PH组), 每组12只。模型组和PCD给药组小鼠依法造模, 同时每天分别灌胃给予PCD25、50和100 mg· kg-1 , 容量为20 mL· kg-1 。正常对照组小鼠相应注射等体积的注射用水和灌胃给予等体积的生理盐水。1.3　MDA含量和端粒酶活性的测定末次给药24 h后摘眼球取血, 处死小鼠, 快速摘取心、肝和脑, 在低温条件下进行新鲜组织匀浆,离心, 取上清。硫代巴比妥酸比色法测定MDA含量。PCR-ELISA法检测端粒酶活性, 操作步骤按试剂盒说明书进行, 酶标仪450 nm处测定A值。1.4　淋巴细胞增殖反应测定[ 4]在超净工作台中无菌取出小鼠脾脏, 制备小鼠脾脏细胞悬液, 调细胞密度为1 ×109个· L-1 , 刀豆蛋白A(ConA)作为刺激原在体外培养48 h, MTT法测定细胞增殖反应。于酶联仪测波长570 nm测定A值, 结果以3个复孔A的均值表示。1.5　中性红法测定腹腔巨噬细胞吞噬功能末次给药24 h后, 小鼠脱颈处死, 无菌收集小鼠腹腔液, 1 000 r· min-1离心, Hanks液洗涤细胞3次, 1640培养液制备细胞悬液。取3 mL置培养皿中, 37 ℃, 5%CO2培养2 h, 巨噬细胞黏附于容器表面, 用4 ℃ Hanks液吹吸, 收集黏附细胞, 血球计数板计数并调整细胞密度为2 ×109个· L-1 , 置37 ℃培养箱培养2 h后, 弃上清和非贴壁细胞。取贴壁巨噬细胞, 加0.1% 中性红生理盐水, 37 ℃继续培养30 min, 弃中性红, 用37 ℃PBS反复冲洗巨噬细胞, 用体积分数50%乙酸和50%乙醇稀释后,测A值。1.6　血清IL-2水平的测定摘眼球取血, 离心(3 000 r· min-1 , 10 min)分离血清, 酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定血清中IL-2含量, 具体操作根据试剂盒使用说明书, 酶标仪450 nm处检测各组小鼠血清中IL-2水平。1.7　统计学分析数据以SPSS11.0处理, 计量资料以均数±标准差( x±s)表示, 采用单因素方差分析和组间t检验。2　结　果2.1　PCD对衰老小鼠心、脑和肝MDA含量的影响与正常对照组比较, 模型组小鼠心、肝和脑的MDA含量明显增加(P<0.01)。灌胃给予PCD25、50和100 mg· kg-1后, 小鼠心、脑和肝MDA含量较模型组呈剂量依赖性降低(P<0.01, P<0.05), 高剂量组MDA含量接近正常水平(表1)。2.2　PCD对衰老小鼠心、脑和肝组织端粒酶活性的影响与正常对照组比较, 模型组小鼠心、肝和脑组织的端粒酶活性明显降低。灌胃给予PCD后, 能剂量依赖性升高心、脑组织中端粒酶活性, 高剂量组接近正常对照组水平。而对衰老小鼠肝脏组织端粒酶活性无明显影响(P>0.05)(表2)。2.3　PCD对衰老小鼠淋巴细胞增殖反应、腹腔巨噬细胞吞噬功能和血清IL-2含量的影响与正常对照组比较, 模型组小鼠淋巴细胞增殖反应、腹腔巨噬细胞吞噬功能和外周血IL-2含量均显著下降(P<0.01)。灌胃给予PCD后, 衰老小鼠的淋巴细胞增殖反应、腹腔巨噬细胞吞噬功能和血清IL-2含量剂量依耐性升高, 与模型组比较有差异性(P<0.01, P<0.05)(表3)。3　讨　论对于衰老产生的确切机制, 迄今尚不明确, 多年来, 国内外学者提出了数十种衰老学说, 如自由基学说, 分子氧是生物体生存所必需, 生物体内的营养物质通过氧化放出能量, 细胞的氧化状态在衰老, 肿瘤发生、发展中起着重要作用。但某些氧化过程中会形成自由基, 衰老与异常自由基反应密切相关。当自由基在体内积累过多时, 会引起体内尤其是生物膜的不饱和脂肪酸的过氧化, 导致细胞膜结构发生改变, 膜功能受损, 产生MDA、脂褐素(LPF)[ 5] 。MDA是极其活泼的交联剂, 它能与蛋白质、酶以及核酸上游离的氨基酸共价交联成希夫碱, 因其具有异常键, 经溶酶体吞噬后不能被水解酶消化, 聚集于细胞成为脂褐质, 脂褐质能毒害细胞, 阻碍细胞内物质和消息的传递, 导致核加快细胞的衰老和死亡。因此MDA可作为器官、细胞衰老可靠标志。端粒学说认为染色体顶端的染色体(端粒)的长度与衰老和寿命密切相关, 端粒的长度大约2 ～15 kb, 由于存在末端复制问题, DNA每复制1次, 端粒DNA就会丢失50 ～ 200 bp, 随着细胞分裂次数的增加, 端粒DNA进行性地缩短, 缩短到一定限度后,便不能维持染色体的稳定, 细胞便失去了分裂增殖能力而衰老死亡, 这种缩短就是衰老的标志[ 6] 。细胞进入增殖衰竭期, 细胞继续存活但不能分裂增殖[ 7] 。因此, 端粒也被称为细胞的“生物钟”, 细胞的衰老决定着整个机体的衰老。Bryma研究发现,端粒的长度与端粒酶的活性有关, 端粒酶的活性越高, 端粒越长, 染色体的稳定性完整性越好, 细胞分裂次数增多, 寿命延长。免疫系统作为一个完整的、自主的系统在维护和调整生命活动中起着重要作用, 而免疫功能下降,又是衰老最突出的特征, 免疫功能失调可加速机体的衰老[ 8] 。本实验结果显示, PCD能明显减少心、脑和肝组织中MDA含量, 提高衰老模型小鼠心、脑组织端粒酶活性, 以及衰老小鼠淋巴细胞增殖反应、腹腔巨噬细胞吞噬功能和外周血IL-2含量。由此推断, PCD在拮抗自由基损伤方面具有良好作用,并且可以促进淋巴细胞增殖, 提高机体非特异性细胞免疫和免疫调节功能, 起到延缓机体老化的作用。REFERENCES[ 1] 　MA ZG.DifferentofProcessedCistanchesinensisG.BeckandHerbaCistanchebyHPLCFingerprints[ J] .ChinPharmJ(中国药学杂志), 2011, 46(12):899-902.[ 2] 　SHIHF, LINAP, ZHANGH Q, etal.TheeffectofpolysaccgridesofCistanchedeserticolaY.C.Maonspleendeficiencysyndromerats[J] .ChinWildPlantRes(中国野生植物资源),2000, 19(6):49-51.[ 3] 　XU SY, BIAN RL, CHENX.MethodoldgyofPharmacologicalExperiments)(药理实验方法学)[ M] .Vol3.Beijing:People' sMedicalPublishingHouse, 2002:1465-1466.[ 4] 　LIUYQ, SUW, WUJJ, etal.Effectofcynomorium coccineumextractiononimmunityfunctionandfreeradicalmetabolismofagingmice[J] .JCellMolImmunol(细胞与分子免疫学杂志),2009, 25(1):1155-1157.[ 5] 　YANGH J, WANGZL, XUESH.Progressinstudiesofagingmechanism[ J] .ChinJControlEndem Dis(中国地方病防治杂志), 2008, 23(1):35-37.[ 6] 　YANGJ, ZHANXH, SUNY, etal.Effectofsijunzidecoctiononmalondialdehydecontentandtelomeraseactivityinheart, liverandbraintissuesodD-galactoseinducedagingmodelmice[ J] .ChinJIntegrTraditChinWestMed(中国中西医结合杂志), 2005, 25(6):531-533.[ 7] 　ZHANGXH, ZHANGJN.Telomere, telomerase, agingandcancer[J] .IntJGenetics(国际遗传学杂志), 2007, 30(1):69-71.[ 8] 　SONGSX, LVZJ.ResearchprogressofT、Bcellsenescenceanditsmolecularmechanism[ J] .JCellMolImmunol(细胞与分子免疫学杂志), 2002, 18(3):306-308.

摘要　使用D-半乳糖造成小鼠实验性衰老模型‚观察肉苁蓉多糖对实验性衰老小鼠肺胶原蛋白、弹性蛋白含量的影响‚对肺组织和红细胞中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）及丙二醛（MDA）含量的影响。结果　灌服肉苁蓉多糖的衰老小鼠的肺组织及红细胞中SOD、GSH-Px 活力不同程度提高‚肺及血浆中丙二醛含量有所降低。同时肺胶原蛋白含量减少‚弹性蛋白含量增多。结论　肉苁蓉多糖具有抗氧化性损伤和抗肺衰老的作用。关键词　衰老；肺胶原蛋白；弹性蛋白；抗氧化功能；肉苁蓉多糖　肺组织随着增龄而呈退行性变化‚其表现之一为弹性蛋白减少、胶原蛋白增多‚特别是胶原蛋白增多使肺纤维化‚肺顺应性下降‚呼吸功能衰退。肺脏终生暴露于不利的工作环境并受到伤害性因素（如污染、感染、吸烟等）的影响‚这些损伤因素包括了体内形成的氧自由基成分‚因此肺抗氧化功能损伤与弹性组织成分变化的关系值得研究。本实验通过使用D-半乳糖造成小鼠糖代谢紊乱‚进而损伤机体抗氧化功能诱发衰老‚试图弄情实验性抗氧化功能减弱对肺弹性组织成分的影响和肉苁蓉多糖对肺氧化性损伤和弹性组织成分变化的改善作用。1　材料和方法1．1　D-半乳糖实验性衰老模型［1］ 及实验设计　取ICR 小鼠（扬州大学实验动物中心提供‚2～3mon‚20～22g‚♀♂各半）‚随机分为4组‚每组20只。对照组每日灌服生理盐水20ml·kg－1‚正常饲养；模型组和治疗Ⅰ组、Ⅱ组每日皮下注射D-半乳糖50mg·kg－1·d－1‚同时治疗Ⅰ组、Ⅱ组分别给予肉苁蓉多糖50‚100mg·kg－1；模型组灌服生理盐水20ml·kg－1‚实验周期40d。40d 后各组动物取血液、肺组织（匀浆）分别测定超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力、维生素E（VitE）和丙二醛（MDA）含量；取肺组织测定胶原蛋白和弹性蛋白。1．2　肺胶原蛋白测定　按氯胺-T 法［2］‚将新鲜肺组织酒精脱水12h‚丙酮脱脂48h。110℃烘干后磨成粉末。取40mg 肺组织干粉加入6mol·L－1盐酸3ml‚125℃烤箱中水解5h。加入6mol·L－1 NaOH2ml‚放置10 h。加入l ml 氯胺-T 溶液放置20min‚加入l ml 过氯酸‚5min 后加入l ml10％对二甲氨基苯甲醛溶液‚60℃水浴中保温20min。显色‚于550nm 波长处比色。根据羟脯氨酸标准曲线和羟脯氨酸占胶原蛋白固定比例计算胶原蛋白含量（mg·g－1肺组织干重）。1．3　肺弹性蛋白测定　按刘秉慈的方法［2］ 将肺组织在50％吡啶水溶液中（4℃）粉碎‚3000× g 10min 离心‚去除上清‚离心洗涤‚真空干燥后浸入液氮‚取出研成粉末。于2mol·L－1 CaCl2 中（4℃）持续搅拌24h‚离心洗涤4次‚无水乙醇脱脂脱水20min‚2∶1（ V／V ）氯仿-甲醇浸泡20min‚冷冻干燥‚加入胶原酶（组织∶酶＝50∶1‚w／w）‚37℃消化10h‚离心、洗涤。加入含有5mol·L－1盐酸胍、0∙05mol·L－1二硫赤藓糖醇、2∙6mmol·L－1EDTA 的0∙1mol·L－1Tris 缓冲液（pH8∙5）中。通氮‚加塞‚37℃10h‚离心洗涤2次‚再加入含6mol·L－1脲素‚34∙7mmol SDS 及含0∙05·L－1二硫赤藓糖醇0∙05mol·L－1缓冲液（pH7∙7）中‚通氮‚加塞‚37℃10h‚离心洗涤后再重复1次‚残渣冷冻干燥‚测蛋白质含量（Lowry 法）即为弹性蛋白含量（mg·g－1肺组织）。1．4　肺组织和血液中SOD、GSH-Px、Vit E 和MDA的测定　取新鲜肺组织‚用50mmol·L－1 Tris-HCl缓冲液（pH7∙4）制成10％肺匀浆‚分别取全血（测定MDA 和Vit E）并制成红细胞抽提液（测SOD 和GSH-Px）‚用试剂盒（南京聚力生物医学工程研究所提供）测定SOD‚GSH-Px、Vit E 和MDA 含量。2　结果2．1　实验性衰老小鼠肺胶原蛋白、弹性蛋白含量变化及肉苁蓉多糖的影响　D-半乳糖连续注射40d后‚模型组小鼠肺胶原蛋白含量增多‚弹性蛋白含量减少。肉苁蓉多糖治疗Ⅰ组对衰老小鼠肺胶原蛋白含量有所降低‚但差异无显著性；治疗Ⅱ组（100mg·kg－1·d－1×40d）可明显抑制D-半乳糖引起的肺弹性组织成分改变。肉苁蓉多糖两个治疗组对弹性蛋白均有改善作用（见表1）。2．2　实验性衰老小鼠血液及肺中SOD、GSH-Px、Vit E、MDA 含量变化及肉苁蓉多糖的影响　D-半乳糖实验性衰老小鼠血液和肺组织抗氧化性物质含量少于对照组‚脂质过氧化物（MDA）浓度增多。肉苁蓉多糖2个剂量组可不同程度抑制D-半乳糖引起的机体抗氧化功能减弱及造成的氧化性损伤（见表2‚表3）。3　讨论呼吸系统退行性变化在人体的衰老过程中发生较早‚可能与它直接与外界环境接触‚易受伤害性因素‚特别是氧自由基的损伤有关。随着增龄‚肺活量下降速度较快。这与其弹性功能老化有关。氧自由基损伤在肺老化中起重要作用‚肺组织细胞的损伤或死亡通常为胶原所取代‚进而造成肺弹性蛋白逐渐减少‚胶原蛋白逐渐增多使肺不断纤维化‚其后果是肺顺应性降低‚通气功能衰退。D-半乳糖在一定时间内连续注射使机体细胞内半乳糖浓度增高‚在醛糖还原酶催化下还原成半乳糖醇‚这种物质不能被细胞进一步代谢而堆积在内‚造成细胞代谢紊乱‚破坏并消耗了机体抗氧化物质‚并不断产生自由基导致组织细胞受损［3］。在本试验中D-半乳糖引起血液和肺组织中抗氧化物质SOD、GSH-Px、Vit E 明显减少和脂质过氧化产物（MDA）产生增多同时造成肺胶原蛋白含量增多、弹性蛋白含量减少‚提示实验性氧化和抗氧化功能失衡可导致肺纤维化。有实验表明自由基在体外能明显促进纤维细胞增殖和胶原合成［4］。在体内的抗氧化物质中‚SOD 能清除超氧阴离子（O－）保护细胞免受损伤；GSH-Px 能特异地催化还原型谷胱甘肽（GSH）对过氧化氢的还原反应‚从而起到保护细胞膜结构和功能的完整性；Vit E 是天然脂溶性抗氧化剂‚主要存在于细胞膜性结构中‚Vit E 不但是单线态氧（1O2）和O－的清除剂‚更重要的是脂质过氧化作用的阻断剂‚Vit E 与GSH-Px 协同保护细胞膜免受脂质过氧化损伤。对衰老机体来讲‚为防止渐进性自由基损伤和肺纤维化‚不断补充抗氧化物质‚调节机体氧化与抗氧化功能的平稳显得作常重要［5‚6］。本实验结果显示肉苁蓉多糖可抑制肺胶原蛋白增多和弹性蛋白减少以及改变机体氧化／抗氧化功能的失衡。这可能与其直接或间接清除自由基对机体的损害作用‚消除D-半乳糖引起的自由基产生增多‚避免了因抗氧化性物质消耗而导致的肺组织损伤有关‚从而达到延缓衰老的作用。参考文献1　龚国清‚徐黻本．小鼠衰老模型研究．中国药科大学学报‚1991；22（2）：1012　刘秉慈．细胞外间质成分的实验技术．见：方福德等主编．现代医学实验技巧全书．北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社‚1995：6793　张尚明‚罗　玲‚郭　平et al．羟自由基对人胚肺成纤维细胞的体外作用．卫生研究‚1994；23（4）：2044　王本样主编．现代中药药理学．天津：天津科技出版社‚1997：8905　周双文‚谷正兆‚霍建民et al．丹参、川芎嗪抑制弹性蛋白酶活力及保持弹力纤维的实验研究．中华结核和呼吸杂志‚1990；13（2）：996　孙　云‚徐学萍‚王德俊et al．衰老动物肺胶原蛋白、弹性蛋白含量与抗氧化功能关系及川芎嗪影响．实用老年医学‚1997；11：32

〔摘　要〕　目的　观察肉苁蓉多糖对Ｄ-半乳糖致衰大鼠肝线粒体氧化损伤的保护作用。方法　采用Ｄ-半乳糖所致衰老模型大鼠‚灌服肉苁蓉多糖6ｗ‚测定肝脏Ｃａ2＋-ＡＴＰ酶活性、肝线粒体丙二醛（ＭＤＡ）含量、磷脂酶Ａ2（ＰＬＡ2）活性、膜流动性及呼吸链复合体Ⅰ ＋Ⅲ、Ⅱ ＋Ⅲ活性。结果　肉苁蓉多糖显著提高衰老模型大鼠肝脏Ｃａ2＋-ＡＴＰ酶活性、肝线粒体膜流动性及呼吸链复合体Ⅰ ＋Ⅲ、Ⅱ ＋Ⅲ活性‚显著降低肝线粒体ＭＤＡ含量、ＰＬＡ2活性。结论　肉苁蓉多糖能提高衰老模型大鼠肝线粒体抗氧化能力‚改善线粒体能量代谢‚具有抗衰老作用。〔关键词〕　肉苁蓉多糖；致衰大鼠；线粒体；能量代谢　有研究表明肉苁蓉多糖具有增强免疫力、抗氧化等药理作用〔1〕。但其在线粒体水平上抗衰老作用的机制‚国内外未见报道。本研究通过观察衰老时线粒体抗氧化作用及能量代谢功能的变化‚探讨肉苁蓉多糖在线粒体水平的抗衰老作用。1　材料与方法1∙1　材料　普通级Ｗｉｓｔａｒ大鼠30只‚3～4月龄‚体重180～210ｇ‚雌雄各半‚由黑龙江省佳木斯大学实验动物中心提供‚合格证号：黑动字第99102001号。药材肉苁蓉‚由佳木斯药材公司提供‚经本校生药学教研室刘娟教授鉴定为肉苁蓉。1∙2　仪器和试剂　岛津ＲＦ-5000型荧光分光光度计；赛多利斯ＰＰ-25型高灵敏度ｐＨ计；760ＣＲＴ双光束紫外可见分光光度计；ＧＬ-21Ｍ高速冷冻离心机。试剂：细胞色素Ｃ（氧化型）‚1‚6-二苯基-1‚3‚5-己三烯（ＤＰＨ）由Ｓｉｇｍａ公司提供；ＨＥＰＥＳ‚ＮＡＤＨ‚去氧胆酸钠由ＡＭＲＥＳＣＯ公司提供；丙二醛（ＭＤＡ）试剂盒‚Ｃａ2＋-ＡＴＰ酶试剂盒‚蛋白测定试剂盒：由南京建成生物工程研究所提供；Ｄ-半乳糖（Ｄ-ｇａｌ）由上海试剂二厂提供。1∙3　方法1∙3∙1　肉苁蓉多糖的提取〔2〕　取生药400ｇ用水浸泡30ｍｉｎ‚超声提取两次‚每次30ｍｉｎ‚抽滤器抽滤‚合并滤液‚将水提液加95％乙醇沉淀‚静置过夜‚次日抽滤分离沉淀‚将沉淀物用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤‚干燥恒重后得肉苁蓉多糖‚4℃贮存。1∙3∙2　动物分组、给药及处理　将30只大鼠随机分为3组：青年对照组、衰老模型组、模型给药组‚每组各10只‚常规饲料喂养。青年对照组每日上午皮下注射生理盐水‚同时灌服温开水；衰老模型组及模型给药组每日上午按50ｍｇ／ｋｇ剂量皮下注射Ｄ-ｇａｌ‚衰老模型组同时灌服温开水；模型给药组同时按生药2ｇ／ｋｇ灌服肉苁蓉多糖。连续给药6ｗ后‚处死动物取材。1∙4　样本制备及指标测定　取肝脏1ｇ‚用冷生理盐水漂洗‚拭干称重‚加入9倍体积预冷的匀浆介质‚用电动匀浆机充分磨碎得肝组织匀浆‚将肝组织匀浆3000ｒ／ｍｉｎ离心10ｍｉｎ‚取上清冻存待测。按上述方法制备肝匀浆‚取10％肝组织匀浆2000ｒ／ｍｉｎ离心10ｍｉｎ‚弃沉淀‚取上清液在高速冷冻离心机中10000ｒ／ｍｉｎ离心15ｍｉｎ‚沉淀物即为线粒体‚将线粒体悬浮于介质中‚供指标测定。肝组织Ｃａ2＋-ＡＴＰ酶活性‚肝线粒体ＭＤＡ含量按试剂盒说明测定；肝线粒体磷脂酶Ａ2 （ＰＬＡ2）活性、膜流动性、呼吸链复合体Ⅰ ＋Ⅲ、Ⅱ ＋Ⅲ活性测定参照文献方法进行〔3‚4〕。1∙5　统计学分析　采用ＳＰＳＳ11∙5软件‚数据均以ｘ±ｓ表示‚应用ｑ检验、方差分析。2　结　果2∙1　肉苁蓉多糖对大鼠肝组织Ｃａ2＋-ＡＴＰ酶活性的影响　实验过程中衰老模型组及模型给药组各死亡1只大鼠。衰老模型组Ｃａ2＋-ＡＴＰ酶活性〔（0∙711±0∙102） μｍｏｌＰｉ·ｍｇ－1·ｈ－1〕较青年组〔（1∙153±0∙203） μｍｏｌＰｉ·ｍｇ－1·ｈ－1〕显著下降（Ｐ＜0∙01）‚模型给药组〔（1∙023±0∙136） μｍｏｌＰｉ·ｍｇ－1·ｈ－1〕也降低‚但无统计学意义；肉苁蓉多糖可使肝脏Ｃａ2＋-ＡＴＰ酶活性明显上升（Ｐ＜0∙01）‚并达到青年状态。2∙2　肉苁蓉多糖对大鼠肝线粒体内ＭＤＡ含量、ＰＬＡ2 活性的影响　见表1。与青年组比较‚衰老模型组肝线粒体ＭＤＡ含量显著升高（Ｐ＜0∙01）‚肉苁蓉多糖使线粒体ＭＤＡ含量较衰老模型组显著降低（Ｐ＜0∙01）‚可恢复到青年水平。衰老模型组线粒体ＰＬＡ2活性较青年组显著提高‚给予肉苁蓉多糖线粒体ＰＬＡ2活性并未恢复到青年组水平（Ｐ＜0∙01）‚与衰老模型组比较‚肉苁蓉多糖可显著降低线粒体ＰＬＡ2活性（Ｐ＜0∙01）。2∙3　肉苁蓉多糖对大鼠肝线粒体膜流动性的影响　见表1。衰老模型组荧光偏振度（Ｐ）较青年组显著升高（Ｐ＜0∙01）‚模型给药组Ｐ虽高于青年组‚但与青年组无显著差异；与衰老模型组比较‚模型给药组Ｐ明显降低（Ｐ＜0∙01）。2∙4　肉苁蓉多糖对大鼠肝线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ ＋Ⅲ、Ⅱ ＋Ⅲ活性的影响　见表1。与青年组比较‚衰老模型组呼吸链酶复合体Ⅰ ＋Ⅲ、Ⅱ ＋Ⅲ活性显著下降（Ｐ＜0∙01）；与衰老模型组比较‚模型给药组明显提高复合体Ⅰ ＋Ⅲ、Ⅱ ＋Ⅲ活力（Ｐ＜0∙05‚Ｐ＜0∙01）‚模型给药组可将复合体Ⅰ ＋Ⅲ活性恢复到青年水平。3　讨　论　　目前被普遍接受的有关衰老的“自由基-线粒体损伤”假说认为‚线粒体是细胞内主要耗氧部位‚是产生自由基的主要场所‚也是自由基攻击的靶部位‚所以在线粒体水平上研究衰老及中药抗衰老的机制‚对揭示衰老本质有重要意义〔5～7〕。　　有实验表明‚细胞膜钙泵活性随年龄增加而显著下降‚外排Ｃａ2＋的能力明显降低‚导致细胞内游离钙增加‚钙稳态失调〔8〕。钙超载时激活ＰＬＡ2‚ＰＬＡ2活性升高可改变膜磷脂的成分‚影响膜流动性‚损害呼吸链并造成线粒体不可逆损伤‚同时会产生大量自由基‚导致膜通透性增加‚钙离子大量流入‚进一步激活ＰＬＡ2〔9〕‚造成恶性循环。本研究表明肉苁蓉多糖可提高Ｃａ2＋-ＡＴＰ酶活性‚降低肝线粒体ＭＤＡ含量、ＰＬＡ2 活性‚表明其可减轻自由基对肝组织及线粒体的损伤作用‚保证Ｃａ2＋-ＡＴＰ酶活性‚使肝细胞内外钙离子浓度保持正常水平‚避免由于钙超载而导致线粒体ＰＬＡ2活性的升高。　　适当的线粒体膜流动性对电子传递和质子转运以及氧化磷酸化的进行是必不可少的。本实验采用荧光偏振法‚以ＤＰＨ作为荧光探针标记线粒体膜来测定膜流动性‚荧光偏振度大‚膜流动性小；反之‚荧光偏振度小‚膜流动性大。肉苁蓉多糖可提高线粒体膜流动性‚这可能正是由于肉苁蓉多糖可以提高肝脏抗氧化能力‚减少氧自由基的生成‚减少脂质过氧化产物‚抑制ＰＬＡ2活性‚从而减少了导致线粒体膜流动性降低的各种因素‚使线粒体膜流动性保持正常‚保证了线粒体的功能。　　线粒体产能过程中‚呼吸链上复合体的活性决定了产能的多少。复合体Ⅰ和Ⅱ是电子传递的两个入口‚复合体Ⅲ接收来自复合体Ⅰ和复合体Ⅱ的电子向下传递并伴随能量的产生‚所以通过复合体Ⅰ ＋Ⅲ、复合体Ⅱ ＋Ⅲ活性反映线粒体功能的变化是具有一定代表性的。肉苁蓉多糖使肝线粒体酶复合体Ⅰ ＋Ⅲ、Ⅱ ＋Ⅲ活力都有提高‚其机制可能是：①减少自由基生成‚从而减轻自由基对酶复合体的攻击；②使线粒体ＰＬＡ2活性降低以减少其有害代谢产物对酶复合体的损伤；③保证膜流动性的稳定‚使线粒体膜有一定的柔性‚从而保证了线粒体内膜上酶复合体的活性。　　本实验表明肉苁蓉多糖可以提高机体抗氧化能力‚减少脂质过氧化产物‚减轻线粒体氧化损伤‚改善线粒体能量代谢‚达到延缓衰老的目的。4　参考文献1　孙　云‚王德俊‚刘晓梅‚等∙实验性衰老小鼠肺功能和超微结构的变化及肉苁蓉多糖的影响〔Ｊ〕∙中国药理学通报‚2002；18（1）：84-7∙2　曾群力‚霍亚楠‚毛俊浩‚等∙肉苁蓉多糖的分离、纯化和鉴定〔Ｊ〕∙中草药‚2002；33（12）：1057-9∙3　邵擎东‚肖建如‚杨金华‚等∙颈髓损伤对颈髓细胞线粒体膜流动性与线粒体呼吸功能的影响〔Ｊ〕∙中华创伤杂志‚2000；16（8）：469-70∙4　伍期专‚陈　燕‚陈清棠∙线粒体肌病患者的线粒体呼吸及呼吸链酶复合体活力测定〔Ｊ〕∙中华神经精神科杂志‚1993；26（5）：262-4∙5　ＩｎｏｕｅＭ‚ＳａｔｏＥＦ‚ＮｉｓｈｉｋａｗａＭ‚ｅｔａｌ∙Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓａｎｄｉｔｓｒｏｌｅｉｎａｅｒｏｂｉｃｌｉｆｅ〔Ｊ〕∙ＣｕｒｒＭｅｄＣｈｅｍ‚2003；10（23）：2495-505∙6　ＨａｒｍａｎＤ∙Ｔｈｅｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌｔｈｅｏｒｙｏｆａｇｉｎｇ〔Ｊ〕∙ＡｎｔｉｏｘｉｄＲｅｄｏｘＳｉｇｎａｌ‚2003；5（5）：557-61∙7　ＺｏｒｏｖＤＢ∙Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｄａｍａｇｅａｓａｓｏｕｒｃｅｏｆｄｉｓｅａｓｅａｎｄａｇｉｎｇ：ａｓｔｒａｔｅｇｙｏｆｈｏｗｔｏｆｉｇｈｔｔｈｅｓｅ〔Ｊ〕∙Ｂｉｏｃｈｉｍ ＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ‚1996；1275（1-2）：10-5∙8　狄荣科‚严丽荣‚马　瑞‚等∙褪黑激素对中老年大鼠抗氧化作用的初步观察〔Ｊ〕∙中国老年学杂志‚2000；20（4）：232-3∙9　ＲｏｒｄｏｒｆＧ‚ＵｅｍｕｒａＹ‚ＢｏｎｖｅｎｔｒｅＪＶ∙ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅＡ2（ＰＬＡ2） ａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｇｅｒｂｉｌｂｒａｉｎ：ｅｎｈａｎｃｅｄａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｃｙｔｏｓｏｌｉｃ‚ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ‚ａｎｄｍｉｃｒｏｓｏｍａｌｆｏｒｍｓａｆｔｅｒｉｓｃｈｅｍｉａａｎｄｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ〔Ｊ〕∙ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ‚1991；11（6）：1829-36∙

摘要: 目的探讨肉苁蓉多糖对气管切开插管留置大鼠肺部免疫功能的影响。方法54 只SD 大鼠随机分为正常组、模型组、肉苁蓉多糖组。除正常组外，其他组建立气管切开插管留置大鼠模型。造模6 小时后肉苁蓉多糖组用肉苁蓉多糖灌胃，正常组和模型组予等量生理盐水灌胃，均每日1 次。造模后第24 小时、72 小时、168 小时三个时段取材，并检测大鼠肺组织β － 防御素－ 2( rBD2) mＲNA 表达、肺泡灌洗液分泌性免疫球蛋白A( sIgA) 及外周血IL － 2、IL － 6 的含量。结果( 1) 与正常组比较，模型组大鼠rBD2 mＲNA 表达在气管切开插管留置第24 小时明显升高，随后明显下降，第168 小时降到最低点( P ＜ 0． 05) 。与模型组比较，肉苁蓉多糖组大鼠rBD2 mＲNA 表达在第24 小时降低，第72 小时、168 小时明显升高( P ＜ 0． 05) 。( 2) 与正常组比较，模型组大鼠肺泡灌洗液sIgA 含量在气管切开插管留置第24 小时明显升高( P ＜0． 05) ，在第72 小时开始下降，逐渐回落至正常组水平。与模型组比较，肉苁蓉多糖组大鼠sIgA 含量在第72 及168 小时明显升高( P ＜ 0． 05) 。( 3) 与正常组比较，模型组大鼠IL － 2 含量在第72 小时升高( P ＜ 0． 05) ，其余时间段无明显改变( P ＞ 0． 05) 。与模型组比较，肉苁蓉多糖组大鼠IL － 2 含量在第24 小时即明显升高，第72 小时继续升高，在第168 小时达到高峰。( 4) 与正常组比较，模型组大鼠IL － 6 含量在第24 小时出现明显升高( P ＜ 0． 05) ，在第72 小时稍有下降，在第168 小时无明显变化( P ＞ 0． 05) 。与模型组比较，肉苁蓉多糖用药大鼠外周血IL － 6 水平在第24 小时即显著降低，随后逐渐降低，至第168 小时达最低值( P ＜ 0． 05) 。结论肉苁蓉多糖能够改善气管切开插管留置大鼠肺部免疫功能。关键词: 肉苁蓉多糖; 气管切开插管; 肺部免疫功能; β － 防御素－ 2作为肉苁蓉的主要有效成分，肉苁蓉多糖具有调节内分泌［1］、增强吞噬细胞活性、促进淋巴细胞增殖［2］、抗氧化、抗衰老［3］等诸多药理作用。我们前期研究发现，补肾阳中药肉苁蓉能够提高气管切开插管留置大鼠肺泡灌洗液肺泡表面活性物质相关蛋白A( SP － A) 的浓度，减轻肺部病理改变［4］。然而，关于肉苁蓉多糖对肺部免疫功能的影响目前尚未见相关报道。因此，本课题试图通过动态观察大鼠肺组织rBD2、肺泡灌洗液sIgA 及外周血IL － 2、IL － 6 等指标，探讨肉苁蓉多糖对气管切开插管留置大鼠肺部免疫功能的影响。1 材料与方法1． 1 主要试剂和仪器提取总ＲNA 试剂盒、逆转录试剂盒及PCＲ 试剂盒均购自TAKAＲA 公司。IL － 2、IL － 6 、sIgA，ELISA 试剂盒均购自上海源叶生物科技有限公司; 肉苁蓉多糖( 批号:C23J7Y18405) 购自上海源叶生物科技有限公司。酶标仪( Model550 BIO ＲAD，美国BIO － ＲAD 公司) ，分光光度计( NanoDrop，T小时ermo Scientific 公司，美国) ，Ｒeal － Time PCＲ 仪( FAST7500，美国AB 公司) 。1． 2 实验动物及分组54 只雄性SPF 级SD 大鼠，体重( 250 ±20) g，均由广西医科大学实验动物中心提供( 动物生产许可证号: SCXK 桂2014 － 0002，动物使用许可证号SYXK 桂2014 －0003) 。将大鼠随机分成正常组、模型组、肉苁蓉多糖组，每组18只。模型组和肉苁蓉多糖组大鼠均建立气管切开插管大鼠模型，正常组大鼠不作处理。1． 3 气管切开插管大鼠模型的制备采用一次性硬膜外麻醉导管制作气管切开插管留置大鼠模型［5］。大鼠称重，麻醉后，暴露气管，作一“V”字型切口，将导管送入气管中约15 ～ 20mm，缝合消毒。气管外预留导管15 ～ 20mm，绑线固定; 定时检测导管与外界通气情况以及导管内分泌物情况，确保其通气良好，定时消毒切口。1． 4 给药剂量与方法用温水将肉苁蓉多糖粉末状溶解成含药浓度为3． 492ng /mL 的肉苁蓉多糖水溶液。参照徐叔云［6］《药理实验方法学》换算动物剂量公式计算得出每只大鼠给药剂量为50mg /( kg·d) 。因此肉苁蓉多糖组大鼠给予肉苁蓉多糖水溶液灌胃，剂量3mL/d; 正常组及模型组大鼠予以等量生理盐水灌胃，均每日1 次，连续7 天。1． 5 取材分别于造模成功后24 小时、72 小时、168 小时，每组各取6 只大鼠，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠( 3． 5mL/kg) ，麻醉成功后，经腹主动脉采血3mL，置于普通干燥管中，用于测定血清IL － 2 和IL － 6 水平。取材时结扎右肺，于左肺取肺泡灌洗液，用5mL 冰冻灭菌生理盐水灌洗，反复灌洗3 次，回收约3mL;上述过程重复3 次，共回收9mL，用于检测肺泡灌洗液sIgA 含量; 在4℃，离心10min( 2400 r /min) ，取上清液，置于－ 20℃冰箱中保存。开胸，取右肺中叶组织100mg，分装，迅速置于液氮中，后转移至－ 80 ℃冰箱中保存，用于测定肺组织rBD2 mＲNA 表达。1． 6 观察指标与检测rBD2 mＲNA 水平的测定: 取肺组织标本，研碎，加入ＲNA 提取试剂ＲNAiso PLUS，按说明书提取肺组织总ＲNA; 然后进行逆转录合成cDNA，通过检索基因库，设计并合成出引物( 引物序列见表1) ，由实时荧光定量PCＲ 扩增，并检测rBD2 mＲNA 的相对表达量。肺泡灌洗液sIgA、外周血IL － 6、IL － 2 含量的测定: 均采用多抗体夹心法ELISA 法检测。按照试剂盒说明书进行检测。1． 7 统计学方法采用SPSS 22． 0 统计软件进行数据分析，计量资料以珋x ± s 表示，满足正态分布和方差齐性资料，采用单因素方差分析( one － way ANOVA) ，组间两两比较采用LSD 法、Dunnett＇3 法，以P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。2 结果2． 1 大鼠肺组织rBD2 mＲNA 相对表达量( 2 －△△CT ) 正常组大鼠肺组织rBD2 mＲNA 相对表达量在3 个时间段无统计学差异。与正常组比较，气管切开后，大鼠肺组织rBD2 mＲNA 相对表达量第24 小时明显升高，随后开始下降，至第72 小时表达明显降低，降低程度随着时间延长而逐渐加重，在第168 小时表达下降到最低值( P ＜ 0． 05) 。用肉苁蓉多糖干预后，气管切开插管留置大鼠rBD2 mＲNA 表达量第24 小时表达明显下降，随后逐渐上升，在第168 小时达到最高值( P ＜ 0． 01) 。说明气管切开后，大鼠肺组织rBD2 mＲNA 的表达量立即升高，但随后随时间逐渐下降; 肉苁蓉多糖能够在第168 小时对气管切开插管留置后大鼠肺组织rBD2 mＲNA 的表达起明显促进作用。见表2。2． 2 大鼠肺泡灌洗液sIgA 含量正常组大鼠肺泡灌洗液sIgA 水平在3 个时间段无明显变化。气管切开后，大鼠肺泡灌洗液sIgA含量在第24 小时即明显升高，第72 小时开始下降，第168 小时则明显回落。用肉苁蓉多糖干预后，气管切开插管留置大鼠sIgA水平在第72 小时开始明显上调，并达到高峰( P ＜ 0． 01) ，随后有所下降，但仍明显高于模型组( P ＜ 0． 01) 。说明肉苁蓉多糖可以提高气切后大鼠肺泡灌洗液sIgA 含量，且在第72 小时上调sIgA 含量的效果达到高峰。见表3。2． 3 大鼠外周血IL － 2 含量气管切开后，大鼠外周血IL － 2 水平在第72 小时升高( P ＜ 0． 05 ) ，其余时段无明显改变( P ＞0． 05) 。使用肉苁蓉多糖干预后，气管切开插管留置大鼠外周血IL － 2 含量在第24 小时即明显升高，提高程度与用药时间呈正比，在第168 小时达到高峰( P = 0． 002、0． 000、0． 000) 。提示肉苁蓉多糖对气管切开留置大鼠血清IL － 2 的含量具有明显的上调作用，上调程度随着时间延长而逐渐明显增强。见表4。2． 4 大鼠外周血IL － 6 含量正常组大鼠外周血IL － 6 含量3 个时间段表达无统计学差异。气管切开后大鼠外周血IL － 6 含量在第24 小时即明显升高( P ＜ 0． 01) ，在第72 小时稍有下降，至第168 小时再次回升。用肉苁蓉多糖干预后，其含量在第24 小时即显著降低，在第168 小时达最低值( P 均= 0． 000 ＜ 0． 01) 。提示肉苁蓉多糖可以降低气管切开留置大鼠外周血IL － 6的含量，下降程度随用药时间延长而逐渐明显。见表5。3 讨论肉苁蓉属于补肾阳类中药，最早记载于《神农本草经》，是“上品”类中药，具有补肾壮阳、添精补髓、养血润燥等功效，临床上辨证运用于肾阳不足、精血亏虚、腰膝酸软、肠燥便秘等症。现代药理发现肉苁蓉具有抗氧化、抗衰老、提高机体免疫功能、调节神经内分泌等作用［7］。寻找肉苁蓉发挥作用的有效成分成为目前的课题之一。肉苁蓉多糖属于肉苁蓉主要有效成分之一，具有促进淋巴细胞增殖［8］，改善机体免疫功能，激活免疫细胞、抗氧化、护肝［9］等药理作用。本实验发现，肉苁蓉多糖可以通过上调气管切开插管留置大鼠肺组织rBD2 mＲNA 的表达和肺泡灌洗液sIgA、外周血IL － 2 含量，同时降低外周血IL － 6 的含量，从而达到改善气管切开插管留置大鼠肺部免疫功能。气管切开后，极易发生肺部感染。炎症因子释放、免疫功能低下是气管切开插管后并发肺部感染的重要因素［10］。rBD2 主要来源于唾液腺导管细胞、呼吸道上皮细胞和一些受病原体刺激的血细胞，并在呼吸道黏膜上皮的防御中起重要作用［11］，其表达水平的高低受微生物及炎症反应的影响，反过来rBD2 的表达也影响机体炎症反应状态［12］。sIgA 主要存在于乳汁、胃肠液、呼吸道分泌液等外分泌液中，是黏膜分泌的最重要的体液免疫分子，具有抗感染保护作用［13］。IL － 2 和IL － 6 均属于免疫系统产生的细胞因子。其中IL － 2 对T 细胞的增殖、分化具有促进作用，其表达的升高能够增强机体细胞免疫功能［14］。而IL － 6 属于促炎因子之一，在病理状态下，其表达的增高能引起免疫性病理损伤，加重炎症反应［15］。本实验结果显示，气管切开插管留置大鼠肺组织rBD2 mＲNA及肺泡灌洗液sIgA 含量的表达量在第24 小时升高，随后开始降低，其中rBD2 mＲNA 的表达在第72 小时显著低于正常大鼠，至第168 小时更加明显。提示气管切开后，大鼠肺部免疫功能在短时间内出现暂时增强，随后肺部免疫功能逐渐降低。这与临床上急重症患者行气管切开术后，患者肺部感染的发生率随时间逐渐增加相一致［16］。张冉令等［17］在对气管切开插管留置大鼠的研究中，发现其研究结果与本实验基本一致。同时，气管切开插管留置大鼠外周血IL － 6 水平在第24 小时即明显升高，72小时稍有下降，第168 小时与正常组大鼠比较无统计学差异，外周血IL － 2 水平在第72 小时升高，其余时段与正常组大鼠比较无统计学差异，提示气管切开后炎症反应出现，可能引发短暂的刺激性免疫应答。在用肉苁蓉多糖干预后，气管切开插管留置大鼠肺组织rBD2、肺泡灌洗液sIgA 及外周血IL － 2 的含量均出现不同程度升高。其中肺组织rBD2 和外周血IL － 2 水平在第24 小时即明显升高，提高程度与用药时间呈正比，在第168 小时达到高峰，而肺泡灌洗液sIgA 含量在第72 小时达到高峰，与此同时，其外周血IL － 6 含量在第24 小时即显著降低，降低程度与用药时间呈正比，在第168 小时降至最低。这个结果提示，肉苁蓉多糖可能是从两个方面调节大鼠肺部免疫功能，其一是通过促进rBD2、sIgA及IL － 2 等含量的表达，增强肺部免疫功能，其二则通过降低外周血IL － 6 的水平抑制炎症反应，进一步改善气管切开插管留置大鼠肺部免疫功能。参考文献:［1］ 张娜娜． 肉苁蓉多糖对更年期高血压燥证大鼠内分泌功能调节的研究［J］． 中医药学报，2018，46( 1) : 65．［2］ 张涛，许文胜，贾彦斌，等． 肉苁蓉多糖对THP － 1 细胞吞噬作用的影响及其机理研究［J］． 生命科学研究，2013，17( 2) : 148．［3］ 马慧，尹若熙，郭敏，等． 肉苁蓉多糖对D － 半乳糖致衰老模型小鼠CＲEB 表达的影响［J］． 中国实验方剂学杂志，2014，20( 20) :137．［4］ 黄文川，潘宇政，张冉令，等． 肉苁蓉对气管切开插管大鼠肺部病理及肺泡灌洗液SP － A 浓度的影响［J］． 辽宁中医杂志，2016，43( 11) : 2436．［5］ 朱翠香，彭玲玲，潘宇政． 一次性硬膜外麻醉导管气管切开插管留置大鼠模型建立［J］． 中华实验外科杂志，2015，10( 32) : 2480．［6］ 徐叔云． 药理实验方法学3 版． ［M］． 北京: 人民卫生出版社，2001: 202．［7］ 薛海燕，焦婵媛，姚军． 肉苁蓉总苷药理作用的研究现状［J］． 中国临床药理学杂志，2018，34( 4) : 486．［8］ 曾群力，郑一凡，吕志良． 肉苁蓉多糖的免疫活性作用及机制［J］．浙江大学学报( 医学版) ，2002，31( 4) : 60．［9］ Guo Y，Cao L，Zhao Q，et al． Preliminary characterizations，antioxidantand hepatoprotective activity of polysaccharide from Cistanche deserticola［J］． Int J Biol Macromol，2016，93( Pt A) : 678．［10］ 张冉令，潘宇政，黄文川，等． 骨碎补对气管切开插管留置套管大鼠外周血β － 防御素－ 2 及IL － 2 和肺泡灌洗液sIgA 的干预作用［J］． 中华中医药杂志，2017，32( 4) : 1712．［11］ Abiko Y，Saitoh M． Salivary defensins and their importance in oralhealth and disease［J］． Curr Pharm Des， 2007，13( 30) : 3065．［12］ Masuda N，Mantani Y，Yuasa H，et al． Immunohistochemical study onthe distribution of β － defensin 1 and β － defensin 2 throughout the respiratorytract of healthy rats［J］． Vet Med Sci，2018，80( 3) : 395．［13］ Moraes H，Aoki MS，Freitas CG，et al． SIgA response and incidence ofupper respiratory tract infections during intensified training in youthbasketball players［J］． Biol Sport， 2017，34( 1) : 49．［14］ van Brummelen EMJ，huisman MC，de Wit － van der Veen LJ，et al．Zr － labeled CEA － targeted IL － 2 variant immunocytokine in patientswith solid tumors: CEA － mediated tumor accumulation and role of IL －2 receptor － binding［J］． Oncotarget， 2018，9( 37) : 24737．［15］ Norelli M，Camisa B，Barbiera G，et al． Monocyte － derived IL － 1and IL － 6 are differentially required for cytokine － release syndromeand neurotoxicity due to CAＲ T cells［J］． Nat Med， 2018，24( 6) : 739．［16］ 曾上飞，王丹丹，朱国文，等． 颅内血肿清除术后气管切开患者肺部感染因素研究［J］． 中华医院感染学杂志，2017，27( 2) : 359．［17］ 张冉令，潘宇政，黄文川，等． 基于β － 防御素－ 2 的中药骨碎补对气管切开留置气管套大鼠肺部免疫功能的干预作用［J］． 时珍国医国药，2016，27( 10) : 2365．

摘要: 试验观察了肉苁蓉多糖对肉鸡免疫新城疫苗后T 淋巴细胞活性及IFN- γ含量的影响。结果: 肉苁蓉多糖使用剂量5、10、20mg/只时, 免疫后15 d 时, T 淋巴细胞转化率分别为1.20±0.11、1.30±0.13、1.79±0.32, 对照组为1.22±0.29; 免疫后20 d 时, 外周血中IFN- γ含量分别为23.23±6.13、25.95±1.13、29.95±2.23 pg/ml, 对照组为20.89±5.97 pg/mL; 肉苁蓉多糖使用剂量10、20mg/只时, 试验组T 淋巴细胞活性及IFN- γ含量显著或极显著高于对照组( ( P<0.05 或0.01) 。表明肉苁蓉多糖可能通过提高T 细胞活性及IFN- γ含量来增强肉鸡免疫功能。关键词: 肉苁蓉多糖; 新城疫; T 淋巴细胞; γ- 干扰素1 前言肉苁蓉(Cistanche DeserticolaY C Ma) 别名大芸, 主要分布于新疆、内蒙等地, 药用部分为带鳞片的肉质茎, 具有强肝补肾、益精血、润肠等功效。药理学研究表明, 肉苁蓉具有提高机体免疫功能、促进DNA 合成、抗衰老及雄激素样等重要作用, 其主要生物活性成分包括肉苁蓉多糖、黄酮、3D- 甘露醇、琥珀酸、甜菜碱、咖啡酸糖酯等。肉苁蓉糖是调节机体免疫功能的主要活性成分, 研究表明, CDPS 能单独和协同ConA、PHA 促进小鼠胸腺淋巴细胞增殖, 增强小鼠脾淋巴细胞分泌IL- 2 的能力,提高小鼠脾指数、血清溶血素值及E- 玫瑰花结形成率, 促进小鼠腹腔内吞噬细胞的吞噬能力。目前, 肉苁蓉多糖在兽医临床中的应用及研究较少, 本课题组将肉苁蓉多糖作为一种免疫增强剂配合鸡新城疫苗免疫肉鸡, 结果发现其能提高免疫肉鸡血凝抗体效价及血清对ND 病毒的中和指数。为探讨肉苁蓉多糖促进肉鸡免疫机能的可能机制, 本试验初次观察了肉苁蓉多糖对鸡免疫新城疫苗后血液中T 淋巴细胞活性及血清中IFN- γ含量的影响, 以期为CDPS 作为一种新的免疫增强剂提供一定的理论依据, 现将试验结果报道如下。2 材料与方法2.1 主要试剂及药品ND LaSota 弱毒疫苗: 哈尔滨维科生物技术开发公司, 200732。刀豆素球蛋白(ConA) : Sigma公司产品, 64H7095。四甲基偶氮唑蓝(MTT): 华美生物工程公司产品, BS0887。淋巴细胞分离液: 南京建成生物工程研究所产品,20060507。小牛血清: 杭州四季青生物工程有限公司产品, 051215。改良型RPMI1640 培养基:海克隆生物化学制品( 北京) 有限公司, NSA0028。IFN- γELISA 试剂盒: 美国IDEXX 产品, 主要包括IFN- γ一抗包被的酶标板, IFN- γ标准品, 生物素标记的IFN- γ二抗,浓缩酶联物(HRP) , 批号:064218。肉苁蓉多糖: 西南大学荣昌校区生理生化研究室制备, 肉苁蓉多糖含量≥76%。2.2 试验动物20 日龄健康罗曼肉公鸡60 只, 购自荣昌一养收稿日期: 2008- 06- 09 鸡场。2.3 试验方法2.3.1 动物分组将20 日龄罗曼肉公鸡随机分为4 组, 每组15 只, 即肉苁蓉多糖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组、生理盐水对照组( IV) , 常规隔离饲养, 饮水中添加适量抗生素、地克朱利、葡萄糖、电解多维, 预防细菌性疾病和寄生虫病。2.3.2 新城疫苗免疫方法试验鸡每隔4 d, 随机抽取8 只采血, 监测鸡新城疫血凝抑制(HI)抗体效价, 当母源抗体效价低于3log2 时进行ND 疫苗免疫, 各组鸡肌肉注射2 倍剂量的ND LaSota 苗, 同时, Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别肌肉注射50 mg/mL 肉苁蓉多糖100、200、400 μL/只、IV 组肌肉注射灭菌生理盐水400μL/只。2.3.3 外周血清中IFN- γ含量的测定2.3.3.1 鸡血清的收集及保存免疫后20d, 每组随机取8 羽翅静脉采血2～3mL, 39 ℃静置30min后再4 ℃静置1 h, 3 000 r/min, 离心10 min, 收集血清, - 20 ℃保存, 以测定外周血清中IFN- γ含量的变化。2.3.3.2 IFN- γ含量测定采用ELISA 方法进行。试剂盒整体平衡至20℃后取出包被有单抗的酶标板→配置标准品、洗涤液、辣根过氧化物酶标记物(HRP) 、生物素化的二抗(Biotin) →反应板每孔加入100 μL 标准品、备检血清→混匀30s, 37℃温育60min→洗板→加入100 μL Biotin→混匀30 s, 37 ℃温育60 min → 洗板→每孔加入100 μL HRP→轻轻混匀30 s, 37 ℃温育30 min→洗板→每孔加入100 μL TMB 显色液→轻轻混匀10 s, 37 ℃暗处温育30 min→每孔加入100 μL终止液, 轻轻混匀30 s, 30min 内在450nm处读OD 值。以标准品OD 值为纵坐标, 以标准品浓度为横坐标, 绘制标准曲线, 根据待测血清样品OD 值和标准曲线,由Bio- Rad Laboratories 软件自动计算样品中IFN- γ的含量。2.3.4 T 淋巴细胞转化活力测定: 采用MTT 法进行。2.3.4.1 5 mg/mL MTT 显色剂的配制: 称取MTT0.088 5 g, 溶于17.7mL pH7.2 的PB 中。2.3.4.2 10%SDS- 0.01mol/L HCl:称取SDS10.00 g, 溶于100 mL0.01mol/L 的HCl。2.3.4.3 含ConA 的RPMI1640 完全营养液: 量取RPMI1640 18mL,加入小牛血清2 mL, 混匀, 然后加入稀释好的青霉素和链霉素( 终浓度均为1 000 u/mL) ; 取上述营养液9.9mL, 加入用PBS 配制的1mg/mL 的ConA 0.1mL。2.3.4.4 含ConA 的RPMI1640 完全营养液: 量取RPMI1640 18mL,加入小牛血清2 mL, 混匀, 然后加入稀释好的青霉素和链霉素( 终浓度均为1 000 u/mL) ; 取上述营养液9.9mL, 加入用PBS 配制的1mg/mL 的ConA 0.1mL。2.3.4.5 孵育液取pH 7.6 的PB 89mL, 缓慢加入六偶氮副品红( 4%的亚硝酸钠溶液3mL, 慢慢滴入3 mL、40 mg/mL 的副品红溶液中, 边滴边搅拌) 6mL, 然后再加入α- 醋酸萘酯( α- 醋酸萘酯2g, 溶于100mL 丙酮) 5mL。2.3.4.6 T 淋巴细胞转化活力测定免疫后15 d, 每组随机取8羽, 翅静脉无菌采集肝素抗凝血2mL, 再加入等量的RPMI1640完全营养液( 含10%小牛血清、双抗, 0.22 μm 除菌) 稀释, 在稀释好的血液上方小心加入等量淋巴细胞分离液, 1 500 r/min 水平离心15min, 用吸管吸出淋巴细胞层, 用RPMI1640 完全营养液洗涤淋巴细胞3 次, 以无血清RPMI1640 将淋巴细胞稀释成4×106 个/mL 的淋巴细胞悬液。将含ConA 的RPMI1640 完全营养液100 μL (ConA 终浓度10 μg/mL) 和单独的RPMI1640完全营养液100 μL 分别加入细胞培养板中, 各3 孔, 取淋巴细胞悬液加入上述6 孔细胞培养板中, 每孔100 μL, 将细胞培养板置于39.0 ℃、5%CO2、饱和湿度的CO2 培养箱中培养66h, 然后每孔加入5 mg/mL MTT 15 μL,继续培养4 h, 再加10% SDS-0.01mol/L HCl 100 μL/孔, 继续培养2h 后取出, 室温放置5min,用酶联免疫检测仪检测570 nm和630 nm 下的OD 值, 计算刺激指数( SI) 。用刺激指数判断T淋巴细胞转化的程度, 指数越大表明转化率越高。SI= 含ConA(OD570- OD630)不含ConA(OD570- OD630)2.4 结果分析采用SPSS11.5数据分析软件对试验结果进行统计分析, 各指标用±S 表示, 同时进行t 检验。3 试验结果3.2 肉苁蓉多糖对肉鸡免疫ND 苗后外周血中T 淋巴细胞活性及IFN- γ含量的影响肉苁蓉多糖联合ND 苗免疫肉鸡后15 d 时, 淋巴细胞转化率以Ⅲ组最高, 与对照组比较呈显著差异P<0.05) , Ⅰ组、Ⅱ组与对照组比较差异不显著(P>0.05) ; 免疫后20d 时, 肉苁蓉多糖不同用量组外周血中IFN- γ含量均高于对照组, 但Ⅰ组与对照组比较差异不显著(P>0.05) , Ⅱ组、Ⅲ组与对照组比较差异显著或极显著(P<0.05 或0.01) 。结果见表1。4 分析与讨论试验结果显示, CDPS 对T淋巴细胞增殖活力具有一定的增强作用, 这与曾群力等报道肉苁蓉多糖单用时对小鼠脾、胸腺淋巴细胞增殖有明显促进作用,并可协同ConA、PHA 刺激小鼠胸腺细胞增殖的实验结果基本一致。T 淋巴细胞在免疫系统中起着极重要的作用, 一方面, 活化的B 细胞在Th 分泌的多种细胞因子作用下, 可增殖分化为分泌抗体的浆细胞和记忆B 细胞; 另一方面T 淋巴细胞可通过迟发型超敏性T 细胞和细胞毒性T 细胞介导特异性的细胞免疫功能。表明CDPS 可能通过提高T 淋巴细胞的增殖活力以增强机体免疫功能。IFN- γ主要是由T 淋巴细胞不同的亚群分泌的免疫调节因子, 具有广泛抗病毒作用、抗肿瘤作用和双向免疫调节作用,同时对不同免疫细胞间相互作用和发挥免疫功能具有重要的介导作用。IFN- γ能干扰病毒的繁殖, 其机制是IFN- γ与细胞表面相应受体结合后, 诱导细胞形成抗病毒蛋白, 从而抑制病毒复制。此外, IFN- γ还可通过增强或发动宿主对肿瘤细胞的免疫反应, 有利于促进单核巨噬细胞通过吞噬作用和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用杀伤肿瘤细胞。本次试验中CDPS 免疫组对IFN- γ诱生作用均高于生理盐水对照组, CDPS 用量分别为5、10、20 mg/只时, IFN- γ含量为23.23 ±6.13、25.95 ±1.13、29.95±2.23 pg/mL, 说明CDPS 对鸡IFN- γ含量的影响呈一定的量效关系, 这与杨铁虹等对当归多糖可诱生高水平的IFN- γ产生的结果基本一致, 表明CDPS可能通过提高血清中IFN- γ的含量, 进而诱导单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等MHC- Ⅱ类抗原的表达, 促进其参与抗原的递呈及特异性的免疫识别过程,进而增强机体的免疫功能。5 结论结果表明, 肉苁蓉多糖能提高肉鸡免疫新城疫苗后外周血液中T 淋巴细胞的转化率及IFN- γ含量, 且其效果与肉苁蓉多糖用量存在着一定的量效关系。