【简介】肉苁蓉是列当科植物肉苁蓉或苁蓉等的肉质茎供药用。春采后晒干，叫甜苁蓉；秋采人盐水浸渍，晒干的叫咸苁蓉；甜苁蓉或漂去盐质蒸熟的肉苁蓉，又名淡苁蓉，俗称淡大芸。    【功用】肉苁蓉为温润平补之品，能温补肾阳，补益精血，润肠通便。主治肾虚阳痿，腰膝冷痛，筋骨无力及女子不孕，或体虚肠燥便秘等症。        【性味归经】性温，味甘、咸。归肾、大肠经。    【用量用法】常用 10～20克。水煎服，用量宜大，可用至30克。亦可制酒、熬膏作丸用。    【现代研究】肉众蓉含肉苁蓉苷、洋丁香酚苷、海胆苷、胡萝卜苷、生物碱及15种氨基酸和糖类等。    肉苁蓉能降血压，促进唾液分泌，有抗动脉粥样硬化的作用；有调节内分泌，促进代谢，增强记忆作用；本品的无机盐和亲水性胶质类多糖，能提高小肠推进度，缩短排便时间，抑制大肠对水分吸收有显著的作用。可提高机体核糖核酸的含量，能促进生长、增加体重。有雌性激素样作用，能促进女性生殖器官发育。能增强机体免疫功能，使阳虚动物体液免疫功能恢复。    【进补应用】1.虚劳早衰 肉苁蓉30克，精羊肉30克，粳米50克。煮粥常食，有补虚延年之功。    2.男子肾虚精亏，阳痿尿频 肉苁蓉240克，熟地180克，五味子120克，菟丝子60克。研为细末，酒煮山药糊为丸。每次9克，每日2次。久服能温肾壮阳，固摄小便。    3.者年性多尿症 肉苁蓉30克，粳米30克。    共煮粥，食服，每日1次，连服1周。    4.消渴易饥 肉苁蓉、山茱萸、五味子各等份。    共研为细末，炼蜜为丸，如梧桐子大。每服20粒，用淡盐汤送下，每日3次。    5.肝肾不足，筋骨痿弱，腰膝冷痛 肉苁蓉、杜仲、菟丝子、锁阳各250克。共研细末，炼蜜为丸，每次9克，每日2次。    6.便秘 肉苁蓉30克。水煎服，每日 1剂。    适用于年老津枯、产后血虚、热病津伤之便秘。亦可用肉苁蓉10克，决明子10克，蜂蜜适量，开水冲泡，当茶饮用。或用肉苁蓉、黑芝麻各90克，火麻仁45克，当归60克。研为细末，炼蜜为丸，每次9克，每日2次。    7.肾阳虚闭经 肉苁蓉、附子、茯苓、白术、桃仁、白芍各15克，干姜10克。水煎服，每日1剂。    8.肾虚不孕 肉苁蓉30克，鹿茸18克，原蚕蛾4.5克，山药30克。炼蜜为丸，每服10克，每日2次。    【注意事项】本品药力和缓，人药少则无效，故用量宜大，一般用量为15～30克。因能助阳滑肠，故阴虚火旺及大便泄泻者不宜服用，肠胃有实热之便秘者也不宜应用。

肉苁蓉对女性的作用肉苁蓉一直以来似乎只被视为是男人的专品，殊不知肉苁蓉对女性也有很好的作用，肉苁蓉具有的的抗衰老，提高免疫力的功能几乎适应所有人，对妇女和小孩也是补益佳品。历代中医将肉苁蓉视为“养命门、滋肾气、补精血之要药”，因来自西域，肉苁蓉又有“沙漠人参”之称。在历代补肾阳处方中，肉苁蓉使用频度最高的一种药物，而且还对女子不孕、腰膝冷痛、血枯等症也有治疗效果。此外，肉苁蓉抗衰老，提高免疫功能的特性，几乎适合所有人，中小学生每天喝上一点用它作成的淡粥或者汤，也会有助身体健壮。

肉苁蓉的选方收集缓解便秘经验方【组成】焦槟榔30克、牛蒡子10克、生白术30、柴胡15克、肉苁蓉30克。【功效】缓解老年便秘。【用法】400毫升水煮取，早晚温服。将药清洗后用凉水浸泡15分钟，煮开后小火熬20分钟，倒出药水后再加水熬20分钟，将两次的药水混合后一天服用两次即可缓解便秘。【出处】改善便秘的中药方_健康之路20160805王晏美肉苁蓉羊米粥【组成】肉苁蓉10克、薏米15~30克、精羊肉3两、粳米15~30克、精盐、葱白、生姜各适量。【做法】将肉苁蓉、精羊肉洗净细切，用砂锅加水煎煮肉苁蓉40分钟，取汁去渣，放入羊肉、粳米同煮，待煮沸后加入精盐、生姜、葱白、煮为稀粥即可。【功效】除寒湿。早餐或夜宵食用，具有补肾助阳，健脾养胃，润肠通便的功效。适用于肾阳虚所致的阳痿、遗精、早泄，女子不孕。各种习惯性便秘。夜间多尿、尿频、尿痛、遗尿等。【出处】养生堂20170405熊露主任推荐。

肉苁蓉的炮制方法1、肉苁蓉：拣净杂质，清水浸泡，每天换水1-2次（如系咸苁蓉，泡尽盐分），润透，切片（纵切），晒干。2、酒苁蓉：取苁蓉片，用黄酒拌匀，置罐内密闭，坐水锅中，隔水加热蒸至酒尽为度，取出，晾干。（每肉苁蓉100斤，用黄酒30斤）3、 黑豆制：取肉苁蓉用米泔水漂泡3天，每天换水1次，去尽咸味，刮去表面鳞叶，切1.5cm 厚的片；然后取黑豆5kg炒香，分成3份，每次取1份掺水和肉苁蓉用微火煮干，取出至半干，再蒸透后晒干，另取黑豆1份同煮，蒸晒，反复3次，晒干即可， 每肉苁蓉500kg，用黑豆50kg。4、《雷公炮炙论》：凡使（肉苁蓉），先须用清酒浸一宿，至明，以棕刷刷去沙土浮甲尽，劈破中心，去白膜一重如竹丝草样，却蒸，从午至酉出，又用酥炙得所。

肉苁蓉的食用方法泡酒法肉苁蓉50克，淫羊藿100克，好白酒2斤。将前二药洗净浸入酒中封严，10日后饮用，每日3次，每次1小杯。功用：补肾壮阳，治疗肾阳虚的阳痿、宫寒不孕、腰膝酸痛、虚寒带下等症。肉苁蓉药膳:苁蓉羊肉粥煮粥法-1肉苁蓉10克，精羊肉150克，大米100克，生姜3片，葱白2茎，细盐少许。煮粥法-2将苁蓉、羊肉洗净，切细；生姜、葱白洗净，切细;大米淘净。将苁蓉放锅中，加清水适量，文火煮沸后，下大米、羊肉煮粥，待熟时，调入葱白、生姜、细盐等，再煮一、二沸即成，每日1剂。茶饮法将肉苁蓉清洗干净，上锅蒸软，切成薄片，泡茶饮服，每日数次，日用量6~9克为宜。煎汤法肉苁蓉15克，火麻仁12克，炒枳壳9克，升麻3克，瓜蒌仁15克，郁李仁6克，怀牛膝12克。以上七味共煎，50分钟后取汤温服，每日一剂，两煎两服。功用：理气宽肠去浊，补肾降火，滋阴润肠通便。制膏法肉苁蓉500克，锁阳500克，蜂蜜250克。将二味药的饮片洗净，用砂锅煎为浓汁，去渣，再放入蜂蜜熬成膏，然后置陶器中贮藏。每日饭前服，一日两次，每次约4汤匙，用温开水送服。功用：温补肾阳，治肾虚滑精、阳痿、腰膝酸软。煮羹法嫩肉苁蓉150克，山药50克，羊肉100克。将肉苁蓉去鳞用酒洗净后切片，山药、羊肉亦切为片，放锅中加水煮，再加入适量调料，羹成后食用。功用：补肾养肝，用于阳虚血少，治腰痛、畏寒肢冷、阳痿。肉苁蓉熬粥将肉苁蓉15克用砂锅煎制，取汁去渣，然后和精羊肉、粳米一起熬粥，待煮沸后加入精盐、生姜、葱白煮为稀粥，当作早餐或夜宵来吃，不仅对男性肾阳虚所致的阳痿遗精早泄有效，对女子不孕、腰膝冷痛也有不错的作用。（肉苁蓉）肉苁蓉的功效与作用肉苁蓉含有丰富的生物碱、结晶性的中性物质、氨基酸、微量元素、维生素等成分。能补肾阳、益精血，能抑制“阳虚”症状的出现，防止体重减轻。可有效地预防、治疗男子肾虚阳痿、遗精早泄及女子月经不调、闭经不孕等疾病。1、肉苁蓉治虚劳早衰：肉苁蓉30克，精羊肉30克，粳米50克。煮粥常食，有补虚延年之功。2、肉苁蓉治男子肾虚精亏，阳痿尿频：肉苁蓉240克，熟地180克，五味子120克，菟丝子60克。研为细末，酒煮山药糊为丸。每次9克，每日2次。久服能温肾壮阳，固摄小便。3、肉苁蓉治老年性多尿症：肉苁蓉30克，粳米30克。共煮粥，食服，每日1次，连服1周。4、肉苁蓉治消渴易饥：肉苁蓉、山茱萸、五味子各等份。共研为细末，炼蜜为丸，如梧桐子大。每服20粒，用淡盐汤送下，每日3次。5、肉苁蓉治肝肾不足，筋骨痿弱，腰膝冷痛：肉苁蓉、杜仲、菟丝子、锁阳各250克。共研细末，炼蜜为丸，每次9克，每日2次。6、便秘：肉苁蓉30克。水煎服，每日 1剂。适用于年老津枯、产后血虚、热病津伤之便秘。亦可用肉苁蓉10克，决明子10克，蜂蜜适量，开水冲泡，当茶饮用。或用肉苁蓉、黑芝麻各90克，火麻仁45克，当归60克。研为细末，炼蜜为丸，每次9克，每日2次。7、肉苁蓉治肾阳虚闭经：肉苁蓉、附子、茯苓、白术、桃仁、白芍各15克，干姜10克。水煎服，每日1剂。8、肉苁蓉治肾虚不孕：肉苁蓉30克，鹿茸18克，原蚕蛾4.5克，山药30克。炼蜜为丸，每服10克，每日2次。

【摘要】　目的　观察肉苁蓉对小鼠睾丸和附睾的形态学及组织化学的影响。方法　选昆明系雄性小鼠30 只, 随机分为用药Ⅰ 、Ⅱ 组与对照组。用肉苁蓉水煎液( 4g·kg -1·d-1和8g·kg -1·d-1) 灌胃, 对照组用生理盐水灌胃, 三周后处死小鼠, 测定精液中精子数量、活率、运行速度等形态学指标, 以及精浆中果糖含量。组织化学观察睾丸和附睾琥珀酸脱氢酶和非特异性脂酶反应。结果　给药组上述指标均高于对照组。结论　提示肉苁蓉确有壮阳补肾之功效。【关键词】　肉苁蓉;小鼠;睾丸;附睾;形态学;组织化学肉苁蓉列为当科植物肉苁蓉( Cistanche Deseriticola)的带鳞片的肉质茎。是一味名贵的补药, 具有补肾、壮阳、强肝肾、益精气等作用[ 1], 肉苁蓉为历代补肾壮阳处方中使用频率最高的药物, 也是著名的补益药物之一, 仅次于人参[ 2] 。为了进一步探讨肉苁蓉的作用机制, 我们对服药组、对照组小鼠进行了睾丸和附睾的形态学及组织化学的观察。1 　材料和方法1 .1 　材料药物:肉苁蓉产于内蒙古阿拉善, 并经内蒙古药检所鉴定, 符合国家药典规定。按生药∶水=100g∶400ml, 先浸泡30min, 加热煮沸后再用温火煎30min,将药液倒出, 按100g∶200ml 比例重煎。将两次的煎液浓缩至相当于每毫升含生药1g 备用。动物:昆明系小白鼠, 雄性, 30 只, 体重25g -30g 。由扬州大学医学院动物中心提供。1 .2 　方法实验动物随机分为用药Ⅰ 、Ⅱ组, 每组10 只, 灌胃服肉苁蓉水煎液, 日用量分别为4g/kg 和8g/kg 。对照组( 10 只) 灌胃服同容积生理盐水。每日灌服一次, 连续3 周。末次给药24 小时后, 处死动物。1 .2 .1 　显微镜观察　取小鼠附睾[ 3], 置于10ml37 ℃生理盐水中, 适当剪碎, 温浴10min, 得精子悬液, 按白血球计数法记录显微镜下所看到的精子密度( D) 、精子活率(A) 、精子畸形率( T) 和精子运行速度( V) 。1 .2 .2 　果糖含量测定　取小鼠精液采用间苯二酚显色法[ 4], 分光光度计于500nm 波长比色, 用标准果糖经同样处理绘制标准曲线, 测定精液中果糖含量。1 .2 .3 　组织切片观察　取小鼠睾丸和附睾, 用4 %福尔马林固定, 石蜡包埋、切片、HE 染色, 光镜下观察组织学状况。1 .2 .4 　组织化学观察　取小鼠睾丸和附睾, 4 %福尔马林固定, 冰冻切片, 观察琥珀酸脱氢酶SDH 、非特异性脂酶NSE 的变化[ 5] 。2　结果2 .1 　肉苁蓉对精液中精子密度、活率、运行速度及畸形率的影响2 .2 　肉苁蓉对小鼠精液中果糖含量的影响2 .3 　组织形态学观察对照组:睾丸被膜光滑完整, 生精小管横切面可见精原细胞及不同发育阶段的精母细胞、精子细胞、精子4 ～ 5 层排列有序, 组成多种形态的生精上皮图像。支持细胞可见, 形态正常。睾丸间质中细胞较少, 少数间质细胞呈成纤维细胞样状态, 胞质中空泡增多, 染色浅, 有脂滴和色素积聚。生精小管周围基膜厚约6 ～ 8um( 图1) 。用药组:生精小管界膜完整, 厚约10 ～ 14um, 其间存在有平滑肌样细胞。生精小管外形较规则, 各级生精细胞有序排列, 约6 ～ 8 层。精原细胞位于基底部, 染色质呈细粒状, 染色深, 核中可见1 -2 个浅染区, 核仁明显。初级精母细胞数量增多, 体积大,直径约17um。精子外形呈蝌蚪状, 头朝向基底膜,染色深。睾丸间质细胞成群分布, 数量增多, 血管丰富( 图2) 。2 .4 　肉苁蓉对小鼠睾丸和附睾的琥珀酸脱氢酶(SDH) 、非特异性脂酶(NSE) 的影响2 .4 .1 　琥珀酸脱氢酶( SDH) 　各级生精细胞胞质中均有SDH 反应, 其中以精原细胞较强, 间质细胞的反应极强( 表3) 。附睾管上皮细胞内SDH 阳性颗粒散在分布, 以核上区较多( 见图3 、4) 。用药组SDH 反应强于对照组( 见图4) 。2 .4 .2 　非特异性脂酶( NSE) 　睾丸和附睾均有阳性反应颗粒, 尤以睾丸间质细胞和支持细胞呈强阳性。用药组附睾管上皮细胞基底面阳性颗粒增多( 见图5 、6, 见表3) 。3　讨论本实验用肉苁蓉水煎液, 分别以4g/kg 和8g/kg灌胃雄性小鼠2 ～ 3 周后, 小鼠精子数量、活率明显增多, 精子运行速度增快, 而精子畸形率有所下降。组织形态学观察, 用药组睾丸生精功能增强, 附睾管的微环境得到改善, 果糖含量增加。组织化学研究表明, SDH 、NSE 反应呈强阳性。精子发生是一个多时相的复杂过程, 其中包括精原细胞的有丝分裂、精母细胞的成熟分裂和精子细胞的变态三个阶段。每个阶段均有其特殊的代谢类型。生精小管中各级生精细胞的分裂和精子发生需要足够的营养物质及内分泌激素的调节。祖国传统医学认为, 肉苁蓉具有较好的补肾壮阳作用, 则可呈现雄性激素和促性腺激素样作用, 以调节内分泌腺轴的功能[ 6] 。雄激素是精子发生过程中必不可少的激素。附睾是精子进一步成熟发育和分化的微环境, 精子在此过程中依赖于附睾上皮的协同作用, 上皮细胞的分泌、吸收和物质转运活动主要是调节管腔内适于精子发育和分化以及储存和静息的微环境。精浆中果糖的含量是反映附睾功能的重要成份, 用药组果糖含量明显高于对照组。SDH 属于琥珀酸氧化酶系统的酶, 在线粒体内排列成链, SDH 是此系统的第一个酶, 存在于所有有氧呼吸的细胞内,和线粒体膜牢固结合, 是脱氢酶中最重要的酶, 在组化反应中常用来反映三羧酸循环的情况而成为标志酶。NSE 活性与胆固醇的水解和甾体合成有关, 常用来衡量睾丸间质细胞的机能[ 7] 。用药组睾丸和附睾中SDH 、NSE 强阳性反应的药物数明显高于对照组, 证明肉苁蓉确能促进睾丸生精功能、改善附睾的微环境。为肉苁蓉补肾壮阳作用的机理提供了可靠的形态学依据。参　考　文　献1 .李时珍.本草纲目.北京:人民卫生出版社, 1977 :727～ 728 .2 .黄保民, 李新吾.抗老益寿古方药物研析.湖南中医学院学报, 1987;2( 7) :1～ 2.3 .李仪奎主编.中药药理实验方法学.上海:上海科技出版社, 509～ 511.4.罗建华主编.不孕症实验诊断技术.学林出版社, 1994:44～ 46 .5.陈啸梅.组织化学手册.北京:人民卫生出版社, 1982 :130,224 .6.何伟, 舒小奋, 宗桂珍.肉苁蓉炮制前后补肾壮阳作用研究.中国中药杂志, 1996 ;21( 9) :534～ 539.7.王一飞, 吴竟梅, 仇一玄.衡量间质细胞机能的组织化学指标.细胞生物学杂志, 1980;2( 4) :27～ 30.

【摘要】综述肉苁蓉对生殖系统影响的研究进展。研究证明肉苁蓉可促进性激素分泌或表现性激素样作用，对生精功能、精液质量等有很好的保护作用，能有效改善肾功能，对胚胎发育也有一定的促进作用，表现出明显的促进生殖作用。【关键词】肉苁蓉; 生殖; 药理作用; 综述肉苁蓉( Herba Cistanche) 是列当科植物肉苁蓉的带鳞片的干燥肉质茎，别名大芸、寸芸、苁蓉、金笋，具有悠久的药用历史。肉苁蓉主产于我国内蒙古、新疆、甘肃、青海和宁夏等地，是我国西北干旱地区特有的沙生濒危药材，素有“沙漠人参”之美誉。为了阐明肉苁蓉的化学基础，国内外学者对肉苁蓉的有效成分进行了深入系统的分析研究，目前已分离并鉴定了多种有效化学成分，主要包括苯乙醇苷类、环烯醚萜类及木脂素类，此外还含有十多种氨基酸、糖类、维生素及多种微量元素。肉苁蓉，微温，味甘咸，入肾经、大肠经，有温补肾阳、补益精血、润燥通便之功效，用于治疗肾阳亏虚、精血不足、腰膝冷痛、遗精、早泄、宫冷带下、不孕、便秘等。《药性论》称肉苁蓉益髓，悦颜色，延年，治女人血崩，壮阳，大补益，主赤白下。《本草经疏》称肉苁蓉，气本微温，为滋肾补精血之要药，治老人便燥闭结，久服有益肝、肾补精血之功效［1］。肉苁蓉是历代补肾壮阳和增力处方中使用频度最高的药物之一。大量医学实践及研究证明，肉苁蓉疗效显著，属滋补类中药中的珍品。近年来，肉苁蓉的研究、开发及利用引起了中医药研究工作者的广泛关注，已成为中医药领域的研究热点之一。本文就近年来肉苁蓉及其有效活性成分对生殖系统的影响做一综述，以资参考。1 对性激素的影响大量研究表明，肉苁蓉可促进性激素分泌或表现性激素样作用。利用转基因酵母法对肉苁蓉进行检测，发现肉苁蓉有较高的雌激素活性［2］。赵丕文等［3］通过研究肉苁蓉对小鼠子宫发育的影响，探讨其雌激素样作用。结果发现，灌胃肉苁蓉可使小鼠血清雌激素( E2) 和黄体生成素( LH) 含量增高，卵泡刺激素( FSH) 含量降低。肉苁蓉可显著提高小鼠血清雌激素水平，其作用机制可能是由于肉苁蓉的某些活性化学成分引起LH 的分泌量增加，其具体作用途径目前仍不清楚。此外，FSH 的分泌量并未升高，推测随着实验时间的延长，增高的小鼠血清雌激素水平可能反馈性抑制LH 的分泌，使LH 的分泌水平最终下降。王琳琳等［4］利用荧光素酶报告质粒法和雌激素受体竞争性结合实验，评价肉苁蓉中主要活性成分松果菊苷及毛蕊花糖苷的雌激素样作用。结果发现，松果菊苷、毛蕊花糖苷均能有效地结合雌激素受体EＲα、EＲβ，上调雌激素应答元件( EＲE) 的荧光素酶活性、发挥雌激素作用，表现出SEＲMs 活性; 松果菊苷、毛蕊花糖苷还能和雌二醇竞争性地与雌激素受体结合，从而拮抗雌二醇对EＲE 荧光素酶活性产生的上调作用。由此可见，松果菊苷、毛蕊花糖苷是通过与雌激素受体EＲα、Erβ 结合而发挥雌激素作用［4］。2 对生精功能的影响研究证明，肉苁蓉对生精功能、精液质量有很好的保护作用。肉苁蓉水煎液可显著增加小鼠精子密度、精子活率，加快精子运行速度，降低精子畸形率; 改善小鼠睾丸组织形态，使生精小管形态规则，各级生精细胞排列紧密有序，睾丸间质细胞数量明显增加，血管丰富，睾丸生精功能增强，附睾管的微环境得到显著改善，果糖含量增高; 睾丸及附睾内琥珀酸脱氢酶( SDH)和非特异性脂酶( NSE) 均呈强阳性反应［5］。雷公藤多苷可明显增加小鼠精子畸形率，降低配对雌鼠怀孕率，降低睾丸脏器指数，降低尿17-羟皮质醇( 17-OHCS) 及睾酮( T) 水平，升高尿HCG 水平，下调小鼠Y 染色体微缺失的相关基因Dzip1 的表达水平，上调生殖细胞凋亡相关基因Fas 及原癌基因c-jun 的表达水平，上调信号转导相关基因Wnt4 表达水平; 经肉苁蓉干预后，各项指标及相关基因的表达均有不同程度的改善，说明肉苁蓉可以有效地拮抗雷公藤多苷所致的雄性小鼠生殖系统损伤，对雷公藤的生殖毒性具有预防作用［6-8］。肉苁蓉中重要的活性成分肉苁蓉苯乙醇苷可使环磷酰胺致生精障碍模型小鼠的精子密度、精子存活率明显升高，精子畸形率明显降低，睾丸组织匀浆中睾酮水平升高，睾丸生精上皮细胞层数增加，层次清晰，各级生精细胞排列紧密、整齐。实验证明，肉苁蓉苯乙醇苷可以拮抗环磷酰胺所致的小鼠生精障碍，其作用机制可能与肉苁蓉提高睾酮水平有关［9］。氧化损伤可以通过破坏精子细胞膜结构，损伤精子DNA 等多个途径影响精子功能。大量实验研究证明，肉苁蓉提取物及其活性成分有较强的抗氧化损伤作用，对超氧负离子自由基、羟自由基均有一定清除作用［10-13］。李刚等［14］ 利用FeSO4 /H2O2生成活性氧( ＲOS) 的方法，制作大鼠精子氧化损伤模型，研究肉苁蓉提取物对精子膜结构及功能氧化损伤的拮抗作用。结果显示，ＲOS 可以造成大鼠精子膜结构及功能的明显损伤，降低精子悬液T-SOD 活力，增高MDA 含量，降低精子膨胀率及精子存活率。肉苁蓉提取物则可提高精子悬液T-SOD 活力，降低MDA 含量，对ＲOS 所致大鼠精子膜的氧化应激损伤具有不同程度的拮抗作用，可有效减轻精子膜脂质过氧化，起到有效的抗氧化作用，对精子膜结构及功能均具有一定的保护作用［14］。梁华伦等［15］体外建立精子氧化损伤模型，并用肉苁蓉苯乙醇苷对其进行保护处理，利用拉曼光谱技术，检测受到氧化损伤的精子核部DNA 的变化，研究肉苁蓉苯乙醇苷对精子氧化损伤的拮抗作用。结果表明，氧化损伤精子模型中精子细胞核拉曼光谱强度及光谱峰位移均发生显著变化，采用肉苁蓉苯乙醇苷进行保护后，这种变化均得到明显抑制，实验证明肉苁蓉苯乙醇苷一定程度上可以拮抗强氧化剂对人精子DNA 造成的氧化损伤作用。肉苁蓉总苷对受60 Coγ 射线照射后小鼠睾丸组织超微结构的损伤有一定的保护作用，其保护机制可能是肉苁蓉总苷提高了SOD 活性，降低了脂质过氧化对小鼠睾丸组织的损伤作用，也可能是通过促进DNA、ＲNA 和蛋白质的合成，来促进睾丸超微结构及功能的恢复［16］。3 对“肾阳虚”模型的影响肉苁蓉的补肾功效也十分明确。马晶晶等利用氢化可的松建立小鼠肾阳虚模型，研究德赢vwin登录 有效成分类叶升麻苷的补肾壮阳作用。结果显示，类叶升麻苷可使阴茎勃起潜伏期缩短，精子数量增加，性器官脏器系数明显提高，睾丸组织形态结构得到明显改善。说明德赢vwin登录 的有效成分有明显的补肾壮阳作用［17］。肉苁蓉醇提物可以减轻激素所引起的肾上腺皮质萎缩，肾小管上皮细胞肿胀，对肾功能具有保护作用［18］。大量研究表明，肉苁蓉有雌激素作用，肉苁蓉提取物可以通过降低雌二醇含量，升高促性腺激素、睾酮水平而发挥补肾助阳作用［19］，其机制还有待于进一步实验研究。4 对胚胎发育的影响在早期胚胎体外培养中适当添加中药可促进胚胎的体外发育。肉苁蓉总苷、多糖均有较强的抗氧化作用，可以有效对抗胚胎发育过程中产生的氧自由基，促进早期胚胎的发育。李玉芳等利用猪体外受精的胚胎研究肉苁蓉对早期胚胎发育的影响，实验证明培养液中添加肉苁蓉可以明显提高囊胚率［20-21］。谢安等选取小鼠早期胚胎，研究肉苁蓉对小鼠早期胚胎体外发育的影响，结果显示添加肉苁蓉组桑葚胚率与囊胚率较空白组明显提高，表明肉苁蓉能够有效促进早期胚胎体外发育，其机制可能与肉苁蓉降低胚胎生长分裂过程中产生的NO 浓度、消除自由基有关，肉苁蓉可有效调节胚胎发育的微环境，从而显著提高胚胎的体外发育率［22］，但具体机制还需进一步研究。5 小结肉苁蓉作为我国传统的名贵中药，是补肾阳、益精髓的首选药物之一。肉苁蓉的有效成分和药理作用已成为中医药工作者研究的热点，尤其是其促进生殖方面的药理作用及机制的研究已取得一定的成果。肉苁蓉对生殖系统影响的机制可能涉及多个环节，详细机制仍需要进一步进行系统研究。随着肉苁蓉有效成分及药理作用研究的不断深入，可望在不久的将来为生殖功能障碍类疾病提供有效的治疗途径。参考文献:［1］ 胡佳琦，冯佳媛． 肉苁蓉的化学成分和药理作用［J］． 中医临床研究，2012，4( 15) : 26-28．［2］ 陈春，张淑丽． 红花等10 种中药的雌激素活性研究分析［J］． 中国医药指南，2011，9( 14) : 296-297．［3］ 赵丕文，王大伟，王玲巧，等． 用小鼠子宫增重法筛选淫羊藿等10 种中药雌激素样作用的实验研究［J］． 北京中医药大学学报，2006，29( 10) : 686-689．［4 ］ 王琳琳，李薇，宋新波，等． 肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的植物雌激素活性研究［J］． 天然产物研究与开发，2015，26 ( 3 ) :377-380．［5 ］ 王德俊，盛树青，梁虹． 肉苁蓉对小鼠睾丸和附睾形态学及组织化学的影响［J］． 解剖学研究，2000，22( 2) : 101-103．［6 ］ 董飞侠，李颉，黄迪，等． 雷公藤多苷对小鼠生殖功能的影响及肉苁蓉的干预作用［J］． 上海中医药杂志，2009，43( 8) : 64-66．［7 ］ 张昕贤，张新志，林日阳，等． 从内分泌激素改变研究补肾中药对雷公藤小鼠生殖功能的干预作用［J］． 辽宁中医药大学学报，2012，14( 2) : 37-40．［8］ 张昕贤，黄迪，刘楠楠，等． 雷公藤多苷诱导小鼠睾丸生殖相关基因异常表达及补肾中药的干预作用［J］． 中华男科学杂志，2012，18( 5) : 466 － 471．［9］ 赵东海，张磊，张艳，等． 肉苁蓉苯乙醇苷对环磷酰胺致小鼠生精障碍的治疗作用及其机制［J］． 吉林大学学报: 医学版，2014，40( 3) :612-615．［10］ 王雪梅，吴汉平，汪晓敏，等． 16 种中草药提取物的抗氧化活性研究［J］． 安徽大学学报: 自然科学版，2015，39( 2) : 74-80．［11］ 高建德，刘雄，范凌云，等． 肉苁蓉酶解提取工艺及抗氧化活性研究［J］． 中成药，2014，36( 12) : 2621-2624．［12］ 滕立平，慕龙，罗锋，等． 德赢vwin登录 粗多糖提取方法及其清除二苯代苦味酰基自由基的效果［J］． 贵州农业科学，2011，39 ( 1 ) :66-68．［13］ 王国卫，赵芳． 新疆肉苁蓉多糖清除活性氧自由基［J］． 光谱实验室，2011，28( 3) : 1545-1548．［14］ 李刚，朱文斌，牛飞，等． 肉苁蓉苯乙醇苷对大鼠精子体外氧化损伤的保护作用研究［J］． 时珍国医国药，2010，21( 9) : 2205-2207．［15］ 梁华伦，江秀娟，黎奔，等． 基于拉曼光谱技术的肉苁蓉苯乙醇苷对氧化损伤人精子DNA 的保护作用［J］． 广州中医药大学学报，2015，32( 1) : 121-125．［16］ 蒋晓燕，王晓雯，商小英，等． 肉苁蓉总苷对照射损伤小鼠敏感器官超微结构的保护作用［J］． 西北药学杂志，2001，16( 2) : 63-64．［17］ 马晶晶，赵帆，孙云． 类叶升麻苷对肾阳虚小鼠补肾壮阳作用的研究［J］． 扬州大学学报: 农业与生命科学版，2009，30( 1) : 22-25．［18］ 潘玉荣，闵凡印． 肉苁蓉醇提物对阳虚动物模型肾脏、肾上腺的影响［J］． 实用中医药杂志，2004，20( 7) : 357．［19］ 马建玲，陶大勇． 肉苁蓉提取物对雄性小鼠性激素分泌的影响［J］．中兽医医药杂志，2014( 4) : 43-45．［20］ 李玉芳，徐芹伟，张丽，等． 中草药肉苁蓉和黄芪对猪早期胚胎体外发育的影响［J］． 江西农业大学学报，2007，29( 5) : 805-808．［21］ 杨志蓉，朱桂玉，甘世祥，等． 肉苁蓉水提液对猪早期体外发育胚胎中NO 浓度含量的影响［J］． 实验动物科学，2007，24( 4) : 27-29．［22］ 谢安，厉世伟，李龙，等． 肉苁蓉及淫羊藿对小鼠早期胚胎体外发育的影响［J］． 江西农业大学学报，2011，33( 5) : 955-959．

摘要: 目的: 观察肉苁蓉对帕金森病( PD) 模型大鼠行为学及中脑黑质－ 纹状体组织PI3K、Akt、Bcl － 2、Bax 蛋白表达的影响，探讨其对神经细胞的保护作用机制。方法: 将48 只健康SD 雄性大鼠随机分为正常组、溶剂对照组、模型组、肉苁蓉低、中、高剂量组6 组，采用颈背部皮下注射鱼藤酮葵花油乳化液建立PD 大鼠模型，给予肉苁蓉水煎剂后，第3、7、14 天分别进行行为学步幅试验; 第14 天行为学检测后，处死大鼠，提取黑质－ 纹状体蛋白，Western Blot 检测PI3K、Akt、Bcl － 2、Bax 蛋白的表达。结果: 肉苁蓉干预14 天后，与模型组比较，中、高剂量组步幅明显增大( P ＜ 0． 01) ，低、中、高剂量组PI3K、Bcl － 2 蛋白表达、Bcl－ 2 /Bax 值明显升高( P ＜ 0． 01 或P ＜ 0． 05) ，中剂量组Akt 蛋白表达明显升高( P ＜ 0． 01) ，低、中、高剂量组Bax 表达明显降低( P ＜ 0． 01) 。结论: 肉苁蓉能改善帕金森病模型大鼠的行为障碍，其对多巴胺神经细胞的保护作用可能是通过影响PI3K/Akt信号通路，上调Bcl － 2 表达，下调Bax 表达，升高Bcl － 2 /Bax 值，进而抑制神经细胞的凋亡实现的。关键词: 帕金森病; 肉苁蓉; 行为学; PI3K/Akt 信号通路; Bcl － 2; Bax; Bcl － 2 /Bax帕金森病( Parkinson’s disease，PD) 的主要病理特征是黑质纹状体致密部多巴胺能神经元进行性丢失，其发病的重要机制之一是多巴胺能神经细胞的凋亡［1］。在细胞凋亡机制涉及的众多信号转导通路中，PI3K/ Akt 因参与调控凋亡蛋白和凋亡基因发挥抑制细胞凋亡的作用而受到重视［2］。已有研究表明，多种PD 模型及PD 患者均存在PI3K/ Akt信号通路的减弱或异常调节［3 － 4］。肉苁蓉( Herba Cistanche) 为肉苁蓉属植物干燥带鳞叶的肉质茎，能补肾阳、益精血，被誉为“沙漠人参”。本课题组前期研究发现肉苁蓉能调节多巴胺能神经细胞凋亡因子的表达，减轻多巴胺能神经细胞的凋亡［5］。但是肉苁蓉是否通过PI3K/Akt 通路发挥神经保护作用尚需进一步探讨。本实验通过观察肉苁蓉对PD 模型大鼠行为学以及黑质纹状体中PI3K、Akt、Bcl － 2、Bax 蛋白表达的影响，探讨肉苁蓉减轻多巴胺神经细胞凋亡的机制。1 材料1． 1 实验动物福建中医药大学实验动物中心提供实验动物和普通级医学实验动物环境设施，实验动物合格证号为SCXK2014 － 0012，具体为SD 健康雄性大鼠( SPF 级) ，6 ～ 7 周龄，数量48 只，每只体重( 210 ± 30) g。1． 2 试剂与仪器肉苁蓉颗粒剂( 福建中医药大学附属第三人民医院) ; 鱼藤酮( 美国Sigma 公司，批号Ｒ3875) ; 葵籽油( 美国Sigma 公司，批号S5007) ;PI3K 抗体( 美国CST 公司，批号19H8) ; Akt 抗体( 武汉三鹰，批号66009 － 1: ) ; Bcl － 2 抗体( 美国CST 公司，批号15071: ) ; Bax 抗体( 美国CST 公司，批号5023: ) ; β － actin( 武汉三鹰，批号60203) ; 电泳槽与转膜仪( 美国Bio － Ｒad 公司) ; 5417Ｒ 高速冷冻离心机( 德国Eppendorf 公司) ; DU － 650 型蛋白分析仪( 美国Beckman 公司) ; Gel DOC 2000 型凝胶成像分析系统( 美国Bio － Ｒad 公司) 。2 方法2． 1 分组6 ～ 7 周龄的SPF 级SD 雄性大鼠48只，随机法分为正常组、溶剂对照组、模型组以及肉苁蓉低、中、高剂量组，每组各8 只。普通环境饲养，自由饮水。2． 2 造模与干预溶剂对照组给予颈背部皮下注射葵花油乳化液( 1． 5 mg /kg /d) ，1次/d，连续14d;模型组、肉苁蓉低、中、高剂量组颈背部皮下注射鱼藤酮葵花油乳化液( 1． 5 mg /kg /d) 建立PD 模型，注射7d 休息1 天，共15d，造模结束后按照行为评分标准选取造模成功的大鼠( 造模方法及行为评分标准均参照陈忻等［6］的方法) 。造模成功后，肉苁蓉低、中、高剂量组分别给予0． 54 g /kg /d、1． 08 g /kg /d、2． 16 g /kg /d 肉苁蓉水煎剂灌胃( 肉苁蓉低、中、高剂量根据课题组前期实验的结果确定［15］) ，1次/d，连续14d。正常组、溶剂对照组及模型组给予等体积生理盐水灌胃，频次同肉苁蓉组。给药剂量均按人和大鼠间体表面积折算的等效剂量给药。2． 3 行为学检测各组进行肉苁蓉干预后，分别在第3、7、14 天进行行为学的步幅试验，同时记录相应的数据。步幅试验操作方法如下: 制作不透光的木盒子，带有长42 cm，宽4． 5 cm，高10 cm 的跑道，在跑道上放置宽4． 5 cm，长40 cm 的白纸。将大鼠的前爪涂上墨水，训练大鼠在跑道上行走并让其穿过盒子，测量白纸上大鼠2 个前爪印记之间的距离( 取脚印的中心) ，此即步幅。每次测量3 个最长的步幅( 对应大鼠行走的最大速度) 。若出现大鼠在行走过程中停止，或者有明显减速的情形，则重新进行测试。2． 4 实验取材最后一次给药的12h 后，从每组中随机抽取6 只大鼠，采用乙醚麻醉，迅速断头处理，于冰盘上提取以中脑黑质为主的脑组织，脑组织表面的血液用冰0． 9% 氯化钠溶液冲洗干净，残余液体用滤纸吸干，置于－ 80 ℃冰箱保存备用。2． 5 提取蛋白将样品从－ 80 ℃冰箱中取出，称重后放入研磨器研碎，按12． 5μL /mg 加入ＲIＲA 裂解液，冰上裂解30min，使用1mL 注射器反复抽吸20 次。接着将样品放入4℃ 离心机中离心15min，离心机转速为12000r /min，之后每组样品各吸取30μL 上清液到新的离心管中，用BCA 法测定蛋白浓度，其余上清液以4∶ 1的比例加入5 × buffer 溶液，混合均匀后，在水浴锅中煮沸10min，之后置于－80℃冰箱备用。2． 6 Western Blot 法检测PI3K、Akt、Bcl － 2、Bax 蛋白表达将各组蛋白浓度总量调整为30μg /μL，将样品加入到10%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，转膜至PVDF 膜后，按1 ∶ 1000 的稀释比例加入一抗PI3K、Akt、Bcl － 2、Bax。隔天取出条带用二抗( 1 ∶2000) 孵育1h，TBST 清洗后，采用ECL 试剂盒显影并成像，用Image Lab 软件进行半定量分析，并记录相应条带的灰度值。2． 7 统计学分析本实验数据计量资料用珋x ± s( 均数± 标准差) 表示，组间比较采用重复测量方差分析或者单因素方差分析; 组间进行两两比较，方差齐则采用LSD 法，方差不齐则采用Games － Howell法。采用SPSS 22． 0 统计学软件进行分析处理。P＜ 0． 05 表示差异有统计学意义。3 结果3． 1 6 组大鼠步幅比较肉苁蓉干预后第3、7、14天，模型组大鼠步幅比正常组明显下降( P ＜ 0． 01) ;肉苁蓉给药后各组步幅有显著性差异，其中肉苁蓉干预第7 天，高剂量组步幅较模型组有显著增加( P＜ 0． 01) ; 而肉苁蓉干预14 天后，中、高剂量组步幅较模型组均出现明显增长( P ＜ 0． 01) 。见表1。3． 2 6 组大鼠黑质纹状体PI3K、Akt、Bcl － 2、Bax 蛋白表达及Bcl － 2 /Bax 值比较与正常组比较，模型组PI3K、Akt、Bcl － 2 蛋白表达、Bcl － 2 /Bax 值均明显降低( P ＜ 0． 01 或P ＜ 0． 05) ，Bax 蛋白表达显著升高( P ＜ 0． 01) 。而与模型组相比，肉苁蓉低、中、高剂量组PI3K 表达明显升高( P ＜ 0． 01 或P ＜0. 05) ，中剂量组Akt 明显升高( P ＜ 0． 01) ，低、中、高剂量组Bcl － 2 蛋白表达、Bcl － 2 /Bax 值均显著升高( P ＜ 0． 01) ，Bax 蛋白表达明显降低( P ＜ 0． 01) 。见表2、图1。4 讨论PD 是一种常见的神经系统退行性疾病，主要的发病机制是多巴胺能神经细胞的凋亡，有效抑制或减少细胞凋亡是实现神经保护的重要手段。中医理论认为，PD 虽然病位在脑，但是病机实为肾虚髓空，可通过补益肾脏来濡养脑髓。而肉苁蓉性甘、咸，温; 归肾、大肠经; 补肾阳，益精血，润肠通便，是传统补肾中药［7］。现有的研究已表明，肉苁蓉可以抗氧化、抗衰老，能够提高细胞中多种中枢神经递质的含量，起到神经保护作用［8］。本课题组前期研究也发现多味补肾中药如淫羊藿、菟丝子、肉苁蓉等均可增加细胞中神经营养因子含量，减少相关神经凋亡因子含量，从而抑制多巴胺神经细胞的凋亡，其中又以肉苁蓉作用最为突出［9］。PI3K/Akt 是一条经典的细胞信号转导通路，在神经系统中广泛存在，PI3K/AKT 激活后可以调节其下游的凋亡相关蛋白，如Bcl － 2 蛋白和Bax 蛋白，使Bcl － 2 /Bax 值升高，发挥抑制神经细胞凋亡的作用［10 － 14］。本实验结果发现，肉苁蓉干预后第7天，高剂量组步幅较模型组有显著增加，而肉苁蓉干预后第14 天，中、高剂量组的步幅均出现明显增长，提示一定剂量的肉苁蓉作用一段时间后能改善PD模型大鼠的行为障碍，这与本课题组之前的研究结论一致［15］。同时Western Blot 结果显示，模型组PI3K、Akt、Bcl － 2 表达、Bcl － 2 /Bax 值均较正常组显著降低，Bax 表达较正常组升高; 给予肉苁蓉后，与模型组相比，给药组PI3K、Akt、Bcl － 2 表达、Bcl－ 2 /Bax 值升高，Bax 水平降低，提示肉苁蓉可能是通过影响PI3K/Akt 信号通路，增加Bcl － 2 表达、降低Bax 表达，从而升高Bcl － 2 /Bax 比值，减轻神经细胞凋亡来发挥神经保护作用的。本次实验还发现肉苁蓉中剂量组无论是步幅实验，还是PI3K、Akt、Bcl － 2、Bax 的蛋白表达的变化均表现明显，可考虑将这个剂量作为下一步实验的最适浓度。另外，由于要确定肉苁蓉对PI3K/Akt 通路的激活作用，需要使用通路抑制剂进行研究，这可作为下一步深入探讨机制的思路。参考文献［1］Bonilla － Porras AＲ，Arevalo － Arbelaez A，Alzate － Ｒestrepo JF，etal． PAＲKIN overexpression in human mesenchymal stromal cellsfrom Wharton＇s jelly suppresses 6 － hydroxydopamine － induced apoptosis:Potential therapeutic strategy in Parkinson＇s disease［J］． Cytotherapy，2017，20( 1) : 45 － 61．［2］Wang J，Liu H，Zhang X，et al． Sulfated Hetero － PolysaccharidesProtect SH － SY5Y Cells from H2O2 － Induced Apoptosis by Affectingthe PI3K/Akt Signaling Pathway［J］． Mar Drugs，2017，15( 4) :110．［3］Chen WF，Wu L，Du ZＲ， et al． Neuroprotective properties of icariin inMPTP － induced mouse model of Parkinson＇s disease: Involvement ofPI3K/Akt and MEK/EＲK signaling pathways［J］． Phytomedicine，2016，25: 93 － 99．［4］Yal nkaya N，Haytural H，Bilgi B， et al． Expression changes of genesassociated with apoptosis and survival processes in Parkinson＇s disease［J］． Neurosci Lett，2016，615: 72 － 77．［5］Shaogang，Shuifen， Jinmu， et al． How do Chinese medicines that tonifythe kidney inhibit dopaminergic neuron apoptosis［J］． Neural ＲegenerationＲesearch，2013，8( 30) : 2 820 － 2 826．［6］陈忻，张楠，赵晖，等． 鱼藤酮致帕金森病大鼠行为学与黑质病理损伤的关系［J］． 中国神经精神疾病杂志，2008，34 ( 4) : 232 －234．［7］Chinese Pharmacopoeia Commission． Pharmacopoeia of the People＇sＲepublic of China( I) ［S］． Beijing: Chemical Industry Press，2015:135．［8］Zhang K，Ma X，He W，et al． Extracts of Cistanche deserticola CanAntagonize Immunosenescence and Extend Life Span in Senescence－ Accelerated Mouse Prone 8 ( SAM － P8) Mice［J］． Evidence －based Complementary and Alternative Medicine，2014，2014 ( 2 ) :601 383．［9］林少刚． 补肾中药干预MES23． 5 多巴胺能神经细胞凋亡的研究［D］． 福州: 福建中医药大学，2012．［10］Lai Z，Zhang L，Su J，et al． Sevoflurane postconditioning improveslong － term learning and memory of neonatal hypoxia － ischemiabrain damage rats via the PI3K/Akt － MPTP pathway［J］． BrainＲes， 2015，1630: 25 － 37．［11］Zhang J，Tong W，Sun H，et al． Nrf2 － mediated neuroprotection byMANF against 6 － OHDA － induced cell damage via PI3K/AKT /GSK3β pathway［J］． Exp Gerontol， 2017，100: 77 － 86．［12］Kim SM，Park YJ，Shin MS，et a． Acacetin inhibits neuronal celldeath induced by 6 － hydroxydopamine in cellular Parkinson＇s diseasemodel［J］． Bioorg Med Chem Lett，2017，27 ( 23) : 5 207 － 5212．［13］B D＇Orsi，J Mateyka， JH Prehn． Control of mitochondrial physiologyand cell death by the Bcl － 2 family proteins Bax and Bok［J］． NeurochemistryInternational，2017， 109: 162 － 170．［14］Ke K，Lou T． MicroＲNA － 10a suppresses breast cancer progressionvia PI3K/Akt /mTOＲ pathway［J］． Oncol Lett，2017，14( 5) : 5 994－ 6 000．［15］Yang S S，Qin W，Chen S Y， et al． Effects of cistanche deserticola onbehavior and expression of GSK － 3β in hippocampus of rat model ofparkinson＇s disease［J］． Ｒehabilitation Medicine，2016，26 ( 6) : 24－ 27 + 33．

摘要: 目的探讨肉苁蓉对卵巢早衰大鼠免疫因子和凋亡相关蛋白的影响及其作用机制。方法按照体重将SD 大鼠随机分为5 组: 正常组、模型组和低、中、高3 个剂量实验组，每组10 只。用雷公藤多苷50 μg·g － 1给予大鼠制备卵巢早衰大鼠模型。低、中、高3 个剂量实验组分别给予5， 10， 20 g·kg － 1 肉苁蓉。用酶联免疫吸附法检测大鼠促卵泡激素( FSH) 、雌激素和抗苗勒管激素( AMH) 水平; 以实时定量聚合酶链反应检测肿瘤坏死因子－ α( TNF － α) 和干扰素－ γ( IFN － γ) 的基因相对表达水平; 以免疫印迹法检测B 淋巴细胞瘤－ 2( Bcl － 2)和B 淋巴细胞瘤－ 2 相关X 蛋白( Bax) 蛋白相对表达水平。结果正常组、模型组和低、中、高3 个剂量实验组的FSH 水平分别为( 16. 42 ± 1. 76 ) ，( 31. 83 ± 2. 67) ，( 25. 89 ± 2. 48) ，( 23. 73 ± 2. 05) 和( 21. 55 ± 2. 94) U·L － 1 ; 上述这5 组的雌激素水平分别为( 97. 64 ± 7. 85) ，( 53. 47 ± 6. 98) ，( 89. 56 ± 7. 28) ，( 93. 35 ± 6. 29) 和( 92. 45 ± 5. 60) ng·L － 1 ; 上述这5 组的AMH 水平分别为( 280. 84 ± 22. 42) ，( 149. 35 ± 14. 57) ，( 231. 71 ± 27. 38) ，( 253. 33 ± 27. 36) 和( 265. 64 ± 25. 34) pg·mL － 1 ; 上述这5 组的TNF － α 基因的相对表达水平分别为1. 00 ± 0. 00， 3. 54 ± 0. 35， 2. 41 ± 0. 27， 2. 32 ± 0. 25 和2. 13 ± 0. 21; 上述这5 组的IFN － γ 基因的相对表达水平分别为1. 00 ± 0. 00，4. 45 ± 0. 98，2. 93 ± 0. 31，2. 85 ± 0. 29和2. 67 ± 0. 26; 上述这5 组的Bcl － 2 蛋白的相对表达水平分别为0. 72 ± 0. 05， 0. 28 ± 0. 04， 0. 42 ± 0. 04， 0. 51 ± 0. 06 和0. 64 ± 0. 07; 上述这5 组的Bax 蛋白的相对表达水平分别为0. 48 ± 0. 04，1. 05 ± 0. 07，0. 86 ± 0. 08，0. 69 ± 0. 07和0. 53 ± 0. 06。模型组与正常组比较，或者低、中、高3 个剂量实验组与模型组比较，差异均有统计学意义( 均P ＜ 0. 05) 。结论肉苁蓉能够调控FSH、雌激素和AMH 的水平，抑制TNF － α 和IFN － γ 基因的表达，其可能通过调控性激素因子及Bcl － 2 /Bax 蛋白的平衡从而影响卵巢早衰。关键词: 肉苁蓉; 卵巢早衰; 免疫因子; B 淋巴细胞瘤－ 2; B 淋巴细胞瘤－ 2 相关X 蛋白卵巢早衰( premature ovarian failure，POF) 是指卵巢内激素水平不平衡导致的卵巢功能障碍［1］。卵巢颗粒细胞的凋亡和细胞免疫因子均与POF 的发生密切相关［2］。肉苁蓉( CistanchesHerba，CH) 可以通过清除胚胎体外培养产生的自由基，提高胚胎体外发育率［3］。本实验研究肉苁蓉对POF 大鼠免疫因子和凋亡相关蛋白的影响及其作用机制。材料与方法1 材料动物SPF 级12 周龄的SD 雌性大鼠，体重250 g左右，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。动物许可证号: SCXK( 沪) 2007 － 0005。药品与试剂肉苁蓉药材，购自承德医学院附属医院附属中药房同济大药房药剂科，经陕西中医药大学丁延平教授鉴定确为肉苁蓉，参考杨志蓉等［3］方法，制成剂量为50 mg·mL － 1 肉苁蓉溶液) 。实时荧光定量聚合酶链反应( qＲT － PCＲ) 试剂盒，购自南京Vazyme 生物公司; 免疫组化所用试剂，购自福州迈新公司; 二辛可酸( BCA) 试剂盒，购自碧云天生物技术研究所。仪器荧光显微镜，德国ZIESS 公司产品;Multiskan MK3 酶标仪，美国Thermo 公司产品。2 实验方法2. 1 POF 大鼠模型的制备［4］大鼠用雷公藤多苷50 μg·g － 1 连续灌胃14 d，建立POF 大鼠模型。2. 2 分组与给药［3 － 4］将造模成功大鼠随机分为4 组: 模型组和低、中、高3 个剂量实验组，每组10 只。10 只正常SD 大鼠作为正常组。于造模结束后24 h，低、中、高3 个剂量实验组分别给予5，10，20 g·kg － 1肉苁蓉，连续灌服20 d。模型组与正常组大鼠自由饮水。自中药灌胃第11 天起，每日进行大鼠阴道脱落细胞涂片观察，连续10 d，观察并记录大鼠动情周期。2. 3 以酶联免疫吸附法( ELISA) 检测促卵泡激素( FSH) 、雌激素和抗苗勒管激素( AMH) 水平［4］分组与处置见“2. 2”。大鼠于间情期，腹主动脉取血，静置30 min，以3000 r·min － 1 离心，取上清液，按照ELISA 试剂盒说明书要求，于酶标仪450 nm 波长处测定光密度( OD) 值，即代表FSH、雌激素和AMH水平。2. 4 以qＲT － PCＲ 测定肿瘤坏死因子－ α( TNF － α) 、干扰素－ γ( IFN － γ) 、B 淋巴细胞瘤－ 2( Bcl －2) 和B 淋巴细胞瘤－ 2 相关X 蛋白( Bax) 基因的表达水平［5］分组与处置见“2. 2”。提取卵巢组织总ＲNA，逆转录成cDNA 后，按照qPCＲ 说明书进行qＲT － PCＲ扩增。循环条件: 95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s; 72 ℃ 30 s，共40 个循环; 60 ℃ 延长5 min; 基因的相对表达量用2 －△△Ct法计算。2. 5 以免疫印迹法检测Bcl －2 和Bax 蛋白表达［5］分组与处置见2. 2。提取各组卵巢组织蛋白，定量。按照文献方法操作。成像后，用Quantity One 凝胶分析软件处理，测定各组蛋白条带的OD 值，以目的条带和β － actin 条带的比值作为蛋白表达水平。2. 6 以免疫组化染色检测TNF － α 和IFN － γ 蛋白表达水平［4］分组与处置见“2. 2”。腹主动脉取血后，即刻剖腹取卵巢，置于4%多聚甲醛液中固定24 h，脱水后石蜡包埋，切片脱蜡，蒸馏水洗2 min，抗原修复，滴加H2O2阻断内源性过氧化物酶，再用血清封闭，清洗3次后，加入一抗孵育30 min 后，4℃过夜。再加酶标二抗，37 ℃孵育20 min; 加二氨基联苯胺显色，苏木素复染，脱水后封片，显微镜下观察染色结果。以TNF － α及IFN － γ 表达的积分OD 值代表其蛋白表达水平，每张切片随机取5 个视野。3 统计学处理用SPSS 20. 00 进行统计学分析。计量资料以珋x ± s表示，2组间比较用t 检验，多组间比较用单因素方差分析。结果1 肉苁蓉对大鼠性激素FSH、雌激素和AMH 水平的影响模型组与正常组比较，FSH 水平明显增加，而雌激素和AMH 水平明显降低，差异均有统计学意义( 均P ＜ 0. 05) ; 低、中、高3 个剂量实验组与模型组比较，上述指标的差异均有统计学意义( 均P ＜ 0. 05) ，见表1。可见，肉苁蓉可降低FSH 的水平，提高雌激素和AMH 的水平。2 肉苁蓉对大鼠TNF － α 和IFN － γ 基因表达的影响模型组与正常组比较，TNF － α 和IFN － γ 基因表达水平均明显增加，差异均有统计学意义( 均P ＜0. 05) ; 低、中、高3 个剂量实验组与模型组比较，上述指标的差异均有统计学意义( 均P ＜ 0. 05) ，见表2。可见，肉苁蓉可抑制TNF － α、IFN － γ 基因的表达。3 肉苁蓉对大鼠TNF － α 和IFN － γ 蛋白的影响模型组与正常组比较，TNF － α 和IFN － γ 蛋白表达水平均明显增加，差异均有统计学意义( 均P ＜ 0. 05) ; 低、中、高3 个剂量实验组与模型组比较，上述指标的差异均有统计学意义( 均P ＜ 0. 05) ，见表3。可见，肉苁蓉可抑制TNF － α 和IFN － γ 蛋白的表达。4 肉苁蓉对大鼠卵巢Bcl －2 和Bax 基因表达的影响模型组与正常组比较，Bcl － 2 基因的表达明显降低，Bax 基因的表达明显增加，差异均有统计学意义( 均P ＜ 0. 05) ; 低、中、高3 个剂量实验组与模型组比较，上述指标的差异均有统计学意义( 均P ＜ 0. 05) ，见表4。可见，肉苁蓉可促进Bcl － 2 基因的表达，却抑制Bax 基因的表达。5 肉苁蓉对大鼠卵巢Bcl － 2、Bax 蛋白表达和Bcl －2 /Bax比值的影响模型组与正常组比较，Bcl － 2 蛋白表达水平和Bcl － 2 /Bax 的比值均明显降低，而Bax 蛋白表达水平明显增加，差异均有统计学意义( 均P ＜ 0. 05) ; 低、中、高3 个剂量实验组与模型组比较，上述指标的差异均有统计学意义( 均P ＜ 0. 05) ，见图1 和表5。可见，肉苁蓉可促进Bcl － 2 蛋白的表达，抑制Bax 蛋白的表达，提高Bcl － 2 /Bax 的比值。讨论卵巢早衰大鼠中IFN － γ 的水平明显升高［6］。本研究结果发现，低、中、高3 个剂量实验组大鼠性激素FSH 含量显著降低，雌激素、AMH 含量显著升高;TNF － α、IFN － γ 和Bax 表达显著降低; Bcl － 2 表达水平显著升高，而Bcl － 2 /Bax 的比值显著升高。由此可见，肉苁蓉可以通过调节大鼠性激素水平，抑制TNF － α 和IFN － γ 的表达来减少卵泡闭锁和细胞凋亡，进而减缓卵巢衰竭速度; 肉苁蓉还可以上调Bcl － 2 /Bax。表明肉苁蓉有抑制卵巢早衰的作用，其机制可能与卵巢的性激素水平、TNF － α、IFN － γ 及凋亡相关蛋白Bcl － 2 /Bax 表达有关。参考文献:［1］ 崔合香. 中医分期用药治疗卵巢早衰的临床疗效观察［J］. 中国中医药科技，2019，26( 1) : 129 － 130.［2］ 梁嘉丽，邝兆民，杨静，等. 补肾阴及补肾阳法对化疗诱导的卵巢早衰大鼠外周血TNF － α、IFN － α 水平及卵巢颗粒细胞凋亡的影响［J］. 中国病理生理杂志，2017，33( 1) : 139 － 142.［3］ 杨志蓉，朱桂玉，甘世祥，等. 肉苁蓉水提液对猪早期体外发育胚胎中NO 剂量含量的影响［J］. 实验动物科学，2007，24 ( 4) :27 － 29，39.［4］ 张丽娜，郑锦，刘特，等. 补肾活血方对卵巢早衰模型大鼠性激素水平及颗粒细胞凋亡调控相关因子的影响［J］. 上海中医药杂志，2015，49( 7) : 72 － 76.［5］ 梁策，高慧，张腾. 补肾调冲方对卵巢早衰大鼠性激素水平和卵巢Bcl － 2 /Bax 表达的影响［J］. 中国实验方剂学杂志，2016，22( 19) : 100 － 104.［6］ 高慧，杨涓，夏天，等. 补肾调冲方对卵巢早衰大鼠卵巢相关细胞因子TNF － α， IFN － γ 表达的影响［J］. 国医论坛，2008，23( 2) : 35 － 37.

[ 摘要] 　目的:研究中药肉苁蓉对神经母细胞瘤细胞烟碱型乙酰胆碱受体表达的影响及其对抗β 淀粉样蛋白(Aβ)神经毒性作用机制, 以探讨其在阿尔茨海默病(alzheimer' s disease , AD)治疗中的作用。方法:比色法测定细胞MT T 还原率筛选肉苁蓉安全浓度范围, 并用Aβ25-35处理细胞后, 测定M TT 还原率, 蛋白质印迹法(We ster n blo tting)测定烟碱型乙酰胆碱受体α3 、α7 蛋白表达的变化;TBA 比色法测定脂质过氧化产物(丙二醛)的水平。结果:肉苁蓉能提高细胞α3 及α7 烟碱型乙酰胆碱受体亚单位蛋白质表达水平;并能对抗Aβ25-35 引起的α3 和α7 受体亚单位蛋白质水平降低;同时能减弱Aβ25-35 引起的细胞损伤和脂质过氧化水平升高。这些作用随浓度的增加而增强。结论:肉苁蓉能上调烟碱型乙酰胆碱受体亚单位蛋白表达水平,且能对抗Aβ 25-35 的神经毒性作用, 在AD 的治疗中可能起到一定作用。[ 关键词] 　肉苁蓉;神经母细胞瘤细胞;尼古丁受体;β-淀粉样蛋白;阿尔茨海默病阿尔茨海默病(alzheimer' s disease , 简称AD)是一种主要在老年期发生的以进行性痴呆为主要特征的神经元退行性变疾病, 其主要临床表现为进行性认知功能障碍、记忆力衰退、性格和行为改变等[ 1-3] 。病理学上以脑细胞内神经原纤维缠结及细胞外老年斑形成为主要特征[ 4] 。老年斑的主要成分为β-淀粉样蛋白(β-amyloid peptide ,Aβ), 是一种神经毒性物质,可以引起神经元的损伤和死亡, 是AD 发病过程中的一个重要因素, 能促进AD 的发生和发展。烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic ace ty lcholinereceptor , nAChR 或称尼古丁受体)与学习和记忆等认知功能密切相关, 并具有明显的神经保护作用[ 5] 。在较早的一些研究中就发现, AD 患者大脑皮层尼古丁受体出现持续和严重的丢失, 大脑皮层nAChR 缺失与AD 患者认知障碍有显著的相关性。由于AD 的发病机制复杂, 目前尚无有确切疗效的治疗药物。中医药在延缓衰老以及防治痴呆等相关疾病方面有着丰富的理论和实践经验, 具有潜在的优势和广阔的发展前景。肉苁蓉作为一种著名的补益药, 在延缓衰老, 增强机体免疫功能、激活超氧化物歧化酶活性和降低体内脂褐素堆积方面都有着重要的作用[ 2] 。本研究用Aβ25-35 处理来源于人脑的神经母细胞瘤(SH-S Y5Y)细胞作为研究对象,以研究肉苁蓉神经保护作用机制。1　材料肉苁蓉来源于新疆的德赢vwin登录 [ Cistanch tubulosa(Schenk .)R .Wight] , 由贵阳医学院药学院提供并鉴定。D-MEM 培养液(英国Gibco Invitrogen 公司);源于人脑的SH-SY5Y 细胞(德国German Collectionof Microorganisms and Cell Cultures 公司);羊抗α3 、α7 及鼠抗β-肌动蛋白(β-actin)多克隆抗体及HRP 标记的抗羊及抗鼠二抗(美国Santa Cruz BiotechnologyInc);聚乙烯二氟(PVDF)膜、ECL-Plus 发光试剂、高效显影胶片(Amersham 公司);其他化学试剂均购自Sigma 公司。2　方法2.1　肉苁蓉液的制备　肉苁蓉生药加10 倍量的水煮2 次, 每次1 h , 滤过, 合并滤液, 滤液用旋转蒸发仪70 ℃减压回收溶液, 测定体积, 计算浓度。最后质量浓度为1 g 生药·mL-1 。2.2　细胞培养,β-淀粉样肽及肉苁蓉的处理　先用含15 %胎牛血清的DMEM 培养液培养SH-SY5Y细胞, 待细胞生长稳定后, 改用不含血清的DMEM培养液继续培养, 培养箱中含5 %二氧化碳, 温度为37 ℃。在SH-SY5Y 细胞中加入10 μmo l·L-1 的Aβ25-35 , 培养48 h 。为观察肉苁蓉对Aβ25-35 毒性作用的影响, 先分别加入0 .1 mg·L-1 及1 mg ·L -1 肉苁蓉水提物培养24 h 后, 再加入Aβ25-35 培养48 h 。每个实验组均设3 个复孔, 重复3 次实验。2.3 　3-4 , 5-二甲基噻唑-2 , 5-二酚四唑溴化物(3-(4 , 5-dimethy lthiazo l-2-yl)-2 , 5-diphen-yl tet razoliumbromide , MTT)测定　为筛选肉苁蓉的安全浓度, 选择0 .05 ～ 5 mg·L-1 质量浓度处理SH-SY5Y细胞后24 h 后测定M TT 还原率, 以检测其对细胞是否具有毒性作用及其安全浓度范围。2.4　脂质过氧化水平的测定　脂质过氧化中间产物丙二醛可与硫代巴比妥酸(thibabituric acid, TBA)缩合, 形成红色产物, 在532 nm 处有最大吸收峰。收集培养神经细胞的培养液, 测定丙二醛含量。2.5　尼古丁受体亚单位蛋白表达测定　参照Guan等[ 7] 的方法进行提取细胞膜蛋白及用西印迹方法检测α3 ,α7 nAChR 蛋白水平。以Labworks 软件分析结果时以β-actin 蛋白条带作为内参照, 计算3 、7nAChR 蛋白条带与β-actin 蛋白条带像素灰度的百分比值作为α3 、α7 nAChR 蛋白表达的相对水平比。2.6 　统计学分析　每组所得结果用 x ±s 表示, 结果用S PSS 12 .0统计软件进行单因素方差分析。3　结果3.1 　肉苁蓉安全浓度筛查　肉苁蓉水提物质量浓度大于3 mg·L-1时SH-SY5Y 神经细胞MT T 还原率出现下降趋势, 在0 .5 ～ 3 mg·L-1 范围时细胞MT T 还原率无明显变化, 表明该浓度对细胞毒性作用较小。因此选择0 .1 mg·L -1及1 mg·L -1作为本次研究肉苁蓉的选用浓度。3.2　肉苁蓉处理后MTT 还原率　肉苁蓉处理后MTT 还原率测定发现, 10 μmol·L-1Aβ25-35 处理细胞后引起MTT 还原率明显降低;0 .1 mg ·L-1 及1 mg·L-1 肉苁蓉水提物处理细胞不影响细胞功能;而用肉苁蓉水提物预处理细胞后可明显减弱Aβ25-35对细胞的毒性作用,Aβ25-35 组与不同浓度肉苁蓉水提物与Aβ25-35联合处理组之间的差异有统计学意义, 随肉苁蓉水提物使用浓度的增加, 该对抗作用越明显。3.3 　烟碱型乙酰胆碱受体亚单位蛋白表达水平　烟碱型乙酰胆碱受体α3 及α7 亚单位蛋白表达水平结果表明, 10 μmo l·L-1 Aβ25-35 处理细胞后引起α3及α7 nAChR 蛋白质表达水平明显降低;单纯肉苁蓉水提物处理细胞可上调α3 及α7 nACh R 蛋白表达水平, 且对于α7 受体的上调作用随着浓度增加该作用越明显, 对于α3 受体的作用浓度差别不大;用肉苁蓉水提物预处理细胞后可减弱Aβ25-3 5对细胞尼古丁受体亚单位蛋白质表达水平的下调作用,Aβ25-35组与肉苁蓉水提物与Aβ25-35 联合处理组之间的差异有统计学意义。3.4 　脂质过氧化代谢产物丙二醛水平　结果表明,10 μmo l·L -1Aβ25-35 处理细胞后引起细胞脂质过氧化产物丙二醛水平明显升高;用肉苁蓉水提物处理不影响丙二醛含量;而肉苁蓉水提物预处理细胞后可减弱Aβ25-35 所引起的脂质过氧化水平升高, 此作用亦随着肉苁蓉使用浓度的增加而增强。4　讨论大量研究已经证明在AD 脑组织中老年斑的主要成分Aβ 是由其前体蛋白(APP)经β-和γ-分泌酶水解后形成的, 具有一定的神经毒性作用。近来也有研究表明[ 8] ,Aβ 的损伤作用是AD 发生发展的首要因素, 其损伤机制之一是通过增强氧化应激反应和释放自由基产物, 从而引起神经元受损。本研究用Aβ25-35 处理来源于人类的SH-SY5Y 神经细胞,模拟AD 患者脑内神经细胞的病理过程, 以此作为肉苁蓉体外研究的类AD 细胞模型。研究结果显示, 与对照组相比, Aβ25-35处理组SH-SY5Y 神经细胞的MT T 还原率明显降低, 丙二醛水平明显升高,进一步证实Aβ25-35 可通过诱导氧化应激引起神经细胞的损伤。实验还发现肉苁蓉能对抗Aβ25-35引起的脂质过氧化水平的升高, 具有很好的抗氧化作用。肉苁蓉预处理的SH-SY5Y 神经细胞能够对抗Aβ25-35 引起的MT T 还原率降低, 进一步表明肉苁蓉具有抗Aβ25-35引起的神经细胞毒性的作用。烟碱型乙酰胆碱受体是神经系统中一类非第2信使介导性神经递质结合的离子通道, 与学习和记忆关系密切, 是一类明确的具有神经保护功能的受体, 其减少与AD 的发生有关[ 9] 。AD 患者脑内烟碱型乙酰胆碱受体-配体结合率降低, 其亚基的蛋白表达水平也降低[ 10] 。目前寻找可上调nAChR 受体表达且副作用小的药物是治疗AD 药物研究的方向之一。在SH-SY5Y 神经细胞中, α3 和α7 是主要的尼古丁受体亚类。本研究中, 通过测定α3 和α7nAChR 蛋白水平发现, Aβ25-35 能够明显降低α3 、α7亚单位蛋白的表达。肉苁蓉能够明显地上调α3 和α7 nACh R 蛋白的表达水平, 且能对抗Aβ25-35 所导致α3 、α7 亚单位蛋白的表达降低。这样的作用说明在治疗AD 药物的选择中肉苁蓉可能具有重要的作用。参考文献:[ 1] 　Evans DA , Funk ens tein HH , Albert MS , et a l .Prevelence ofAlzh eimer' s dis ease in a commu ni ty populat ion of older personshigh er than previou sly report ed[ J] .JAM A , 1989 , 262 :2551-2556 .[ 2] 　李巧如, 李石蓝.肉苁蓉抗衰老作用的实验研究[ J] .上海中医药杂志, 1990 , 11 :22-24 .[ 3] 　McKh ann G , Drachman D , Folst ein M , et al .Clinical di agnosisof Al zheimer' s di sease :report of the NINC DS-ADRDAw ork group under th e au spices of Department of H ealth andH uman S ervices Task Force on Alz heim er s Disease[ J] .Neurology, 1984 , 34 :939-944 .[ 4] 　Doody RS , St evens JC , Beck C .Pract ice paramet er :managementof demen tia (an evidence-based review)[ J] .Neu rol ogy ,2001 , 56 :1154-1166 .[ 5] 　官志忠.阿尔茨海默病的病理学及生物膜结构与受体改变机制[ J] .中华病理学杂志, 2003 , 32(1):67-71 .[ 6] 　Dajas-Bailador F , Wonn acot t S .Nicot inic acetyl choline receptors and th e regulati on of neu ronal signaling Trends PharmacolSci[ J] .2004 , 25 :317-324 .[ 7] 　Liu Y , Peterson DA , Kimura H , et al .Mechanism of cellular 3-(4 , 5-dimethyl thiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl -tetrazolium b romide(MTT)reduct ion[ J] .J Neurochem , 1997 , 69 :581-593.[ 8] 　Guan ZZ , Miao H , T ian JY , et a l .Supp ress ed expres sion ofnicot inic acet ylcholine recep tors by nanomolar beta-amyl oidpeptides in PC12 cells[ J] .J .Neu ral .Transm , 2001 , 108 :1417-1433 .[ 9] 　Jan B , Qinghai Z, Evan T , et a l .Oxidative Met aboli tes accelerate Alzh eimer's am yloidogenesis by a tw o-st ep mechanism ,eliminating the requirement for nucleation[ J] .Biochemis t ry ,2005 , 44 :4977-4983 .[ 10] Guan ZZ , Zhang X , Ri vk a R, et al .Decreased p rot ein levelsof nicotinic recept or su bunit s in the hippocampus and t en poralcort ex of pat ien ts w ith Alzheimer's dis ease[ J] .J Neurochem ,2000 , 74 :237-243 .