注：按出峰时间顺序峰1-5为：松果菊苷、毛蕊花糖苷、管花苷A、异毛蕊花糖苷、2＇-乙酰毛蕊花糖苷图2-1 5种苯乙醇苷类对照品UPLC 图谱3.1.2 稳定性试验结果磴口样品在0,7,14,21,28h后5种对照品相对峰面积的RSD值，显示均小于3％（见表2-3），显示样品稳定性良好。表2-3 稳定性结果成分峰面积(n-5)RSD/%松果菊苷133079133900131700132106132311990毛蕊花糖苷5365485433795441875417225381340.61管花苷A163015861603164816682.04异毛蕊花糖苷57001579125630257838568751.192＇-乙酰毛蕊花糖苷53235530655216052781514921.373.1.3 重复性试验结果平行制备阿克苏沙雅样品5份，计算5种对照品（R1～R5）相对峰面积，RSD值均小于3％（见表2-4），表明样品重现性良好。表2-4 重复性结果成分峰面积(n=5)RSD/%松果菊苷1761231769031757751746771793590.99毛蕊花糖苷95603956429486894541970651.02管花苷A19805197931929919035201662.29异毛蕊花糖苷9066977710035997297911.132＇-乙酰毛蕊花糖苷88696881178752287299886100.713.2 不同产地肉苁蓉苯乙醇苷类含量定性分析将不同产地肉苁蓉中松果菊苷、毛蕊花糖苷、管花苷A、异毛蕊花糖苷和2＇-乙酰毛蕊花糖苷5种苯乙醇苷峰面积制作成柱状图，结果见图2-3、2-4、2-5。3.2.1 新疆产地肉苁蓉不同采收季节苯乙醇苷类含量比较 流动相：0.1M氯化钠溶液流速：0.5mL·min进样量：200μL样品浓度：1mg＊mL2.3 苯乙醇苷类定性方法学考察2.3.1 精密度试验取且末1样品在2.2.1色谱条件下连续进样6次，以R1～R5为特征峰，计算峰面积及RSD％。2.3.2 稳定性试验测定磴口样品在0h，7h，14h，21h，28h后，以R1～R5为特征峰，计算峰面积，及RSD％。2.3.3 重复性试验阿克苏沙雅样品平行制备5份，在2.2.1色谱条件下分析，以R1～R5为特征峰计算峰面积，计算RSD％。3 结果3.1 苯乙醇苷类定性方法学结果3.1.1 精密度试验结果5种对照品UPLC图谱见图2-1，以QM1样品进行精密度试验，结果显示5种对照品相对峰面积的RSD值均小于3％，表明其精密度良好，结果见表2-2。表2-2 精密度结果成分峰面积(n=6)RSD/%松果菊苷3590306356694635735613577564356068735680210.29毛蕊花糖苷1056323105305410636291062552106111810614240.39管花苷A1618141626771610261594381602901545541.80异毛蕊花糖苷1178801157001169071138171183921115972.252＇-乙酰毛蕊花糖苷2440724262250822395823302246332.50 按照表2-1记录，于田2、且末1、且末2为秋季采收，其余产地均为春季采收，5种苯乙醇苷含量分布中，秋季采收含量明显高于春季，这与庞金虎［121等人研究结论相一致。这是由于经过春夏秋的旺盛生长，初秋开始，肉苁蓉地下根茎的营养物质开始积累，有效成分含量增高，且秋季气候低温干燥，有助于药材前处理，所以秋季采收时间为10月下旬至11月上旬。另外，春季采收应在3月下旬至4月上旬，防止抽薹营养物质的消耗。此外，来自于新疆和田博远基地，且末治沙站，阿克苏沙雅的肉苁蓉样品为鲜品，5种苯乙醇苷含量很低，说明药材采收后，干燥过程对有效成分的积累有较大的影响13）。 图2-3 不同采收季节5种苯乙醇苷含量分布柱状图3.2.2 新疆产地野生与栽培肉苁蓉苯乙醇苷类比较去除季节因素的影响，下列产地均为春季采收，作图2-4；观察柱形图，所有样品所含5种苯乙醇苷类成分中，主要以松果菊苷和毛蕊花糖苷为主；其中奇台及木垒为野生样品，其余产地均为栽培样品，野生样品峰面积高度明显高于栽培，说明野生生长有助于苯乙醇苷类成分含量的提升。 图2-4野生

第二章 苯乙醇苷类与多糖定性分析肉苁蓉（Cistanche deserticola Y.C.Ma）为列当科多年寄生植物，具有补肾壮阳，润肠通便，延缓衰老，消除疲劳，提高免疫力，保肝护肝等功效，被载入《中华本草》、《中国药典》等医药名录。肉苁蓉在内蒙古、新疆、宁夏等地均有分布，其主要有效成分为苯乙醇苷类和多糖成分。检索近4年苯乙醇苷类含量检测的相关文献可知，研究人员均采用HPLC、UPLC或与质谱联用建立色谱条件，色谱条件会依据药物性质、仪器性能等因素作出相应调整，建立HPLC、UPLC色谱条件对苯乙醇苷类进行定性定量分析已成为一种成熟的技术手段。本文通过建立UPLC色谱条件，初步对不同产地肉苁蓉的苯乙醇苷类进行定性分析：运用MALLS4法测定其多糖分子量与分布，同时运用离子色谱法测定其单糖与糖醛酸，从3方面初步考察肉苁蓉的内在质量并比较其差异，为肉苁蓉的科学开发与种植提供参考依据。1 材料1.1 药材收集不同产地肉苁蓉，经中国医学科学院药用植物研究所副研究员徐荣鉴定为荒漠肉苁蓉（Cistanche deserticola Y．C．Ma）干燥带鳞叶的肉质茎，药材详细信息见表2-1。表2-1 样品详细信息样品序号产地来源采收季节S1新疆奇台野生春S2新疆木垒野生春S3新疆阿克苏沙雅栽培春S4内蒙（同仁堂酒制）栽培春S5内蒙阿拉善左旗野生春S6内蒙阿拉善右旗野生春S7新疆且末治沙站栽培春S8新疆且末2栽培秋S9新疆鄯善栽培春S10新疆哈密栽培春S11新疆精河栽培春S12新疆且末1栽培秋S13新疆于田2栽培秋S14内蒙（中国医学科学院药用植物研究所销售部）栽培秋S15宁夏永宁本草从容种植基地栽培秋S16新疆和田博远基地栽培春 1.2 仪器与分析1.2.1 仪器Acquity UPLCTM system(Waters Corp.,USA);DIONEX ICS-3000 USA（美国戴安公司）；多角度激光检测器（Wyatt Technology DAWN EOS）（18角度）；METTLER-AB135十万分之一电子分析天平（METTER-TOLEDO，Switzerland）：RE-2000A 旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；KQ-250DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Milli-Q Advantage A10 超纯水系统（美国密里博公司）。1.2.2 试剂乙腈：色谱纯（Honeywell Burdick＆Jackson，USA）：甲酸：色谱纯（Dikma Technologies Inc.，Beijing）；屈臣氏饮用水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）；氯化钠（国药集团化学试剂有限公司，批号：20160706）；氢氧化钠（Sigma-Aldrich，批号：STBD9065V）；无水乙酸钠（Sigma-Aldrich，批号：H1608071）：三氟乙酸（天津市光复精细化工研究所）；超纯水，其他试剂均为分析纯常规试剂。1.2.3 中药对照品松果菊苷（纯度：98.88％，批号：MUST-17030701）；2＇-乙酰毛蕊花糖苷（纯度：99.28％，批号：MUST-17031504）；管花苷A（纯度：98.57％，批号：MUST-16080111）；毛蕊花糖苷（纯度：99.57％，批号：MUST-17020715）；异毛蕊花糖苷（纯度：99.77％，批号：MUST-17041816），均购自成都曼思特生物科技有限公司。2 方法2.1 供试品的制备2.1.170％醇提物及多糖的制备将不同产地肉苁蓉均用70％乙醇回流提取2次，每次2h，趁热过滤，合并滤液浓缩，真空干燥得到70％醇提物浸膏，备用；药渣用水提取2次，每次2h，趁热过滤， 合并滤液，80％乙醇沉淀得到多糖，备用。2.1.2 苯乙醇苷类供试液分别称取上述备用浸膏各30mg，溶于2mL（0.1％甲酸）水-乙腈（9：1），过0.22μm滤膜，得供试品溶液。2.1.3 多糖供试液分别称取上述多糖各10mg，溶于0.1M氯化钠溶液，供分子量分析。2.1.4 单糖水解液［5-7］分别称取多糖样品10mg于水解管中，加入4mol／L的三氟乙酸4mL，充氮1分钟排出管内空气，旋紧螺旋盖，于120℃水解2h，待冷却后氮气吹干水解液，除去过量的三氟乙酸，加超纯水定容至10mL。稀释相应倍数后，0.2μm滤膜过滤制得。2.2 色谱条件2.2.1 UPLC色谱条件色谱柱：Waters Acquity UPLC® BEHC18 （2.1mmx100mm，1.7μm）：流动相：乙腈（A）-0.1％甲酸水（B）；流速0.3mL／min；进样体积：2μL：柱温：30℃；梯度洗脱条件：0min-8min，2％A；8min-16min，12％A；16min-19min，16％A； 19min-22min,16%A-22%A;22min-25min,19%A;25min-30min,19%A-25%A; 30min-32min,25%A:32min-35min,25%A-30%A;35min-38min,30%A-40%A; 38min-40min,40%A-50%A。2.2.2 离子色谱分析条件色谱柱：分析柱：Carbo PacTMPA20（3x150mm）；淋洗液：250mM 氢氧化钠溶液和1M 醋酸钠溶液；流速：0.5mL／min；进样体积：10μL；柱温：35℃；检测器：脉冲安培检测器，金电极。梯度洗脱条件：A为水，B为250mM氢氧化钠溶液，C为1M醋酸钠溶液；0-20min,94%A,6%B,0%C;20-20.1 min,89%A,6%B,5%C;20.1-35 min,74%A, 6%B,20%C;35.1-45 min,20%A,80%B,0%C;45.1-55min,94%A,6%B,0%C。2.2.3多角度激光光散射仪条件色谱柱：TSK Gel G4000PWxl；

第二节 肉苁蓉抗疲劳作用研究进展1982年第5届国际运动生化会议上将运动型疲劳正式定义为“身体机能的生理过程不能持续在特定水平和／或整体不能维持预定的运动强度。暂时性的能量缺乏以及因此可能会导致的伤害促使研究者开始探索生理性疲劳的原因及消除疲劳方法。正常机体能量的供应中，来源物质主要是ATP、糖、蛋白质，短时间运动中机体会直接利用ATP，随着时间与运动强度的增加，继而摄取血糖及糖原、脂肪，功能物质的减少，直接导致了疲劳的发生，这是关于疲劳机制学说中“衰竭学说”的阐述：同时研究中考察最多的乳酸（BLA）指标，即为“堵塞”学说的基础，乳酸的积累会通过多种途径造成疲劳，有一种解释为，乳酸导致外周疲劳间的关联主要是通过H＋发生的，剧烈运动会导致细胞PH值下降，引起肌纤维最大张力、最大收缩速度、肌肉输出功率、收缩启动时间和放松能力下降等，这同时与内环境稳定性失调学说相关；此外，有关疲劳机制的学说还有突变理论、中枢神经理论等（3234。多数研究已表明肉苁蓉具有显著地抗疲劳作用，而其中有效成分为苯乙醇苷类与多糖，本小节将以肉苁蓉与其所含化学成分为基础，分类对其抗疲劳作用进行综述。1 肉苁蓉抗疲劳研究进展陈飞在研究筋骨草的抗疲劳作用时，以肉苁蓉水煎液（5.0g／kg）为阳性对照，表明肉苁蓉抗疲劳作用已成为共识；龚梦娟同样也采用肉苁蓉水煎液考察其对阳虚小鼠抗疲劳作用的影响，结果表明，10g．kg＇肉苁蓉水煎液能延长阳虚小鼠负重游泳的死亡时间（TD）和首次下沉时间（FST），并能降低MDA含量，提高SOD和GSH-Px活性，即肉苁蓉能提高阳虚小鼠的抗疲劳能力，且从行为学上看肉苁蓉主要增加游泳前期的耐力。王小新7等给予小鼠肉苁蓉粉末超声水溶液7天，结果显示抗疲劳试验中，高剂量组（100mg／kg）可以延长小鼠的游泳时间，抗疲劳作用显著增强。倪慧［38］考察了复方德赢vwin登录 片缓解疲劳的药效，给予药物30天后，1.000g／kg．bw剂量的复方德赢vwin登录 片能明显延长小鼠的负重游泳时间，增加小鼠肝糖原储备量，降低小鼠运动后血清尿素水平，表明其具有抗疲劳作用。 周海涛39等采用60％乙醇提取物对小鼠灌胃，试验结果表明：6.01gkg＇可以提高大鼠运动能力及心肌线粒体抗氧化酶能力（超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽过氧化物歧化酶（GSH-Px），从而减轻自由基对心肌线粒体膜和肌浆网膜造成伤害，抑制线粒体氧化损伤，从而延缓疲劳。彭亮40）等给予小鼠肉苁蓉茶35天后，1667、3333mg／kgBW剂量的肉苁蓉茶提取液，能够延长小鼠的负重游泳时间，增加小鼠的肝糖原的储备量，减小小鼠运动后的血乳酸量：同时能够延长小鼠在常压下缺氧存活时间及硝酸钠中毒后的存活时间，表明肉苁蓉茶可以提高小鼠的抗疲劳能力和常压耐缺氧能力。孙建等考察肉苁蓉水煎剂对小鼠抗疲劳能力的影响，给药30天后，高剂量（1.0g／mL）、低剂量（0.25g／mL）均使小鼠在疲劳转棒仪停留时间增加，同时，给药组小鼠血液中血红蛋白的含量较对照组明显增加，乳酸的含量明显降低，ATP酶的活性明显增强，说明给药后血液运输氧的能力增强，能量代谢改善，其中高剂量肉苁蓉水煎剂效果更加明显。王金芳2等研究肉苁蓉70％醇提物对小鼠抗疲劳影响，给药14天后，小鼠负重游泳实验结果为阳性，且血乳酸、血清尿素、肝糖元三项生化指标中血清尿素及肝糖原两项指标为阳性，结果表明人工种植肉苁蓉提取物具有缓解运动疲劳功能的作用。2 苯乙醇苷类抗疲劳作用研究进展Run-Lan Cai et al43从肉苁蓉中富集纯化苯乙醇苷类，探讨苯乙醇苷抗疲劳活性，试验结果表明，给药组（3周）与对照组相比，苯乙醇苷能够显著提高小鼠游泳时间，降低CK（磷酸激酶）、乳酸脱氢酶（LDH）、血乳酸（BLA）含量；提高血红蛋白（HGB）、萄糖含量：由此可知，苯乙醇苷能够降低游泳产生的肌肉伤害，减少无氧有害代谢产物的积累，提高能量储存等途径体现抗疲劳作用。马莉研究了首先红景天苷对小鼠的抗疲劳作用，实验表明，红景天苷能够延长小鼠力竭游泳时间，增加肝、肌糖原储备（静止状态下）、血红蛋白含量，减少运动中血乳酸的生成，从而判定红景天苷具有抗疲劳活性；在抗氧化方面，红景天苷可以提高SOD及GSH-Px活性，降低MDA含量（提高LDH活性）、CK／CK-MB活性，同时观察到给药组骨骼肌与心肌损伤轻微；在能量代谢方面，给药组MDH、SDH、PK活性均呈 现升高趋势；促进脂肪利用，减少蛋白质参与功能的比例，从不同角度解释抗疲劳机制的作用通路，也说明红景天苷发挥抗疲劳作用是多靶点进行的。王昊4同样从神经递质方面检测红景天苷抗疲劳的作用靶点，通过定点检测神经递质5-羟色胺、5-羟吲哚乙酸、多巴胺、去甲肾上腺素等单胺类神经递质的变化，揭示红景天苷抗疲劳对神经中枢的影响。3 多糖抗疲劳研究进展王一民等对杜仲多糖的抗疲劳活性进行评价，试验结果表明，高剂量多糖能够显著延长小鼠力竭游泳时间、降低血清CK（磷酸激酶）活性和BUN（血尿素氮）浓度，而这两项指标反映了杜仲多糖可能通过调节糖有氧代谢及抗氧化来发挥抗疲劳作用。顾佳雯等47人探讨了腹腔注射紫菜多糖（PY-G1）对小鼠（昆明雌性）疲劳游泳的影响，测定结果显示：PY-G1能延长游泳时间，增加肝、肌糖原含量，显著提高乳酸脱氢酶（LDH）活性，从而从提高能量储存、清除代谢产物延缓疲劳的发生。叶敏等4人考察了红托竹荪多糖（DRP）对负重小鼠游泳的影响，红托竹荪多糖能延长小鼠力竭游泳时间，降低力竭运动后小鼠BLA、BUN、MDA 含量：提高血清中SOD活性；同时，DRP低、高剂量组小鼠力竭运动后肌糖原和肝糖原显著高于空白对照组，通过测定抗疲劳相关生化指标，可确定红托竹荪多糖具有抗疲劳作用。黄燕峰等）建立慢性疲劳小鼠模型，给与小鼠黄芪多糖，观察其对小鼠骨骼肌线粒体功能的影响，结果显示，与模型组相比，给药后小鼠血清、骨骼肌中乳酸脱氢酶（LDH）活性、丙二醛（MDA）含量降低，谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性增加：同时检测给药组小鼠骨骼肌线粒体内氧化应激蛋白发现，MnSOD和p53水平下降，线粒体起源相关蛋白PGC-1a表达升高，自噬相关蛋白Atg7和LC3-II／LC3-I表达水平下降、p62表达水平升高：qRT-PCR法检测结果显示：Mnf-1和Mnf-2mRNA的表达水平升高，而Drp-1mRNA的表达水平则下降，说明黄芪多糖可提高慢性疲劳小鼠的运动耐力，其分子机制与降低组织内氧化应激水平，改善骨骼肌线粒体自噬、起源及线粒体融合-分裂有关。 4 其他药物抗疲劳相关机制研究进展上述对苯乙醇苷与多糖类成分的抗疲劳机制进行综合性论述后，以下收集了其余药物或化学成分可能的疲劳途径，对抗疲劳机制的研究进行补充说明。刘秀娟等（50人研究了甜菜碱对大鼠力竭运动的影响，甜菜碱补充可以延缓运动性疲劳的出现，明显延长大鼠运动至力竭的时间；同时减少运动中MDA的产生量，提高SOD、CAT、GSH-Px的活性，清除超氧化物，减少并抑制脂质过氧化物对组织的损害，起到抗氧化作用，对组织细胞起到保护作用。赵玉杰［5等人探讨了升阳益胃颗粒对抗疲劳的作用机制，试验结果显示，升阳益胃颗粒显著延长了力竭游泳时间，说明其能缓解大鼠慢性疲劳状态，同时提高骨骼肌线粒体中协同刺激因子1a（PGC-1a）和细胞色素氧化酶（COX）含量，初步探讨了升阳益胃颗粒抗疲劳作用的可能途径。刘翔2通过建立大强度耐力训练大鼠模型，测定垂盆草提取物对运动大鼠耐力的影响；结果表明，给药后，运动大鼠体内血糖、肝、肌糖原水平升高，同时血尿素氮（BUN）含量下降，说明垂盆草提取物能够提高运动大鼠体内糖储备，维持骨骼肌及红细胞能量供应，从而提高运动能力。综上所述，对于抗疲劳机制的研究，目前多数研究是以下3个角度进行探索：1）能量代谢：通过测定肝／肌糖原，尿素氮（BUN）、葡萄糖及血糖含量的变化，分析机体给予具有抗疲劳作用药物前后，能量转化及维持平衡的途径。2）抗氧化系统：测定给药前后SOD、CAT、GSH-Px、LDH等相关酶的活性，探索抗疲劳与抗氧化应激的关系。3）中枢系统：通过检测脑内5-HT、DA、NE、5-HIAA等神经递质的变化，揭示抗疲劳作用途径。

第二节 肉苁蓉抗疲劳作用研究进展1982年第5届国际运动生化会议上将运动型疲劳正式定义为“身体机能的生理过程不能持续在特定水平和／或整体不能维持预定的运动强度。暂时性的能量缺乏以及因此可能会导致的伤害促使研究者开始探索生理性疲劳的原因及消除疲劳方法。正常机体能量的供应中，来源物质主要是ATP、糖、蛋白质，短时间运动中机体会直接利用ATP，随着时间与运动强度的增加，继而摄取血糖及糖原、脂肪，功能物质的减少，直接导致了疲劳的发生，这是关于疲劳机制学说中“衰竭学说”的阐述：同时研究中考察最多的乳酸（BLA）指标，即为“堵塞”学说的基础，乳酸的积累会通过多种途径造成疲劳，有一种解释为，乳酸导致外周疲劳间的关联主要是通过H＋发生的，剧烈运动会导致细胞PH值下降，引起肌纤维最大张力、最大收缩速度、肌肉输出功率、收缩启动时间和放松能力下降等，这同时与内环境稳定性失调学说相关；此外，有关疲劳机制的学说还有突变理论、中枢神经理论等（3234。多数研究已表明肉苁蓉具有显著地抗疲劳作用，而其中有效成分为苯乙醇苷类与多糖，本小节将以肉苁蓉与其所含化学成分为基础，分类对其抗疲劳作用进行综述。1 、肉苁蓉抗疲劳研究进展陈飞在研究筋骨草的抗疲劳作用时，以肉苁蓉水煎液（5.0g／kg）为阳性对照，表明肉苁蓉抗疲劳作用已成为共识；龚梦娟同样也采用肉苁蓉水煎液考察其对阳虚小鼠抗疲劳作用的影响，结果表明，10g．kg＇肉苁蓉水煎液能延长阳虚小鼠负重游泳的死亡时间（TD）和首次下沉时间（FST），并能降低MDA含量，提高SOD和GSH-Px活性，即肉苁蓉能提高阳虚小鼠的抗疲劳能力，且从行为学上看肉苁蓉主要增加游泳前期的耐力。王小新7等给予小鼠肉苁蓉粉末超声水溶液7天，结果显示抗疲劳试验中，高剂量组（100mg／kg）可以延长小鼠的游泳时间，抗疲劳作用显著增强。倪慧［38］考察了复方德赢vwin登录 片缓解疲劳的药效，给予药物30天后，1.000g／kg．bw剂量的复方德赢vwin登录 片能明显延长小鼠的负重游泳时间，增加小鼠肝糖原储备量，降低小鼠运动后血清尿素水平，表明其具有抗疲劳作用。 周海涛39等采用60％乙醇提取物对小鼠灌胃，试验结果表明：6.01gkg＇可以提高大鼠运动能力及心肌线粒体抗氧化酶能力（超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽过氧化物歧化酶（GSH-Px），从而减轻自由基对心肌线粒体膜和肌浆网膜造成伤害，抑制线粒体氧化损伤，从而延缓疲劳。彭亮40）等给予小鼠肉苁蓉茶35天后，1667、3333mg／kgBW剂量的肉苁蓉茶提取液，能够延长小鼠的负重游泳时间，增加小鼠的肝糖原的储备量，减小小鼠运动后的血乳酸量：同时能够延长小鼠在常压下缺氧存活时间及硝酸钠中毒后的存活时间，表明肉苁蓉茶可以提高小鼠的抗疲劳能力和常压耐缺氧能力。孙建等考察肉苁蓉水煎剂对小鼠抗疲劳能力的影响，给药30天后，高剂量（1.0g／mL）、低剂量（0.25g／mL）均使小鼠在疲劳转棒仪停留时间增加，同时，给药组小鼠血液中血红蛋白的含量较对照组明显增加，乳酸的含量明显降低，ATP酶的活性明显增强，说明给药后血液运输氧的能力增强，能量代谢改善，其中高剂量肉苁蓉水煎剂效果更加明显。王金芳2等研究肉苁蓉70％醇提物对小鼠抗疲劳影响，给药14天后，小鼠负重游泳实验结果为阳性，且血乳酸、血清尿素、肝糖元三项生化指标中血清尿素及肝糖原两项指标为阳性，结果表明人工种植肉苁蓉提取物具有缓解运动疲劳功能的作用。2 、苯乙醇苷类抗疲劳作用研究进展Run-Lan Cai et al43从肉苁蓉中富集纯化苯乙醇苷类，探讨苯乙醇苷抗疲劳活性，试验结果表明，给药组（3周）与对照组相比，苯乙醇苷能够显著提高小鼠游泳时间，降低CK（磷酸激酶）、乳酸脱氢酶（LDH）、血乳酸（BLA）含量；提高血红蛋白（HGB）、萄糖含量：由此可知，苯乙醇苷能够降低游泳产生的肌肉伤害，减少无氧有害代谢产物的积累，提高能量储存等途径体现抗疲劳作用。马莉研究了首先红景天苷对小鼠的抗疲劳作用，实验表明，红景天苷能够延长小鼠力竭游泳时间，增加肝、肌糖原储备（静止状态下）、血红蛋白含量，减少运动中血乳酸的生成，从而判定红景天苷具有抗疲劳活性；在抗氧化方面，红景天苷可以提高SOD及GSH-Px活性，降低MDA含量（提高LDH活性）、CK／CK-MB活性，同时观察到给药组骨骼肌与心肌损伤轻微；在能量代谢方面，给药组MDH、SDH、PK活性均呈 现升高趋势；促进脂肪利用，减少蛋白质参与功能的比例，从不同角度解释抗疲劳机制的作用通路，也说明红景天苷发挥抗疲劳作用是多靶点进行的。王昊4同样从神经递质方面检测红景天苷抗疲劳的作用靶点，通过定点检测神经递质5-羟色胺、5-羟吲哚乙酸、多巴胺、去甲肾上腺素等单胺类神经递质的变化，揭示红景天苷抗疲劳对神经中枢的影响。3、 多糖抗疲劳研究进展王一民等对杜仲多糖的抗疲劳活性进行评价，试验结果表明，高剂量多糖能够显著延长小鼠力竭游泳时间、降低血清CK（磷酸激酶）活性和BUN（血尿素氮）浓度，而这两项指标反映了杜仲多糖可能通过调节糖有氧代谢及抗氧化来发挥抗疲劳作用。顾佳雯等47人探讨了腹腔注射紫菜多糖（PY-G1）对小鼠（昆明雌性）疲劳游泳的影响，测定结果显示：PY-G1能延长游泳时间，增加肝、肌糖原含量，显著提高乳酸脱氢酶（LDH）活性，从而从提高能量储存、清除代谢产物延缓疲劳的发生。叶敏等4人考察了红托竹荪多糖（DRP）对负重小鼠游泳的影响，红托竹荪多糖能延长小鼠力竭游泳时间，降低力竭运动后小鼠BLA、BUN、MDA 含量：提高血清中SOD活性；同时，DRP低、高剂量组小鼠力竭运动后肌糖原和肝糖原显著高于空白对照组，通过测定抗疲劳相关生化指标，可确定红托竹荪多糖具有抗疲劳作用。黄燕峰等）建立慢性疲劳小鼠模型，给与小鼠黄芪多糖，观察其对小鼠骨骼肌线粒体功能的影响，结果显示，与模型组相比，给药后小鼠血清、骨骼肌中乳酸脱氢酶（LDH）活性、丙二醛（MDA）含量降低，谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性增加：同时检测给药组小鼠骨骼肌线粒体内氧化应激蛋白发现，MnSOD和p53水平下降，线粒体起源相关蛋白PGC-1a表达升高，自噬相关蛋白Atg7和LC3-II／LC3-I表达水平下降、p62表达水平升高：qRT-PCR法检测结果显示：Mnf-1和Mnf-2mRNA的表达水平升高，而Drp-1mRNA的表达水平则下降，说明黄芪多糖可提高慢性疲劳小鼠的运动耐力，其分子机制与降低组织内氧化应激水平，改善骨骼肌线粒体自噬、起源及线粒体融合-分裂有关。 4、 其他药物抗疲劳相关机制研究进展上述对苯乙醇苷与多糖类成分的抗疲劳机制进行综合性论述后，以下收集了其余药物或化学成分可能的疲劳途径，对抗疲劳机制的研究进行补充说明。刘秀娟等（50人研究了甜菜碱对大鼠力竭运动的影响，甜菜碱补充可以延缓运动性疲劳的出现，明显延长大鼠运动至力竭的时间；同时减少运动中MDA的产生量，提高SOD、CAT、GSH-Px的活性，清除超氧化物，减少并抑制脂质过氧化物对组织的损害，起到抗氧化作用，对组织细胞起到保护作用。赵玉杰［5等人探讨了升阳益胃颗粒对抗疲劳的作用机制，试验结果显示，升阳益胃颗粒显著延长了力竭游泳时间，说明其能缓解大鼠慢性疲劳状态，同时提高骨骼肌线粒体中协同刺激因子1a（PGC-1a）和细胞色素氧化酶（COX）含量，初步探讨了升阳益胃颗粒抗疲劳作用的可能途径。刘翔2通过建立大强度耐力训练大鼠模型，测定垂盆草提取物对运动大鼠耐力的影响；结果表明，给药后，运动大鼠体内血糖、肝、肌糖原水平升高，同时血尿素氮（BUN）含量下降，说明垂盆草提取物能够提高运动大鼠体内糖储备，维持骨骼肌及红细胞能量供应，从而提高运动能力。综上所述，对于抗疲劳机制的研究，目前多数研究是以下3个角度进行探索：1）能量代谢：通过测定肝／肌糖原，尿素氮（BUN）、葡萄糖及血糖含量的变化，分析机体给予具有抗疲劳作用药物前后，能量转化及维持平衡的途径。2）抗氧化系统：测定给药前后SOD、CAT、GSH-Px、LDH等相关酶的活性，探索抗疲劳与抗氧化应激的关系。3）中枢系统：通过检测脑内5-HT、DA、NE、5-HIAA等神经递质的变化，揭示抗疲劳作用途径。

前言现代药理研究表明，肉苁蓉中具有抗氧化、抗疲劳、抗衰老、保肝等多种药效；其中有效成分为苯乙醇苷类与多糖，但目前国内外关于苯乙醇苷类与多糖相互作用研究较少，故本文以体外抗氧化和抗疲劳药效学试验分析探讨肉苁蓉有效成分的相互作用关系。收集不同产地肉苁蓉，首次综合分析肉苁蓉中苯乙醇苷类与多糖，从化学分析角度比较肉苁蓉品质；对肉苁蓉70％醇提物，苯乙醇总苷、多糖进行含量测定，以清除DPPH水平评价上述3者抗氧化能力；以isobologram 分析法研究苯乙醇苷类与多糖抗氧化相互作用方式；文章还将建立不同产地苯乙醇苷类指纹图谱，以Iso（清除 DPPH 能力）为药效指标，运用数理统计学（相关分析、灰关联度分析、偏最小二乘分析）对肉苁蓉抗氧化活性进行谱一效分析，最后通过 UPLC-Q-TOF／MS对肉苁蓉化学成分进行归属，发掘抗氧化活性成分。选取高品质肉苁蓉作为抗疲劳药效学试验用药，将苯乙醇苷类、多糖单独给药与合并给药，测定不同给药组下对小鼠抗疲劳作用的影响，从而探索苯乙醇苷类与多糖潜在的相互作用，推测有效成分发挥抗疲劳机制的途径。 第一章 文献综述本章综述将对肉苁蓉2大有效成分，苯乙醇苷类及多糖化学分析、药理活性方面进行综合叙述，为试验设计提供基本思路与数据参考；重点对肉苁蓉抗疲劳作用的研究进展、分子机制详细叙述：为文章谱效关系的分析，抗氧化、抗疲劳药效学试验的设计提供可借鉴方法。第一节 肉苁蓉属化学成分及药理活性研究进展目前药理研究表明，肉苁蓉种主要有效成分为苯乙醇苷类与多糖，现主要对这2种成分的研究进展进行讨论。1 苯乙醇苷类研究进展1.1 苯乙醇苷类化学成分查阅近10年文献，Yong Jiang etal对肉苁蓉属化学成分进行综述，包括荒漠肉苁蓉、盐生肉苁蓉、德赢vwin登录 等5个种，其中统计苯乙醇苷类化合物达到34种，环烯醚萜类化合物有17种，木质素类有6种，苯甲醇等其他类化合物共有9种。卢克刚等首次从荒漠肉苁蓉中分离得到次黄嘌呤核苷（inosine），2＇-脱氧腺苷（2＇-deoxyadenosine），2-甲氧腺苷（2＇-O-methyl-adenosine）；刘晓明等3首次从荒漠肉苁蓉种分离得到 plantainoside C、osmanthuside B。（Z／E）、芒柄花苷（ononin）、管花苷E（tubuloside E）、盐生肉苁蓉苷D（salsaside D）、盐生肉苁蓉苷E（salsasideE）6种化合物，其中前3种为首次从本属中分离得到。南泽东等人在肉苁蓉醇提物中分离出10余种化合物，之后其团队又继续发现一种新的化合物 cistadesertoside A。在最新的肉苁蓉属化学成分文献综述中，丁燕等5人统计的苯苷类化合物达到64种，环烯醚萜及其苷类化合物有25种，1个木质素苷元及12个木质素苷。同年，MavisBoakye-Yiadom 等16人从荒漠肉苁蓉种分离出一种新的化合物 kankanoside D1，从苯乙醇苷化学成分的发现来看，从2009至今，新增化学成分27种，使得肉苁蓉中一个又一个有价值的活性成分被挖掘利用。 1.2 苯乙醇苷药理研究进展在Lin-lin Wang7最新的文献综述中，概括了苯乙醇苷类化合物的药理研究进展，包括抗氧化能力，提高记忆与神经保护作用，保护脑细胞和抗凋亡作用，抗肿瘤活性，保肝作用，拟雌激素作用（植物雌激素），治疗骨质疏松症和骨折愈合，免疫调节作用，抗辐射，抗炎，治疗高原疾病，降血糖等其他作用。Hoi Shan Wong et al8建立高脂肪进食小鼠模型以验证肉苁蓉（Cd）的减肥效果及线粒体解偶联机制是否与其相关；结果表明通过肉苁蓉醇提纯化物喂养的模型小鼠体重显著降低，特别是在骨骼肌中通过线粒体解偶联的诱导。同时体重减轻也与改善胰岛素敏感有关。陶艺存等对高原肺水肿大鼠预防给与肉苁蓉（Ct）苯乙醇苷药物后，降低肺组织含水量，改善病理现象，同时测定的抗炎、抗氧化相关指标呈现阳性变化，由此推测肉苁蓉苯乙醇苷改善高原性肺水肿可能与抗炎、抗氧化机制相关。Elaine Wat et allo采用肉苁蓉水提物培养L6大鼠骨骼肌细胞，通过分析MTT染色后膜联蛋白VFITC／PI变化与胱天蛋白酶-3活性，探讨其是否对辛伐他丁诱导引起的细胞凋亡具有保护作用，同时检测ATP的产量变化；结果表明肉苁蓉水提物可能通过胱天蛋白酶-3信号通道改善（呈剂量依赖性）由辛伐他丁引起的肌肉毒性副作用，同时会导致ATP含量降低。Qian Yu et all研究了肉苁蓉（Cd）苯乙醇的心肌保护作用及相应信号通路；结果显示用PhG-RE治疗后，心脏梗塞面积显著减少；CK-MB和LDH活性降低，同时降低MDA水平，升高GSH-Px，SOD活性；细胞色素C的表达在治疗组明显降低，同时在治疗组观察到抗凋亡蛋白Bcl-2／Bax上调与裂解的半胱天冬酶-3下调；PhG-RE可以降低再灌注心肌的氧化应激，对抑制凋亡途径起重要作用，进行心脏保护。Wei-Yong Lin et al2）给予果蝇德赢vwin登录 水提物粉末制剂进行氧化应激、饥饿、迷宫认知等试验，通过定量RT-PCR的靶基因转录水平推测相关信号通路，结果显示Notch信号通路、Nmdarl and Nmdar2（N-甲基-D-天冬氨酸受体）为德赢vwin登录 改善记忆潜在的作用机制：由Silent information regulator（沉默信息调节器）调整的 forkhead boxtranscription factor（叉头框转录因子）可能为延长寿命的作用通路，同时结果显示抗氧化机制也与延长生命相关；另一种关键的抗衰老途径由mTOR的复合物（mTORC1 and

荒漠肉苁蓉（Cistanche deserticola Y.C.Ma）为传统的补肾助阳中药，简称肉苁蓉，具有增力、补肾壮阳、益精血等传统疗效，用于阳痿，不孕，腰膝酸软，筋骨无力，肠燥便秘等症状。化学研究进展表明其主要成分苯苷类、木脂素及其苷类、环烯醚萜及其苷类、生物碱、多糖等；其中苯乙醇苷类主要针对抗疲劳、抗衰老、抗氧化、抗心肌缺血、保肝等疗效，多糖则主要应用于免疫功能；而从目前国内外研究现状来看，肉苁蓉增力作用的有效成分及其相互作用关系尚未明确，故本文针对肉苁蓉增力作用，对其主要有效成分苯乙醇苷类和多糖进行化学分析，以抗氧化、抗疲劳药效学试验初步研究两者的相互作用关系，初步阐述肉苁蓉增力有效成分及其相互作用关系。1 文献综述对有关肉苁蓉的文献报道作出系统性梳理，对苯乙醇苷类与多糖类化学成分与药理研究进展进行总结，为论文实验设计提供研究背景。2 苯乙醇苷类与多糖类定性分析收集不同产地肉苁蓉，制备70％醇提物（主要含苯乙醇苷类）与多糖类成分。通过定性分析苯乙醇苷类含量发现，肉苁蓉中所含苯乙醇苷类主要以松果菊苷与毛蕊花糖苷为主，且秋季采收含量普遍高于春季；野生方式生长则更有利于苯乙醇苷类的积累。多糖检测表明，不同产地肉苁蓉中多糖分子量分布也呈现出较大差异：16种产地肉苁蓉多糖水解后，葡萄糖在所测7种单糖中所占比例达到50％以上，其次为半乳糖和阿拉伯糖。3 苯乙醇苷类与多糖抗氧化活性及相互作用分析体外清除自由基试验中，苯乙醇总苷ICso为14.39 μg＊mL，70％醇提物为44.57μg＊mL，多糖为261.3μg＊mL；纯化后苯乙醇苷类成分抗氧化活性提高约2倍，根据isobologram 分析方法，以单一化合物1Cso为基础，结果表明苯乙醇苷类和多糖是以协同作用发挥抗氧化药效；含量测定中，肉苁蓉70％醇提物通过纯化分析获得苯乙醇总苷，以松果菊苷与毛蕊花糖苷计算，含量由1.9％提高至17％，苯酚硫酸法测得多糖含量为86.87%。 肉苁蓉70％醇提物指纹图谱，体外抗氧化（清除DPPH）药效指标，运用偏最小二乘分析法、相关性分析、灰关联度综合分析肉苁蓉中抗氧化活性成分，结果表明，指纹图谱共匹配17个共有色谱峰，论文成功鉴定其中12个化学成分，即松果菊苷、毛蕊花糖苷及其异构体、肉苁蓉苷A及其异构体、肉苁蓉苷F、cistantubuloside C1／C2、管花苷A、syringalide A-3-a-L-rhamnopyranoside(kankanoside G)、2'-acetylacteoside、kankanoside F、 kankanose。在对共有特征峰进行归属时，首次在荒漠肉苁蓉中发现 salsaside C1／C2、kankanoside F、kankanoside G、kankanose4种化学成分，7种未知结构化合物，为肉苁蓉化学成分的挖掘提供数据基础。5 苯乙醇苷类与多糖抗疲劳及相互作用分析肉苁蓉增力作用也与其抗疲劳作用密切相关。前期摸索发现，肉苁蓉（生药）在1、2、4gKg＇剂量下均能显著延长小鼠力竭游泳时间，在最优剂量2g·Kg＇下，将苯乙醇苷类与多糖单独给药、合并给药，探索苯乙醇苷类与多糖对疲劳状态的影响及其相互作用关系。结果表明，与对照组相比，单独给予苯乙醇苷类能够显著增加小鼠体内肝糖元含量，延长力竭游泳时间（P＜0.01）；单独给予多糖能够显著降低血乳酸水平（P＜0.01）；而在清除尿素含量一项，苯乙醇苷类与多糖单独给药、合并给药均未显示出显著性降低；综上所述，肉苁蓉在发挥抗疲劳作用时，其有效成分苯乙醇苷类和多糖是通过不同途径及作用方式发挥药效。关键词：荒漠肉苁蓉；苯乙醇苷：多糖；谱效：相互作用；抗疲劳；抗氧化；

摘要: 目的探索肉苁蓉含药血清对人骨肉瘤化疗耐药MG － 63 细胞的逆转作用及对多药耐药蛋白1( MＲP1) 和P53 蛋白表达的影响。方法通过肉苁蓉水溶液灌胃SD 大鼠获得高、中、低剂量组的含药血清及空白组血清。贴壁培养法培养MG － 63 细胞，MTT 法检测药物干预前MTX 的IC50值，将MG － 63 细胞分为高剂量组( A) 、中剂量组( B) 、低剂量组( C) 、空白组( N) ，采用IC50浓度的MTX 分别干预各组贴壁细胞，24 h 后A、B、C 组加入相应的肉苁蓉含药血清，空白组加入对照组血清，持续干预至盐水组细胞在IC50浓度的MTX 中稳定生长各组停止干预。MTT 法检测各组细胞对MTX 的耐药倍数，流式细胞仪检测MＲP1 的表达，Western blot 检测P53 蛋白的表达。结果干预后A、B、C、N 四组细胞耐药指数( ＲI) 依次为: 1． 80、2． 55、2． 84、3． 74; 肉苁蓉含药血清干预后各组细胞MＲP1 的表达均下调，与空白组相比较有明显统计学差异( P ＜ 0． 001) ; 相比较于空白组，药物干预后各组P53 蛋白表率达均下调，各组比较有统计学意义( P ＜ 0． 01) 。结论肉苁蓉能有效逆转化疗耐药骨肉瘤MG － 63 细胞的耐药性，其机制可能与下调MＲP1 及P53 蛋白的表达有关。关键词: 骨肉瘤; 化疗耐药; 多药耐药相关蛋白1; P53 蛋白; MG － 63; 肉苁蓉骨肉瘤( Osteosarcoma，OS) 是临床最多见的原发恶性骨肿瘤，起源于间叶组织，多见于青少年，好发于股骨远端和胫骨近端，病死率高［1］。Ｒosen 在1978 年首次提出了辅助化疗联合手术切除的理念，近年来由于新辅助化疗理念的不断完善已将OS患者5 年生存率从20% 提升至70%［2］。OS 治疗的成败需综合手术完整的切除与化疗敏感性综合评估，术前化疗可有利于瘤体完整的切除，肿瘤细胞对化疗药的耐药是导致术后局部复发与转移的最常见原因，因此，化疗的高敏感性对OS 患者的预后及生存期有着重要的临床意义，而耐药是OS 患者化疗失败最常见且最难解决的问题之一。近年来，中药因其低毒、多通路协同抗肿瘤的优势，研究者们对于中医药逆转肿瘤耐药性的研究做了大量开拓性的研究，且部分研究得到了佐证。大多扶正类药物如人参［3］、黄芪［4］等中药，不仅可以提高自身免疫功能，同时也可以逆转肿瘤细胞的多药耐药，肉苁蓉可改善肿瘤化疗后造血和免疫功能低下，有增效减毒之效［5］。OS 化疗抵抗的患者往往表现为免疫功能及造血功能的低下，因此，本研究在体外试验的水平上，通过观察肉苁蓉含药血清对人骨肉瘤MG － 63 /MTX 耐药细胞P 糖蛋白( P － glycoprotein，P － gp) 及多药耐药相关蛋白1( MDＲ － associated protein 1，MＲP1) 的影响，初步探索肉苁蓉逆转骨肉瘤化疗耐药的分子机制。1 材料与仪器1． 1 细胞株MG － 63 细胞，购自上海中科院细胞研究所。1． 2 动物SPF 级SD 大鼠［10 周龄，体重( 270 ± 30) g］88 只，购自甘肃中医药大学实验动物中心，动物合格证号:62001000000427。1． 3 试剂胎牛血清、0． 25% Trypsin － EDTA、高糖DMEM 培养基( Cellmax 公司，批号分别为: 20161213、20171102、20170919) ;甲氨蝶呤( 大连美仑生物技术有限公司，批号: 15475 － 56 － 6) ;肉苁蓉( 甘肃天力士中天药业有限责任公司，批号: 1802025) ，由甘肃数字草本检验中心有限公司鉴定; MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒( 大连美仑生物技术有限公司，货号: MA0198) ; 兔单克隆抗体P53 抗体( abcam 公司，批号: ab32389) ; 山羊抗兔( bioeasy 公司，批号: BE0101) ; 鼠抗人单克隆抗体MＲP1 抗体( Biolegend 公司，批号: 370104) 。1． 4 仪器MCO － 5AC 型细胞培育箱( 日本三洋电机公司) ; ＲT－ 6100 型酶标仪( 深圳雷杜生命科学股份有限公司) ; SW － CJ －1 FD 型超净台( 苏州净化股份有限公司) ; LMQ 型高压蒸汽灭菌机( 山东新华医疗器械有限公司) ; TDZ4 － WS 型低速离心机( 长沙平凡仪器有限公司) ; XK96 － 3 型微量振荡器( 姜堰市医疗器械有限公司) ; PowerPoc 型凝胶电泳仪( 美国Bio － rad 公司) ;ChemiDocTM 型凝胶成像分析仪( 美国Bio － rad 公司) 。2 实验方法2． 1 制备含药血清将肉苁蓉制备为全药粉末，沸水稀释。随机将大鼠分为四组，高剂量组( 7． 2g·kg － 1 ) 、中剂量组( 0． 72g·kg － 1 ) 、低剂量组( 0． 36g·kg － 1 ) 及盐水灌胃组，每日2 次，连续灌胃7d。第7 天给药后60 min 内所有大鼠均在10% 水合氯醛( 3ml /kg) 麻醉下心脏采血。静置1． 5h 后，4℃ 4000r /min 离心10min，收集上层血清， 15ml 离心管分装，再次离心取上层血清后0． 22μm 滤膜过滤除菌，－ 80℃冰箱保存待用。2． 2 药物干预前MTT 法测定MTX 对MG － 63 细胞的IC50 MG－ 63 细胞在25cm2 的透气培养瓶贴壁培养，隔48h 用含10%FBS 的H － DMEM 培养基换液，5% CO2、37℃恒温培养箱中培养。取处对数生长期的MG － 63 细胞，胰酶消化，调整密度至4 × 104 /ml 的单细胞悬液，按照MTX 的梯度浓度( 20，5，0． 5，0． 05，0． 005，0) μg·ml － 1 接种6 组细胞到96 孔板，每个浓度设5 复孔，每孔180μl，4h 后依次加入各浓度的MTX，48 小时后各孔加入20μl MTT( 5mg·L － 1 ) ，4h 后弃孔内废液，各孔加入200μl DMSO，摇床上震荡，10min 后96 孔板于全自动酶标仪上检测各孔560nm 的吸光度，重复3 次。计算各浓度下MTX 对MG － 63 细胞的抑制率，以药物浓度和抑制率做回归分析后得到IC50值。2． 3 分组干预及细胞耐药诱导将MG － 63 细胞分为肉苁蓉高剂量( A) 组、肉苁蓉中剂量( B) 组、肉苁蓉低剂量( C) 组及对照( N) 组。取对数生长期的人骨肉瘤MG － 63 细胞，胰酶消化后制备成悬液，调整密度为5 × 105 个，接种4 小时后4 组均加入含IC50浓度的MTX 的完全培养液，各组分别加入相应浓度的肉苁蓉含药血清， 24h 后换液，各组细胞活性恢复后，重复上述步骤，培养至N 组细胞可以在含MTX 的培养液中稳定生长以后，各组均干预。2． 4 MTT 法检测药物干预后MG － 63 细胞对MTX 的耐药指数同“2． 2”的方法测定药物干预后MTX 对MG － 63 细胞的IC50，计算耐药倍数。2． 5 流式细胞仪检测肉苁蓉对化疗MG － 63 耐药细胞MＲP1 的表达干预完成后，4 组各取一瓶，胰酶消化后制备成单细胞悬液，4℃、1200 r /min 离心5min，弃上清，加入5ml PBS，4℃、1200 r /min离心5min，去上清，取106 个细胞于1． 5 ml EP 管，加1ml PBS，4℃、1200 r /min 离心5min，去上清，加50μl PBS，混匀后加5μl MＲP1 抗体， 15min 后加入500μl PBS，混匀后上机检测，重复3 次，取均值。2． 6 蛋白印迹法检测肉苁蓉对化疗MG － 63 耐药细胞P53 蛋白的表达各组取1 瓶对数期细胞，细胞裂解后提取总蛋白，BCA 法定量样品蛋白，95℃ 水浴锅煮沸10 min，制备10% 的分离胶及5%的浓缩胶，蛋白上样30μg，80V 恒压电泳至染料到达分离胶底部停止电泳，恒流120mA 转膜1 h，5% 脱脂奶粉封闭60 min，加入P53 一抗( 1∶ 1000 比例稀释) ，4℃、摇床上孵育过夜，次日PBST 洗涤3 次，每次10 min，加入山羊抗兔辣根酶标记的二抗( 1∶ 5000) ，室温孵育1 h，PBST 洗涤3 次，每次10 min，调整凝胶成像分析仪的相关参数，ECL 发光液显影并采集图像信号， Image J软件分析各组条带灰度值，通过样品蛋白与内参蛋白的灰度值比值，间接分析P53 的相对表达量。2． 7 统计学分析所有数据均采用SPSS 22． 0、GraphPad Prism 7统计软件处理，计量资料以珋x ± s 表示，组间样本比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 检验，以P ＜ 0． 05 判断为差异有统计学意义。3 结果3． 1 各组细胞MTX 药敏测定与正常MG － 63 细胞相比，各组药物干预后的耐药细胞对MTX 的IC50均升高( 表1) ; 与N 组相比，药物干预后的三组细胞对MTX 的IC50降低，A 组明显低于空白组。各组耐药指数( ＲI) 分别为: 1． 80、2． 55、2． 84、3． 74。3． 2 各组细胞MＲP1 蛋白的表达结果与空白组相比，肉苁蓉含药血清干预后各组MG － 63 细胞中MＲP1 蛋白表达率明显降低，有显著统计学差异( P ＜ 0． 001) ; 同时，MＲP1 蛋白的表达与肉苁蓉含药血清浓度呈负相关，A 组MＲP1 的表达最低，与B 组、C 组比较有统计学差异( P ＜ 0． 01) 。见图1，表2。3． 3 各组细胞P53 蛋白的表达结果与空白组相比，肉苁蓉含药血清干预组细胞中P53 蛋白率明显呈低表达，有统计学差异( P＜ 0． 01) ，高、中剂量组细胞中P53 表达明显降低，与空白组比较有显著差异( P ＜ 0． 001) ( 图2，表3) ，且P53 蛋白的表达率与药物的浓度呈反比关系。4 讨论化疗耐药性的产生会使得肿瘤细胞免受化疗药物攻击，是影响OS 患者化疗效果的关键因素。研究发现肿瘤化疗的敏感性与药物的活化摄运障碍、肿瘤细胞DNA 修复能力提高、细胞周期阻滞与凋亡失衡、自噬等有关［6，7］，其中关系最密切的是抗癌药物的活化摄运障碍，肿瘤细胞可借某些膜蛋白的跨膜转运功能将化疗药物排出细胞外，从而达到降低细胞内有效药物浓度的目的，进而降低化疗药物的杀伤作用。ABC 跨膜转运家族成员P －gp 及MＲP1 的表达异常与化疗药物的外排作用密切相关，主要通过将化疗药物由胞内转至胞外，降低了OS 细胞内有效作用浓度，从而产生耐药性［8，9］。P53 基因与细胞周期及凋亡、细胞DNA 损伤的修复等生物学功能有关，分为野生型和突变型［10］。野生型P53 可将细胞周期阻滞到G0期，最终导致细胞的程序性死亡［11］，但因其不稳定的性质，极易突变，其半衰期仅20 ～ 30 min，故不易被检测。突变后的P53 基因的稳定性增加，同时半衰期延长到了2 ～ 12 小时，容易被检测［12］。突变后的P53 基因不但会导致肿瘤细胞的过度增殖，诱发肿瘤新生，而且会抑制正常的细胞色素C 的释放［13，14］。在OS 中，秦晓飞［15］发现OS 组织P53 蛋白阳性表达率升高，与患者化疗敏感性降低及预后不良有关。Zhang ZF 等［16］认为OS 细胞的迁移与恶性增殖度与P53 密切相关，沉默P53 基因可降低OS 细胞的增殖与迁移率。MＲP1 基因与P － gp 的功能相似，可借助耦合物谷胱甘肽、谷胱甘肽转移酶耦将化疗药物泵出胞外［8］。已有的研究发现MＲP1 蛋白的表达率与多种肿瘤细胞的耐药性相关，且与患者的预后相关。MＲP1 的表达与骨肉瘤的恶性程度及耐药性产生过程有着密切的关联，如屠重棋等［17］通过对比正常骨组织和OS 组织中MＲP1 的表达，发现MＲP1 在OS 中存在表达，且与恶性程度呈正相关。Tao Y 等［18］发现与人骨肉瘤MG63 和HOS 耐药细胞中CD133、MＲP1、MDＲ1 均呈高表达。张洪泉等［19］发现肉苁蓉多糖可以增强小鼠Lewis 肺癌和小鼠S180 肉瘤的抑制率。刘智勤［5］发现肉苁蓉对抗环磷酰胺化疗S180 小鼠有增效减毒之效。最新研究发现肉苁蓉苯乙醇苷可通过诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞提高黑色素瘤荷瘤小鼠生存期，提高了肿瘤小鼠的存活率［20］。现代研究表明，肉苁蓉具有提高免疫力、抗氧化、抗衰老、保肝、保护心肌、抗肿瘤等作用［21］，本次研究发现肉苁蓉在体外水平具有有逆转人骨肉瘤化疗MG － 6 细胞对MTX 的耐药作用，机制可能与肉苁蓉下调MＲP1 及P53 蛋白的表达水平有关，且下调水平与药物浓度呈正相关。但参与OS 产生化疗抵抗的机制较多，如DNA 损伤修复学说、酶系统介导的耐药、自噬等，因此肉苁蓉逆转化疗MG － 63 细胞的耐药性是否与其他机制参与有待进一步研究。参考文献:［1］ Xiao X，Wang W，Wang Z． The Ｒole of Chemotherapy for Metastatic，Ｒelapsed and Ｒefractory Osteosarcoma［J］． Pediatric Drugs，2014，16( 6) : 503．［2］ Zhang CL，Hu JP，Zhu KP， et al． Complications and functional outcomesof cemented megaprostheses for high － grade osteosarcoma around theknee［J］． Int Orthop，2018， 42( 4) : 927．［3］ 闫克敏，肖海娟，杨林，等． 人参皂苷Ｒh2 对结肠癌耐药细胞HCT116 /L － OHP 侵袭迁移能力的影响［J］． 中国实验方剂学杂志，2019， 25( 13) : 73．［4］ 孙舒玉，何小鹃，罗丹，等． 黄芪多糖对顺铂治疗S180 荷瘤鼠的增效减毒作用［J］． 中国中医基础医学杂志， 2013， 19( 9) : 1031．［5］ 刘智勤，陈鹊汀，李岩，等． 肉苁蓉对化疗荷瘤小鼠增效减毒作用的研究［J］． 时珍国医国药，2011，22( 4) : 1037．［6］ 范璐，臧俊亭，冯娜，等． 骨肉瘤化疗及耐药分子机制的研究进展［J］． 癌症进展，2019，17( 21) : 2495．［7］ Chou AJ，Gorlick Ｒ． Chemotherapy resistance in osteosarcoma: currentchallenges and future directions［J］． Expert Ｒev Anticancer Ther，2006，6( 7) : 1075．［8］ 王超，方平飞，蔡骅琳． ABC 膜转运蛋白及其调控在肿瘤耐药和解毒新机制中的研究进展［J］． 中国药学杂志，2017，52( 22) : 1961．［9］ Orelle C，Mathieu K， Jault JM． Multidrug ABC transporters in bacteria［J］． Ｒes Microbiol，2019，170( 8) : 381．［10］ Yang J，Li YH，He MT， et al． HSP90 regulates osteosarcoma cell apoptosisby targeting the p53 /TCF － 1 － mediated transcriptional network［J］． J Cell Physiol， 2020，235( 4) : 3894．［11］ Chen YQ，Yang TQ，Zhou B， et al． HOXA5 overexpression promotes osteosarcomacell apoptosis through the p53 and p38α MAPK pathway［J］． Gene，2019， 689( 3) : 18．［12］ 于英君，张庆梅，郭丽新，等． 树舌多糖GF 对HepA 瘤细胞p53 基因表达的影响［J］． 中医药学报，2002，30( 2) : 56．［13］ Levine A J，Momand J，Finlay C A． The p53 tumour suppressor gene［J］． Nature，1991， 351( 6326) : 453．［14］ Dumont P，Leu I J，Della Pietra A C，et al． The codon 72 polymorphicvariants of p53 have markedly different apoptotic potential［J］． NatGenet，2003，33( 3) : 357．［15］ 秦晓飞，韩志，张勇勇，等． 骨肉瘤组织p53、鼠双微体2 蛋白表达及意义［J］． 山东医药，2016，56( 32) : 41．［16］ Zhang ZF，Xu HH，Hu WH，et al． LINC01116 promotes proliferation，invasion and migration of osteosarcoma cells by silencing p53 and EZH2［J］． Eur Ｒev Med Pharmacol Sci， 2019， 23( 16) : 6813．［17］ 屠重棋，田永刚，裴福兴． 多药耐药相关蛋白1 在骨肉瘤中的表达［J］． 四川大学学报( 医学版) ，2003，34( 4) : 684．［18］ Tao Y，Ou Y，Yin H， et al． Establishment and characterization of humanosteosarcoma cells resistant to pyropheophorbide － α methyl ester － mediatedphotodynamic therapy［J］． Int J Oncol，2017，51( 5) : 1427．［19］ 张洪泉，许爱华，李电东． 肉苁蓉多糖对肿瘤和荷瘤小鼠的药理作用［J］． 中国中西医结合杂志， 1997， 17( S1) : 155．［20］ Li JY，Li JY，Aipire A， et al． Phenylethanoid Glycosides from Cistanchetubulosa Inhibits the Growth of B16 － F10 Cells both in Vitro and in Vivoby Induction of Apoptosis via Mitochondria － dependent Pathway［J］． J Cancer，2016，7( 13) : 1877．［21］ 薛海燕，焦婵媛，姚军． 肉苁蓉总苷药理作用的研究现状［J］． 中国临床药理学杂志，2018，34( 4) : 486．

［摘要］ 目的：研究肉苁蓉对感染性休克肝线粒体功能的影响‚探讨肉苁蓉在细胞水平治疗感染性休克的机制。方法：40只SD 大鼠随机分为5组：假手术组‚12h 对照组‚12h 给药组‚16h 对照组和16h 给药组。采用盲肠结扎穿孔术（CLP） 复制感染性休克模型‚比较各组存活率和平均动脉压（MAP）‚肝线粒体ATP 酶活性‚呼吸控制率（RCR）‚ADP／O 比值的变化。结果：大鼠在复制感染性休克模型后‚肝线粒体ATP 酶活性‚呼吸控制率和ADP／O 比值显著降低‚24h 存活率明显下降。给药组肝线粒体ATP酶活性‚呼吸控制率（RCR） 和ADP／O 比值较对照组明显改善（ P ＜0∙05）‚与大鼠死亡率的降低呈明显正相关。结论：肉苁蓉能增强线粒体摄氧功能和氧化磷酸化功能‚恢复感染性休克线粒体的正常的能量代谢功能。［关键词］ 肉苁蓉；感染性休克；线粒体；ATP 酶；RCR；ADP／O感染性休克是临床急危重症‚死亡率高‚寻找和开发有效治疗药物一直是困扰科研和临床工作者的重大问题。近年国内学者对中药在感染性休克中的作用进行了广泛的研究‚发现丹参‚参附‚大黄‚肉苁蓉和许多中药复方制剂对感染性休克中多器官衰竭具有确切疗效‚能显著降低实验动物并发症和死亡率‚但其具体作用机制尚不清楚。研究资料表明‚感染性休克早期线粒体的摄氧功能和氧化磷酸化功能明显降低‚直接促成了感染性休克后期的发展变化‚线粒体的损伤在感染性休克中的作用不容忽视。改善感染性休克各器官线粒体功能可能是中药治疗机理之一。本实验中我们观察了肉苁蓉对感染性休克大鼠肝脏线粒体ATP 酶活性和呼吸控制率（RCR）‚ADP／O 比值的影响以及与大鼠死亡率之间的关系‚为阐明肉苁蓉治疗感染性休克的机制进行积极探索。1　材料与方法1∙1　材料1） 试药与仪器　肉苁蓉1200g‚蒸馏水煎2次‚所得滤液蒸发浓缩至浓度1000g／L。戊巴比妥钠（001104）‚中国医药集团上海化学试剂公司；ATP 酶试剂（20030108） 南京建成生物工程研究所。JYD-IA 溶氧测定仪‚江苏电分析仪器厂。2） 实验动物　雄性SD 大鼠40只‚体重（210±20） g‚购自华中科技大学同济医学院实验动物中心。1∙2　方法1） 动物分组与给药　动物随机分为5组‚每组8只‚假手术组‚12h 对照组‚12h 给药组‚16h对照组和16h 给药组。假手术组和对照组给予生理盐水灌胃‚给药组予1000g／L 肉苁蓉灌胃‚2次／d‚连续15d。采用盲肠结扎穿孔术［1］ 复制感染性休克模型‚手术前动物自由饮水‚禁食12h。2） 平均动脉压的测定　颈静脉插入头皮针‚肝素抗凝‚左侧颈总动脉插管至主动脉弓处‚用自制导管与生理多道仪相连‚记录平均动脉压（MAP）‚待MAP 平稳后进行实验。3） 线粒体ATP 酶活性测定　取大鼠肝脏6g 迅速置于0℃分离介质〔蔗糖250mmol／L‚乙羟乙基哌嗪2-乙基磺酸2mmol／L‚乙二胺四乙酸0∙1mmol／L‚pH 7∙4〕‚剖开洗去杂质‚以分离介质悬浮（1∶10）‚用Teflon 电动匀浆器匀浆（1200r／min）‚以2000r／min 离心10min‚留置上清液‚以10000r／min离心15min‚弃去上清液‚取沉淀物以2mL 分离介质进行悬浮得到线粒体悬液‚全部过程在0℃～4℃进行。采用定磷法［2］ 测ATP 酶活性。4） 线粒体呼吸功能的测定　采用Clark 氧电极法［3］ ‚取反应介质（0∙225mol／L 蔗糖‚15mmol／LKCl‚15mmol／L KH2PO4‚50mmol／L trisHCl‚1mmoL／L EDTA‚pH7∙5） 2∙9mL‚加入搅拌反应杯中‚恒温30℃。加入线粒体悬液0∙1mL‚以琥珀酸（终浓度10mmol／L） 为底物‚反应1min 后‚加入600nmol／L ADP‚用JYD-IA 溶氧测定仪记录线粒体氧化还原反应曲线‚计算Ⅲ态‚Ⅳ态‚RCR和ADP／O 比值。1∙3　统计学处理实验数据以均数±标准差表示‚SPSS 软件进行单因素方差分析和相关分析。P ＜0∙05为差异有显著性。2∙1　大鼠平均动脉压和24h 死亡率变化盲肠结扎穿孔术后‚对照组大鼠12h 血压显著降低‚16h 更趋明显‚与假手术组比较‚差异有显著性‚见表1。肉苁蓉治疗组血压得到改善。对照组死亡率与假手术组相比较‚死亡率显著上升‚给药组死亡率较相应对照组明显降低。2∙2　线粒体呼吸功能的变化　　对照组呼吸Ⅲ态速率‚明显低于假手术组（P ＜0∙01）‚Ⅳ态呼吸速率较假手术组变化不大‚而对照组RCR 显著低于假手术组（P ＜0∙01）‚给药组RCR较接近于假手术组。对照组ADP／O 比值随时间延长逐渐降低‚见表2。肉苁蓉治疗组其比值逐渐回升‚与假手术组相比‚差异具有显著性‚与大鼠死亡率呈显著的正相关（r ＝0∙892）。2∙3　线粒体ATP 酶活性变化给药组钠钾ATP 酶‚钙ATP 酶‚镁ATP 酶‚钙镁ATP 酶活性均显著高于相应对照组‚达到假手术组水平‚见表3。与大鼠死亡率降低呈显著的正相关（ r ＝0∙834）。3　讨　　论摄氧功能和氧化磷酸化功能是线粒体能量代谢的重要组成部分。感染性休克造成组织急性缺氧使线粒体内膜呼吸功能复合体得不到及时氧供应‚NADH 不能经呼吸链氧化成NAD＋‚质子不能从呼吸链上脱落‚呼吸链传递功能受阻‚氧化磷酸化严重障碍。感染性休克中急性缺血缺氧线粒体内膜损伤‚通透性增加‚肿胀‚内膜蛋白、脂类组分丢失‚有序结构改变‚流动性降低是直接导致线粒体摄氧功能障碍和电子传递活性下降的原因。本实验中对照组12h Ⅲ态和RCR 较假手术组显著降低（P ＜0∙05）‚16h组更趋严重（P ＜0∙01）。Ⅲ态下降提示感染性休克肝线粒体膜电子传递链损伤‚ATP 合成酶活性下降。RCR 是线粒体在有ADP 时的快速摄氧速率与ADP 耗尽后的摄氧速率之比值‚它是评价线粒体完整性和氧化磷酸化偶联程度的灵敏指标之一。本实验观察到‚肉苁蓉给药组RCR 和Ⅲ态显著上升‚表明电子传递链速度加快‚氧化磷酸化藕联程度提高。Na＋-K＋-ATP 酶镶嵌于线粒体内膜‚是保证线粒体结构和功能的重要离子泵。实验中对照组该酶活性下降‚提示感染性休克线粒体内膜存在严重钠泵功能障碍‚致线粒体内膜水肿‚线粒体膜流动性下降。Hackenbrock 和Slater 研究表明呼吸链上电子传递过程和氧化磷酸化藕联过程均依赖于呼吸链活性成分在内膜中的侧向扩散和碰撞‚即膜流动性。膜流动性增大‚则电子传递加快［4‚5］ 。蒋建新等［6］ 研究发现感染性休克肝线粒体微粘度‚各向异性和荧光偏振度都非常显著地升高。这些都提示膜流动性显著降低可能是线粒体氧化磷酸化功能障碍的重要原因之一。Na＋-K＋-ATP 酶是维持线粒体膜流动性正常的关键酶‚肉苁蓉能显著提高Na＋-K＋-ATP 酶活力可能是肉苁蓉改善线粒体能量代谢的重要机理。保持细胞内钙和镁的稳定是维持细胞内释放反应和信息传递的必须物质基础［7］ 。实验中对照组钙ATP 酶活性下降直接影响钙泵活性‚钙泵活性下降‚使线粒体钙泵向细胞外排Ca2＋ 的作用减弱‚线粒体内Ca2＋超载。线粒体内钙超载是线粒体氧化磷酸化障碍‚结构受损和细胞坏死的重要原因［8‚9］ 。对照组RCR 较假手术组急剧下降可能与线粒体内钙超载有关。同时我们也发现肉苁蓉治疗组镁ATP 酶和钙镁ATP 酶活力较对照组高。镁ATP 酶和钙镁ATP 酶是维持细胞内钙镁平衡的重要物质‚Widner报道细胞内镁离子的减少是细胞不可逆损伤的诱发因素‚Mg2＋／Ca2＋比值是反映细胞不可逆损伤的重要指标［10］ 。肉苁蓉维持细胞内钙酶稳态是肉苁蓉恢复细胞正常能量代谢的重要前提。总之‚肉苁蓉能从细胞水平降低线粒体内膜通透性‚维持内膜正常有序结构和线粒体膜流动性‚改善线粒体呼吸功能‚加快电子呼吸链的传递‚提高氧化磷酸化效率‚稳定细胞内钙镁稳态‚减少自由基形成‚增强线粒体能量代谢功能‚这是肉苁蓉能从整体升高感染性休克平均动脉压和降低模型给药组的死亡率必然原因。本实验从能量代谢角度阐明了肉苁蓉治疗感染性休克的机制‚为更深层次的研究提供了有效的理论线索。［参考文献］［1］ 金惠铭∙ 盲肠结扎穿孔术后的败血症模型［J］ ∙中国病理生理杂志‚1990‚6 （2）：126～127∙［2］ 汪谦‚朱晓峰‚赵西龙∙现代医学实验方法［M］ ∙北京：人民卫生出版社‚1997：342∙［3］ Estabrook R W∙Oxidative and phosphorylation methods in enzymology ［C］ ∙new york：Academic Press‚1967∙45～51∙［4］ Hackenbrock C K‚Baue A E‚Johnson D et al∙Lateral diffusion and electron tranfer in the mitochondriainnerme mbrane ［J］ ∙TrendsBiochem Sci‚1998‚6 （12）：151～158∙［5］ Slater E C‚Toda K‚Kayano K et al∙A hypothesis for the michanism of respiratory chain phosphorylation not involving the electrochemicalgradient of protons as obligatory intermedicate ［J］ ∙ Biochem Biophys Acta‚1995‚811 （3）：217～230∙［6］ Jiang J X‚wang J W‚Chen HS et al∙Studies on michanism of mouse liver mitochondria injury following septic shock ［J］ ∙TraumaJournal China‚1994‚10 （2）：67～69∙［7］ Mela L‚Pharo R L‚Sordah L A et al∙Spectrophotometric measurements of the kinetics of Ca2＋ and Mg2＋ accumulation mitochondria［J］ ∙ Biochemistry‚1996‚7 （11）：4059～4072∙［8］ Mergner W J‚Hang R R‚Jackson J B et al∙Studies on the pathogenesis of ischemic cell injury∙Ⅵ∙Accumulation of cacium by isolatedmitochondria ［J］ ∙Virchows Arc B Cell Patho∙l 1997‚26 （4）：1～8∙［9］ Lenen S‚Gorlich J K‚Rustenbeck I et al∙Regulation of transmembrane in transport by reaction products of phospholipase as infects oflypiphospholipilid on mitochondrial Ca2＋ transport ［J］∙Biochem Biophys Acta‚1999‚982 （26）：140146～140152∙［10］ Widener L L‚Parks D A‚Clarks A J et al∙Vevepamil pretreatment preserves mitochondrial function and tissue magnesium in the ischemickidney ［J］ ∙Circ Shock‚1994‚13 （1）：27～36∙

摘　要：目的：研究肉苁蓉提取物对感染性休克大鼠急性肺损伤的影响‚探讨感染性休克治疗方法。方法：采用盲肠结扎穿孔术（CLP）复制感染性休克模型‚观察肺组织病理学变化‚测定急性肺损伤（ALI）生物学指标。结果：生理盐水组肺间质水肿‚肺泡腔内可见大量细胞浸润和血浆蛋白渗出‚肺血管内皮细胞损伤‚肺湿干重比‚肺泡灌洗液中中性粒细胞比例‚蛋白含量及肺泡通透指数‚肺毛细血管通透性均显著升高‚肺组织丙二醛（MDA）‚超氧化物歧化酶（SOD）‚髓过氧化物酶（MPO）均显著升高。大黄和肉苁蓉给药组‚上述指标均较生理盐水组显著下降。结论：肉苁蓉及大黄对感染性休克大鼠急性肺损伤具有良好保护作用‚其机制可能是通过抑制中性粒细胞在肺组织的浸润‚减少氧自由基对肺组织的损伤实现的。关键词：肉苁蓉；大黄；感染性休克；急性肺损伤感染性休克是临床急危重症‚寻求有效治疗药物一直是临床和基础研究的重大难题。感染性休克的中医病机是正虚邪实‚单纯针对机体邪盛采取的攻下疗法是有效治疗措施之一‚但如果将感染性休克治疗仅局限于攻下治疗也难免失之偏颇‚重视扶正补虚治疗显得同等重要。肉苁蓉是传统补益类中药‚证实其具有增强细胞DNA 合成率‚抗氧自由基等细胞保护功能‚为此笔者实验观察了肉苁蓉对感染性休克肺组织损伤的作用‚以求为感染性休克扶正补虚治疗提供有效探索。1　材料与方法1．1　动物　体重200～250g 健康雄性SD 大鼠40只（华中科技大学实验动物中心提供‚质检号TJLA－2003－167）随机分为四组：生理盐水组（n＝8）‚1g/ml大黄组（n＝8）‚1g/ml 肉苁蓉组（n＝12）‚3g/ml 肉苁蓉组（n＝12）。实验动物分别采用相应药物常规灌胃15天‚1日2次‚（大黄和肉苁蓉提取物均系本院中药制剂室汪均植博士提供‚浓度均以每毫升所含生药克数表示‚给药剂量200mg/kg）实验动物均在盲肠结扎穿孔术［1］ 后12小时采集标本。1．2　感染性休克大鼠肺组织学检查　每组各取动物肺脏左叶少许‚经10％甲醛固定‚石蜡包埋切片‚HE染色后‚用普通光学显微镜观察‚并在此基础上再取肺组织制成1mm3 小大。用25％戊二醛溶液固定‚然后固定于1％四氧化锇液中‚乙醇‚丙酮脱水‚经Epon81包埋‚制备超薄切片后‚行铀－－－铅双重染色‚用透射电镜观察。1．3　大鼠肺组织湿/干重比‚及肺泡灌洗液中细胞计数比‚蛋白含量测定　开胸取出肺脏‚称湿重后‚置烤箱（80℃‚20h）烤至衡重‚称干重‚计算湿/干重比。另一批大鼠‚开胸后行肺泡灌洗‚灌洗液在显微镜下计细胞总数‚细胞分类。考马氏亮蓝法测定蛋白含量‚计算肺通透指数（肺泡灌洗液蛋白/血浆蛋白‚LPI）。1．4　大鼠肺血管通透性（PVP）变化　按照Zhou 等［2］介绍的方法‚各组动物在给药后‚均在作盲肠结扎穿孔术同时股静脉注射Evans 蓝（50mg/kg）‚将动物开胸取出肺脏‚剪去周围组织‚将肺浸泡在甲酰胺溶液中（甲酰胺用量按动物体重20mg/100g）‚置45～50℃温箱中温育72h‚待组织中色素全部浸出‚取出组织‚离心‚取上清液‚用721型分光光度计620nm 进行比色‚根据标准曲线计算Evans 蓝含量来测定PVP 的变化。1．5　大鼠肺组织MDA 的测定　采用硫代巴比妥酸（TBA）法［3］ 测定MDA 活性‚本法微量‚快速‚简便‚准确。主要根据MDA 可以与TBA 结合生成红色产物在532nm 处存在最大吸收峰的原理。50ml 待测标本加4ml1．67mo/l 的硫酸‚0．5ml10％磷钨酸‚混匀‚3000r/min离心10min‚沉淀再同上处理1次‚然后加1ml 双蒸水‚1mlTBA 溶液‚95℃水浴60min‚用5ml 正丁醇提取‚四乙氧基丙烷作为标准品‚终浓度为1nmo/l L‚荧光分光光度计532nm 处测定吸光值。1．6　大鼠肺组织SOD 的测定　采用黄嘌呤氧化酶法［4］ 测定SOD 活性（试剂盒购自南京建成生物工程研究所）。1．7　大鼠肺组织MPO 测定　取肺组织于等渗盐水中尽量洗净残血‚置于含0．5％十六烷基三甲基溴化铵的磷酸缓冲液（pH6．0）中制成5％的匀浆‚按试剂盒说明书操作。1．8　统计学方法　实验数据均以均数±标准差（﹣x±s）表示‚SPSS 软件进行单因素方差分析和相关分析。2　结果2．1　肉苁蓉和大黄对感染性休克肺组织湿/干重比‚及肺泡灌洗液中细胞计数比‚蛋白含量的影响　见表1。2．2　肉苁蓉和大黄对大鼠肺组织形态学改变的影响大体观察：生理盐水组肺脏体积明显增大‚呈暗红色‚表面可见不同程度充血水肿‚边缘部分大量肺梗死灶。大黄和肉苁蓉给药组肺脏呈浅红色‚表面轻度充血水肿‚未见明显肺梗死灶。光镜观察：生理盐水组见肺泡‚肺间质充血水肿‚肺泡腔内大量弥漫性中性粒细胞浸润‚部分有脓肿形成‚可见不同程度的肺不张‚坏死‚代偿性肺气肿‚血栓及类似透明膜形成。大黄和肉苁蓉给药组上述病变明显减轻。电镜观察：生理盐水组肺泡上皮细胞肿胀‚板层小体排空现象明显‚形成大空泡‚毛细血管内皮细胞肿胀‚内皮细胞之间连续损伤‚细胞间隙增宽‚毛细血管及肺泡基底膜疏松‚增宽‚不规则增厚‚厚薄不均。肉苁蓉和大黄给药组肺泡上皮细胞肿胀不明显‚板层小体排空减轻‚形成空泡数量少‚体积小‚毛细血管内皮细胞之间连接接近正常‚基底膜轻度疏松‚不规则增厚。3mg/L 肉苁蓉给药组较1mg/L 肉苁蓉给药组肺组织形态学改变范围更小‚肺损伤程度更轻。2．3　肉苁蓉和大黄对大鼠肺通透指数（LPI）和血管通透性（PVP）的影响　见表2。2．4　肉苁蓉和大黄对大鼠肺组织MDA‚SOD‚MPO 活性的影响　见表3。3　讨论多器官衰竭是感染性休克后期病情不可逆转和死亡率高的根本原因［15］ ‚保护器官功能对降低感染性休克临床高死亡率具有重要意义。肺脏作为多器官衰竭的首发器官‚1/3感染性休克患者死于急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合症（ARDS）。急性肺损伤的主要病理生理机制是大量中性粒细胞在肺组织内聚集和活化‚与血管内皮细胞粘附的同时‚转移单电子的还原型辅酶Ⅱ氧化酶浓度增高而引起呼吸爆发‚产生大量氧自由基‚通过较强的氧化作用引起细胞膜和膜性结构的损害和功能障碍［6］ 。脂质过氧化物反映组织中氧自由基的变化‚与肺损伤的程度有直接的量相关［7］ ‚在机体的酶与非酶抗自由基氧化系统中‚SOD 的活性与组织损伤度保持良好的相关性［8］ 。大黄和肉苁蓉给药组MDA 和SOD 活性与生理盐水组相比较具有显著差异（P＜0．01）。李春盛等研究表明大黄具有保护急性肺损伤肺泡上皮和血管内皮的作用‚大黄对肺的保护作用机制可能是通过抑制NO 和iNOS 活性实现的。本实验结果再次证明大黄对肺泡上皮和血管内皮的良好保护作用‚同时发现大黄还可能通过减少中性粒细胞在肺组织内的聚集‚减轻自由基生成而达到保护肺组织的作用。肉苁蓉具有增强免疫功能‚抗衰老‚增强细胞DNA 合成率等广泛的药理作用［9］ 。实验结果表明‚肉苁蓉给药组肺系数‚肺通透指数‚肺泡灌洗液中性粒细胞比例‚肺血管通透性均显著下降‚肺组织MDA 活性下降（P＜0．01）‚SOD 显著上升（P＜0．01）‚MPO 活性下降。同时形态学观察发现肺组织损伤程度明显减轻‚中性粒细胞浸润减少‚且3mg/L 肉苁蓉给药组较1mg/L 肉苁蓉给药组肺损伤程度更轻‚存在良好的量效关系。提示肉苁蓉对急性肺损伤具有较显著的保护作用。其机制可能为：①抑制炎性细胞肺内迁移‚减少中性粒细胞等被激活产生的氧自由基‚使生物膜得到保护；②促进核酸和蛋白质合成‚对肺损伤具有保护作用。③增强吞噬细胞免疫功能‚减轻内毒素造成的肺组织损伤。该实验结果为临床感染性休克急性肺损伤扶正补虚治疗提供了实验基础。参考文献：［1］　金惠铭．盲肠结扎穿孔术后的败血症模型［J］．中国病理生理杂志‚1990‚6（2）：126－127．［2］　Zhou WG‚Mc Collum MO‚Levine BA‚et al．Role of platelet activating factorin pancreaatitis associated acute lung injury in the rat［J］．Am J Pathol‚1992‚140：971．［3］　汪谦‚朱晓峰‚赵西龙．现代医学实验方法［M］．北京：人民卫生出版社‚1997．508．［4］　张秀明‚李健斋‚魏明竟．现代临床生化检验学［M］．北京：人民军医出版社‚2001．896．［5］　罗正曜．休克学［M］．天津：天津科学技术出版社‚2001．345．［6］　Manthous CA‚Hall JB‚Samsel RW．Endotoxin in human disease‚part2：Biologic effect and clinical evaluation of anti－endotoxin therapies ［J］．Chest‚1993‚104：1872．［7］　Ward PA‚Till GO‚Hatherill JT‚et al．Systemic complement activation lunginjury and products of lipid peroxidation［J］．J Clin Invest‚1985‚76（2）：571．［8］　Ward PA‚Tohson KJ‚Till GP‚et al．Animal models of oxidant lung injury［J］．Respiration‚1986‚50（14）：5－12．［9］　周志锦．肉苁蓉研究进展［J］．中医药信息‚1995‚16（5）：28－30．

摘　要　目的:研究肉苁蓉对感染性休克大鼠肝线粒体功能的影响。方法:采用盲肠结扎穿孔术( CLP) 复制感染性休克模型, 采用多导生理仪监测平均动脉压( MAP) 的变化, 定磷法测定肝线粒体ATP酶活性, 采用Clark氧电极法测定呼吸控制率( RCR) 、Ⅲ 态的变化。结果:大鼠在CLP术后, 线粒体ATP酶活性、RCR和Ⅲ 态显著降低。肉苁蓉给药组肝线粒体ATP酶活性、RCR和Ⅲ 态较对照组明显改善, 与大鼠死亡率的降低呈显著正相关。结论:肉苁蓉能增强实验性感染性休克大鼠线粒体能量代谢功能。关键词　肉苁蓉;感染性休克;线粒体;ATP酶;RCR肉苁蓉( CistanchedeserticolaY.C.Ma)具有延缓衰老、抗膜脂质过氧化、增加细胞DNA合成率, 抗疲劳等作用[ 1] 。研究发现发现肉苁蓉能减轻感染性休克肝损伤, 降低感染性休克大鼠死亡率[ 2] 。感染性休克早期肝线粒体能量代谢功能降低是感染性休克肝损伤的始动环节[ 3] 。以改善肝线粒体能量代谢为突破口, 有可能开拓感染性休克治疗的新领域。本文观察了肉苁蓉对感染性休克大鼠肝脏线粒体ATP酶活性和呼吸控制率( RCR) 、Ⅲ 态的影响, 以探讨肉苁蓉抗感染性休克作用机制。1　材料与方法1.1 　试验药物　肉苁蓉购自新疆, 取干肉苁蓉200g, 蒸馏水煎2次, 收集所得滤液蒸发浓缩至浓度1g/ml。1.2 　动物　雄性SD大鼠40只, 体重200g～ 250g, 由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。1.3　试剂与仪器　ATP酶试剂( 20060108)南京建成生物工程研究所。JYD-IA溶氧测定仪, 江苏电分析仪器厂。1.4　方法　大鼠随机分为5组, 假手术组, 12小时对照组, 12小时给药组, 116小时对照组, 16小时给药组。假手术组和对照组给予生理盐水灌胃, 给药组予1g/ml的肉苁蓉( 200mg/kg)灌胃1日2次, 喂至15天。采用盲肠结扎穿孔术[ 4] 复制感染性休克模型, 手术前动物自由饮水, 禁食12小时。1.4.1　平均动脉压的测定　颈静脉插入头皮针, 肝素抗凝,左侧颈总动脉插管至主动脉弓处, 用自制导管与生理多导仪相连, 记录平均动脉压( MAP), 待MAP平稳后进行实验。1.4.2　线粒体ATP酶活性测定　取大鼠肝脏6g迅速置于0℃分离介质( 蔗糖250mmol, 乙羟乙基哌嗪2 -乙基磺酸2mmol, 乙二胺四乙酸0.1mmol, pH7.4), 剖开洗去杂质, 以分离介质悬浮( 1∶ 10), 用Teflon电动匀浆器匀浆( 1200rpm), 以2000rpm离心10分钟, 留置上清液, 以10000rpm离心15 分钟,弃去上清液, 取沉淀物以2ml分离介质进行悬浮得到线粒体悬液, 全部过程在0 ～ 4℃进行。采用定磷法[ 5] 测ATP酶活性。1.4.3　线粒体呼吸功能的测定　采用Clark氧电极法[ 6] , 取反应介质( 0.225mol/L 蔗糖, 15mmol/L KCl, 15mmol/LKH2PO4, 50mmol/LtrisHCl, 1mmol/LEDTA, pH7.5) 2.9ml, 加入搅拌反应杯中, 恒温30℃.加入线粒体悬液0.1ml, 以琥珀酸(终浓度10mmol/L)为底物, 反应1 分钟后, 加入600nmol/LADP,用JYD-IA溶氧测定仪记录线粒体氧化还原反应曲线, 计算Ⅲ态、Ⅳ态、RCR。2　结果2.1　肉苁蓉对感染性休克大鼠平均动脉压和24小时大鼠死亡率的影响　盲肠结扎穿孔术后对照组12 小时血压显著降低, 16小时更趋明显。肉苁蓉治疗组血压改善, 死亡率明显降低, 见表1。2.2　肉苁蓉对感染性休克大鼠线粒体呼吸功能的影响　对照组呼吸Ⅲ 态速率明显低于假手术组, Ⅳ态呼吸速率较假手术组变化不大, 而致对照组RCR显著低于假手术组, 给药组RCR较接近于假手术组。对照组ADP/O比值随时间延长逐渐降低, 肉苁蓉治疗组其比值逐渐回升, 与大鼠死亡率相关性分析( r=0.892) , 见表1。2.3　肉苁蓉对感染性休克大鼠线粒体ATP酶活性的影响　给药组钠钾ATP酶、钙ATP酶、镁ATP酶、钙镁ATP酶活性均显著高于相应对照组达到假手术组水平, 与大鼠死亡率降低呈显著的正相关( r=0.834) , 见表2。3　讨论　　感染性休克后期多器官衰竭的形成是感染性休克死亡率居高不下的根本原因。肝脏是机体能量代谢中心, 又是多器官衰竭最易受累的器官之一。研究表明, 感染性休克细胞水平能量代谢障碍早于其他病理生理改变, 是多器官功能障碍综合征的诱因。线粒体是机体合成ATP的主要细胞结构, 改善线粒体能量代谢是降低感染性休克死亡率的重要手段。本文观察了肉苁蓉对感染性休克大鼠肝脏线粒体Ⅲ 态和RCR的影响, 对照组12小时Ⅲ 态和RCR较假手术组显著降低, 16小时组更趋严重。Ⅲ 态下降提示感染性休克肝线粒体膜电子传递链损伤, ATP合成酶活性下降。RCR下降表明线粒体氧化磷酸化耦联程度降低, 线粒体合成ATP障碍。肉苁蓉给药组RCR和Ⅲ 态显著上升, 表明肉苁蓉能加快肝线粒体电子传递链速度, 提高氧化磷酸化耦联程度。张勇通过实验证实连续服用14天肉苁蓉水煎液的小鼠, 体重明显增加, 常压耐氧量能力亦显著优于对照组, 负重游泳时间显著延长[ 7] 。韩丽春等用肉苁蓉的水煎液对小鼠灌胃, 小鼠负荷运动后骨骼肌超微结构显示肌糖元含量丰富, 运动后线粒体普遍增生、肥大[ 8] 。可见肉苁蓉不仅能增强机体能量代谢功能, 提高细胞能量储备, 而且还能从结构上使线粒体适应机体病理及生理改变。　　Na+-K+-ATP酶镶嵌于线粒体内膜, 在维持细胞生理活动、体温及正常代谢, 调节细胞内外离子平衡中发挥重要生理作用。Na+-K+-ATP酶活性下降, 线粒体钠泵功能障碍, 致线粒体内膜水肿, 线粒体膜流动性下降。Hackenbrock和Slater的实验研究表明呼吸链上电子传递过程和氧化磷酸化耦联过程均依赖于呼吸链活性成分在内膜中的侧向扩散和碰撞, 即膜流动性。膜流动性增大, 则电子传递加快[ 9, 10] 。Na+-K+-ATP酶是维持线粒体膜流动性正常的关键酶, 膜流动性的降低导致线粒体氧化磷酸化功能障碍, ATP合成不足, 又直接降低Na+-K+-ATP酶的活力, 二者互为因果, 构成恶性循环。Ca2 +-ATP酶、Mg2 +-ATP酶和Ca2 +-Mg2+-ATP酶是维持细胞内钙镁平衡的重要物质, Ca2 +-ATP酶活性下降使线粒体钙泵向细胞外排Ca2 +的作用减弱, 线粒体内Ca2 +超载。线粒体内钙超载是线粒体氧化磷酸化障碍, 结构受损和细胞坏死的重要原因[ 11, 12] 。Widner报道细胞内镁离子的减少是细胞不可逆损伤的诱发因素,Mg2 + /Ca2 +比值是反映细胞不可逆损伤的重要指标[ 13] 。肉苁蓉给药组Na+-K+-ATP酶、Ca2 +-ATP酶、Mg2 +-ATP酶、Ca2 +-Mg2 +-ATP酶活性均较对照组显著上升, 提示肉苁蓉通过加快线粒体电子呼吸链传递速度和提高氧化磷酸化效率明显增加线粒体ATP合成量, 保证了膜上ATP酶所需能量供应。同时ATP酶是一种巯基酶, 肉苁蓉具有抗膜脂质过氧化作用, 这可能是肉苁蓉保护ATP酶的化学基础及药理学基础。参考文献1　李琳琳, 王晓雯, 王雪飞, 等.肉苁蓉总甙的抗脂质过氧化作用及抗辐射作用.中国中药杂志, 2006;22( 6) ∶364 ～ 3672　大仓多美子, 内蒙古产肉苁蓉研究.国外医学中医中药分册, 2001;13( 2 ) ∶523　罗正曜.休克学.天津:天津科学技术出版社, 2001∶3454　金惠铭, 盲肠结扎穿孔术后的败血症模型.中国病理生理杂志,1990;6 ( 2) ∶ 126 ～ 1275　汪谦.现代医学实验方法.北京:人民卫生出版社, 1997∶3426　EstabrookRW.Oxidativeandphosphorylationmethodsinenzymology.newyork:AcademicPress, 2005;( 10) ∶45 ～ 517　张勇, 吴焕, 王顺年, 等.三种肉苁蓉壮阳补肾作用的比较.中国中药杂志, 2004;11 ( 3) ∶228　韩丽春, 候金凤, 纪志华, 等.肉苁蓉对小鼠血清肌酸激酶和骨骼肌超微结构的影响.中国中药杂志, 2005;18( 12 )∶ 7439　HackenbrockCK, BaueAE, JohnsonD, etal.Lateraldiffusionandelectrontransferinthemitochondriainnermembrane.TrendsBiochem Sci, 2005;6( 12 ) ∶151 ～ 15810　SlaterEC, TodaK, KayanoK, etal.Ahypothesisforthemichanism ofrespiratorychainphosphorylationnotinvolvingtheelectrochemicalgradientofprotonsasobligatoryintermedicate.BiochemBiophysActa, 2005;811∶21711　MergnerWJ, HangRR, JacksonJB, etal.Studiesonthepathogenesisofischemiccellinjury..Ⅵ .Accumulationofcacium byisolatedmitochondria.VirchowsArcBCellPathol.2007;26∶112　LenenS, GorlichJK, RustenbeckI, etal.RegulationoftransmembraneintransportbyreactionproductsofphospholipaseasinfectsoflypiphospholipilidonmitochondrialCa2+ transport.Biochem BiophysActa, 2006;982 ∶14014613　WidenerLL, ParksDA, ClarksAJ, etal.Vevepamilpretreatmentpreservesmitochondrialfunctionandtissuemagnesiumintheischemickidney.CircShock, 2006;13∶27