1．松果菊苷 4．管花苷A 5．毛蕊花糖苷 6．异毛蕊花糖苷 10．金石蚕苷 13.2＇-乙酰金石蚕苷表2 肉苁蓉、德赢vwin登录 及沙苁蓉样品指纹图谱与各自对照图谱的相似度评价结果编号相似度编号相似度编号相似度RCRI0.930GHI0.999SCRI0.982RCR20.995GH20.997SCR20.971RCR30.935GH30.997SCR30.999RCR40.982GH40.998SCR40.978RCR50.939GH50.994SCR50.966RCR60.918GH60.751SCR60.749RCR70.968GH70.991SCR70.929RCR80.979GH80.996SCR80.997RCR90.919GH90.995SCR90.992RCR100.843GH100.995SCR100.981RCR110.899SCR110.992RCR120.959SCR120.993RCR130.981SCR130.998RCR140.955RCR150.856图3 肉苁蓉及德赢vwin登录 样品主成分分析得分图图4 肉苁蓉及德赢vwin登录 样品正交偏最小二乘判别分析得分图图5 肉苁蓉及德赢vwin登录 样品正交偏最小二乘判别分析VIP图试验前期分别对肉苁蓉与德赢vwin登录 样品进行了聚类分析和主成分分析，结果发现聚类分析无法将二者分开，而主成分分析可将二者分开。为了进一步分析肉苁蓉与德赢vwin登录 中化学成分的差异，本研究进行了正交偏最小二乘判别分析，所建立的模型具有较好的解析能力和预测能力，分析结果与主成分分析一致，并确定色谱峰1（松果菊苷）、4（管花苷A）、7～9为肉苁蓉与德赢vwin登录 的差异性化合物。综上，本研究建立了肉苁蓉、德赢vwin登录 及沙苁蓉的UPLC指纹图谱分析方法，该方法稳定可靠，可用于肉苁蓉、德赢vwin登录 及沙苁蓉的指纹图谱研究及真伪鉴别。参考文献［1］居鹏飞，何燕萍，楼之岑，肉苁蓉类药源调查与资源保护［J］．中草药，1994.25（4）：205-208,224［2］国家药典委员会，中华人民共和国药典［S］．一部，北京：中国医药科技出版社，2020：140-141．［3］丁燕，张开梅，苍小鑫，等，肉苁蓉属化学成分及生物活性研究进展［J］．大连工业大学学报，2016,35（6）：395-402. [ 4 ]马志国，沙苁蓉与肉苁蓉饮片HPLC指纹图谱鉴别研究［J］．中国药学杂志，2011,46（12）：899-902．［5］那吾日克孜·亚库甫，阿提克木·麦合司木，维吾尔中药肉苁蓉的红外指纹图谱研究［J］.喀什师范学院学报，2011.32(6):46-47. [6]刘洋、肉苁蓉、草苁蓉活性成分和指纹图谱研究［D］。长春：吉林大学，2013． [7]龚立冬，肉苁蓉有效成份分析及指纹图谱研究［D］.无锡：江南大学，2007． [8]朱乃亮，徐荣，吴海峰，等，荒漠肉苁蓉和德赢vwin登录 指纹图谱比较研究［J］．中国药学杂志，2016.51（13）：1116-1119［9］卢丹逸，肉苁蓉质量分析新方法及沙苁蓉总苷的制备工艺研究［D］．广州：暨南大学，2014．

2 方法与结果2.1 色谱条件 色谱柱为Waters HSS T3（100mmx2.1mm，1.8μm）柱；流动相：甲醇（A）-0.1％甲酸溶液（B），梯度洗脱（0～4min，34％A；4～10min，34％～40% A;10~15min,40%~46%A;15~17 min,46%~ 34％A；17～20min，34％A），流速为0.3mL／min；检测波长为330mm；柱温为30℃；进样量为1山。2.2 对照品溶液的制备 取松果菊苷、管花苷A、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、金石蚕苷、2＇-乙酰金石蚕苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇溶解，制成每1mL分别含0.196、0.234、0.228、0.213、0.590、 0.357mg的混合对照品溶液。2.3 供试品溶液的制备 取干燥肉苁蓉、德赢vwin登录 、沙苁蓉样品粉末（过65目筛）0.5g，精密称定，置于50ml具塞锥形瓶中，加70％甲醇25mL，称重，超声（250 W，40kHz）30min，放冷，补重，滤过，取续滤液3mL，置于10mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，以0.22μm微孔滤膜滤过，即得。2.4 方法学考察2.4.1 精密度试验：取同一肉苁蓉供试品溶液（RCR10），按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，以5号毛蕊花糖苷色谱峰为参照峰（S），计算得到各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.17％～0.37％、0.08％～2.98％，表明仪器精密度良好。2.4.2 稳定性试验：取同一肉苁蓉供试品溶液（RCR10），分别于0、2、4、8、12、16、20、24、28h，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以5号毛蕊花糖苷色谱峰为参照峰（S），计算得到各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.06％～0.60％、0.10％～3.35％，表明供试品溶液在28h内稳定性良好。2.4.3 重复性试验：取同一批肉苁蓉供试品（RCR10）6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以5号毛蕊花糖苷色谱峰为参照峰（S），计算得到各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.06％～0.12％、0.15％～3.14％，表明该方法重复性良好。2.5 指纹图谱分析及相似度评价2.5.1 指纹图谱的建立：取15批肉苁蓉、10批德赢vwin登录 、13批沙苁蓉样品适量，按“2.3”项下方法制备样品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，将数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”，分别以RCR1、GHI、SCR1为参照图谱，以0.1的时间窗宽度进行峰匹配，得到肉苁蓉、德赢vwin登录 及沙苁蓉的UPLC叠加图谱，采用平均数法生成对照图谱（R），见图1．肉苁蓉、德赢vwin登录 、沙苁蓉样品指纹图谱分别有9、6、6个共有峰。通过与对照品（图2）比对，确定色谱峰1为松果菊苷，4为管花苷A，5为毛蕊花糖苷，6为异毛蕊花糖苷，10为金石蚕苷，13为2-乙酰金石蚕苷。2.5.2 相似度评价：肉苁蓉、德赢vwin登录 及沙苁蓉样品与各自对照图谱之间的相似度评价结果见表2。15批肉苁蓉样品指纹图谱的相似度均≥0.843，10批德赢vwin登录 样品指纹图谱的相似度均≥0.751,13批沙苁蓉样品指纹图谱的相似度均≥0.749。将肉苁蓉、德赢vwin登录 及沙苁蓉对照图谱导人“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”，计算肉苁蓉、德赢vwin登录 及沙苁蓉对照图谱间的相似度，肉苁蓉与德赢vwin登录 具有较高的相似度，为0.932，面沙苁蓉与德赢vwin登录 的相似度很低，仅有0.070，与肉苁蓉的相似度更低，只有0.045。2.6 化学计量学分析2.6.1 主成分分析：将肉苁蓉及德赢vwin登录 样品指纹图谱中共有峰的峰面积导入SIMCA-P 13.0软件，进行主成分分析，提取前2个主成分使样品的多维数据转化成二维数据，得到主成分分析得分图，见图3。肉苁蓉与德赢vwin登录 样品可区分开。2.6.2 正交偏最小二乘判别分析：为了进一步区分肉苁蓉及德赢vwin登录 样品，在无监督的主成分分析的基础上，进行有监督的正交偏最小二乘判别分析，获得相应的模型。累积解析能力参数R2x和R2Y分别为0.852和0.823，预测能力参数Q2为0.810，说明所建立模型具有较好的解析能力和预测能力，可用于苁蓉与德赢vwin登录 样品的区分。由正交偏最小二乘判别分析得分图（图4）可知，肉苁蓉与德赢vwin登录 样品可区分开。对肉苁蓉及德赢vwin登录 样品的数据差异性进行整体分析，得到变量权重重要性排序预测值（VIP），见图5。以VIP＞1为提取标准，得到肉苁蓉与德赢vwin登录 的差异性标志物分别为色谱峰1（松果菊苷）、7～9、4（管花苷A），可作为区分肉苁蓉与德赢vwin登录 的指标性成分。3 讨论肉苁蓉样品指纹图谱有9个共有峰，德赢vwin登录 样品指纹图谱有6个共有峰，二者均指认了松果菊苷、管花苷A、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷4个成分；沙苁蓉样品指纹图谱有6个共有峰，指认了毛蕊花糖苷、金石蚕苷、2＇-乙酰金石蚕苷3个成分。肉苁蓉、德赢vwin登录 、沙苁蓉样品与其各自对照图谱相似度分别为0.843～0.995,0.751～0.999,0.749～0.999，说明肉苁蓉饮片的内在质量相对较稳定，而德赢vwin登录 、沙苁蓉各批次之间差异较大，这可能是由于产地、采收、加工及储存方式等不同造成药材批间的明显差异。比较分析肉苁蓉、德赢vwin登录 及沙苁蓉对照图谱可知，毛蕊花糖苷是肉苁蓉和德赢vwin登录 的第2大色谱峰，同样也是沙苁蓉的共有峰；管花苷A、异毛蕊花糖苷是肉苁蓉和德赢vwin登录 中含量相对较低的共有峰，而沙苁蓉中没有此色谱峰；沙苁蓉的特征峰分别是金石蚕苷、2＇-乙酰金石蚕苷。由此可见这些指纹特征均很显著，可用于肉苁蓉、德赢vwin登录 及沙苁蓉样品的种间鉴别。

梁渐崧口，李秀枝＇，吴孟华，张 英矿，曹晖，马志国1．广东一方制药有限公司，广东佛山528244；2 暨南大学药学院，广东广州510632；3．暨南大学岭南传统中药研究中心，广东广州510632摘要 目的：建立肉苁蓉与伪品沙苁蓉的UPLC指纹图谱。方法：色谱柱为Waters Hss T3（100mmx2.1 mm，1.8μm）柱；流动相为甲醇-0.1％甲酸溶液，梯度洗脱；流速为0.3ml／min；检测波长为330mm；柱温为30℃；进样量为1pl；建立指纹图谱，并进行相似度评价、主成分分析及正交偏最小二乘判别分析。结果：建立的肉苁蓉、德赢vwin登录 及沙苁蓉指纹图谱分别含有9,6、6个共有峰。肉苁蓉与德赢vwin登录 的对照图谱的相似度为0.932，沙苁蓉与德赢vwin登录 、肉苁蓉的对照图谱的相似度分别为0.070,0.045。主成分分析及正交偏最小二乘判别分析均可将肉苁蓉与德赢vwin登录 区分开。结论：所建立的UPLC指纹图谱分析方法简便，重复性好，专属性强，可为肉苁蓉与伪品沙苁蓉的种间鉴别及质量评价提供参考依据。关键调 肉苁蓉：德赢vwin登录 ；沙苁蓉；UPLC；指纹图谱：化学计量学中图分类号：R284.3  文献标识码：A  文章编号：1001-4454（2021）01-0110-06DOI:10.13863/j.issnl001-4454,2021.01.021肉苁蓉为列当科肉苁蓉属植物，我国有4种及1变种，分别为肉苁蓉 Cistanche deserticola Y．C．Ma、德赢vwin登录 Cistanche mbulasa（Schenk）Wight、盐生 肉苁蓉 Cistanche salsa（C.A.Mey.）G.Beck、沙苁蓉 Cistanche sinensis G.Beck、白花肉苁蓉 Cistanche salsa var．albiflora P．F．Tu et Z．C．Lou。2020年版中国 药典规定肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉 Cistanche de-serticola Y.C.Ma或德赢vwin登录 Cistanche tubulosa （Sehenk）Wight的干燥带鳞叶的肉质茎，具有补肾阳、益精血、润肠通便的功效（2）。肉苁蓉主要含有苯乙醇苷类、苯甲醇苷类、环烯醚萜及其苷类等成分。文献报道沙苁蓉是肉苁蓉常见的伪品，其与肉苁蓉的HPLC指纹图谱有明显差异（，目前对肉苁蓉指纹图谱的研究主要针对肉苁蓉与德赢vwin登录 或不同产地、不同采收季节肉苁蓉指纹图谱的研究（），对肉苁蓉与沙苁蓉的指纹图谱比较研究报道较少，且大多是采用HPLC法，存在分析时间长，灵敏度不佳的缺点。本文采用UPLC 法建立肉苁蓉、德赢vwin登录 及沙苁蓉指纹图谱，并进行聚类分析、主成分分析及正交偏最小二乘判别分析，以期为肉苁蓉药材品种鉴别提供实验依据。1 仪器与材料1.1 仪器 Waters Acquity UPLC型超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；KQ-500E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ME204E型万分之一天平、XP26型百万分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。1.2 材料 松果菊苷（批号：S-003-190403）、管花苷A（批号：G-066-181216）、毛蕊花糖苷（批号：M-011-181106）、异毛蕊花糖苷（批号：Y-073-170325）、金石蚕苷（批号：J-014-190712）对照品均购自成都瑞芬思生物科技有限公司；2＇-乙酰金石蚕苷对照品为实验室自制，经＇H-NMR、”C-NMR、MS等波谱技术鉴定了化学结构，质量分数＞98.0％（）。甲酸、甲醇均为色谱纯；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。15批肉苁蓉、10批德赢vwin登录 及13批沙苁蓉样品均收集于各地药材市场或企业，来源信息见表1，经笔者马志国副教授鉴定为列当科植物肉苁蓉Cistanche deserticola Y.C.Ma、德赢vwin登录 Cistanche tmbulosa（Schenk）Wight 或沙苁蓉 Cistanche sinensis G.Beck的干燥带鳞叶的肉质茎。表1             15批肉苁蓉、10批德赢vwin登录 及13批沙苁蓉样品来源信息编号基原来源RCR1Cistanche desenicola Y.C.Ma广州清平药材市场RCR2Citanche deeticola Y.C.Ma广州清平药材市场RCR3Cistanche deserticola Y.C.Ma广州清平药材市场RCR4Cistanche deseticola Y.C.Ma广东省药材公司RCR5Cistanche deeticola Y.C. Ma广西仁济堂中药饮片有限公司RCR6Cistanche deseticola Y.C.Ma江西顺福康饮片有限公司RCR7Cistanche desenicola Y.C.Ma中科院新疆生态与地理研究所RCR8Cistanche deserticola Y.C.Ma中科院新疆生态与地理研究所RCR9Cistanche deserticola Y.C.Ma新疆昌吉州奇台县RCR10Cistanche deseticola Y.C.Ma新疆昌吉州奇台县RCR11Cistanche dewticola Y.C.Ma新疆昌吉州奇台县RCR12Citanche deseticola Y.C.Ma新疆昌吉州奇台县RCR13Cistanche deserticola Y.C Ma新疆昌吉州奇台县RCR14Cistanche deseticola Y.C.Ma佛山捷康大药房RCR15Cistanche deeticola Y.C.Ma中科院新疆生态与地理研究所GH1Cistanche tubulosa(Schenk)Wight新疆达泽红花药业有限公司GH2Cistanche tmllosa(Schenk)Wight新疆达泽红花药业有限公司GH3Citanche tulaulosa(Schenk)Wight新疆达泽红花药业有限公司GH4Citanche tulalosa(Schenk)Wight广州康乐医药GH5Cistaanche tullosa(Sehenk)Wight广州老百姓大药房GH6Cistanche tululona(Sehenk)Wight新疆和田GH7Cistanche tulaulosa(Schenk)Wight新疆和田GH8Cistanche tulaulosa(Schenk)Wight中科院新疆生态与地理研究所GH9Cistanche tulaulosa(Schenk)Wight中科院新疆生态与地理研究所GH10Cistanche tmbalosa(Schenk)Wight新疆吉昌州SCR1Cistanche sinensis G.Beck广州林和药业SCR2Cistanche sinersis G.Beck广州老百姓大药房SCR3Cistanche sinesis G.Bek广州二天堂大药房SCR4Cistanche sinensis G.Beck山东龙口华康大药房SCRSCistanche sinensis G.Beck广州仁和堂SCR6Cistanche sinesis G.Beck广州七乐康大药房SCR7Cistanche sinensis G.Beck广州康乐医药SCR8Cistanche sinensis G.Beck山东龙口博祥大药房SCR9Cistanche sinensis G.Beck广州林和药业SCR10Cistanche sinensis G.Beck佛山九福堂大药房SCR11Cistanche sinensis G.Beck佛山百姓大药房SCR12Cistanche sinensis G.Beck佛山中天大药房SCR13Cistanche sinensis G.Beck山东龙口华康大药房 

2.2 愈伤组织继代培养2.2.1 愈伤组织继代培养基和培养条件：外植体上诱导出的愈伤组织生长25d左右开始变褐，20d时将愈伤组织及时切下进行继代培养，以后每25d继代1次。继代的基本培养基为B5，在暗培养条件下生长缓慢，在半光照（10h／d）条件下生长速度明显加快。采用正交实验方法L（3），对外植体、植物生长调节物质和蔗糖浓度在半光照（10h／d）培养条件下的生长情况进行了筛选，愈伤组织生长量为生长52d时的结果，见表7。在半光照（10h／d）条件下，对愈伤组织生长影响较大的培养条件是蔗糖浓度，其次是激素6-BA和NAA，而采用愈伤组织0～2代材料培养对愈伤组织生长的影响不是主要因素。方差分析结果（表8）表明这几种因素对愈伤组织的生长量影响差异均无显著性。表7 植物激素与培养条件正交设计表及结果Table 7 Orthogonal design and results of planthormones and culture conditions因素和愈伤组织生长量/g水平愈伤组织蔗糖浓度6-BAVVNKI0.493 20.60670.404.20.4343K20.458.40.436 20.527 40.427K30.435 50.344 20.45550.5251R0.019 20.087.50.041 10.032.42.2.2 愈伤组织生长与褐化：愈伤组织在培养初期生长缓慢，在0～10d属于生长延迟期，生长速度接近于0，此阶段后期生长略有加快，在15～25d内，生长速度明显加快，生长量增加显著，是延迟期的6.3倍，25～30d生长最快，生长速度是延迟期的表8 愈伤组织生长量方差分析表Table 8 Variance analysis of callus growth方差来源离差平方和自由度均方F值金伤组织0.000 620.000 30.14蓝糖浓度0.011820.005.92.816-BA0.002.520,001 250.60VVI0.001.920.000 950.45误差0.002 12总和0.018.910Fo.s=19.00 F#99.0114.5倍，愈伤组织的最佳继代时间是25～30d．45d后愈伤组织生长量下降到与延迟期相当的水平，且开始褐化，50d后褐化加重，彻底停止生长。愈伤组织生长曲线见图1。图1 肉苁蓉愈伤组织生长曲线Fig 1 Time curve of callus growth of C deserticola2.3 愈伤组织物质中有效成分的测定：将在B5培养基中继代培养40d左右的愈伤组织取出并自然干燥后，应用《中国药典》2005年版一部方法对愈伤组织中毛蕊花糖苷和松果菊苷进行测定，结果见图2．经换算肉苁蓉愈伤组织培养物中松果菊苷达3.92％，洋丁香苷（毛蕊花糖苷）可达0.45％；野生肉苁蓉肉质茎中松果菊苷达2.59％，毛蕊花糖苷1.40%。   图2 松果菊苷和洋丁香苷（毛蕊花糖苷）对照品（A）、肉苁蓉愈伤组织（B）、野生肉苁蓉（C）的HPLC图谱3 讨论对药用植物肉从蓉进行愈伤组织的诱导研究对扩大和保护自然资源具有重要的意义。肉苁蓉以其肉质茎入药，肉质茎的粗度通常在10cm左右，利用肉质茎中维管组织部分诱导肉苁蓉愈伤组织是最合适的外植体，在适宜的培养条件下可以诱导产生大伤组织。愈伤组织继代条件与诱导条件略有不同。对于药用植物，特别是一些濒危药用植物，利用愈伤组织培养提取药用活性成分是一种行之有效的方法。郭志刚印等对盐生肉苁蓉愈伤组织培养方法与苯乙醇苷化合物合成进行了研究，认为愈伤组织中的主要成分与天然肉苁蓉基本相同。于荣敏等对银杏愈伤组织培养和其代谢产物银杏内酯进行了研究，筛选出了银杏内酯高产细胞系，银杏内酯量达万分之一，与天然植物的量相当。笔者利用高效液相色谱技术对野生肉苁蓉肉质茎和由肉质茎诱导出的愈伤组织物质中主要药用活性成分麦角甾苷的测定比较，证明了愈伤组织培养物质中含有较高质量浓度的毛蕊花糖苷。《中国药典》2005年版一部中对肉苁蓉药材质量标准的要求中明确指出，样品干样中松果菊苷（C＝HO）和毛蕊花糖苷（C～H＝O）的量应不低于0.3％。测定的愈伤组织干物质中松果菊苷（C＝H＝O＝）和毛蕊花糖苷（C-HOs）的量为4.37％，野生肉苁蓉肉质茎为3.99％。充分说明利用肉苁蓉愈伤组织培养技术来提取药用有效成分是可行的，可以减少对自然资源的采挖压力。

宋玉霞，郭生虎，张芦燕，李“苗，马洪爱，牛东玲一，郑国琦，王英华”1．宁夏农业生物技术重点试验室，宁夏 银川 750002；2．宁夏大学生命科学学院，宁夏 银川 750021，3．宁夏药品检验所，宁夏 银川 750004摘 要：目的 为扩大和提高肉苁蓉Cistanche deserticola 资源的利用效率，方法 以肉苁蓉肉质茎的不同组织部位作为外植体，采用正交实验方法，筛选诱导愈伤组织产生的不同培养基和培养条件，并继代培养，应用HPLC方法对愈伤组织培养物中松果菊苷和洋丁香苷（毛蕊花糖苷）的量进行测定。结果 肉苁蓉肉质茎的维管组织部分是诱导愈伤组织的最适外植体，鳞片叶次之，髓组织部分请导效果较差。在暗培养，25～27℃条件下以B5为基本培养基附加6-BA（0.5～2mg／L）与IAA（0.5～1.5mg／L）诱导愈伤组织效果最佳：在半光照（光培养10h／d．暗培养14h／山）条件下，愈伤组织生长正常，最佳继代时间为25～30d，愈伤组织培养物中松果菊苷和洋丁香苷（毛蕊花糖苷）达4.37％。结论 筛选出了适宜的肉苁蓉愈伤组织培养方法，且培养物中主要药用有效成分松果菊苷和洋丁香苷（毛蕊花糖苷）的量达到并超过了《中国药典》要求（0.3％）的标准。关键词：肉苁蓉：肉质茎：愈伤组织：洋丁香苷（毛蕊花糖苷）；松果菊苷肉苁蓉Cistanche deserticola Y.C.Ma为列当 科肉苁蓉属多年生寄生草本植物，具肉质茎，属珍稀药用植物，生长在干旱荒漠中。内含生物碱、黄酮类、苯乙基糖苷、环烯醚萜苷等多种活性成分，药用价值很大。肉苁蓉具有补肾、益精、润肠、提高人体免疫功能、抗衰老、抗疲劳等多种功能。多年来人们利用的肉苁蓉全部为天然资源，由于市场需求量日益增大，造成滥采乱挖严重。另外，肉苁蓉生长环境十分恶劣，并具有独特的寄生生物学特性，野生资源严重匮乏，成为濒危植物。为扩大和保护野生资源，人们开始从多种途径解决肉苁蓉的繁殖问题，进行了人工栽培研究，并有成功报道，但由于技术局限性较大，推广应用还存在一些问题。利用组织培养技术，诱导愈伤组织，提取药用活性成分的方法在许多药用植物研究方面被采用。对肉苁蓉这类资源少、难繁殖的药用植物采用愈伤组织培养技术提取药用活性成分的研究更加重要。国内对肉苁蓉愈伤组织的诱导研究有过研究报道，但对肉苁蓉愈伤组织物质中毛蕊花糖苷与松果菊苷定量测定的报道较少。本试验对肉苁蓉的肉质茎进行了系统的愈伤组织诱导和培养研究，并按照2005年版《中国药典》一部的方法和标准，对其主要药用有效成分松果菊苷和毛蕊花糖苷的量进行了测定，为利用愈伤组织提取药用活性成分奠定基础。1 材料和方法1.1 材料：试验材料肉苁蓉C，deserticola Y．C．Ma肉质茎采自内蒙古阿拉善左旗苏海图苏木乌兰布和沙漠中（标本由宁夏大学马德滋教授鉴定）。1.2 方法1.2.1 外植体处理：肉苁蓉的肉质茎共有3个部分构成：茎外部覆瓦状排列的鳞片叶；维管束呈环状排列的维管组织部分：中心的髓组织部分。将肉苁蓉肉质茎用自来水和蒸馏水反复冲洗干净后，分成3个部分：鳞片叶、维管组织、髓组织作为诱导愈伤组织的外植体。在超净工作台上，先用70％乙醇浸泡1min，再用0.1％升汞浸泡9min，然后再用无菌水冲洗3～5次，用灭菌滤纸吸干表面水分，分别切成0.5cmx0.5cmx0.3cm的小块，接种到不同的诱导培养基上。1.2.2 愈伤组织诱导和培养条件：实验所选择的基本培养基为MS、B5培养基，附加植物激素（2,4-D；6-BA：NAA等），培养基中加蔗糖30g，琼脂5.5g／L．培养基的pH值为5.8。在暗培养条件下诱导愈伤组织，培养温度为25～27℃，在半光照条件下（光照10h／d），进行愈伤组织继代培养，光照强度为1500～20001x，结合自然光照800k左右。采用正交实验方法，应用正交表L（3），对各因素进行了3个水平试验筛选，见表1、2。表1 植物激素正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test of plant hormones水因素* 2.-D/1mg·L-) 6-BA/(mg·L-))NAA/mg·L)10.5100.2231.01.512500.51.0表2 植物激素与培养条件正交实验因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test of plant hormones and culture condition水因素*愈伤组织蓝糖/%-BA/mgL-5 NAA/mg·L-ic P23ullttg Ho校政松：Fl紧密，甲税状Fuse.All righ23ts teserved.1.52.0http//www.cnki.1.01.5 

〔摘 要〕 目的 探讨肉苁蓉多糖对D-半乳糖致衰老小鼠脑神经细胞的保护作用及其机制。方法 建立D-半乳糖致衰小鼠模型,观察肉苁蓉多糖对脑组织超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力、神经细胞凋亡及DNA 损伤和凋亡相关基因Bcl-2 的表达情况。结果 衰老小鼠脑神经细胞MDA 含量、DNA 损伤率和细胞凋亡率明显增加(P<0. 01),SOD 活性、GSH-Px 活力及Bcl-2 基因表达明显降低(P<0. 05)。灌服肉苁蓉多糖可提高SOD 活性、GSH-Px 活力,降低MDA 含量,增强神经细胞DNA 损伤的修复能力,减少凋亡细胞数,增加Bcl-2 基因表达。结论 肉苁蓉多糖对D-半乳糖致衰小鼠脑神经细胞具有保护作用。〔关键词〕 肉苁蓉多糖;凋亡;Bcl-2肉苁蓉为国家二级保护植物,含多种活性成分,多糖是其主要活性成分之一。肉苁蓉及其有效成分具有抗疲劳、抗衰老、抗肿瘤、增强机体免疫力等药理作用,但有关肉苁蓉多糖对衰老小鼠脑神经细胞保护作用的研究尚未见报道。本实验拟探讨肉苁蓉多糖对衰老小鼠脑神经细胞的保护作用及其机制。1 材料与方法1. 1 材料 昆明种小鼠60 只,雌雄各半(牡丹江医学院实验动物中心提供)。D-半乳糖(上海试剂二厂);丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒(南京建成生物工程研究所);细胞凋亡、Bcl-2、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(武汉博士德生物制品有限公司);TritonX-100、二甲基亚砜、胰蛋白酶(华舜生物工程有限公司);Scout-Ⅱ半自动生化分析仪;R201D 旋转蒸发仪;真空泵,恒压稳流电泳仪,生化培养箱,OLYMPUS荧光显微镜。1. 2 方法1. 2. 1 肉苁蓉多糖的制备 肉苁蓉生药片,经热乙醇浸泡3 h 后,纱布过滤后弃滤液。药渣加水煎煮3 次,每次1 ~2 h,过滤后合并滤液。蒸发浓缩后离心去沉淀,上清液加2 ~ 3 倍体积的95% 乙醇沉淀,4℃ 静置24 h,次日4℃ 6 000 r/ min 离心20 min 收集沉淀。沉淀经水复溶、脱蛋白透析、冷冻干燥后获粗多糖。1. 2. 2 D-半乳糖致衰小鼠模型的建立 60 只昆明种小鼠随机分为青年对照组,衰老模型组,肉苁蓉多糖组,每组20 只。衰老模型组和肉苁蓉多糖组每日上午颈背部皮下注射D-半乳糖100 mg/ kg,连续30 d。青年对照组每日颈背部皮下注射相同剂量的生理盐水。每天皮下注射的同时灌胃给药,肉苁蓉多糖组灌服肉苁蓉多糖(折合生药0. 01 g/ ml),青年对照组和衰老模型组每日灌胃相同剂量的蒸馏水,连续30 d。1. 2. 3 动物处理及指标测定 30 d 后所有小鼠断头处死,立即取出脑组织,取大脑中部中性甲醛固定。余下脑组织一部分用生理盐水制成匀浆,一部分用胰蛋白酶消化制成单细胞悬液。取脑组织匀浆,按SOD、MDA、GSH-Px 试剂盒说明书操作,用半自动生化分析仪比色分析测定结果。DNA 的损伤率采用单细胞凝胶电泳法即彗星实验检测;TUNEL 法观察神经细胞凋亡数;免疫组化法检测Bcl-2 基因表达。1. 3 统计学处理 用SPSS16. 0 软件行q 检验。2 结 果2. 1 肉苁蓉多糖对小鼠脑SOD、MDA、GSH-Px、DNA损伤率和细胞凋亡的影响 灌服肉苁蓉多糖可提高致衰小鼠SOD 活性、GSH-Px 活力,降低MDA 含量,增强神经细胞DNA 损伤的修复能力,减少凋亡细胞数。见表1,图1 ~3。2. 2 肉苁蓉多糖对脑组织Bcl-2 表达强度的影响青年对照组脑组织Bcl-2 阳性表达18 例,衰老模型组为4 例,肉苁蓉多糖组为16 例,组间比较差异有统计学意义(P<0. 05)。肉苁蓉多糖可增强D-半乳糖致衰小鼠脑神经细胞Bcl-2 表达强度。见图4。3 讨 论衰老自由基学说认为人类随年龄增长的退行性变化是由自由基活性氧化损伤作用所致。D-半乳糖致亚急性中毒状态下,体内产生大量超氧阴离子自由基,对组织产生过氧化损害,这种生化和组织结构的改变与衰老表现基本吻合。有研究发现,细胞程序性死亡对衰老起主动作用,并引起特征性形态改变及衰老性生长停滞,衰老细胞死亡的实质就是细胞凋亡〔1〕。Bcl-2 家族蛋白在调控神经细胞凋亡和生存中发挥重要作用,家族成员包括促凋亡基因和抑制凋亡基因,抑制细胞凋亡的基因主要有Bcl-2、Bcl-xl 等。Bcl-2 基因是一种原癌基因, 具有抑制细胞凋亡的作用〔2,3〕。Bcl-2的过度表达可减少神经元程序性细胞死亡,引起特定脑区内神经元数目增多。肉苁蓉又名金笋、地精,为列当科植物肉苁蓉或德赢vwin登录 的干燥带鳞叶的肉质茎,主产于内蒙古、甘肃、新疆、青海等地;性温、味甘咸,为补肾壮阳、润肠通便之要药,有“沙漠人参”的美誉,《中国药典》2010 年版收录的肉苁蓉和德赢vwin登录 为正品药材〔4,5〕。现代药理研究也证明肉苁蓉除具有补肾壮阳、润肠通便作用外,还具有抗疲劳、抗衰老、增强机体免疫力及增强记忆力等作用。吴波等〔6〕研究发现肉苁蓉总苷能明显提高亚急性衰老小鼠抗氧化及延缓衰老的作用;尹刚等〔7〕研究发现肉苁蓉多糖通过调控抗凋亡基因表达水平抑制大鼠海马区神经元的凋亡,这与本实验观察到的结果相似。本实验结果显示灌服肉苁蓉多糖后,衰老小鼠各项衰老指标得以改善,其原因与以下因素有关:①肉苁蓉多糖作为一种功效显著的天然抗氧化剂,可清除超氧自由基、羟自由基、单线态氧等多种自由基及其代谢产物,使SOD 的消耗减少、活性上升,MDA 含量下降。②肉苁蓉多糖中含有多种人体必需的微量元素,能提高DNA 损伤的修复能力。③肉苁蓉多糖有促进代谢、调节基因表达的作用,上调Bcl-2 基因表达水平,通过Bcl-2 发挥其抗氧化作用,可减少氧自由基产生和脂质过氧化物的形成,减少体内自由基积聚引起的一系列连锁反应,减少DNA 氧化损伤,抑制氧化应激诱导的细胞凋亡的发生,对脑神经细胞起到保护作用。综上,肉苁蓉多糖具有改善衰老小鼠脑神经细胞损伤的作用,这种作用与其抗氧化、抗凋亡及上调Bcl-2表达水平有关,但Bcl-2 表达与激活途径的具体机制及与抗氧化、抗凋亡之间的关系还不清楚,将在进一步的实验中深入研究。4 参考文献1 范京惠,左玉柱,李一经. 细胞凋亡的研究进展〔J〕. 东北农业大学学报,2015;36(6):804-7.2 Ehrhardt C,Marjuki H,Wolff T,et al. Role of PI 3-kinase,Akt and Bcl-2-related proteins in sustaining the survival of neurotrophic factor-independentadult sympathetic neurons factor-independent adult sympatheticneurons〔J〕. J Cell Biol,2001;154(5):995-1005.3 Zhang H,Rosdahl I. Bcl-xL and bcl-2 proteins in melanoma progressionand UVB-induced apoptosis〔J〕. Inter J Oncol,2006;28(3):661-6.4 钟 平. 沙漠人参肉苁蓉〔J〕. 森林与人类,2004;24(11):25.5 国家药典委员会. 中国药典〔M〕. 北京:中国医药科技出版社,2010:126.6 吴 波,付玉梅. 肉苁蓉总苷对亚急性衰老小鼠抗脂质过氧化作用的研究〔J〕. 中国药理学通报,2005;21(5):639.7 尹 刚,龚道恺,刘帮会. 肉苁蓉多糖对阿尔茨海默病模型大鼠的学习记忆能力及海马神经元Bcl-2 和caspase-3 表达的影响〔J〕. 时珍国医国药,2013;24(5):1091-2.

［摘要］ 目的: 探讨肉苁蓉多糖( CDPS) 对Aβ25 － 35诱导的大鼠肾上腺嗜络瘤细胞( PC12) 损伤BDNF 基因表观遗传的调控作用，分析组蛋白乙酰化对BDNF 基因转录的影响。方法: 采用Aβ25 － 35诱导PC12 细胞损伤建立阿尔茨海默病( AD) 体外模型，在给予阳性药人参皂苷Ｒd( GSrd) 、CDPS 高、低浓度后，流式细胞术检测细胞凋亡情况; Hoechst33258 染色观察细胞形态的变化。ELISA 法检测组蛋白乙酰化酶( HATs) 、组蛋白去乙酰化酶2( HDAC2) 和BDNF 的含量变化。Western Blotting 检测P300 和HDAC2 的表达水平变化。染色质免疫共沉淀( CHIP) 检测BDNF exon Ⅳ组蛋白H3 乙酰化水平的变化和HDAC2 含量变化。结果: 20 μmol·L － 1 Aβ25 － 35暴露PC12 细胞48 h 后成功建立AD 细胞凋亡模型。GSrd 组、CDPS 高、低浓度作用48 h 后，HATs表达增加( P ＜ 0． 05) ，HDAC2 表达下降( P ＜ 0． 05) ，BDNF 水平提高( P ＜ 0． 05) ，并且有剂量依赖性。ChIP分析证实Aβ25 － 35诱导PC12 细胞后BDNF 基因exon Ⅳ组蛋白H3 乙酰化水平明显下降，且降低呈HDAC2 依赖性; 给药48 h 后，BDNF 基因exon Ⅳ组蛋白H3 乙酰化水平显著升高，HDAC2 水平显著降低。结论: CDPS可能通过重建Ac-H3 和HDAC2 之间的平衡，抑制HDAC2 的表达来活化BDNF 基因转录从而起到保护PC12 细胞、刺激PC12 细胞再生的作用。［关键词］ 肉苁蓉多糖; PC12 细胞; 组蛋白乙酰化酶2; 组蛋白H3肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉( Cistanche deserticolaY． C． Ma) 或德赢vwin登录 ［Cistanche Tubulosa( schrenk) Ｒ． Wight］的干燥带鳞叶的肉质茎。入肾经，能补肾阳、益精血; 入大肠经，能润肠燥、缓通便［1］。研究表明［2］，多数药用植物的多糖都具有显著的生物活性，如免疫调节、抗衰老、抗炎保肝、抗肿瘤等。阿 尔茨海默病( Alzheimer's disease，AD) 是一种进行性的神经退行性疾病［3］。认知功能下降是该病的主要病理特征，但目前对于认知功能下降的原因尚不明确，同时也缺乏有效的治疗方法。大量研究［4］发现，组蛋白乙酰化异常是AD 发病过程中常见的表观遗传异常。在如认知功能障碍的AD 特征性症状病理机制研究中发现，组蛋白乙酰化修饰调节了记忆相关基因的表达情况［5 － 7］。组蛋白乙酰化动态平衡由组蛋白乙酰化酶( HATs) 和组蛋白去乙酰化酶( HDACs) 2 种活性酶共同调节。HATs 主要对染色质核小体的核心组蛋白N 端尾部赖氨酸残基进行可逆性乙酰化修饰，中和DNA 和相邻组蛋白之间的正电荷，促进DNA 解螺旋，松弛染色质结构，有利于转录因子与DNA 功能区结合，最终激活转录。目前发现的参与学习记忆的组蛋白乙酰化酶是P300 /CBP［8］。另外，有研究表明［9］HATs 活性降低参与到神经退行性疾病中。脑源性神经营养因子( brain derived neurotrophicfactor，BDNF) ，是神经元和神经胶质重要的神经营养因子，被认为是记忆形成过程中的关键蛋白之一，是成熟的中枢及周围神经系统的神经元维持生存及正常生理功能所必需的物质［10 － 11］。一些研究表明BDNF 在齿状回的颗粒细胞层( GCL) 中高度表达，表明其通过TrkB 受体参与突触可塑性和神经元发育。此外，BDNF 表达和释放也可以通过遗传和表观遗传变异，如组蛋白修饰［12 － 13］。P300 /CBP是具有HAT 活性的转录共激活剂，对长期记忆过程有重要影响，取决于从头基因表达［14］，并且BDNF的表达受P300 /CBP 的活性调节［15］。研究证实［16］，不仅环境因素可以造成BDNF 启动子区的长期表观遗传改变，药物刺激也会如此，如丙咪嗪通过HDAC5 的下调增强bdnf P4 和P6 的H3 乙酰化。但是，我们仍不清楚这些快速的表观遗传变化是否参与在给与肉苁蓉多糖( CDPS) 后Aβ25 － 35诱导的PC12 细胞中调节BDNF 转录表达。本研究以GＲsd 为阳性药［17］，结果证实在Aβ25 － 35诱导的AD 细胞模型给与肉苁蓉3 种有效成分后，通过重建Ac-H3 和HDAC2 之间的平衡，增加BDNF 表达，从而改善、促进神经元存活。本研究表明BDNF 表达和释放与表观遗传修饰，特别是和由HDAC 和HAT 调节的组蛋白乙酰化改变密切相关。材料与方法1 药品与试剂DMEM 培养基( 美国Gibco 公司，批号: 12491-015) ; FBS( 美国Gibco 公司，批号: 10099141) ; MTT( 美国Sigma 公司，批号: M5655) ; BDNF 酶联免疫试剂盒( 武汉新启迪生物科技有限公司，批号:3374518) ; HATs 酶联免疫试剂盒( 武汉新启迪生物科技有限公司，批号: 6907299) ; HDAC2 酶联免疫试剂盒( 武汉新启迪生物科技有限公司，批号:6907236) ; 人参皂苷( 成都曼斯特生物科技有限公司，批号: A0245) ; Aβ25 － 35( 上海吉尔生化有限公司，批号: 10-375) ; HDAC2 多克隆抗体( 英国Abcam 公司，批号: ab32117) ; P300 多克隆抗体( 英国Abcam公司，批号: ab142163) ; β-actin 多克隆抗体( 北京中杉金桥生物技术有限公司，批号: ZM-0001) ; HＲP-羊抗兔二抗( 英国Abcam 公司，批号: ab205718) ; 彩色预染蛋白分子量标准( 美国Sigma 公司) ; ECL 显色液( Theromo Fisher Scientific，批号: 10318H08) ; 核蛋白提取试剂盒( 康为世纪生物科技有限公司，批号:CW0199S) ; 蛋白磷酸酶抑制剂混合物( 康为世纪生物科技有限公司，批号: CW2383S) ; 染色质免疫沉淀试剂盒( 德国Merck Millipore 公司，批号: 17-371) 。2 主要仪器PL 203 电子天平( 梅特勒-托利多仪器上海有限公司) ; TGL 16 超低温离心机( 长沙平凡仪器仪表有限公司) ; TU 1901 紫外分光光度计( 上海精密仪器仪表有限公司) ; DYY 6C 电泳仪电源( 北京市六一仪器厂) ; 聚丙烯酰胺凝胶电泳( WesternBlotting 电泳，北京市六一仪器厂) ; 转膜装置( 美国Bio-ＲAD 公司) ; wH 1 微型旋涡混合器( 上海沪西分析仪器厂) ; 十万分之一电子天平( 美国MettlerToledo 公司) ; 10 μL，100 μL，200 μL 和1 000 μL 移液枪( 美国Ｒainin Instrument 公司) ; MDF U3386S低温冰箱( 日本三洋公司) ; SB2200 T 超声波清洗器( 上海必能信超声有限公司) ; Model680 酶标仪( 日本Bio-ＲAD 公司) ; C6 流式细胞仪( 美国BD Accuri公司) ; Odyssey 双色红外荧光成像系统( 美国LI-COＲ 公司) ; UH 100A 超声波细胞粉碎仪( 天津奥特赛恩斯有限公司) 。3 CDPS 的制备及鉴定肉苁蓉生药材，经热乙醇浸泡3 h 后，用纱布过滤，弃滤液。药渣加水煎煮3 次，每次1 ～ 2 h，过滤，合并滤液( 呈棕红色) 。蒸发浓缩后5 000 r·min － 1离心10 min 去沉淀，上清液加2 ～ 3 倍体积的95%乙醇沉淀，4 ℃ 静置24 h，次日，于6 000 r·min － 1( 4 ℃) 离心20 min，收集沉淀。沉淀经水复溶、脱蛋白、透析、冷冻干燥后获CDPS。通过紫外分光光度法测定多糖含量＞ 90%，其余为极少量的几种单糖和低聚糖。4 细胞PC12 细胞株( 北京协和细胞资源中心) 。5 细胞模型建立取对数生长期的PC12 细胞，按照每毫升3 ×104 个的密度接种到96 孔培养板中，每孔0． 1 mL，培养48 h 后，用Aβ25 － 35和CDPS( 50 和150 μg·mL － 1 ) 共同作用48 h，收集细胞进行实验。6 流式细胞术检测凋亡情况用去离子水将10 × Binding Buffer 稀释成1 ×Binding Buffer; 2 000 r·min － 1 ( 室温) 离心5 ～ 10 min，收集细胞; 细胞洗涤: 用4 ℃预冷的1 × PBS 重悬细胞，2000 r·min － 1 离心5 ～ 10 min，洗涤细胞; 加入300 μL 的1 × Binding Buffer 悬浮细胞; Annexin VFITC标记: 加入5 μL 的Annexin V-FITC 混匀后，避光，室温孵育15 min; 上机前5 min 再加入5 μL的PI 染色。在1 h 内，进行流式细胞仪的检测和观察。7 酶联免疫法测定HATs，HDAC2 和BDNF药物处理后，收集PC12 细胞培养液，2 500r·min － 1离心10 min，取上清测试。制作标准曲线，按照试剂盒操作步骤，加入规定体积的检测试剂，避光孵育30 min 后，在酶标仪上测定450 nm 处的吸光度( A) 值并计算HATs，HDAC2 和BDNF 的含量。各实验组设置3 个复孔，实验重复3 次。8 Western Blotting 电泳ＲIAP 缓冲液裂解PC12 细胞，提取核蛋白，BCA法进行蛋白质含量定量。加ＲIAP 缓冲液，将各组蛋白量调整一致。SDS-PAGE 电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部，转移至NC 膜( 100 V，2 h) ，预染蛋白marker 确定蛋白分子量标准位置。用50 g·L － 1 脱脂奶粉封闭1 h。一抗P300 /CBP( 1 ∶ 5 000) ，HADC2( 1∶ 5 000) 和β-actin( 1 ∶ 200) 多克隆抗体分别用封闭液按比例稀释后，4℃孵育过夜，再用TBS 脱色3次，每次10 min。辣根过氧化物标记的山羊抗兔多克隆抗体( 1∶ 5 000) 室温孵育1 h，加入DAB 显色后用Bandscan 分析软件分析条带灰度，进行半定量比较分析，均采用自身灰度值校正，以目的基因的条带灰度与管家基因β-actin 的灰度比值表示蛋白的表达水平。9 染色质免疫共沉淀( ChIP)在装有20 mL 生长培养基的150 mm 培养皿中培养PC12 细胞，长到80% ～90%的密度，用1%甲醛在室温下搅拌15 min。加入甘氨酸( 125 mmol·L － 1 终浓度) 终止固定。在PBS 中洗涤组织并将沉淀悬浮在十二烷基硫酸中( SDS) 裂解缓冲液( 50 mmol·L － 1Tris，10 mmol·L － 1 EDTA，1 % SDS) 。以6 × 10 s 条件将染色质在冰上超声处理，获得约200 ～ 400 bp 的碎片。将1 /10 的裂解物保存为input 用于ChIP 标准化。每组加入针对乙酰化组蛋白H3 或HDAC2抗体的多克隆抗体样品并在4 ℃下温和混合温育过夜，并使用兔或小鼠IgG 作为阴性对照。将免疫复合物与磁珠( life technologies) 一起孵育4 ～ 6 h，然后依次用150 mmol·L － 1 NaCl 低盐缓冲液和500 mmol·L － 1 NaCl 高盐缓冲液洗涤，重悬浮于含0． 1 mol·L － 1NaHCO3的120 mL 1%SDS 中，在65 ℃温育过夜。解交联样品用ＲNase 和蛋白酶K( 美国Sigma-AldrichChinese Journal of NewDrugs2018,27(12)处理，并通过QIAquick PCＲ 纯化试剂盒纯化DNA( Qiagen) 。对免疫沉淀的DNA 样品进行定量实时PCＲ。PCＲ 进行靶基因的转录控制区的片段扩增( 约200 bp) 。引物设计如下: bdnf 外显子IV( 5'-TCAGGAGTACATATCGGCCACCA-3'，5'-GTAGGCCAAGTTGCCTTGTCCGT-3') GAPDH ( 5'-AGACAGCCGCATCTTCTTGT-3'， 5'-CTGCGGGAGAAGAAAGTCAG-3') 。MTT 法结果见表1。10 统计学处理所有数据均以珋x ± s 表示。采用SPSS 软件进行统计分析，多个实验组比较采用单因素方差分析。P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。结果1 CDPS 对Aβ25 － 35诱导损伤的保护作用结果显示，Aβ25 － 35作用细胞48 h 后，细胞存活率已降低为( 42． 91 ± 4． 59) %，与对照组比较差异具有统计学意义( P ＜ 0． 05 ) 。阳性药人参皂苷( GSrd) 对细胞有保护作用，与模型组比较差异具有统计学意义( P ＜ 0． 05) ; CDPS( 50 和150 μg·mL － 1 )对于AD 模型细胞均有保护作用，并且有剂量依赖性，与模型组比较差异具有统计学意义( P ＜ 0． 05) 。2 CDPS 对于损伤细胞凋亡情况的影响2． 1 流式细胞术检测细胞凋亡率由图1 可知，正常组的细胞凋亡率为0． 0%，均为活细胞; 与正常组相比，模型组的细胞凋亡率明显上升( 33. 7%) ，差异有统计学意义( P ＜ 0. 05 ) ，说明Aβ25 － 35引起PC12 细胞的凋亡; 与模型组比较，给与GSrd 后，细胞凋亡率明显降低到( 0． 8% ) 。给与CDPS( 50 和150 μg·mL － 1 ) 组干预后，明显降低了细胞的凋亡率，且有剂量依赖性，分别为18． 1% 和12． 1% ，表明CDPS 能抑制Aβ25 － 35诱导PC12 细胞的凋亡，结果见表2。2． 2 CDPS 对于PC12 细胞中HATs 和HDAC2 含量的影响结果显示，与HATs 活性模型组相比，空白对照组显著降低; HDAC2 活性模型组相比空白对照组显著升高; 给与GSrd 后HATs 活性显著升高，HDAC2 活性显著降低。给与CDPS( 50 和150 μg·mL － 1 ) 干预后，与模型组相比HATs 活性显著升高，HDAC2 活性显著降低，且有剂量依赖性。说明Aβ25 － 35诱导PC12 细胞的凋亡过程中组蛋白乙酰化修饰参与其中，HATs 和HDAC2 的酶活性变化对PC12 细胞存活产生了影响，结果见图2。3 CDPS 组PC12 细胞中P300 /CBP 和HDAC2 蛋白表达的影响P300 /CBP 是目前发现的与学习记忆相关的HAT，HDAC2 是公认的与学习和记忆相关的HDAC。本研究中采用Western Blot 分析各组细胞中P300 /CBP 和HDAC2 的表达情况。结果显示，与空白对照组相比模型组P300 /CBP 表达量降低( P ＜ 0. 05) ; 给与GSrd 后P300 /CBP 表达增加( P ＜ 0. 05) ; 给与CDPS( 50 和150 μg·mL － 1 ) 干预后，P300 /CBP 表达增加( P ＜ 0. 05) ，且有剂量依赖性。结果与酶活性检测结果一致( 见图3) 。4 CDPS 组PC12 细胞中BDNF 分泌的影响BDNF 对神经元的存活、分化、生长发育起重要作用，防止神经元受损伤死亡、改善神经元的病理状态、促进受损伤神经元再生及分化等生物效应。为了探究CDPS 对Aβ25 － 35诱导PC12 细胞凋亡的保护机制。我们用ELISA 法检测各组细胞培养基中BDNF蛋白分泌量。结果显示，与空白对照组相比模型组BDNF 分泌减少( P ＜ 0． 05) ; 给与GSrd 后BDNF分泌增加( P ＜ 0． 05) ; 给与CDPS ( 50 和150 μg·mL － 1 ) 干预后，BDNF 分泌增加( P ＜ 0． 05) ，且有剂量依赖性。说明CDPS 介导的神经保护作用随着BDNF 分泌增加而增强，结果见表3。5 CDPS 对于PC12 细胞H3 乙酰化水平的影响有研究表明BDNF 的分泌受到组蛋白乙酰化修饰影响。为了确定本研究PC12 细胞中BDNF 的组蛋白乙酰化修饰是否受到Aβ25 － 35的影响，我们采用染色质免疫共沉淀法来分析各组细胞中AC-H3 和HDAC2 水平。ChIP 分析显示在Aβ25 － 35诱导后，BDNF 的外显子IV 的HDAC2 水平( 图4A) 和H3乙酰化水平( 图4B) 显著降低，这与BDNF 表达的下调一致( 见表3) 。给与CDPS 后BDNF 外显子IV区H3 乙酰化水平增加( 图4B) ，与模型组相比有显著性差异。GSrd 组BDNF 外显子IV 区H3 乙酰化水平增加与文献［17］报道一致。通过以上结果可知CDPS 介导的神经保护作用过程伴随着BDNF 分泌的显著增加，而BDNF 分泌受到Ac-H3 和HDAC2调控，见表4。讨论Aβ 异常产生与沉积是AD 的早期事件和核心病理改变。介导细胞凋亡［18］、炎症级联反应［19］、氧化应激、线粒体功能障碍等毒性效应，加剧AD 的发展。体内、体外研究均显示，Aβ25 － 35具有与Aβ1 － 42类似的凝聚性质及毒性作用，能够引起神经元损伤、学习记忆能力受损，且因其具有易于溶解等优势，被广泛用于Aβ 损伤及毒性作用的研究［20］。MTT 结果表明，Aβ25 － 35浓度20 μmol·L － 1，作用时间48 h 条件下培养的PC12 细胞会出现明显的凋亡特征，可作为较理想的AD 细胞模型。V-FITC 及PI 双染流式细胞技术检测不同实验组PC12 细胞的凋亡情况。Aβ25 － 35处理后的细胞凋亡率明显增高，给予CDPS 后，PC12 细胞的凋亡率明显下降，且有剂量依赖性。表明CDPS 具有抑制细胞凋亡的作用，因此本研究细胞模型可以作为评价CDPS 对Aβ25 － 35诱导PC12 细胞损伤保护作用的理想细胞模型。GSrd 是从天然植物中分离出的单体成分，具有活跃的生物活性。研究［21］ 表明GSrd 能够降低PC12 细胞内活性氧簇水平、通过减少丙二醛含量、增强抗氧化酶的活性来抵抗过氧化氢诱导的细胞毒性损伤。体内实验发现GSrd 可通过重建Ac-H3 和HDAC2 之间的平衡，增加BDNF 表达，从而改善、促进神经元存活，改善慢性脑损伤［17］。CDPS 与GSrd类似，均从补益类天然植物中分离得到，且均有神经营养和神经保护作用。研究发现，CDPS 可通过增加Bcl-2 的表达，降低caspase-3 的表达，抑制海马神经元凋亡，改善AD 模型大鼠的学习记忆能力。本课题组前期实验结果［22 － 26］表明，CDPS 可显著提高东莨菪碱所致学习记忆障碍模型小鼠突触素生长相关蛋白43( GAP-43) 的表达，增多海马区突触数量，增强神经突触的可塑性，缓解学习障碍表现。并观察到CDPS 可增加D-半乳糖所致衰老小鼠脑组织SOD 活性，减少MDA 含量，改善脑组织神经元损伤，并激活cAMP/PKA/CＲEB 信号通路，以改善学习记忆障碍。因此本研究选GSrd 作为阳性药。本研究探索了CDPS 介导的BDNF 上调机制。研究表明BDNF 在突触可树性、神经发生及细胞存活中的重要作用［27］。但是这些调控机制慢慢向表观遗传机制退让，通过表观遗传修饰影响基因的表达在多种人类疾病中发挥重要作用。组蛋白赖氨酸残基在组蛋白乙酰基转移酶HATs 的作用下发生乙酰化，从而使染色质结构松解，暴露转录因子与DNA 作用的结合位点，启动转录机制，而组蛋白去乙酰化酶HDAC 则与转录抑制相关。HDAC2 是大脑中最高度表达的Ⅰ类HDAC 之一［28］。HDAC2 的升高可伴随人类神经变性大脑的认知衰退［28 － 29］，并且HDAC2 也负面调节健康小鼠脑中的记忆和突触可塑性［30 － 31］。本研究揭示AD 细胞模型中H3 乙酰化水平显著降低、HDAC2 显著增加的机制。这一研究说明BDNF 受到表观遗传途径的调控。目前，通过使用非选择性HDAC 抑制剂在逆转认知缺陷方面的旨在增加组蛋白乙酰化的药理学治疗中已取得可喜的结果［32 －33］。本研究显示AD 细胞模型中HDAC2 水平升高，BDNF 分泌量减少; 应用GSrd 阻断HDAC2 会增强BDNF 的表达，在给与CDPS 处理后结果相似。基于以上体外试验，本课题组将进一步对CDPS 对AD 病理状态下体内组蛋白乙酰化水平的影响进行研究，并进行后续实验。

多糖类是重要的生物高分子化合物, 我国多糖类的研究虽然起步较晚, 但在近几十年来随着膜学说及免疫物质的研究, 逐渐发现多糖类在生命现象中的重要性, 发现多糖类属非细胞毒物质, 有着多方面的生物活性, 关于多糖的研究得以重视起来。作者对中药肉苁蓉中的苁蓉多糖成分进行了系统的研究, 以期为多糖类的研究作出贡献。1 　材料及仪器肉苁蓉:由内蒙古阿拉善药材公司提供, 无水葡萄糖对照品:中国药品生物制品检定所提供, 红外分光光度计:599 -BPE, 紫外分光光度计:UV -260岛津, 真空恒温干燥箱:YB —IA 天津。2 　方法及实验结果2.1 　提取分离和精制取肉苁蓉剪碎加水小火煮沸2 小时, 过滤, 残渣加水煮沸2小时过滤, 合并提取液。用Sevag法〔1〕去蛋白。取提取液浓缩后加乙醇反复多次沉淀, 用H2O2 在pH =8〔2〕的条件下脱色,得灰白色物质。依次用无水乙醇、乙醚洗涤, 置真空干燥器中减压干燥, 得灰白色干燥物。2.2 　理化分析( 1) 理化性质:苁蓉多糖精品呈灰白色粉末状, 溶于水, 尤易溶于热水。不溶于高浓度的乙醇及丙酮、乙酸乙酯、氯仿、乙醚等有机溶剂。苁蓉多糖的水溶液为透明的粘稠状, 碘—碘化钾反应为阴性, 茚三酮反应为阴性, 蒽酮反应及硫酸—咔唑反应为阳性。( 2) 纯度鉴定:采用硅胶薄层色谱法, 用浓氨水:正丁醇:水( 40∶60∶5) 展开, 苁蓉多糖只有一个斑点, 纸层析法用新华滤纸点样展开约8 小时, 取出后吹干, 用0.5 %甲苯胺蓝乙醇液染色, 再用95 %的乙醇漂洗至背景无色。结果表明为单一斑点。( 3) 紫外光谱分析:将苁蓉多糖配成500μg/ml 的溶液, 用紫外分光光度计在200 ～ 400nm扫描, 未发现有核酸( 260nm)和蛋白质( 280nm) 特征吸收。( 4) 红外光谱分析:取苁蓉多糖2mg, KB1 压片, 红外光谱扫描, 特征吸收分别为:3500cm, 3000cm, 1600cm,1400cm, 1100cm, 890cm 为β —吡喃糖苷健特征吸收峰。( 5) 含量测定:采用硫酸—蒽酮法〔3〕比色, 无水葡萄糖为对照品, 测得多糖含量为69.64 %, 硫酸—咔唑法测定葡萄糖醛酸含量为18.12 %。总糖含量为87.76 %, 其余为水分及灰分, 不含蛋白质和核酸。讨论:报告了从苁蓉中提取出灰白色的多糖成分以及多糖的理化性质, 由于条件所限所得苁蓉多糖的纯度不够好, 这将是作者努力的方向。同时苁蓉多糖的单糖组成以及连结方式将是作者继续关注的问题。参考文献1　沈阳药学院学报.第2 卷第3 期,1985, 234 ～ 2402　中国科学院上海药物研究所.中草药有效成分提取与分离.上海科学技术出版社, 1983 415～ 4203　袁晓等.植物生理生化实验.高等教育出版社, 1983

[摘　要]　目的: 研究肉苁蓉多糖( CDPS)的免疫活性作用及其体外免疫调节作用的机制。方法: 采用噻唑蓝比色法(M T T)观察CDPS体外对ISO、DEX、TN F-β 抑制小鼠胸腺淋巴细胞增殖的调节作用;采用流式细胞仪进行了CDPS对细胞周期及其胞内Ca2+ 的测定。结果: CDPS在较高浓度能对抗ISO、DEX对淋巴细胞增殖的抑制作用,及对抗高浓度TN F-β 对淋巴细胞增殖的抑制作用,协同低浓度TN F-β 对淋巴细胞的增殖促进作用; 100 μg /m l、200μg /ml CDPS均能使分裂期的细胞明显增加; 较高浓度( 100μg /ml)的CDPS对小鼠胸腺细胞内Ca 离子浓度有明显的促进升高作用。结论: CDPS能促进细胞进入分裂期,并推断其对小鼠胸腺淋巴细胞增殖的促进作用与其促进小鼠胸腺淋巴细胞内钙释放有关。[关键词]　肉苁蓉/药理学; 多糖类/药理学; 淋巴细胞增殖; 细胞周期; Ca2+肉苁蓉(Cistanche Deserticola Y C Ma )是我国稀有的名贵中药材,在《神农本草经》中被列为上品,具有益精血、补肾助阳、润肠通便、延缓衰老之功能。近代药理学研究表明,它能提高机体免疫功能,促进DN A合成, 增强体力,提高智力,具有明显的抗衰老作用[1 ]。作者研究了肉苁蓉的一种多糖组分CDPS对小鼠淋巴细胞免疫功能的调节作用。1　材料与方法1. 1　试剂与药品　RPMI 1640培养基: GIBCO公司; HEPES: FARCO公司; L-谷氨酰胺:上海东风试剂厂;青霉素、链霉素: 华北制药厂;刀豆球蛋白( ConA)、M T T: SIGMA公司; 植物血凝素( PHA): 上海市医学化验所; 异丙肾上腺素( ISO ): 上海市天丰药厂; 巯基乙醇: Fluka公司; 新生小牛血清: 四季青生物工程公司; 地塞米松( DEX )为浙江大学医学院附属第一医院马量医师赠送; 肿瘤抑制因子( TN F)为浙江大学生命科学院细胞教研室余越汉老师提供;其余试剂均为国产分析纯。1. 2　实验动物　ICR小鼠,雄性, 6～ 8周龄,体重18～ 20 g , 22只,购于浙江省实验动物中心。1. 3　肉苁蓉多糖的提取　肉苁蓉多糖由本室自行提取[2 ]: 生药肉苁蓉粉碎后,经热乙醇浸渍,沸水抽提, 乙醇沉淀,中性酶结合Sev ag 法脱蛋白,阴离子DEAE-Sephadex A-50交换层析, Sephacryl S-200凝胶过滤层析,得到肉苁蓉多糖( CDPS)单一组分。干燥保存,临用前用不完全RPMI1640配成一定浓度,超滤灭菌。1. 4　脾、胸腺淋巴细胞的制备[3 ]　小鼠脱颈处死,无菌取脾或胸腺,经200目钢网过筛,以含5% 新生小牛血清的Hanks液制成单个细胞悬液, 于1500 r /min, 10 min 离心后, 用0. 01mol /L Tris-N H4 Cl低渗液裂解红细胞1 min后,再用Hanks 液离心洗涤,最后将细胞悬浮于含10%新鲜小牛血清的RPMI 1640完全培养液(含2 mmol /L L-谷氨酰胺, 100 mmol /L丙酮酸钠, 1 mmol /L巯基乙醇,临用前加入青霉素100 U /ml和链霉素100μg /ml )中,台盼蓝计数,活细胞> 95% ,调整脾细胞浓度为1×106 /ml,胸腺细胞浓度为4× 106 /ml。1. 5　淋巴细胞增殖反应　按Mo sma nn 法[ 4]改进: 96孔细胞培养板,每孔加入1× 106 /ml脾细胞悬液或4× 106 /ml胸腺细胞悬液100μl及不同浓度的药物100 μl,于5% CO2 , 37℃培养箱中培养72 h,培养结束前4 h,每孔加入MT T ( 5 mg /ml ) 8 μl, 培养结束时每孔吸去150μl上清,加入0. 5 N盐酸异丙醇150μl,于微量震荡器上轻轻震荡使蓝色结晶完全溶解,在酶标仪上测定OD570,每实验点设为三复孔。1. 6　对细胞周期影响的测定[5 ]　24孔细胞培养板,每孔加入4× 106 /ml胸腺细胞悬液1 ml,补加各种试剂及多糖溶液至2 ml,于5% CO2 ,37℃培养箱中培养72 h 后, 1500 r /min,离心15 min,弃上清, 沉淀的细胞加入70% 的乙醇固定, 4℃保存备用。测试时,细胞经PBS洗涤两次, 1500 r /min, 离心15 min,弃上清,加入0. 5 ml 0. 1% RNaseA,于4℃酶解30 min后,50μg /ml溴乙碇避光4℃染色30 min,细胞样品在FACSca n f low cytometer 上检测荧光强度,每一样品收集10000个细胞测试点,数据采用Mul ticycle软件分析。1. 7　细胞内钙离子浓度的测定[6 ]　同上方法取小鼠胸腺细胞,用不完全RPM I1640培养液悬浮,调其细胞浓度至1× 107 /ml。每实验管加入1 ml的胸腺细胞悬液和1μM Fluo-3AM染液5 μl, 25% F-127 5 μl, 于37℃温育30 min后,用不完全RPMI1640洗两次, 1500 r /min,离心10 min,弃上清,沉淀的细胞加不同浓度的多糖和Co nA后在FACScan f low cytometer上检测荧光强度,每一样品收集10 000个细胞测试点,数据采用CELLQU EST软件分析。1. 8　统计学方法用方差分析,细胞周期和钙离子测定采用流式细胞仪自身所带软件分析。2　结　果2. 1　肉苁蓉多糖体外对ISO、DEX、TN F-β 抑制小鼠胸腺淋巴细胞增殖的调节　β -肾上腺素受体的激动剂异丙肾上腺素( ISO)和一类肾上腺皮质激素-地塞米松( DEX )有抑制淋巴细胞增殖的作用, CDPS 在较高浓度( 75、125 μg /ml )能对抗ISO、DEX对淋巴细胞增殖的抑制作用( P < 0. 01)。见图1。肿瘤坏死因子( TN F-β )在高浓度时对淋巴细胞的增殖呈抑制作用,而较高浓度的CDPS ( 125 μg /ml )可以对抗TNF-β 的抑制作用, 且协同低浓度TN F-β 对淋巴细胞的增殖促进作用(图2)。2. 2　肉苁蓉多糖对胸腺淋巴细胞周期的调节　CDPS 25μg /ml、100μg /ml、200μg /ml三个浓度分别作用于小鼠胸腺淋巴细胞72 h后,经FACS 测定细胞内DN A 含量, 根据公式S+ G2G1+ S+ G2× 100%计算增殖指数( PI )。结果表明, 100 μg /ml、200 μg /ml 均能使分裂期的细胞明显增加,两者的增殖指数( 68. 0% , 56. 6% )均明显高于对照组( 44. 6% ) , 其中200μg /ml组略低于100 μg /ml组, 因为在200 μg /ml浓度时,其对细胞的增殖作用已成下降趋势[7 ]。而25μg /ml组的P I 值( 47. 5% )比对照组无明显增高。2. 3　肉苁蓉多糖对小鼠胸腺淋巴细胞内钙离子浓度的作用　实验结果表明,较高浓度( 100μg /ml )的CDPS对小鼠胸腺细胞内Ca 离子浓度有明显的促进升高作用,与对照组相比有显著差异( P < 0. 01) , 且与Co nA具有协同作用( P < 0. 01) ,与作用时间存在一定的效应关系(图3)。3　讨　论肉苁蓉俗称“沙漠人参” ,为列当科植物肉苁蓉的干燥带鳞片的肉质茎,具有补肾阳、益精血、润肠等作用,属于一种能兴奋垂体-肾上腺皮质或有类似肾上腺皮质激素样作用,能调节机体免疫功能的名贵中药。我们先前的研究结果表明, CDPS体外对未经活化或经Con A、PHA活化的胸腺T淋巴细胞均有促进其增殖的作用,结合Con A、PHA是两类T细胞刺激剂,我们认为CDPS是T细胞的免疫佐剂。同时还发现, CDPS较高浓度时可显著提高小鼠脾淋巴细胞分泌IL-2[7 ]。有人研究发现, 重组体TN F体外可引起正常鼠和人T淋巴细胞簇的凋亡,这种作用可潜在地被IL-2、IL-1、IFN-γ、IL-4等抑制[8 ]。地塞米松( DEX)可通过抑制淋巴细胞表达和分泌IL-2,及下调高亲和力的IL-2R生成来抑制淋巴细胞增殖。本实验发现,较高浓度CDPS可对抗高浓度TN F-β 对淋巴细胞增殖的抑制作用,协同低浓度TN F-β 对淋巴细胞的增殖促进作用,且能对抗ISO、DEX对淋巴细胞增殖的抑制作用。这些作用正是通过CDPS促进T淋巴细胞的增殖,并由T细胞自分泌IL-2等细胞因子来完成的。近几年来,人们对植物多糖的免疫药理作用研究较多,但对多糖的免疫调节机理的研究很少,尤其是对多糖作用于淋巴细胞的以Ca2+为第二信使的信号传导途径的研究一直未见报道,本实验进行了这方面的初步研究。胞内信号分子包括cAM P、Ca2+ 、IP3、DG、cGMP等,其中Ca2+ 对细胞有极其重要的生理作用,细胞内Ca2+ 浓度的升高,是淋巴细胞激活和增殖中早期呈现的一个重要现象,这个过程主要发生在细胞受刺激剂激活的最初几十秒到几分钟内。T细胞活化的经典途径是磷脂酰肌醇( PIP2 )代谢。磷脂酰肌醇代谢产物1, 4, 5-三磷酸肌醇( IP3)可通过与内织网上膜受体结合而促使内织网内贮存Ca2+ 释放,提高胞内Ca2+ 的水平,而胞内Ca2+ 浓度的升高可促进N F-AT( nucleic facto r of actived T cell )的生成,后者具有促进IL-2基因表达的作用。实验结果表明,较高浓度( 100μg /ml)的CDPS在作用5、10 min时对小鼠胸腺细胞内Ca2+ 浓度有明显的促进升高作用,且与Co nA具有协同作用。故我们推测, CDPS促进小鼠胸腺淋巴细胞内钙释放, 使胞内钙离子浓度升高而促进了IL-2基因的表达,导致T细胞增殖,正是肉苁蓉多糖对机体调节作用的理论依据之一。Ref erences:[ 1 ]　JIN Xiu-lian, SU Yu-ke (金秀莲、苏玉珂) . 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摘要:目的　观察肉苁蓉多糖( CDPS) 对巨噬细胞的活化作用。方法　采用中性红法测定吞噬活性;Griess试剂法测定NO释放量;L929 细胞法及小鼠胸腺细胞法测定TNF-α及IL-1释放。结果　CDPS在6.25 ～ 50 mg· L-1剂量范围内可剂量依赖性地增强BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红能力和促进NO释放;在2.8 ～ 100 mg· L-1剂量范围内可使正常和免疫抑制的RAW264.7细胞NO释放明显增加;在0.56 ～ 7.2 mg· L-1 或3.6 ～ 10 mg· L-1 范围促进RAW264.7细胞TNF-α或IL-1产生, 均具有良好的量效关系。结论　CDPS可明显提高巨噬细胞吞噬及分泌功能, 活化巨噬细胞。肉苁蓉免疫增强作用可能与此有关。关键词:肉苁蓉多糖;巨噬细胞;吞噬活性;NO;TNF-α;IL-1;植物多糖因其普遍具有的免疫调节作用及其相对低毒的特点引起人们的广泛关注[ 1], 多种证据显示植物多糖发挥免疫调节作用的一条重要途径是活化巨噬细胞, 激活其吞噬活性, 增加NO、TNF-α、IL-1等的分泌以发挥巨噬细胞对肿瘤细胞和微生物的细胞毒作用[ 2] 。肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉( CistanchedeserticolaY.C.Ma)的带鳞片的干燥肉质茎, 具有广泛的药理作用。其水煎物可明显提高巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数[ 3], 但迄今未见肉苁蓉多糖( Cistanche deserticola polysaccharide,CDPS)对巨噬细胞活化报道, 本文较系统的考察了CDPS对巨噬细胞活化相关指标的影响。1　材料与方法1.1　药品与试剂　CDPS由医科院药植所植化室提供, 多糖含量87%。脂多糖( LPS), 地塞米松( Dex) , MTT均为Sigma公司产品。胎牛血清、RPMI1640培养基、胰蛋白酶均系Gibco公司产品。其它试剂为国产分析纯。1.2　动物与细胞株　BALB/c及C3 H/Hej小鼠( SPF级)均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供, RAW264.7细胞株购于美国ATCC公司, L929细胞株由中国典型培养物保藏中心提供。1.3　仪器　MultiskanAscent酶标仪, 美国ThermoElectron公司产品。雷磁PHS-3B型精密pH计, 上海精密科学仪器有限公司。Napco5410型二氧化碳孵箱, 美国NAPCO。BCN-1360型超净工作台, 北京东联哈尔仪器制造有限公司。XDS-1B倒置显微镜,重庆光电仪器公司。1.4　方法1.4.1　CDPS对BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的影响[ 4] 　按文献[ 5] 法分离培养小鼠腹腔巨噬细胞, 将细胞接种于96孔细胞板, 贴壁后加入不同浓度CDPS(正常对照孔或阳性孔加等体积的培养基或LPS)孵育24 h, 弃上清, 加质量浓度为0.75g· L-1中性红200 μl/孔, 置37℃, 5% CO2 孵箱(后简称孵箱)培养30 min后弃上清, Hanks液200 μl/孔洗3遍, 加细胞裂解液( 1 mol· L-1醋酸与等体积无水乙醇的混合液) 200 μl/孔, 充分振摇3 min,37℃孵育1 h, 在酶标仪570 nm波长处测定吸光度。按下公式计算吞噬增加率/% =(给药孔吸光度-对照孔吸光度) /对照孔吸光度×100%1.4.2　CDPS对BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞NO释放的影响　小鼠腹腔巨噬细胞接种于96孔细胞板中, 贴壁后加入不同浓度CDPS(正常对照孔或阳性孔加等体积的培养基或LPS) , 置孵箱中培养24 h,Griess法[ 5] 测定上清中NO2-的含量, 用以反映NO分泌水平。1.4.3　CDPS对正常及免疫抑制的RAW264.7 细胞NO释放的影响　将RAW264.7细胞按2 ×105个/孔接种于96 孔板, 于孵箱中孵育24 h后弃上清, 每孔按100 μl/孔加无血清DMEM培养基(免疫抑制组DMEM含30 nmol· L-1的Dex) , 孵箱孵育2h后, 正常及免疫抑制细胞均加入100 μl/孔不同浓度CDPS药液, 阳性孔加入100 μl/孔0.02 mg· L-1( 终浓度0.01mg· L-1) LPS, 置孵箱中培养24h,Griess法测定NO分泌水平。1.4.4　CDPS对RAW264.7细胞产生TNF-α和IL-1的影响　将RAW264.7细胞按2 ×105 个/孔接种于96孔板, 于孵箱中孵育24 h后弃上清, 每孔按100 μl/孔加入不同浓度CDPS药液, 阳性孔加0.02mg· L-1 LPS, 继续培养24 h, 收集上清, 分别采用C3 H/Hej小鼠胸腺细胞法[ 6, 7] 及L929细胞法[ 8, 9]测定上清中TNF-α及IL-1。　　TNF-α测定:取对数生长期的L929 细胞, 按2×104 个/孔种于96孔板中, 于孵箱中培养24 h, 按100 μl/孔加入用含0.2 mg· L-1放线菌素D的无血清培养液稀释的待测样品(细胞上清) , 继续培养20h, MTT法测定细胞死亡率。设正常对照组死亡率为0, 其它各组与正常对照组比较, 计算死亡率=( 1-给药组吸光度/正常对照组吸光度) ×100%, 以死亡率表示TNF-α的生物学活性, 死亡率越高表明TNF-α的生物学活性越强, 细胞产生的TNF-α也就越多。　　IL-1测定:将C3 H/Hej小鼠胸腺细胞按2 ×106个/孔接种于96 孔板, 孵箱中孵育24 h后弃上清,按200 μl/孔加入含3 mg· L-1 ConA的无血清培养液稀释的待测样品(细胞上清)后继续培养20 h,MTT法测定细胞增殖率, 设正常对照组增殖率为0,其它各组与正常对照组比较, 计算增殖率=(给药组吸光度/正常对照组吸光度-1) × 100% , 以增殖率表示IL-1的生物学活性, 增殖率越高表明IL-1生物学活性越强, 细胞产生的IL-1也就越多。1.5　统计分析　实验数据采用MicrosoftExcel软件进行t检验, 实验结果采用 x±s表示。2　结果2.1　对BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红和NO释放的影响　结果表明, 6.25 mg· L-1 CDPS可明显提高小鼠腹腔巨噬细胞对中性红的吞噬力及促进NO释放, 且随剂量增高, 作用增强。显示良好的量效关系( Tab1) 。2.2　对正常和免疫抑制的RAW264.7细胞NO释放影响　如Fig1所示, DEX可明显抑制RAW264.7细胞NO分泌, 对正常细胞, NO分泌量降至Griess试剂检测限以下, 而对活化巨噬细胞( LPS刺激)也明显抑制其分泌量。CDPS对正常或抑制状态细胞均有明显促进NO释放作用, 且具明显的量效特征。2.3　对RAW264.7 细胞TNF-α释放影响　0.56mg· L-1 CDPS即可明显增加RAW264.7细胞TNF-α释放, 且随CDPS剂量增加释放量也随之加大, 量效关系明显( Tab2) 。2.4　CDPS对RAW264.7 细胞IL-1 释放影响　3.6 mg· L-1 CDPS即可明显促进RAW264.7 细胞IL-1的释放, 3.6 ～ 10 mg· L-1剂量区间巨噬细胞IL-1释放量明显高于对照组, 且具量效关系( Tab3) 。4　讨论　　巨噬细胞是重要的免疫调节和效应细胞, 通过吞噬杀伤微生物、抗原提呈和分泌多种细胞因子等作用控制机体的炎症反应和免疫应答。植物多糖的免疫调节作用与活化巨噬细胞密切相关[ 2] 。巨噬细胞活化表现为吞噬功能增强, 一些具调节免疫应答的细胞因子合成及分泌增加, 以此对入侵的病原微生物或肿瘤细胞等发挥吞噬或细胞毒作用。已知巨噬细胞可产生NO, 而NO的一个最突出的作用是增强巨噬细胞对抗病毒、细菌、真菌、肿瘤细胞等作用。TNF-α不仅直接参与抗肿瘤作用, 还可调节NK细胞等免疫细胞的活性[ 10] 。IL-1可活化淋巴细胞诱导免疫应答及协同刺激胸腺细胞增生等作用。因此实验选择了以上3种细胞因子作为观察对象。　研究表明CDPS对巨噬细胞的吞噬功能及NO、TNF-α、IL-1的释放呈现明显增强作用, 对免疫抑制的RAW264.7 细胞NO的释放也有明显的促进效果。这些结果显示肉苁蓉的免疫增强作用与其所含多糖的巨噬细胞活化作用密切相关, CDPS可能是肉苁蓉提高免疫力主要有效部位。此外, 我们还注意到, CDPS在促细胞因子释放上存在不同的量效区间, CDPS有效剂量大小依次为NO>IL-1 >TNF-α。巨噬细胞对CDPS促TNF-α生成最敏感这一结果是否与TNF-α可触发其他细胞因子的生成[ 10] 相关值得进一步研究。参考文献:[ 1] 　TzianabosAO.Polysaccharideimmunomodulatorsastherapeuticagents:structuralaspectsandbiologicalfunction[ J] .ClinMicrobiolRev, 2000, 13( 4 ) :523 -33.[ 2] 　PaulsenBS.Plantpolysaccharideswithimmunostimulatoryactivities[J] .CurrOrgChem, 2001, 5( 9 ):939 -50.[ 3] 　何　伟, 舒小奋, 宗桂珍, 等.肉苁蓉炮制前后补肾壮阳作用的研究[ J] .中国中药杂志, 1996, 21 ( 9) :534 -7.[ 4] 　WeeksBA, KeislerAS, MvrvikQN, WarinnerJE.Differentialuptakeofneutralredbymacrophagesfromthreespeciesofestuarinefish[J] .DevCompImmunol, 1987, 11( 1 ) :117 -24.[ 5] 　李　敏, 刘耕陶.双环醇对脂多糖诱导巨噬细胞iNOS蛋白的表达和NF-κB活化的抑制作用[ J] .中国药理学通报, 2006, 22( 12 ) :1438 -43.[ 6] 　李英杰, 齐春会, 赵修南, 等.枸杞糖缀合物和糖链对小鼠巨噬细胞功能的影响[ J] .中国药理学通报, 2005, 21 ( 11) :1304 -8.[ 7] 　沈玉先, 魏　伟, 徐叔云.细胞因子测定[ M] //徐叔云, 卞如濂, 陈　修.药理实验方法学.3 版.北京:人民卫生出版社,2002:1438 -40.[ 8] 　ShahanTA, SiegelPD, SorensonW G, etal, Asensitivenewbioassayfortumornecrosisfactor[J] .JImmunolMethods, 1994, 175( 2 ) :181 -7.[ 9] 　胡　森, 周国勇, 吕　艺, 等.卡巴胆碱对脂多糖刺激巨噬细胞释放炎症细胞因子的影响及其受体研究[ J] .中国药理学通报, 2007, 23( 12) :1575 -9.[ 10] BranellecD, ChouaibS.TNF:antitumoralagentattheborderlinesofimmunityandinflammation[ J] .PatholBiol( Paris), 1991, 39( 3 ) 230 -9.