摘 要: 目的: 观察肉苁蓉多糖对骨髓抑制贫血小鼠造血功能的影响, 探讨其造血调控作用机制。方法: 采用CO60照射和注射环磷酰胺复合制备贫血小鼠模型。应用流式细胞术( FCM ) 检测肉苁蓉多糖对骨髓抑制贫血小鼠骨髓细胞周期的影响, 采用造血祖细胞培养术观察三系造血祖细胞集落数。结果: 低剂量和高剂量肉苁蓉多糖能明显促进骨髓G0 /G1期细胞向S期细胞以及S期细胞向G2 M/ 期细胞的转化, G2 M/ 期细胞比例明显升高, 增殖指数( PI) 也明显升高。给药组CFU - E, BFU - E, CFU -M eG 与贫血对照组集落数有显著差异。结论: 肉苁蓉多糖可能通过促使骨髓抑制贫血小鼠骨髓细胞细胞周期的转化, 促进骨髓造血功能的恢复, 并促进红系巨核系造血。关键词: 肉苁蓉多糖; 骨髓抑制性贫血; 小鼠严重的骨髓抑制性贫血常可由放、化疗引起, 其对人类和动物会造成造血系统机能的损伤。肾中精气是血的化源之一。当肾中精气不足时, 可导致血液生成不足而形成血虚的病理变化。肉苁蓉是经典的补肾药, 具有补肾阳、益精血、润肠通便等功效, 在临床常用于辅助治疗各种因素造成的贫血。肉苁蓉多糖为肉苁蓉的主要成分。本实验运用血液实验技术, 观察肉苁蓉多糖对骨髓抑制贫血小鼠的骨髓有核细胞周期变化, 各系造血祖细胞集落产率等的影响, 探讨肉苁蓉对骨髓抑制性贫血小鼠造血的影响, 对肉苁蓉多糖的作用机理进行探讨。1 材 料1. 1 实验动物8~ 12周龄BALB /c纯系雄性小鼠40只,体量18~ 22g, 由成都中医药大学实验动物中心提供。1. 2 试剂 肉苁蓉多糖, 湖南九汇制药厂提供; 环磷酰胺(上海华联制药有限公司产品Lot031110 - 2) ; RNA 酶、碘丙啶( PI) 荧光染液( 美国Sigma 公司产品Lot A108354) ;1640培养基( G ibco公司), 促红细胞生长激素( Fry thropo ietin,成都地奥) , IL - 3、粒单系集落生长刺激因子( mGM -CSF, Riche 公司), 促血小板生长激素( Throm bopoie - tin,R& D公司, 美国)。1. 3 仪器 Co60C源(四川省农业科学院辐照场提供), 流式细胞仪( FACScan, Beckm an公司)四川省人民医院。2 方 法2. 1 动物模型制备 小鼠经2. 0Gy Co60照射后的第3天开始每天腹腔注射环磷酰胺( CTX ) 50mg /kg ( 于临用前配制), 连续给药3天完成骨髓抑制性贫血模型制备[1 - 3]。2. 2 实验动物造模及分组将实验小鼠分正常对照组、模型组、肉苁蓉多糖低剂量组和高剂量组, 每组10只。除正常对照组外, 其它3组均进行造模。小鼠造模完成的第2天开始给药, 正常对照组和模型组每只小鼠腹腔注射0. 2mL /d的生理盐水; 低剂量和高剂量肉苁蓉组分别给肉苁蓉50m g /kg和100m g /kg, 每只小鼠腹腔注射0. 2mL /d, 共给药7天。2. 3 流式细胞仪测定细胞周期单个骨髓细胞悬液离心( 1000r /m in, 5m in), 弃上清, 用PBS洗涤2次, 去上清液, 滴70%乙醇隔夜固定细胞, 立即混匀, 用封口膜封口, 置4e冰箱冷藏备用。取细胞样品, 用PBS 洗两次, 以洗去残留的乙醇, 加100LLPBS后混匀, 每管加PI染液1m L, 避光染色30m in, 上流式细胞仪检测细胞周期的变化。2. 4 本实验室常规培养方法制备骨髓有核细胞单细胞悬液, 每孔BMC 终浓度为1 @ 105 /m L, 根据各自体系分别对粒系( CFU - GM ), 红系( BFU - E, CFU - E )、巨核系( CFU -Meg) 祖细胞培养。2. 5 统计学处理 实验所得数据用€x ? s 表示, 各组数据先行方差齐性检验, 再进行单因素方差分析A= 0. 05。SPSS11. 5软件分析结果。3 结 果3. 1 肉苁蓉多糖对小鼠骨髓细胞周期的影响 见表1。由表1可见, 各组骨髓细胞以G0 /G1期为主, 与正常对照组相比, 模型组、低剂量和高剂量肉苁蓉多糖组G0 /G1期细胞比例有不同程度的减少, 但低剂量和高剂量肉苁蓉多糖组细胞其差异无统计学意义。G2 M/ 期细胞在低剂量和高剂量肉苁蓉多糖组有所增加, 模型组有所增加, 其差异有统计学意义( P < 0. 05); 说明模型组G2 M/ 骨髓细胞明显阻滞,其中低剂量和高剂量肉苁蓉多糖组细胞S期细胞比例有不同程度的增加与模型组比较明显增加( P < 0. 05 )。肉苁蓉多糖似乎更倾向于促进细胞由G0 /G1进入S 期以及S期细胞向G2M 期细胞转化, 促进骨髓细胞DNA的合成作用。3. 2 肉苁蓉多糖对贫血小鼠造血祖细胞集落形成的影响见表2。贫血小鼠骨髓有核细胞( BM C)形成造血祖细胞集落的数目远低于正常对照小鼠, 有显著统计学意义(P <0. 05) 。肉苁蓉多糖能明显促进贫血小鼠巨核系和红系造血祖细胞集落的形成, 与贫血对照组相比, 肉苁蓉组有显著的统计意义( P < 0. 05), 但是粒系没有显著差异。提示肉苁蓉多糖可促进造血祖细胞增殖。4 讨 论目前多糖已作为肿瘤辅助治疗药物大量应用于临床,相关报道证实可以减轻放化疗副作用, 提高生存质量[4 ]。本实验采用复合造模法制备的骨髓抑制贫血小鼠作为实验动物。骨髓细胞周期是反映造血系统造血功能的重要指标之一, 细胞周期各个时相的分布情况可以反映骨髓细胞增殖的状态。在细胞周期调控机制中有两个重要的检查点,分别位于G1期与S期、G2期与M 期之间。本实验在BMC周期时相分析中, 已证实肉苁蓉多糖能够促进G1期骨髓细胞进入细胞周期运行。细胞周期运行的调控是个非常复杂的过程, 依赖于细胞周期素( cyc lin) 、细胞周期依赖型激酶( CDK)及其抑制剂( CDK i) 等的相互作用。G0 /G1期细胞能否进入S 期是细胞周期能否正常运行的第一个关键步骤, 在G1晚期R限制点是增殖的敏感点, R限制点对很多理化、生物、射线因素敏感, 多糖对骨髓抑制的解除是否与保护R限制点有关尚待进一步验证。S 期主要事件是DNA合成的启动、DNA 合成、蛋白合成。用药后主要表现为S期所占比例明显增加。一定剂量的肉苁蓉具有促使骨髓抑制贫血小鼠骨髓细胞解除G0 /G1期阻滞、加速G0 /G1期细胞向S 期细胞以及S 期细胞向G2 M/ 期细胞转化的作用。细胞周期性调控是一个极为复杂的过程, 涉及众多的基因调控, 今后还有待于在分子水平上进一步研究体内用药对造血祖细胞的影响, 即在一定浓度范围, 肉苁蓉多糖给药组均可促进巨核系、红系造血祖细胞的增殖与分化, 减轻骨髓抑制, 促进造血。但给药组对粒系集落的增殖不明显与模型组没有差异, 可能与其给药时间短有关[5 - 7 ]。肉苁蓉多糖的作用是否是直接作用于祖细胞由于接种的骨髓有核细胞是相当复杂的异质细胞群, 不能排除在此过程中肉苁蓉多糖对基质细胞的刺激作用产生的细胞因子分泌对各系祖细胞的增殃分化调控的影响, 事实上, 从对红系的影响可以看出这一点, 肉苁蓉多糖主要表现对红系的影响, 是否提示肉苁蓉多糖可能刺激EPO 的分泌或通过某种机制增强EPO的效果来影响红系。参考文献[ 1 ] 潘景轩, 朱振宇, 李树浓, 等. 亚致死量60Co射线照射后小鼠骨髓造血细胞程序性死亡特性研究[ J ]. 实验血液学杂志,1996, 4( 2 ) : 195 - 197[ 2 ] 孙纪元. 再生障碍性贫血动物模型实验研究[ J ]. 中国实验动物学杂志, 2000, 10 ( 4) : 210 - 212[ 3 ] 陈志伟. 骨髓抑制性贫血小鼠模型的研究[ J ]. 中国比较医学杂志, 2006, 16 ( 5) : 260 -262[ 4 ] 宋俊玲, 杨岚, 田琼, 等. 血小板因子4 对环磷酰胺诱导化学损伤小鼠骨髓细胞的保护作用[ J ]. 第四军医大学学报,2002, 23( 9 ): 803 -805[ 5 ] 高月, 刘秀珍, 马成禹, 等. 红景天对小鼠造血功能的影响[ J]. 中华放射医学与防护杂志, 1994, 12( 6 ) : 391 - 392[ 6 ] 吕艳, 祝彼得, 冯雪梅, 等. 人参总皂苷和西洋参茎叶总皂苷对贫血小鼠造血影响的比较[ J ]. 成都中医药大学学报,2005, 2( 2 ) : 33 - 35[ 7 ] 张新胜. 红景天苷对骨髓抑制贫血小鼠骨髓细胞周期和凋亡相关蛋白表达的影响[ J ]. 四川大学学报(医学版) , 2005, 36( 6) : 820 - 823

摘要：目的：探讨肉苁蓉多糖对更年期高血压燥证大鼠血清内分泌功能的调节作用。方法：采用摘除S H R 大鼠卵巢并给予燥性饲料的方法建立更年期高血压燥证复合动物模型，并对模型进行行为学和检测指标评价。将符合更年期高血压燥证的6 2 只大鼠随机分为5 组：S H R 组（1 0 只）、假手术组（1 0 只），模型组（1 0 只，更年期高血压燥证），阳性组（1 0 只，坤泰胶囊，1 . 0 8 g/ k g ) ，肉苁蓉高剂量组（1 1 只，相当于肉苁蓉生药量1 1 . 8 4 g ，1 . 2 g/ k g ) 、低剂量组（1 1 只，相当于肉苁蓉生药量5 . 9 2 g ，0 . 6 g /k g ) ，观察各大鼠血压及行为变化，检测大鼠血清神经递质（N E 、D A 、5 - H T 、5 -H I A A 、N P Y ) 及内分泌（E 2 、F S H 、L H )表达水平的变化。结果：与假手术组相比，模型组大鼠行为学变化、血清神经递质及内分泌变化符合更年期高血压燥证临床特征，提示模型复制成功。药物干预治疗后，肉苁蓉多糖（C D P S ) 高、低剂量组明显下调F S H 、L H 表达水平（B < 0 . 0 5 ) ，但对E 2表达水平调整作用不明显，比模型组稍高，组间比较显示差异没有统计学意义（B > 0 . 0 5 ) ; 肉苁蓉多糖（C D P S ) 低剂量组对D A 的调节能力稍弱，与模型组相比，没有显著性差异（B > 0 . 0 5 ) ，肉苁蓉多糖（C D P S ) 高剂量组作用强度稍弱于阳性组。结论：肉苁蓉多糖能通过增强H P O A 功能实现对神经递质与内分泌激素的调节，纠正下丘脑神经递质紊乱状态，改善植物神经功能，稳定机体内环境，促进内分泌功能的改善，并加速新陈代谢，发挥改善更年期症状的作用。关键词：更年期高血压；燥证；肉苁蓉多糖; 神经内分泌功能更年期高血压是由于机体内分泌代谢紊乱并伴有植物神经功能失调从而引发的血压波动，有近8 0 F 的女性会出现该症状，并且该阶段血压波动易受到情绪、睡眠等外界因素的干扰，导致血压变异性较大，常规降压药控制不理想，并且长期服用有不同程度的不良反应发生。现代研究更年期血压异常波动可能与患者内分泌激素水平变化有明显关联[1]，临床治疗主要以雌激素替代疗法进行干预，而该方法不适用于有激素禁忌症的患者，如肝肾功能障碍、乳腺癌、糖尿病等，与此同时也会增加患者心脑血管疾病及生殖系统副反应发生的几率[2];相对于祖国医学对该疾病的治疗，则显的更具有优势，中医药辨证组方不但能对血压进行不同幅度的调节，还能改善患者睡眠状况、减轻患者临床症状，临床治疗以疗效确切、毒副作用少等优点而受到患者的好评。肉苁蓉为列当科寄生植物，是“药食两用”之品，营养价值高，具有独特的医药和保健功能，其中多糖（cistan ch e deserticola p olysacch arid es，C D P S )为其主要生物学活性组分，有研究显示由肉苁蓉组方制成的制剂能改善更年期综合征的临床症状[3]，且肉苁蓉对雌性肾虚小鼠有促卵泡发育、促黄体生成作用，显示了肉苁蓉对雌性肾虚小鼠内分泌功能的调节作用[4]，但对于肉苁蓉多糖的调节作用机制尚未有深入研究，基于此，本研究以更年期妇女患者的临床指征为基础复制更年期高血压燥证动物模型，并给予肉苁蓉多糖进行干预治疗，以考察肉苁蓉多糖对更年期患者内分泌系统的调节机制。1 材料与方法1 .1 动物健康雌性S P F 级S H R 大鼠6 5 只，体质量(2 0 0 . 0 ±15. 0 )g ，购自河南省实验动物中心，许可证号SCXK(豫#2 0 1 4 - 0 0 0 9 。大鼠喂养普通饲料，自由饮水，避免噪声及其他环境因素干扰。1 . 2 试药与试剂肉苁蓉饮片5 0 0 g (购自张仲景大药房，产地:内蒙古，批号2 0 1 2 1 0 2 5 );其他试剂均为分析纯。坤泰胶囊(贵阳新天药业股份有限公司，批号1 4 0 5 0 7 ) ; 内分泌指标[雌二醇（e s a d i o l ，E2 ) 、促卵泡生成激素（folliclestim ulating horm one，F S H ) 、促黄体丽生成激素（lu tein izinghorm one，L H )] E lisa 检测试剂盒购 自北京康为世纪生物科技有限公司；神经递质[ 去甲肾上腺素(N E ) 、多巴胺（D A ) 、5 - 羟色胺（5 - H T ) 、神经肽Y(neuropettide Y ，N P Y ) 、5 - 羟吲哚乙酸（5 - H IA A )]E l i s 检测试剂盒购自北京四正柏生物科技有限公司。1 . 3 仪器与设备超声波清洗器(KQ - 3 0 0 V D V ，昆山市超声仪器有限公司）；岛津2 0 1 0 型紫外可见分光光度计（日本）；A C C E S S 型全自动化学发光免疫分析仪（美国BECK MAN COULTER 公司 ）；A B2 0 4 - S 型梅特勒电子天平(北京梅特勒- 托利多有限公司）；动物无创血压测量仪（BP - 1 0 0 A 型，程度泰盟科技有限公司）。1 . 4 方法1 - 4 . 1 肉苁蓉多糖的制备取肉灰蓉饮片5 0 0 g ，加1 0 倍量水浸泡3 0 m in ，加热提取2 次，每次1 . 5 h ，合并煎液（呈棕红色），浓缩至2 : 1 (体积质量比），离心（3 0 0 0 r /m in )1 5 m in ，取上清液，加入3 倍量9 5 F 乙醇沉淀，冷藏并静置2 4 h ，离心分离沉淀，将沉淀物用无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤，将洗涤后的沉淀真空干燥，采用蒽酮-硫酸法测定肉灰蓉多糖的含量，即得到肉苁蓉多糖粗品（灰棕红色，得率为1 0 . 1 3 % ) 。I . 4 . 2 分组与给药所有大鼠购回后分笼饲养，适应1 周后分组，剔除体质量偏差较大的S H R 大鼠3 只，其余6 2 只按照随机数字表法分为5 组，分别为S H R 组，假手术组，模型组(更年期高血压燥证模型），阳性组（坤泰胶囊，1. 0 8g/ k g ) ，肉苁蓉高剂量组（相当于肉苁蓉生药量I I . 8 4 g ，1 . 2 g/ k g ) 、低剂量组（相当于肉苁蓉生药量5 . 9 2 g ，0 . 6 g/ k g );按照《药理实验中动物间和动物与人间的等效剂量换算》公式换算大鼠给药剂量，2 0 1 5版《中国药典》肉苁蓉用量为6 ~ 1 0 g/ d ，肉苁蓉多糖粗 1 g 当 肉 生药 9 . 8 7 g ， 药 肉蓉多糖适量于灭菌生理盐水中，配制成0 . 1 g/ m L 的肉苁蓉多糖溶液，阳性组取内容物配制成浓度为0. 1 g/ m L 的水溶液，按照体质量计算每次给药剂量，正常对照组和模型组给予等剂量的生理盐水。除肉苁蓉多糖两个剂量组分别1 1 只大鼠外，其余三组均为1 0 只。各组动物连续给药4 周，观察并记录药物干预期间动物行 学特征 化。1 . 4 . 3 动物模型的复制参考文献方法复制更年期高血压燥证大鼠模型[5 < ，采用手术方法摘除双侧卵巢，复制更年期高血压大鼠，在模型复制成功1 周后，每日给予特殊饲料(饲料配方:普通大鼠饲料+ 0. 5 F 孜然+ 0. 5 F 五香粉+ 1 0 F 动物脂肪+ 2. 5 F 油炸花生仁+ 2. 5 F 熟芝麻) 1 0 0 g ，饮用水2 0 0 m L ，保持饲养笼温度和相对湿度恒定，连续造模3 周，复制更年期高血压燥证大鼠，模型复制期间密切观察动物生物学特性并及时记录。1 . 4 . 4 指标的检测实验结束后，采用动物无创血压测量仪检测实验前后大鼠尾动脉收缩压（测量3 次，取平均值）。1 0 %水合氯醛溶液腹腔麻醉( 3 5 m + k g ) ，腹主动脉取血约5 m L ，以3 0 0 0 r /m in 速度离心1 5 m in ，分离血清于E p -p en d o rf管，- 2 0 °C 冷冻保存待测。采用放免法测定血清内分泌指标（E2 、F S H 、L H ) 。取血后的大鼠迅速断头取脑，采用化学荧光法测定下丘脑神经递质（5 -H T 、N E 、D A 、N P Y 、5 - H I A A ) 含量。1 . 4 . 5 统计学处理采用SPSS1 6 . 0 数据处理系统对实验数据进行统计学分析，首先对实验数据进行正态性检验（[ S 检验），符合正态分布且方差齐的数据采用单因素方差分析法进行多组间比较; 不符合正态分布的数据采用Chi - sq u a re检验，所有统计比较以B < 0 . 0 5 代表差异具有统计学意义。2 结果2 . 1 更年期高血压燥证大鼠模型评价更年期高血压燥证模型大鼠表现出明显的好斗、易怒、性情急躁等特点，动物饮食量降低，毛发槁枯，该症状与临床特征相一' 致。2 . 2 各组大鼠在药物干预前后血压水平变化由表1 可以看出: 假手术组与S H R 组相比血压变化不明显，差异没有统计学意义（ B > 0. 0 5 ) ; 模型组大鼠血压较S H R 组有明显上升，与假手术组相比差异具有统计学意义（B < 0 . 0 5 ) 。2 . 3 各组大鼠在药物干预前后血清内分泌水平变化由表2 可以看出: 与假手术组和S H R 组大鼠相比模型组大鼠内分泌激素水平较大，组间差异明显（ B <0. 0 5 ) ，集中体现在E2 水平大幅度下降，F S H 、L H 表达水平明显上升，提示模型组大鼠内分泌指标出现紊乱，符合更年期高血压临床特征。给予药物干预后，阳性组和C D P S 高、低剂量组大鼠的内分泌水平有不同程度的改善，其中阳性组改善作用更为明显，C D P S 高、低剂量组对E2 水平的改善程度稍弱，与模型组相比，差异没有统计学意义（ B > 0 . 0 5 ) ，而对F S H 、L H 指标改善明显，差异具有统计学意义( B < 0 . 0 5 ) 。2 . 4 各组大鼠在药物干预前后各血清神经递质含量化由表3 可以看出: 模型组大鼠与假手术组相比，各神经递质表达水平有显著差异（ B < 0. 0 5 ) ，提示模型组大鼠 经递 达水 异 ， 症 符合更年期血压燥证临床特征。经药物干预治疗后，与模型组相比，除C D P S 低剂量组对D A 调节作用稍弱以外（ B >0. 0 5 ) ，阳性组和C D P S 各剂量组均能不同程度的调整各神经递质的表达水平，且差异具有统计学意义（ B <0. 0 5 ) ，其中阳性组作用强度较C D P S 高剂量组强。3 讨论更年期综合征（m enopausal syndrom e, M P S) 是指更年期妇女由于卵巢功能衰退，E2 分泌减少，机体对下丘脑- 垂体系统的负反馈调节作用减弱，诱导下丘脑弓状核和室旁核脉冲式分泌促性腺激素释放激素( G n R H ) 至门脉循环系统，刺激垂体分泌F S H ) L H 增加，引起下丘脑- 垂体- 卵巢轴（h yp oth alam o- pituitary- ovarian a x ix ，H P O A ) 功能紊乱* 7+ ，进而影响下丘脑单胺类神经递质的平衡。神经递质在神经细胞间及神经细胞与内分泌、免疫系统之间信息传递有非常重要的作用，其中神经递质中以单胺类神经递质为主，包括儿茶酚胺类（如D A ) 、吲哚类（如5 - H T ) ，而5 - H T是控制人类情绪变化的最主要物质，直接影响机体的生理及心理功能，更年期妇女神经递质的异常变化会导致机体植物神经功能的异常，进而影响个人情绪与正常的生理功能，产生诸如失眠多梦、烦躁不安等症状[8+ ; 有研究证实* 9+ 血清E2 表达水平的降低与F S H 、L H 的升高与女性更年期发病有明显关系。传统中医学中，对于更年期并与明确的名称与之相对应，根据患者临床症状，可将本病与“脏燥”“盗汗”“眩晕”等疾病相关联。祖国医学认为，女子以肝为先天，以血为用，更年期妇女天癸将绝而未绝，阴血亏虚，肝失所养，疏泄不力而致肝气郁结不畅，故“肝郁”为更年期发生之标; 肝失条达，则气机不畅，血行不利，可成血瘀之弊，故“血瘀”为其主要病理表现; 肝失所养，日久累肾，肾气日衰，精血不足，阴阳失衡，故而“肾虚”为发生之本' 根据辨证，兼以祛痰、解郁、泻火之法；“更年期”实为本虚标实、虚实夹杂之证，治则当以“滋补肝肾”为主[10]，基于此，实验复制动物模型时在更年期高血压模型的基础上复制了燥证模型更符合更年期特征肉苁蓉属于《神农本草经》“上品”类中药，为列当科植物肉灰蓉（ -eser' o* Y . C . M a) 的干燥带鳞叶的肉质茎，具有补肾壮阳、添精补髓、养血润燥、悦色延年之功效，由于其资源的匮乏，目前已列为国家二级保护植物。现代药理学研究证实，肉苁蓉有多种生物学活性，发挥该生物学活性的主要活性成分为多糖类成分，如促进机体产生白介素- 2 、促进免疫细胞增殖、促进网状内皮系统吞噬、促进胸腺成熟细胞向外周释放等免疫调节作用[11_13]。坤泰胶囊（原名更年宁心胶囊）用于更年期综合征，尤其是对绝经过渡期更年期患者更为适合，提示该制剂可直接作用于卵巢组织，促进卵巢内微循环，增强卵巢供血功能，有效改善卵巢功能；同时组方中熟地黄、阿胶等中药能刺激已经闭锁的卵泡，恢复卵巢分泌激素的功能，调节激素分泌平衡' 延长卵巢生命力，推迟女性绝经期[14-15]，因此本文以坤泰胶囊作为阳性药物参与对照。从研究结果来看: 卵巢摘除前后模型组大鼠尾动脉收缩压无明显变化（ B > 0 . 0 5 ) ，提示摘除卵巢对S H R 大鼠的应激性刺激尚未影响到血压的波动' 摘除后的大鼠内分泌指标有异常变化，大鼠在被切除卵巢后，血清中雌激素E2 表达水平显著下降（ B < 0 . 0 5 ) ，提示此时下丘脑- 垂体的负反馈作用减弱，代偿性使F S H 、L H 含量上升（ B < 0 . 0 5 ) ，导致内分泌功能出现紊乱，该变化符合更年期特征，而内分泌的紊乱会影响到下丘脑单胺类神经递质的平衡; 研究显示， CDPS高、低剂量组明显下调F S H 、L H 表达水平（ B < 0 . 0 5 ) ，E2 达水 作用 ， 模型组 ， 组间比较显示差异没有统计学意义( B > 0 . 0 5 ) 。从神经递质的角度来看: 模型组大鼠血清5 - H T 、5 - H IAA含量显著上升，N P Y 、N E 、D A 含量明显下降，该变化符合更年期 女 经递 的 化 ; 主要是儿茶酚胺类递质合成代谢受到抑制，而分解代谢有所增强，同时会导致大脑内5 - H T 的代谢及神经活性相应增强，打破了 5 - HT/ N E 的动态平衡，而5 - HT在机体中以抑制兴奋为主要效应，其指标的异常升高，会引起情绪低沉、抑郁寡欢，这也是5 - H T 能够引起神经功能低下导致抑郁症的病理生理基础之一。上 ， 肉 多 H PO A现肾上腺素与皮质激素的调节，F S H 、L H 指标的下调和E2 含量的回升提示肉苁蓉多糖能显著改善机体的内分泌调节机制，纠正下丘脑神经递质紊乱状态，改善植物神经功能，稳定机体内环境，促进内分泌功能的改善，并加速新陈代谢，发挥改善更年期症状的作用。参考文献：[ 1 ] 祖力胡马尔•玉素甫，郭蔚，徐燕，等.中西医防治女性更年期高血压病的研究进展[J].中国医药导报，2015，33(12):46 -50.[2] Marnocha SK，Bergstrom M，Dempsey LF. 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摘要: 目的研究肉苁蓉多糖( CDPS) 对东莨菪碱所致学习记忆障碍小鼠在突触可塑性方面的改善作用。方法昆明小鼠随机分为6 组，分别为东莨菪碱模型组、正常对照组、CDPS 小剂量( 25 mg·kg － 1 ) 组、CDPS 中剂量( 50 mg·kg － 1 )组、CDPS 大剂量( 100 mg·kg － 1 ) 组和阳性对照组。除正常对照组外，其他组小鼠口服给CDPS 6 周，并于Morris 水迷宫训练第4 天前腹腔注射东莨菪碱4mg·kg － 1， 30 min 后进行行为学指标测定，包括Morris 水迷宫和跳台试验。处死取脑海马组织，运用Western blot 技术及ＲT-PCＲ 比较小鼠海马区GAP-43，SYP 以及PSD-95 的蛋白水平及基因水平的表达差异，并用透射电镜观察海马CA3 区突触数量与相关结构的变化。结果CDPS ( 25、50、100 mg·kg － 1 ) 组小鼠与正常对照组小鼠在水迷宫实验的潜伏期明显短于模型组小鼠，而且在Q3 象限的时间明显大于模型组小鼠。CDPS( 50、100mg·kg － 1 ) 组小鼠跳台实验中的错误次数与模型组小鼠相比减少。Western blot 与ＲT-PCＲ 实验结果显示，模型组小鼠海马区GAP-43、SYP 的表达水平与正常对照组比较明显降低。CDPS ( 25、50、100 mg·kg － 1 ) 组小鼠海马区SYP 的表达较模型组明显增高，CDPS ( 25、50 mg·kg － 1 ) 组小鼠海马区GAP-43 的表达水平较模型组明显增高，PSD-95 的表达在不同组中没有明显变化。最后，我们观察小鼠海马CA3 区的超薄切片发现，CDPS 可以使CA3 区突触数量增多。结论东莨菪碱可以造成小鼠学习记忆障碍模型，并使小鼠海马区相关蛋白表达异常，由此引起突触可塑性的变化，进而导致学习记忆能力的改变。而CDPS 能够提高SYP 与GAP-43的表达，增多突触数量，使突触可塑性有所恢复，并且改善小鼠的学习记忆能力。关键词: 肉苁蓉多糖; 突触可塑性; 学习记忆; SYP; GAP-43; PSD-95肉苁蓉始载于《神农本草经》并列为上品，为列当科植物肉苁蓉( Cistanche deserticola Y． C． Ma) 的带鳞叶的肉质茎，具有补肾壮阳、填精补髓、养血润燥、悦色延年等功效，在历代补肾阳处方中使用频度最高［1］。中医认为: 脑为髓海，精生髓，肾藏精，在下为肾，在上为脑，虚则皆虚［2］。所以我们认为有益肾作用的肉苁蓉也应具有改善学习记忆的功效。但是迄今为止，未见关于肉苁蓉改善学习记忆的报道。现在学习记忆的研究得到了广泛的重视，根据已有研究经生物信息学分析，已经确定了和学习记忆训练相关的脑区域及相关蛋白［3 － 5］。但是从神经可塑性角度阐述益智药物作用机制的鲜有报道。因此我们采用东莨菪碱诱导的学习记忆障碍小鼠为模型，并用肉苁蓉多糖( CDPS) 对模型小鼠进行治疗。观察药物对小鼠行为学表现的影响，对小鼠海马区的突触素( synaptophysin，SYP) 、生长相关蛋白43( growth associated protein 43，GAP-43) 、突触后致密蛋白95 ( postsynaptic density protein-95，PSD-95 ) 3个突触可塑性相关蛋白表达的影响，以及对突触数量及形态的影响，从而系统了解CDPS 对东莨菪碱所致的学习记忆障碍模型小鼠的药效，并探讨其干预作用的靶点及机制，为进一步研发新药提供实验依据。1 材料与方法1． 1 实验材料1． 1． 2 实验动物昆明小鼠，♂♀各半，体质量( 25 ± 2) g，购自内蒙古大学动物中心，批准号: 2000－ 017 号1． 1． 3 药品与试剂肉苁蓉多糖由本实验室自行提取［6］，多糖纯度为88%。其他试剂有氢溴酸东莨菪碱( Sigma，USA) ，PSD-95 抗体( 1 ∶ 2 000; Abcam，UK) ，GAP-43 抗体( 1 ∶ 1 000; 1 ∶ 500; C-20，SantaCruz Biotechnology，USA) ，SYP 抗体( 1 ∶ 1 000;1 ∶ 500; C-20，Santa Cruz Biotechnology，USA) ，TotalＲNA Kit ( Tiangen，China) ，ＲevertAid First StrandcDNA Synthesis Kit( Thermo Scientific，USA) 。1． 2 试验方法1． 2． 1 模型制备于行为学实验第4 天前30 min，除正常对照组腹腔注射等量的生理盐水外，其余各组小鼠均腹腔注射东莨菪碱( 4 mg·kg － 1 ) 。1． 2． 2 实验分组采用分层随机法随机将动物分为6 组。①蒸馏水组( 正常对照组) ; ②东莨菪碱组( 模型组) 4 mg·kg － 1 ; ③多奈哌齐组( 阳性对照组)0. 8 mg·kg － 1 ; ④CDPS 不同剂量组: 25、50、100 mg·kg － 1。每组各12 只，♀♂各半。除正常对照组外，其他组小鼠口服给肉苁蓉多糖6 周后，于行为学训练第4 天前腹腔注射东莨菪碱( 4 mg·kg － 1 ) 。1． 2． 3 行为学实验Morris 水迷宫测试［7］ Morris水迷宫由一个圆形水池和自动录像及分析系统两部分组成。水池高70 cm，直径100 cm，有机玻璃站台放置其中一个象限中央，水温控制在( 22 ± 2℃) 。6组动物每天训练2 次，共训练5 d，于d 4 训练前30min 造模。数据采集、处理由图像自动监视和处理系统完成，得到游出时间( 即入池到找到站台的时间) 和动物在第三象限时间，以及搜索站台的全过程录像。小鼠被动回避性跳台实验［8］装置为80 cm × 16cm × 40 cm 的茶色有机玻璃箱，箱底铺有铜栅作为刺激电极，内设高4. 5 cm，直径6. 5 cm 的橡皮垫作为回避电击的安全平台。先放入小鼠适应5 min，以36V 交流电电击小鼠，若小鼠跳上安全平台为正确，如从台上跳下，双足接触铜栅为错误反应。记录3min 内出现的错误反应数。24 h 后重测验，以小鼠学习和次日重测验( 记忆) 过程中出现的错误反应次数及潜伏时间来评价学习记忆能力。1． 2． 4 Western blot 水迷宫检测后，立即将小鼠断头处死，头置冰盘中快速分离双侧海马，用生理盐水冲洗表面血迹，以1 ∶ 9 ( 即100 mg 重量加入900 μl体积) 的比例加入蛋白匀浆提取液，加入适当体积的上样缓冲液，终浓度为5 g·L － 1，煮沸5 min，分装。用10%聚丙烯酰胺分离胶，4% 聚丙烯酰胺浓缩胶进行电泳，将蛋白质从SDS-PAGE 凝胶转移至PVDF 膜上，5% 脱脂奶粉封闭，上一抗SYP 或者GAP-43，4℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，显影。1． 2． 5 ＲT-PCＲ 依据文献方法［9］进行试验。用试剂盒( Tiangen，China) 提取总ＲNA，用ＲevertAidFirst Strand cDNA Synthesis Kit ( Thermo Scientific，USA) 进行逆转录，最后对cDNA 样品进行扩增。采用Primer 5． 0 软件进行引物设计，设计得到引物如下: SYP upstream( 5'-CTT CGG CGA CTT CTA CTACTT T-3') ，downstream( 5'-GGA GCG GAT GGA TGTTTG-3') ; GAP-43 upstream( 5'-TGA GCC TGT CCTCTC CTA CCT A-3') ，downstream( 5'-GCC ATA ACAACA CCA AGA AAC A-3') ; GAPDH upstream( 5'-CAT CTA GGA GGG CTA TGC TC-3') ，downstream( 5'-ATG TCA CGC ACG ATT TCC-3') 。1． 2． 6 透射电镜按透射电镜常规制样方法处理组织块，EPON812 包埋，LKB 超薄切片机切片，柠檬酸铅和醋酸铀双染色，H7650 透射电镜下观察切片。在电镜下选择Gray-I 型兴奋突触拍片，每个样品随机选取4 ～ 6 张电镜照片。突触活性带长度的测定按罗兰等( 1990) 的方法进行。突触间隙采用多值平均法，突触数密度( PSD) 与穿孔突触比例统计: 突触计数依据JONES 等( 1991) 所确定的标准。1． 2． 7 统计学处理采用SPSS9． 0 统计软件包，结果用珋x ± s 表示。两组及多组样本均数比较进行单因素方差分析。方差齐时，两两比较采用T 检验法; 方差不齐时，两两比较采用卡方检验法。2 结果2． 1 CDPS 对小鼠行为学表现的影响在用Morris水迷宫测试小鼠空间学习记忆能力试验中，模型组小鼠的游泳时间和游泳距离比正常对照组明显延长( P ＜ 0. 05) ，说明模型小鼠已经出现学习记忆障碍。而与模型组相比，CDPS 能明显缩短模型小鼠的游泳时间( P ＜ 0. 05，Fig 1A) ，明显增长鼠在Q3象限的时间( P ＜ 0. 05，Fig 1B，1 C) ，特别是小剂量组和中剂量组能明显改善小鼠的学习记忆能力( P＜ 0. 01) 。为了保证行为学实验的参考性，我们又对实验动物进行了跳台实验。结果显示，模型组与正常对照组相比，错误次数和潜伏时间上差异具有显著性( P ＜ 0. 01) ，与模型组相比，CDPS 能够减少小鼠的错误次数，延长潜伏时间( P ＜ 0. 05) 。与Morris 水迷宫的结果相一致，仍然是小剂量和中剂量有更明显( P ＜ 0. 01) 的改善学习记忆的作用( Tab 1) 。2． 2 CDPS 对东莨菪碱所致的学习记忆障碍模型小鼠的GAP-43，SYP 和PSD-95 表达水平的影响为了进一步探讨行为学结果与相关蛋白表达的相关性，我们取小鼠脑海马组织进行匀浆，运用Westernblot 检测SYP、GAP-43 与PSD-95 表达水平的变化。结果显示: 与模型组相比，给药组的SYP 及GAP-43 的条带明显增粗，颜色加深( Fig 2) ，提示两种蛋白的表达水平明显提高，特别是小剂量和中剂量组。但是各用药组PSD-95 的蛋白表达水平与模型组相比差异无显著性。为了巩固蛋白表达水平的检测结果，保证GAP-43 和SYP 表达水平差异有显著性结果的确定性，我们进一步检验了mＲNA 水平上两个蛋白的表达。用小鼠海马组织匀浆，经ＲT-PCＲ 检测SYP 及GAP43 的mＲNA 表达水平。结果显示: 与模型组相比，给药组的SYP 的条带明显增粗，颜色明亮，特别是小剂量组与中剂量组，而GAP-43 的条带也明显增粗，特别是小剂量和中剂量组( Fig 3，Tab 2) 。提示，GAP-43 与SYP 在mＲNA 水平上，用药组与模型组比较差异有显著性。2． 3 CDPS 对小鼠CA3 区的突触数量及相关形态的影响为了在超微水平探讨CDPS 对于突触可塑性的影响，我们运用透射电镜技术观察突触数量和突触厚致密部( PSD) 的变化。如Fig 4 ～ 5 所示，在相同视野下，CDPS 组小鼠海马CA3 区突触数密度增大。用药组与正常对照组和模型组比较，突触数量明显增多( P ＜ 0. 05) ，而突触间隙、PSD 厚度没有差异，提示CDPS 能够影响海马CA3 区突触数目，但不影响PSD 的相关形态特征。3 讨论Purro 等［10］研究发现，认知功能障碍的早期表现主要包括突触的丢失和突触功能的异常。若能提高突触的可塑性，修复这种丢失及功能异常，则可以有效地改善认知功能障碍。但是，目前仍然缺少有效的治疗药物，能够促进可塑性事件的发生。SYP位于神经末梢突触囊泡内的钙结合蛋白，与突触结构和功能关系密切，其表达水平可有效地反映突触的状态，是神经损伤后突触发生的重要标志之一［11 － 12］。突触发生丢失、数量减少时或者功能异常时，SYP 的含量降低导致突触传递障碍，从而引起记忆和认知功能下降。GAP-43 是位于轴突生长锥质膜上的磷酸蛋白，在正常成熟的神经元上低表达，在神经发育和再生过程中呈高表达，被作为突触生长的标志物，国际上将其列为神经可塑性的首选分子探针［13 － 14］。PSD-95 是膜结合鸟氨酸蛋白激酶超家族中的一员，是突触后致密区( PSD) 的一种主要蛋白。PSD-95 参与调节离子通道的功能、突触活性和细胞内信号转导，是一种重要的神经细胞骨架蛋白。它能够使谷氨酸NMDA 受体簇集在突触活性区，从而保证突触信号传递的有效进行［15 － 17］。我们通过Morris 水迷宫及跳台试验发现，CDPS组小鼠空间任务的成绩明显优于模型组的小鼠，说明CDPS 可以明显改善东莨菪碱诱导模型小鼠的空间学习能力及记忆水平。我们随之进行Westernblot 对各实验组小鼠海马中SYP、GAP-43 及PSD-95表达水平进行考察。结果发现，与模型组相比，CDPS 对PSD-95 的表达没有明显改变，但是CDPS给药组的SYP 与GAP-43 蛋白的表达水平明显增高，尤其是小剂量和中剂量组。而这两组的行为学表现也明显优于模型组。针对这种积极的相关性，我们进一步在mＲNA 水平检测SYP、GAP-43 的表达，ＲT-PCＲ 实验结果与此基本一致，证实了CDPS增高SYP 及GAP-43 表达水平这一事实。最后我们考察了CDPS在超微水平对突触的影响。我们采用透射电镜技术观察突触数量及突触相关结构的变化。实验结果显示，用药组突触的数量明显增多，但是突触PSD 部分的形态没有改变，这提示我们，CDPS 的作用机制主要是影响突触的数量。综上所述，CDPS 能够改善东莨菪碱所致的学习记忆障碍，提高小鼠的学习记忆能力。其作用机制是通过提高突触可塑性相关蛋白的表达水平，促进突触的形成，增加突触的数量，增强了突触的可塑性，从而改善东莨菪碱造成的损伤。参考文献:［1］ Wu X M，Tu P F． Studies on the chemical structure of polysaccharideCDP-4 isolated from Cistanche deserticola［J］． J Peking Univ( Health Sclences) ，2004，36( 1) : 24 － 6．［2］ 何梦瑶，吴国昌． 医编［M］． 北京: 中国中医药出版社，2009:12．［2］ He M Y，Wu G C． Yi Bian［M］． Beijing: China Press of TraditionalChinese Medicine，2009: 12．［3］ Deiana S，Platt B，Ｒiedel G，The cholinergic system and spatiallearning［J］． Behav Brain Ｒes，2011，221( 2) : 389 － 411．［4］ Kaplan M P，Abel T． Genetic approaches to the study of synapticplasticity and memory storage［J］． CNS Spectr，2003，8 ( 8) : 597－ 610．［5］ Fadda F，Cocco S，Stancampiano Ｒ． Hippocampal acetylcholinerelease correlates with spatial learning performance in freely movingrats［J］． Neuroreport，2000，7( 10) : 2265 － 9．［6］ 吴波，黄敏，马迎军． 肉苁蓉水溶性多糖的分离纯化及分析［J］． 广州医学院报，2006， 34( 1) : 58 － 60．［6］ Wu B，Huang M，Ma Y J． Isolation，purification and analysis ofpolysaccharide of Cistanche 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提要　肉苁蓉多糖（150mg、300mg／100g）连续灌胃1周对大黄脾虚模型大鼠的饲料消耗量减少和体重增长率减慢有显著改善作用。另对脾虚模型所致的胃蛋白酶及唾液淀粉酶活性降低有明显升高作用。关键词　肉苁蓉多糖；大黄脾虚模型；胃蛋白酶；唾液淀粉酶肉苁蓉（Cistanche deserticola Y．C．Ma）为列当科植物肉苁蓉的干燥带鳞叶的肉质茎‚具有补肝肾、益精气的功用。肉苁蓉多糖是从肉苁蓉中分离的粗多糖‚除去水溶性小分子杂质‚经Sevag 法脱蛋白质‚用水、醇反复处理得肉苁蓉多糖‚本实验用大黄水煎剂喂饲大鼠‚制作脾虚证动物模型‚观察肉苁蓉多糖对上述模型全身状态和消化道功能的影响。1　材料1．1　动物　Sparague－Dawley 大鼠‚体重155±20g 雄性‚购于浙江省实验动物中心。1．2　饲料　标准合成大鼠颗粒饲料‚由扬州大学实验动物中心提供。1．3　药品　大黄水煎剂‚西宁大黄切片用水浸泡‚水煎（80℃）浓缩成1g 生药／ml。肉苁蓉多糖：150mg／kg、300mg／kg。3％水溶液0．5、1ml／100g。2　方法　　取SD 大鼠50只‚分成5组‚每组10只‚标准饲养1周‚记录正常饲料消耗量（g／100g 体重／24h）和周体重增长率。造模周除对照组灌服生理盐水（20ml／kg）外‚其余各组均用大黄煎剂（100％‚20ml／kg‚每日1次）连续灌服‚8天后各组动物均出现便溏、纳呆、少动、毛发枯涩、消瘦为主的“脾虚”症状。“脾虚”模型复制成功后‚各组处理如下：对照组继续灌服生理盐水‚“脾虚”长期模型组继续灌服大黄煎剂；“脾虚”自然恢复组停止灌服大黄不给任何治疗‚任其自然恢复；治疗组用肉苁蓉多糖‚按150‚300mg／100g（容量为准1ml／100g）‚治疗时间为1周。测量并计算治疗前后大鼠饲料消耗量和周体重增长率‚每组取8只大鼠收集胃液和唾液‚按下述方法测定胃蛋白酶活性和唾液淀粉酶活性。胃蛋白酶活性测定：按改良安宋（Anson）氏法‚将待测胃液用0．04ml／L 盐酸稀释50倍‚取稀释胃液0．5ml‚在37℃±0．5℃环境中加入血红蛋白基质液2ml‚反应10分钟‚立即加入5％三氯醋酸5ml 终止反应‚过滤‚取滤液在275nm 波长处比色；对照管为稀释胃液0．5ml‚37℃±0．5℃‚10分钟孵育后加入5％三氯醋酸‚室温放置30分钟后加入血红蛋白基质‚比色方法同前‚按下列公式计算胃蛋白酶活性：胃蛋白酶活性（μg／ml 酪氨酸／ml 胃液／分钟）＝（测定管酪氨酸浓度－对照管酪氨酸浓度）×75唾液淀粉酶测定：将0．04％可溶性淀粉溶液5ml‚在37℃水箱中预热5分钟‚加入唾液（蒸馏水稀释100倍）0．01ml‚37℃中反应30分钟‚取出后加入0．01mol／L 碘溶液5ul‚蒸馏水稀释至50ml‚立即在660nm 波长处比色。按公式计算淀粉酶单位：淀粉酶单位U／ml＝（对照管光密度－测定管光密度）÷对照管光密度×800定义：37℃‚30分钟内‚1ml 唾液中淀粉酶能完成水解淀粉2mg‚称为1个淀粉酶单位。3　结果3．1　对大黄脾虚大鼠饲料消耗量和周体重增长率的影响。经肉苁蓉多糖治疗后的大鼠全身状态明显改善‚饲料消耗量和周体重增长率均有不同程度的恢复和增加（见表1）。3．2　对大黄脾虚大鼠胃蛋白酶和唾液淀粉酶活性的影响结果显示经肉苁蓉多糖治疗1周后的脾虚大鼠胃蛋白酶和唾液淀粉酶活性明显升高（见表2）4　讨论　　现代医学研究认为中医理论中的脾虚可以被看作为是一种以消化系统功能低下为主要表现并涉及其它系统功能低下的综合症侯群；过量和长期服用苦寒药大黄会伤元气‚耗阴血‚伐脾胃‚脾失健运‚水谷不能运化。则气血生化无源‚肌肉瘦削‚神疲乏力。本实验用大黄灌服大鼠造成“脾虚”动物模型接近于临床的脾虚症。经大黄灌服后的大鼠出现便溏、消瘦、拱背、纳呆、少动‚四肢无力‚毛发枯燥、畏寒、体重减轻等表现经肉苁蓉多糖治疗后明显改善‚食欲和体重增长率基本恢复到正常水平。由于大黄引起的长期腹泻‚严重影响了消化腺的储备力和反应性‚导致唾液淀粉酶和胃蛋白酶活力明显低于对照组‚而经肉苁蓉多糖治疗后上述两种消化酶活力基本恢复正常。肉苁蓉多糖不仅能恢复消化酶的活性以达助消化之功效外尚能增强免疫‚增强体质‚无疑在治疗严重消化功能紊乱的疾病中‚具有良好的作用。参　考　文　献1　李仪奎．中药药理研究方法学．北京：人民卫生出版社．1993：10212　陈　奇．中药药理实验方法学．上海：上海科技出版社．1991：3203　吴咸中‚高金亮．脾虚证的现代研究．天津：天津科技翻译出版公司．1992：183

摘要目的：探讨肉苁蓉多糖（CDPS）对阿尔茨海默病（AD）大鼠学习记忆能力及脑组织胆碱能系统的影响。方法：60 只大鼠随机分为正常对照组、假手术组、模型组、CDPS低剂量组、CDPS中剂量组和CDPS高剂量组，每组10只，后4 组采用Aβ1-40侧脑室注射制备AD大鼠模型，CDPS低剂量组、CDPS中剂量组和CDPS高剂量组在制模后分别每天以50、100、200 mg/kg CDPS 灌胃，正常对照组及模型组以等量玉米油灌胃，假手术组以等量生理盐水灌胃，均灌胃28 d，进行Morris 水迷宫检测，比色法测定皮质及海马乙酰胆碱酯酶（AChE）和乙酰胆碱转移酶（ChAT）。结果：CDPS可缩短AD大鼠在Morris水迷宫的潜伏期，增加大脑皮质及海马AChE 的含量，提高皮质中ChAT 的活性。结论：CDPS可改善AD 大鼠的学习记忆能力，其机制可能与对胆碱能系统的影响有关。关键词肉苁蓉多糖；阿尔茨海默病；学习记忆；胆碱能系统阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是与年龄相关的进行性记忆丧失和高级认知功能减退的神经系统退行性疾病，其病理变化主要表现为细胞外聚集的β 淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）沉积形成的老年斑、细胞内高度磷酸化Tau 蛋白所致的神经元纤维缠结（neurofibrillary tangle，NFT）,以及前脑基底胆碱能神经元的显著丢失。AD 发病率占65 岁以上人群的8%~10%，且正以每5 年1 倍的速度递增[1]。AD发生的确切机制目前仍未清楚，多数学者认为主要是脑内胆碱能系统受到损害，并提出了“胆碱能假说”：前脑基底胆碱能神经元的退变及大脑皮质和其他区域胆碱能递质的缺失是AD患者认知失常的主要原因[2]。研究表明，肉苁蓉的化学成分包括苯乙醇苷类、环烯醚萜类、木脂素类、多糖和生物碱等，其中多糖是肉苁蓉的主要活性成分[3]。现代药理学研究表明，肉苁蓉具有调节免疫、保肝、抗辐射及神经保护等作用[4]。本实验以Aβ1-40 诱导制备AD 大鼠模型，给予AD 大鼠不同剂量肉苁蓉多糖（polysacchrides of cistanche deserticola，CDPS）后，观察大鼠脑组织乙酰胆碱酯酶（acetylcholineesterase，AChE）、乙酰胆碱转移酶（cholineacetyltransferase，ChAT） 的变化，探讨CDPS 改善AD 大鼠学习记忆能力及其对AD 病因干预的可能机制。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物Wistar 大鼠60 只，体质量180~220 g，由华中科技大学实验动物中心提供。1.1.2 主要试剂Aβ1-40（购于美国Sigma 公司），将1 mg Aβ1-40溶于100 μL无菌0.9％氯化钠溶液中，制成5 μg/μL悬浮液，置于37 ℃恒温箱中孵育7 d，使其变为聚集状态的Aβ1-40，置于4 ℃冰箱备用。ChAT、AchE 检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。1.2 方法1.2.1 CDPS 的提取[5] 肉苁蓉生药片1 kg，经热乙醇浸泡3 h 后，用纱布过滤，弃滤液。药渣加水煎煮3 次，每次1～2 h，过滤，合并滤液（呈棕红色）。蒸发浓缩后，离心去沉淀，上清液加2~3 倍体积的95%乙醇沉淀，4 ℃静置24 h，次日于4 ℃离心20 min（6 000 r/min）收集沉淀。沉淀经水复溶、脱蛋白透析、冷冻干燥后获粗多糖（灰棕红色）。1.2.2 动物分组及模型制备大鼠随机分为正常对照组、假手术组、模型组、CDPS 低剂量组、CDPS 中剂量组和CDPS高剂量组，每组10只。参照文献制备记忆功能障碍动物模型：大鼠腹腔注射水合氯醛（0.35 g/kg）麻醉，固定于脑立体定位仪，头顶部去毛，消毒皮肤，头顶部正中切口，暴露前囟，按大鼠脑立位图谱，于前囟后、中线右侧处，微量注射器自脑表面垂直进针，向侧脑室内缓慢注入2 μLAβ1-40留针（假手术组注射等量生理盐水），以确保注射溶液充分扩散，后缓慢撤针，所有步骤均为无菌操作，皮肤切开处用青霉素抗菌，缝合伤口。CDPS低剂量组、CDPS中剂量组和CDPS高剂量组在模型制备后分别每天以低剂量（50 mg/kg）、中剂量（100 mg/kg）、高剂量（200 mg/kg）CDPS 灌胃，正常对照组及模型组以等量玉米油灌胃，假手术组以等量生理盐水灌胃，连续28 d。1.2.3 Morris 水迷宫实验Morris 水迷宫实验分别于术前7 d、术后7 d 和术后28 d 进行。测试主要完成定位航行试验，前2 d 为适应期，每天上、下午分别进行2次，训练时依次将大鼠按顺时针方向由4 个入水点放入水中，记录大鼠找到并爬上平台所需的时间，即逃避潜伏期（escape latensy，EL）。如果大鼠找到平台时间≤1 min，记录其实际EL；如果找到平台时间＞1 min，则由操作者将其引上平台并停留15 s，EL记录为1 min。1.2.4 大鼠皮质海马组织ChAT 及AchE活性测定水迷宫实验完毕后，将大鼠颈椎脱臼法处死后取脑，分离出皮质和海马，称重后迅速置于－20 ℃冰箱中冷冻，加入预冷的生理盐水，冰浴制成10%匀浆。ChAT测定是以乙酰辅酶和胆碱为底物，在ChAT 的作用下，反应的生成物和显色剂结合，在324 nm 处测定吸光度，以此计算ChAT 的活力，具体操作按照测定试剂盒进行。AchE 水解乙酰胆碱生成胆碱及乙酸，胆碱可与巯基显色剂反应生成对称三硝基苯黄色化合物，根据颜色深浅进行比色定量，水解产物胆碱的数量可反应胆碱酯酶的活力，具体操作按照测定试剂盒进行。1.3 统计学处理采用SPSS 13.0 软件分析数据，计量结果以（x±s） 表示，ANOVA 和t 检验，P<0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 CDPS对AD大鼠学习记忆的影响模型组大鼠的EL 较术前明显增加（P<0.01），CDPS 低剂量组、CDPS 中剂量组和CDPS 高剂量组的EL 与正常对照和假手术组比较，有显著性差异（P<0.01）。术后28 d，CDPS 低剂量组、CDPS中剂量组和CDPS 高剂量组的EL 较术后7 d 明显下降，有显著性差异（P<0.01），见表1。2.2 CDPS 对大鼠海马和皮质组织AchE和ChAT活性的影响在皮质和海马组织，与假手术组相比，模型组AchE 活力升高，ChAT 活力降低（P<0.05），说明Aβ1-40 对大鼠皮质和海马组织的AchE 和ChAT 有损害作用。CDPS 能显著提高海马组织ChAT 活性（P<0.01）。CDPS可显著抑制海马组织的AchE 活力（P< 0.01），见表1。3 讨论AD 发病的胆碱能假说认为，出现AD 的病理过程时大脑基底前脑胆碱能神经元发生退行性病变，ChAT 和AchE的活性改变，引起ACh 的运输合成翻译摄取减少，导致学习与记忆力衰退[6]。研究表明AD 患者脑内ACh 合成分泌减少，其合成酶ChAT 活性下降，且与痴呆严重程度密切相关，海马和皮质锥体细胞的突触、突触烟碱受体及突触前M 受体均减少[7]，故学习记忆力降低与胆碱能功能紊乱关系最为密切。本实验选用侧脑室立体定位仪注射Aβ1-40 制作AD 动物模型，结果提示侧脑室注射凝聚态Aβ1-40 7 d 后大鼠出现学习记忆功能下降。崔丽霞等[8]报道侧脑室立体定位仪注射Aβ1-40大鼠第5 天的EL明显延长、跨台次数明显减少，可见双侧侧脑室注射Aβ1-40均可使大鼠学习记忆能力下降，与本实验结果一致。在水迷宫实验中CDPS 可明显降低大鼠EL，缩短到达平台时间，结果提示CDPS可改善大鼠认知功能。研究中发现大鼠侧脑室注射Aβ1-40后，皮质和海马组织ChAT降低，符合AD 病理特征。CDPS 能明显改善大鼠海马组织的ChAT 活力，能抑制皮质和海马组织的AchE。Ach 是脑内重要的神经递质，胆碱能系统对于机体正常的认知功能发挥着重要功能。Ach 在皮质和海马的缺失将导致学习记忆认知功能显著降低[9]。海马是大脑完成学习记忆最重要的部位，在空间记忆的获得储存提取中发挥重要作用[10]。研究发现增加认知障碍患者海马Ach 浓度后，认知和空间记忆功能均得到改善[11]。Ach 合成的关键酶是ChAT，主要合成场所在胆碱能神经元细胞体，ChAT 活性直接体现大脑胆碱能系统功能，ChAT 活性提高可提高神经元面积和认知功能[12]。AchE 可加快轴突生长，促进神经元细胞相互作用，促进轴突生长，改善多巴胺能神经元功能，促进β 淀粉样肽沉淀形成[13]。CDPS不仅提高ChAT活性，还可减低AchE 活性，显示其可能通过增加脑内Ach 活性抑制Aβ1-40 导致大鼠学习记忆功能障碍。参考文献[1] 耿劲松. 胆碱能神经元及其受体与阿尔茨海默病的关系[J]. 医学研究杂志, 2006，35:70-73.[2] Blusztajn JK, Berse B. 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（1．新疆医科大学公共卫生学院毒理学教研室，新疆乌鲁木齐 830011；2．新疆维吾尔自治区药物研究所，新疆乌鲁木齐830004）摘要：目的 探讨肉苁蓉乙醇提取物肉苁蓉苯乙醇样糖苷（CPhG）对大鼠免疫性肝纤维化的作用及其作用机制。方法SD大鼠75只，随机分为正常对照组、模型组、复方鳖甲软肝片（0.6g·kg＇）阳性药对照组、CPhG 0.125,0.25和0.5g·kg＇组，CPhG组每组13只，其他每组12只，皮下和尾静脉注射牛血清白蛋白诱导大鼠肝纤维化模型，造模同时ig给予相应药物，每日1次，共15周。测定大鼠肝指数，Masson染色法观察肝组织纤维化，全自动化分析仪测定血清谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）、碱性磷酸酶（ALP）、总蛋白（TP）和白蛋白（ALB）含量变化，羟脯氨酸（HyP）测定试剂盒测定肝匀浆中HyP含量的变化；免疫组化法观察肝组织中｜型和川型胶原蛋白表达的变化。结果 与正常对照组比较，模型组大鼠肝指数显著升高（P＜0.05）。模型组大鼠肝组织胶原纤维延伸连接，包绕整个肝小叶使正常肝小叶结构破坏，大方型假小叶形成；模型组大鼠血清中GPT，GOT，ALP．TP和ALB含量及肝匀浆中HyP含量显著升高（P＜0.05，P＜0.01），1型和川型胶原蛋白的表达均显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，CPhG 0.125,0.25和0.5g·kg＇能降低肝纤维化大鼠肝指数（P＜0.05），肝组织形态与正常对照组接近，血清中GPT，GOT，ALP，TP和ALB含量及肝匀浆中HyP含量降低（P＜0.05，P＜0.01），且能抑制肝组织中I型和目型胶原蛋白的表达（P＜0.05，P＜0.01）。结论 CPhG能降低免疫性大鼠肝纤维化程度，其机制可能与降低I型和川型胶原蛋白表达进而抑制肝星状细胞活化、减少胶原生成有关。关键词：肉苁蓉；苯乙醇样糖苷；肝纤维化；胶原蛋白中图分类号：R285.5    文献标志码：A    文章编号：1000-3002-（2016）05-0504-07DOI:10.3867/j.issn.1000-3002.2016.05.004肉苁蓉属（Cistanche）植物是著名的名贵补益类中药。因其疗效确切，药性温和，所以自古就被视为强壮、滋补的中药，有“沙漠人参”之美誉。近年来，肉苁蓉以其显著的生物活性备受人们的关注。化学及药理学研究显示，肉苁蓉肉苁蓉苯乙醇样糖苷（Cistanche phenylethanoid glycosides，CPhG） 是肉苁蓉发挥药效的主要物质基础之一。CPhG具有抗氧化、抗抑郁、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗菌和免疫调节等多种生物活性。Peter于1989年首次发现CPhG类化合物松果菊苷具有显著的保肝护肝作用，随后引起人们对CPhG进行抗肝纤维化研究的兴趣。本课题组的前期研究已经发现，肉苁蓉的肉质茎部提取物类叶升麻苷和异类叶升麻苷，对于体外免疫性肝损伤均有较好的肝保护作用和抗乙肝病毒作用，但对于CPhG抑制肝纤维化的进程及抗肝纤维化的具体机制还未明确。本研究对大鼠皮下和尾静脉注射牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）制备免疫性肝纤维化模型，评价肝损伤及纤维化的程度，以探讨CPhG保肝、抗肝纤维化的作用及其可能的作用机制。1 材料与方法1.1 试剂和仪器德赢vwin登录 （C．tabulosa）新鲜肉质茎6.0kg，70％乙醇热回流提取3次，每次3h，合并提取液。AB-8树脂纯化得到苯乙醇样糖苷提取物即CPhG类化合物，经新疆维吾尔自治区药物研究所赵军研究员用高效液相色谱法鉴定为CPhG，纯度为70％。用0.5％羧甲纤维素钠（CMC-Na）将药物配制成不同浓度，置4℃冰箱保存待用。复方鳖甲软肝片（compound Biejia-rangan tablets，BJRG）（内蒙古福瑞科技股份有限公司，批号：20131006），BSA（美国Sigma公司产品，CAS：9048-46-8，原装进口），羊毛脂（上海源叶生物科技公司），液体石蜡（天津市富宇精细化工有限公司），磷酸盐缓冲液［飞世尔生物化学制品（北京）有限公司，批号：NZD1132］。肝组织羟铺氨酸（hydroxyproline，HyP）检测试剂（南京建成生物工程研究所，批号：20140526），兔抗｜型胶原抗体0.2mL（美国Abcain公司，批号：140619），免抗型胶原抗体0.2mL（中国Bioss公司，批号：980788W）。电热恒温培养箱（上海一恒科技有限公司），立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂），L-530多管架自动平衡离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司），全自动生化分析仪（迈瑞公司，系列号：A086A0182），化学发光分析仪（泰格科信，系列号：mp2808）。1.2 动物、模型制备和给药雄性健康SD大鼠，SPF级，体质量180-220g．由新疆医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号SCXK（新）2011-0004。SPF环境实验动物使用许可证号：SYXK（新）2011-0004，饲养受控环境条件（25℃和12h光／暗周期），大鼠自由进食与饮水，喂标准颗粒饲料，常规饲养3d后使用。动物实验的所有相关程序由新疆医科大学第一临床附属医院动物伦理委员会批准。75只SD大鼠随机分为6组，即正常对照组、模型组、BJRG阳性药对照组（0.6g·kg＇）、CPhG0.125.0.25和0.5g·kg＇组，CPhG组每组13只，其 他每组12只。参照药品说明书，进行人和大鼠间体表面积折算的等效剂量比值设定BJRG阳性药对照组剂量，CPhG剂量参照文献［8］及预实验结果设置。除正常对照组外，大鼠采用朱启贵等方法制备免疫性肝纤维化模型，造模分为致敏阶段和尾静脉攻击阶段。致敏阶段：除正常对照组每只注射0.5mL生理盐水以外，其余各组大鼠均多点sc给予含BSA9g·L-＇弗氏不完全佐剂，每次0.5mL，共5次。前2次注射间隔为14d，后3次注射间隔为7d。末次致敏注射后1周，每只大鼠于眼内呲静脉丛采血，采用双向扩散法检测大鼠血清抗BSA抗体。攻击阶段：抗体阳性大鼠作为模型组及给药组，继续尾静脉注射BSA，每周2次，连续5周，注射剂量由每只2mL逐渐递增至每只4mL；正常对照组尾静脉注射生理盐水。给药：造模同时按设定剂量ig给药（空白对照组和模型组ig给予蒸馏水）每日1次；造模结束后继续治疗4周，每日1次，实验周期共计15周。1.3 肝指数测定各组于末次ig后禁食（不禁水）24h，称重，颈椎脱白处死，取肝，用滤纸吸干脏器表面血液，剪去脂肪和系膜后称重，计算肝指数。肝指数＝器官质量（g）／体质量（g）x100。1.4 Masson染色观察肝组织纤维化所有大鼠取同一部位肝组织，用10％多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片并Masson染色，显微镜下观察组织学变化。肝纤维化分级参照文献［10］分为5级。0级：无纤维化；1级：纤维结缔组织仅限于汇管区或汇管区有扩大，有向小叶发展的倾向；l级：纤维结缔组织增生，超过小叶的2／3并伴有1级改变：级：纤维结缔组织进入肝小叶中央静脉周围；V级：纤维结缔组织在全小叶呈多处弥漫性增生，有假小叶形成，并有级改变。1.5 血清生化指标的检测各组大鼠于末次给药后禁食（不禁水）24h，称重，经戊巴比妥钠（30mg·kg＇，ip）麻醉后取血，12000xg离心10min分离血清，采用全自动生化仪检测血清谷丙转氨酶（glutamic-pyruvic transterase， GPT）、谷草转氨酶（glutamic-oxalacetic transterase， GOT）、碱性磷酸酶（akaline phosphatase，ALP）、总蛋白（total protein，TP）和白蛋白（albumin，ALB）含量。1.6 肝组织匀浆中羟脯氨酸含量的测定精确称取肝组织0.1g（湿重）放入试管中，准确加水解液1mL，混匀。严格按照肝组织HyP检测试剂盒说明书操作测定肝组织HyP的含量。1.7 免疫组化法测定肝组织纤维化｜型和型胶原蛋白表达组织切片用Nkon DIGITAL SIGHTDS-F2型生 物显微镜进行观察，并用K12320型显微摄像系统在低倍镜、高倍镜下选取清晰视野拍照。采用MoticMed 6.0 CMIAS彩色图像分析软件，通过显微摄像系统放大200倍，每片随机选取3个视野，每个视野随机选取5个2cmx3cm大小的区域，1型和目型胶原蛋白免疫组化阳性反应产物为出现位于细胞浆的棕黄色细颗粒状染色，测定其平均吸光度值，值越大表明组织中｜型和型胶原蛋白含量越高。计算公式：吸光度值＝胶原面积（c㎡）／肝组织面积（c㎡）。1.8 统计学分析用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析，实验结果数据采用xts表示；多组间均数比较采用方差分析one-way ANOVA，多组样本均数两两比较采

筋脉点 特指中药材或中药饮片横断面的纤维或维管束。药材折断或切片后，其纤维或维管来呈参差不齐的丝状，犹如人体的筋脉，又称“筋”。在整齐的饮片切面上所表现出的点状痕迹，称之为“筋脉点”。较大的维管束痕迹又称“筋脉纹”。如大黄、何首乌等。-摘自祝之友教授《神农本草经药物解读-从形味性效到临床（5）》，人民卫生出版社，2019．

2.2 生殖期不同阶段营养元素的积累与分配出土期和初花期 肉苁蓉不同部位NKPM元素含量变化规律相同，均为花序＞肉质茎上部＞肉质茎下部；C元素含量变化规律相同，均为花序＞肉质茎下部＞肉质茎上部，见图4.5盛花期：肉苁蓉不同部位 NP.MB元素含量由高到低的顺序相同，均为花序＞肉质茎上部＞肉质茎下部；K元素含量为花序＞肉质茎下部＞肉质茎上部；Ca元素含量为肉质茎下部＞花序＞肉质茎上部，见图6果期：肉苁蓉不同部位 N P元素含量为花序＞肉质茎上部＞肉质茎下部；K元素含量为花序＞肉质茎下部＞肉质茎上部；M元素含量为肉质茎下部＞花序＞肉质茎上部；Ca元素含量为肉质茎下部＞肉质茎上部＞花序，见图7生殖期各个阶段，肉苁蓉各部位 NP元素含量变化规律相同，都呈现出由下到上递增的趋势。随着生殖器官的生长发育，NKP元素始终在积累，各个2.2 生殖期不同阶段营养元素的积累与分配出土期和初花期 肉苁蓉不同部位NKPM元素含量变化规律相同，均为花序＞肉质茎上部＞肉质茎下部；C元素含量变化规律相同，均为花序＞肉质茎下部＞肉质茎上部，见图4.5盛花期：肉苁蓉不同部位 NP.MB元素含量由高到低的顺序相同，均为花序＞肉质茎上部＞肉质茎下部；K元素含量为花序＞肉质茎下部＞肉质茎上部；Ca元素含量为肉质茎下部＞花序＞肉质茎上部，见图6果期：肉苁蓉不同部位 N P元素含量为花序＞肉质茎上部＞肉质茎下部；K元素含量为花序＞肉质茎下部＞肉质茎上部；M元素含量为肉质茎下部＞花序＞肉质茎上部；Ca元素含量为肉质茎下部＞肉质茎上部＞花序，见图7生殖期各个阶段，肉苁蓉各部位 NP元素含量变化规律相同，都呈现出由下到上递增的趋势。随着生殖器官的生长发育，NKP元素始终在积累，各个3 结论与讨论营养元素的生殖分配指用植物体内重要的元素贮量指标反映植物个体或种群水平对生殖的分配。NPK元素作为植物营养 3要素，对植物新陈代谢活动有着重要的作用，N元素作为生命元素，在植物生命活动中占有首要作用，是植物需要量最多，质量分数最高的营养元素之一，也是植物体内蛋白质、核酸、多种酶的组成成分，P元素促进碳水化合物的合成、分解和运输，对细胞分裂和植物各器官组织的分化发育，特别是开花结实具有重要作用.的合成和细胞分裂，增强植物的抗病力，提高植物的抗旱性和抗寒性，C元素能稳定生物膜结构，调钙蛋白能活化多种酶。M8元素是多种酶的活化剂，参与糖类、脂肪和类脂的合成及蛋白质和核酸的合成。肉质茎下部 N元素的积累主要在营养生长旺盛期和开花期，之后有所下降，表明 N元素从营养部位更多的转向生殖部位，以供应生殖需求，整个生殖期肉质茎下部和花序 N元素含量波动较大，肉质茎上部变化趋势平缓，盛花期前肉质茎 N元素含量都高于K元素；K元素含量在整个生殖期基本处于积累状态，且每个部位都在果期达到最高值，同时其含量位于果期5种营养元素首位。除盛花期肉质茎下部 Ca元素含量显著增加外，其余时期肉苁蓉中 PM Ca元素含量大致相同，其中 P元素不断向生殖器官富集，P元素能促进肉苁蓉在不同时期不同部位营养元素含量有相应变化。田间收获种子时观察到一些肉苁蓉植株肉质茎弱小、干枯，营养匮乏，使该株生殖部位的营养物质传递供应不足，导致结果率低，果实干瘪；而肉质茎相对粗壮的植株结果率高，果实饱满，因此在营养生长期可适当增加寄主梭梭的施肥量，并科学合理调整营养元素间比例，为肉质茎提供足够的营养积累，以满足肉苁蓉生殖后期对营养物质的需求，保证开花结果的正常进行，解决肉苁蓉种子产量低的问题。生殖器官的发育和开花结实，对肉苁蓉生殖生长有重要作用，同一时期不同部位Ca元素含量以肉质茎下部中最高，果期肉质茎大部分营养已用于生殖生长，肉质茎纤维化程度加深，细胞壁加厚，主要起机械支持作用，而Ca元素参与细胞壁构成，所以果期C元素含量有所增加。

王霞，徐荣，陈君”，刘友刚，刘同宁（1中国医学科学院 药用植物研究所源危药材繁育国家重点实验室，北京 100193 2天津中医药大学基础医学院，天津300933宁夏永宁县本草苁蓉种植基地，银川 750100）摘要：目的 研究内苁蓉生殖生长期营养元素的分配规律，方法 采放生殖生长期内苁蓉样品，分别对生殖器官和营养器官的营养元素含量进行分析，其中KMBPC元素采用 EPAES法测定，N元素采用凯氏定氟法测定，结果 随着生殖生长期的延长，内苁蓉不同部位营养元素积累高峰期有差异，N元素含量在出土期的花序中最高，K元素含量在果期的花序中最高，M8C元素含量在采期的肉质茎下部中最高，P元素含量在初花期的花序中最高，结论 内苁蓉进入生殖期后，营养元素遥渐由营养器官向生殖器官转移，各部位营养元素含量差异程度不同。关键词：内苁蓉；营养元素；积累量：分配中图分类号：R282   文献标志码：A    文章编号：1001-2494（2011）12-0906-04生殖分配规律的研究是植物种群生态适应机制中十分重要的一个方面。生殖分配指植物一年所同化的资源中用于生殖的比例。生殖分配既可以生殖期生殖部分生物量占植株总生物量的比例进行估算，也可以营养物质含量在植物总营养物质含量的比重进行统计1”。肉苁蓉（Cisanche deenicop Y C Ma是列当科肉苁蓉属多年生寄生性草本植物，适宜在我国的沙漠、荒漠地带种植，以干燥带鳞叶的肉质茎入药。生殖生态学领域中有关肉苁蓉繁育系统的研究较多，而对其生殖分配的研究报道尚少，本实验从肉苁蓉生殖株不同生育时期不同部位的营养元素含量变化入手，初步分析了肉苁蓉营养生长与生殖生长的营养元素分配动态，旨在揭示人工栽培条件下肉苁蓉营养生长及生殖生长的营养元素配置规律，为肉苁蓉种群生态适应机制的进一步研究提供依据。1 材料与方法1.1 田间取样供试材料为宁夏肉苁蓉基地种植的二年或三年生肉苁蓉，取生殖生长不同阶段的肉苁蓉样品各 5株，带回室内分成肉质茎下部（凸起点下部白色肉质部分）、茎上部（凸起点上部变色、纤维化部分）、花序，用自来水清洗去除杂物，再用去离子水冲洗 3次，晾干，分别用纸袋装好，置于60℃烘箱中，24h后取出称量干重，粉碎装袋。1.2 室内测定1.21 仪器与试剂 CP-AES光谱仪（美国 VA-RN公司），KDY凯氏定氮仪，KX1-1010型控温消煮仪 35％氢氧化钠溶液，甲基红 溴甲酚绿混合指示剂，2％硼酸溶液0.1mo ＇盐酸滴定液。1.2 2 测定方法 K ME RCa元素用 CPAES测定，CP-AES分析条件：RF功率1.15 IW，冷却气流量15Lmjr＇，雾化器气体流量0.75LmjT，观测高度12m辅助气气体流量1.5Lmir，样品前处理参照文献方法，仪器及主要工作参数参照文献方法.2 结果与分析21 不同部位营养元素的积累与分配21.1 肉质茎下部 从出土期到盛花期 N K元素含量变化规律基本相同，增长速度相似，且N元素含量积累高峰为盛花期，之后N元素含量呈下降趋势；初花期后 K元素含量呈直线上升，积累高峰期在果期且果期 K元素含量（2.68％）超过 N元素（209％）．P．ME Ca元素积累高峰期都为果期，盛花期前 Mg Ca元素随生殖期延长含量变化趋势基本相同，都呈缓慢上升，果期MgCa元素持续增加，而Ca元素增加速度明显大于 M元素，P元素含量变化趋势呈“N”型，变化幅度较小，见图1．21.2 肉质茎上部 随生殖生长进程5种营养元素基本都呈上升趋势，且都在果期达到积累高峰。其中果期 K（24528％）元素含量略高于 N元素（24375％），明显高于 P．M8C元素。PC元素在整个生殖期呈“N型变化，M8元素含量在整个生殖期呈上升趋势，盛花期后增长速度加快，见图221.3 花序 N元素含量在出土期最高，到初花期含量有所下降，之后又缓慢上升；整个生殖期 K元素含量不断增加积累高峰期为果期，盛花期后 K元素含量增长速度加快 含量超过 N元素；生殖期不同阶段 PM8 C元素变化规律基本相同，C1P元素积累高峰期为初花期，M元素积累高峰期为果期，3种元素含量变化都呈“N”型趋势，波动不明显，见图3肉苁蓉进入生殖生育期后，不同部位营养元素在不断积累与分配，不同时期肉苁蓉不同部位 NK元素含量都分别高于PMB C元素，而 MB R.Ca元素含量相近，且波动较小，同一时期花序中 NK元素含量均高于相对应的肉质茎上部和下部，表明营养元素积累中心已向花序转移.

许忠，田甜（乌鲁木齐市中医医院药剂科，新疆 乌鲁木齐 83000）摘要：目的 比较肉苁蓉与锁阳混合药物高剂量与低剂量对小鼠记忆力与抗疲劳的作用。方法 分别给小鼠灌胃不同剂量的肉苁蓉与锁阳混合药物，分别运用负重游泳法和小鼠跳台仪法，观察并记录小鼠的死亡时间以及小鼠跳台次数与潜伏期。结果 肉苁蓉与锁阳混合药物高、低剂量组与对照组相比，肉苁蓉与锁阳混合药物的高，低剂量组，均能够延长小鼠潜伏时间以及小鼠负重游泳时间。结论 肉苁蓉与锁阳混合药物高，低组能够提高小鼠记忆力；肉苁蓉与锁阳混合药物低剂量组具有明显抗疲劳的作用。关键词：肉苁蓉；锁阳；抗疲劳；记忆力肉苁蓉是我国的传统名贵中药材，有 沙漠人参”之称，应用历史已有1800余年～。肉苁蓉的肉质茎可入药味甘咸，性温四。自古以来，肉苁蓉就因其具有补肾阳、益精血、润肠通便、延缓衰老、提高免疫力等多种功效而在中药复方中被广泛应用。现代医学研究发现，肉苁蓉还在增强记忆力，提高机体耐力，调节内分泌，保肝，治疗各种机能性障碍，特别是性机能障碍和健忘症等方面具有功效＂。锁阳亦是我国传统的名贵中药材，具有滋补强壮、抗衰老、抗应激、清除自由基、抑制血小板聚集和增强免疫功能等作用。锁阳在中医中作为补肾助阳的药物，治疗肾虚阳痿、遗精早泄等症，结合中医理论研究该作用往往观察其对肾阳虚证模型的对抗作用。肉苁蓉和锁阳是分布于我国荒漠地区的2种营寄生高等沙生植物，作为名贵的补益药物被广泛应用于中药复方中，本研究以纯化制备的肉苁蓉与锁阳混合药物为研究对象，采用负重游泳法和小鼠跳台仪法，比较肉苁蓉与锁阳混合药物高剂量和低剂量分别对小鼠抗疲劳作用和记忆力的影响。旨在为进一步合理利用肉苁蓉与锁阳混合药物提供理论依据。1 材料与仪器1.1 仪器及设备 1810-B型石英自动双重纯水蒸馏器（江苏省金坛市医疗仪器厂）、KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、DK-600A型电热恒温水浴箱、PL303电子天平 梅特勒-托利多仪器 上海）有限公司）、DT-200型小鼠跳台测试仪 成都泰盟科技有限公司）。1.2 受试药物 肉苁蓉与锁阳粉末等量混合，用70％的乙醇回流提取10-12k常压95℃），随后旋转蒸发提取液，蒸发为提取液的五分之一，烘干浸膏（85℃），然后超微粉碎为200目。1.3 实验动物 健康昆明种小鼠60只，雌雄各半，体重18-22g，购于新疆医科大学实验动物中心。2 方法2.1 分组 负重游泳实验设正常对照组、肉苁蓉与锁阳混合药物低剂量组1.5mg／10g·bw）、肉苁蓉与锁阳混合药物高剂量组3mg／10g·bw）共3组，每组10只。记忆力实验组设正常对照组、肉苁蓉与锁阳混合药物低剂量组（1.5mg／10g·bw）、肉苁蓉与锁阳混合药物高剂量组3mg／10g-bw）共3组。每组10只。2.2 动物分组 适应性喂养3天后，随机分为3组，分别为空白对照组、肉苁蓉与锁阳混合物高剂量组、肉苁蓉与锁阳混合物低剂量组。每组20只，雌雄对半。2.3 给药方法 负重游泳实验组灌胃给药，各组每天上午12点称量体重后分别按各剂量组要求灌胃给药，其中低剂量组剂量为1.5mg／10g·bw），高剂量组剂量为（3mg／10g·bw），连续7d。记忆力实验组灌胃给药，各组每天上午12点称量体重后分别按各剂量组要求灌胃给药，其中低剂量组剂量为（1.5mg／10g·bw），高剂量组剂量为（3mg／10g-bw），连续7d。2.4 指标观察2.4.1 负重游泳实验时间的测定 负重游泳实验组连续灌胃给药7d，末次给药30min后，将各组小鼠鼠尾负重体重5％铁丝，分别放入30℃±0.5℃水中，立即用秒表计时，以下沉30s不上浮为指标，观察小鼠死亡所需要的时间。2.4.2 记忆力实验潜伏期及跳台次数测定 负重游泳实验组连续灌胃给药7d，第6天给药30min后，进行小鼠学习实验，将小鼠放人反位箱内适应环境3min 设，定电压32V，时间5min，然后立即通电，小鼠受到电流刺激，其正常反应是跳回平台以躲避伤害性刺激，训练5min，以此作为学习成绩。末次给药30min后重做试验，此即记忆保持测验，记录受电击的动物第一次跳下平台的潜伏期和5min内的错误总数。以潜伏期及触电次数为观察指标记录测试成绩。2.5 数据处理 采用SPASS 19.0软件中 one-wayANOVA进行数据处理和显著性检验，结果以X±D表示定量指标的平均值。3 结果与分析3.1 肉苁蓉和锁阳混合物对小鼠负重游泳时间的影响 结果见表1。表1 肉苁蓉和锁阳混合物对小鼠负重游泳时间的影响(insD,m=10)组别负重游泳时间／min空白对照组8.60±3.30*肉苁蓉和锁阳合物低剂量组161.60±46.90肉苁蓉和锁阳合物高剂量组14.00±4.92注：数据右上角标示字母分别表示同列不同处理间有统计学差异，其中a．d表示无统计学差P＞0.05），A．B、C示极差异品著(1000)由表1可以看出，肉苁蓉与锁阳混合药物低剂量组与空白对照组小鼠的负重游泳时间显极显著差异（P＜0.01），具有统计学意义；肉苁蓉与锁阳混合药物低剂量组与高剂量组小鼠的负重游泳时间显极显著性差异P＜0.01），具有统计学意义；肉苁蓉与锁阳混合药物高剂量组与空白对照组没有显著性差异P＞0.05），不具有统计学意义。3.2 肉苁蓉和锁阳混合物对小鼠记忆力影响结果见表2表2   肉苁蓉和锁阳混合物对小鼠记忆力的影响(xD,=-10)组别潜伏期错误次数空白对照组26.90±48.54*0.80=1.23°肉苁蓉和锁阳混合物高剂量组251.50±65.790.20±0.42肉苁蓉和锁阳混合物低剂量组278.00±27.57°0.10=0.32 注：数据右上角标示字母分别表示同列不同处理间差异显著性，其中D、EF、b、c表示无差异显著，A、B、C表示极差异显著（P＜0.01)。由表2可以看出，肉苁蓉与锁阳混合药物高剂量组与空白对照组潜伏期时间显极显著差异（P＜0.01），具有统计学意义；错误次数无显著性差异P＞0.05），不具有统计学意义。肉苁蓉与锁阳混合药物低剂量组与空白对照组潜伏时间显极显著差异P＜0.01），具有统计学意义。错误次数无显著性差异PS0.05），不具有统计学意义；肉苁蓉与锁阳混合药物的高剂量组与低剂量的潜伏期时间与错误次数均无显著性差异P＞0.05），不具有统计学意义。4 结论通过研究得出以下结论：在抗疲劳实验中，肉苁蓉与锁阳混合药物的高、低剂量均可以提高小鼠的抗疲劳性，低剂量抗疲劳性更加明显；在记忆力实验中，肉苁蓉与锁阳混合药物的高、低剂量组均能提高小鼠记忆力，且高、低剂量组的疗效相当。参考文献：［1 苏格尔，李天然，刘基焕，等．药用寄生植物锁阳的人工繁殖研究以内蒙古大学学报：自然科学版，1993,24 3）：324-329．Hu G S,Har Y J.Jia J M,t al.Elfects of 2-aminoilan-2-phosphonie acid phatreatent on the accunalation of salidroside and four phenylethanoid glyconides inuspension celleultue of Cistanche deseticda U)Plan 1 Cell Reports,2011,30(4):665-674.肖培根，李大鹏，杨世林，等，新编中药志 第三卷）［M］.北京：化学工业出版社，2001：107-114．[4] 朱咏华，罗泽民肉苁蓉的研究进展及前景分析门湖南林业科技，2000,27 4）：19-22屠耕飞，何燕萍，楼之岑.肉苁蓉类药源调查与资源保护以中草药，1994.21 4）：205-208．宋志宏，莫少红，陈燕，等.德赢vwin登录 化学成分的研究］中国中药杂志，2000.2512）：728-730．17 杨 坤，焦智活，张根发，肉苁蓉组织培养研究进展及应用前景明中草药，2006,37 1）：140-143．杨烨烨，李伟民，徐 容，等，化学发光法研究锁阳提取液消除02-的功能［）华东师范大学学报：自然科学版，2000（4）：101-103.张延英，李广远，师 霞，等，锁阳蜜对衰老模型小鼠抗应激及血清和脑组织SOD，MDA的影响中国医药学报，2004,19.3）：179-180.[10]CaiRL,YangMH,Shi Y,tal Antifatineactivity of phenylethanoid-rich esx trat from Cistanche desertionla  phytbtherapy Resenh,2010,24 2)313-315.（收稿日期：2014-07-14；修回：2014-11-17）