提要:目的:研究败血症肝线粒体ATP 酶活性的变化及肉苁蓉对其影响。方法:40 只SD 大鼠随机分假手术组、12 小时对照组、12 小时给药组、16 小时对照组、16 小时给药组, 采用盲肠结扎穿孔术( C LP) 复制败血症模型, 比较各组存活率和平均动脉压( MAP) 、肝线粒体ATP 酶活性的变化。结果:大鼠在复制败血症模型后, 肝线粒体ATP 酶活性降低, 24 小时存活率明显下降。给予肉苁蓉后肝线粒体ATP 酶活性较对照组明显改善( P <0.05) , 与大鼠死亡率的降低呈显著正相关。结论:败血症线粒体ATP 酶活性下降, 细胞钙超载和水肿坏死是败血症大鼠死亡的直接原因, 肉苁蓉增强ATP 酶活性是肉苁蓉治疗败血症的重要机制。关键词:肉苁蓉　败血症　线粒体　ATP 酶败血症是临床急危重症, 尽管近30 年来, 抗生素不断更新, 但败血症的死亡率并无明显下降,仍高达50%[ 1] 。单纯西药抗菌“ 祛邪” 治疗并不能改善败血症的预后。败血症在中医病机上属“ 正虚邪实” , 治疗上必须“ 扶正” 和“ 祛邪” 并举的原则, 中药在败血症的治疗上显示出巨大的潜力。败血症并发多器官衰竭是其死亡率居高不下的根本原因, 细胞结构损伤是多器官衰竭的微观病理基础[ 2] 。肉苁蓉作为传统补益类中药, 现代药理学研究表明肉苁蓉具有抗膜酯质过氧化, 保护细胞功能的作用[ 3] 。线粒体能量代谢功能是细胞的基本功能之一, ATP 酶的活性是衡量线粒体能量代谢功能的重要指标。本实验观察了败血症大鼠肝细胞线粒体ATP 酶活性的变化及肉苁蓉对其影响与大鼠死亡率之间的关系, 旨在为临床上败血症的“ 扶正”治疗提供理论依据和有效探索。1　材料和方法1.1　试剂　肉苁蓉购自新疆( 经三峡大学医学院谭德福教授鉴定) , 取干重肉苁蓉200g, 蒸馏水煎2 次, 所得滤液蒸发浓缩至浓度1g/ ml 。戊巴比妥钠( 001104) , 中国医药集团上海化学试剂公司;ATP 酶试剂( 20030108) , 南京建成生物工程研究所。1.2　实验动物模型与分组　雄性SD 大鼠40 只( 购自华中科技大学同济医学院实验动物中心) , 随机分为5 组:假手术组( n =8) , 12 小时对照组(n =8) , 12 小时给药组( n =8) , 16 小时对照组( n=8) , 16 小时给药组( n=8) 。假手术组和对照组给予生理盐水灌胃, 给药组予1g/ml 的肉苁蓉灌胃, 1 日2 次, 喂至15 天。采用盲肠结扎穿孔术[ 4] 复制败血症模型, 手术前动物自由饮水, 禁食12 小时。1.3 　平均动脉压的测定　颈静脉插入头皮针, 肝素抗凝, 左侧颈总动脉插管至主动脉弓处, 用自制导管与生理多道仪相连, 记录平均动脉压( MAP) 。待MAP 平稳后进行实验。1.4 　线粒体ATP 酶活性测定　取大鼠肝脏6g 迅速置于0℃分离介质〔蔗糖250mmol, 乙羟乙基哌嗪2 -乙基磺酸2mmol, 乙二胺四乙酸0.1mmol,pH7.4〕, 剖开洗去杂质, 以分离介质悬浮( 1∶10) , 用Teflon 电动匀浆器匀浆( 1200r/ min) , 以2000r/ min 离心10 分钟, 留置上清液, 以10000r/min 离心15 分钟, 弃去上清液, 取沉淀物以2ml分离介质进行悬浮得到线粒体悬液, 全部过程在0～ 4 ℃进行。采用定磷法[ 5] 测ATP 酶活性( 试剂盒购自南京建成生物工程研究所) 。1.5　统计学处理　实验数据均以均数±标准差( X±S) 表示, SPSS 软件进行单因素方差分析和相关分析。2　结　果2.1 　肉苁蓉对平均动脉压和24 小时大鼠死亡率的影响　盲肠结扎穿孔术后12 小时对照组血压显著降低, 16 小时更趋明显, 与假手术组比较, 有显著差异。肉苁蓉治疗组血压得到改善。对照组死亡率与假手术组相比较, 死亡率显著上升, 给药组死亡率较相应对照组明显降低。见表1 。3　讨　论Na +-K+-ATP 酶又称钠钾泵, 在维持细胞生理活动, 体温及正常代谢, 调节细胞内外离子平衡中发挥重要生理作用。败血症线粒体内膜存在严重钠泵功能障碍, 致线粒体水肿。Na+ -K+ -ATP 酶受到损害, 线粒体内外离子浓度失衡加重,能量代谢酶活性受抑制, 细胞能量供应衰竭, 造成细胞毒性水肿, 同时膜通透性增加, 最终导致细胞死亡。实验中我们发现, 败血症肝细胞线粒体Na+-K +-ATP 酶活性明显降低( P <0.01) , 表明肝组织损害严重。而在给予肉苁蓉后, 肝线粒体Na+-K +-ATP 酶活性明显增高( P <0.05) , 败血症大鼠死亡率显著降低。实验结果提示, Na+-K+-ATP 酶的活性降低与败血症大鼠的病情发展成显著正相关, Na+-K +-ATP 酶活性抑制, 细胞水肿和死亡致多器官衰竭可能是败血症病情迅速发展的重要机理之一。近年有关Na +-K +-ATP 酶与许多疾病相关的报道较多, 引起临床和基础工作者的关注, 研究Na+-K +-ATP 酶的活性变化规律及其调节具有重要意义[ 6] 。关于Na + -K+ -ATP 酶在败血症发展转归中具体作用机制知之甚少, 尚待进一步研究。细胞内钙和镁的稳定是维持细胞内释放反应和信息传递的必须物质基础[ 7] 。实验中对照组Ca2 +-ATP 酶活性下降直接影响钙泵活性, 钙泵活性下降, 使线粒体钙泵向细胞外排Ca2 +的作用减弱,线粒体内Ca2 +超载。线粒体内钙超载是线粒体氧化磷酸化障碍、结构受损和细胞坏死的重要原因[ 8 、9] 。Ca2 + 超载, 使线粒体膜电位降低, 组织ATP 含量下降[ 10] , 组织细胞能量利用障碍。Ca2 +可激活线粒体上的磷脂酶, 致线粒体膜损伤, 破坏线粒体正常合成ATP 的功能致线粒体能量产生障碍[ 11] 。线粒体钙代谢紊乱可直接影响线粒体呼吸功能, 致线粒体摄氧和电子传递链质子氧化障碍[ 12] 。同时Ca2 +升高, 可加重酯质过氧化对线粒体的损害[ 13] 。这些都直接或间接导致细胞能量供应衰竭和组织器官的死亡, 加速了败血症的病理变化发展。实验中我们还发现败血症大鼠Mg2 + -ATP 酶和Ca2 +-Mg2 +-ATP 酶活力也明显下降。Mg2 +-ATP 酶和Ca2 +-Mg2 +-ATP 酶是维持细胞内钙镁平衡的重要物质, Widner 报道细胞内镁离子的减少是细胞不可逆损伤的诱发因素, Mg 2 +/Ca2 +比值是反映细胞不可逆损伤的重要指标[ 14] 。肉苁蓉给药组Mg2 + -ATP 酶和Ca2 + -Mg2 + -ATP 酶活性增强, A TP 酶是一种巯基酶, 肉苁蓉具有抗膜酯质过氧化作用, 这可能是肉苁蓉增强ATP 酶活性的化学基础及药理学基础[ 15] 。败血症线粒体能量代谢障碍, ATP 酶活性下降, 线粒体水肿, 细胞内钙超载, 钙镁平衡紊乱是败血症细胞死亡及多器官衰竭形成的直接原因。肉苁蓉拮抗膜酯质过氧化, 增强A TP 酶活性, 保持细胞内钙镁稳态, 保护细胞功能正常运转是肉苁蓉降低败血症大鼠死亡率的重要机制, 展示了肉苁蓉在治疗败血症中的良好前景。参　考　文　献[ 1] 董伟贤, 胡必杰, 何礼贤.122 例医院败血症对照危险因素研究.中华医院管理杂志, 2001, 17 ( 2) ∶101 ～ 103[ 2] 张钟灵.多器官衰竭与败血症.新医学, 1999, 30 ( 6)∶351 ～ 352[ 3] 施大文, 何松春, 蒋莹.中药肉苁蓉及其同属生药对免疫功能及酯质过氧化作用的影响.上海医科大学学报, 1995, 22( 4) ∶306 ～ 308

摘 要 目的：研究肉苁蓉提取物对败血症休克大鼠急性肝肺胸腺功能损伤的影响，探讨败血症休克治疗方法。方法：采用盲肠结扎穿孔术（ CLP） 复制败血症休克模型，观察肝肺胸腺组织病理学变化，测定急性肝肺胸腺损伤生物学指标和肉苁蓉提取物的影响。结果：大鼠在CLP 术后，生理盐水组肝细胞线粒体Ⅲ态，P／O 比值和呼吸控制率明显降低，线粒体膜钠钾钙镁-ATP 酶活性显著降低；肺湿干重比，肺泡通透指数，肺毛细血管通透性，肺组织丙二醛均显著升高，超氧化物歧化酶显著降低；胸腺细胞凋亡和DNA 断裂百分率显著增加。肉苁蓉给药组，上述指标均较生理盐水组显著改善，达到或接近假手术组水平。结论：肉苁蓉对败血症休克大鼠急性肝肺胸腺损伤具有良好保护作用，其机制可能是减少氧自由基对组织的损伤，改善细胞膜功能，提高机体免疫功能和应激能力。主题词 植物提取物／药理学 肉苁蓉／药理学 败血症／并发症 休克，脓毒性／中医药疗法 大鼠本研究观察了肉苁蓉对败血症休克模型大鼠急性肺肝胸腺等脏器损伤的影响，试图从保护细胞功能为突破口，探讨肉苁蓉在败血症中的作用效果和作用机制，为开发对败血症有效保护性治疗药物作出有益的探索。1 材料和方法1．1 药物、试剂与仪器 药物：戊巴比妥钠（ 中国医药集团上海化学试剂公司） ，丙二醛（ MDA） 试剂盒，超氧化物歧化酶（ SOD） 试剂盒，ATP 酶试剂（ 南京建成生物工程研究所） ，肉苁蓉（ 经三峡大学中医系汪金均植博士鉴定） 水煎剂，伊文思蓝。仪器：日立H-600型透射电镜，流式细胞仪（ EPICS，BeckmanCoulter 公司） ，721型分光光度计。1．2 肉苁蓉提取物的制备 采用浸提法制备肉苁蓉提取物，取干重肉苁蓉200g，置于烧杯中，按1∶10的比例加入蒸馏水，常规浸泡30min 至1h，在电炉上加热1h 后，过滤，如此反复进行2次，收集所得滤液加热蒸发浓缩至1g／mL，冷却后密闭保存于4℃冰箱中备用。1．3 动物及败血症动物模型 健康雄性SD 大鼠（ 华中科技大学实验动物中心提供，体重200～250g。动物随机分为3组，假手术组（ n＝8） ，生理盐水对照组（ n＝8） ，肉苁蓉组（ n＝8） 。假手术组和对照组给予生理盐水（1．0mL／kg） 灌胃，给药组予1g／mL （ 给药剂量200mg／kg） 的肉苁蓉灌胃，1d2次，喂至15d。生理盐水对照组和肉苁蓉组采用盲肠结扎穿孔术［1］复制败血症模型，手术前动物自由饮水，禁食12h。1．4 大鼠肝线粒体ATP 酶活性和肝线粒体呼吸功能测定 术后16h 取大鼠肝脏6g 迅速置于0℃分离介质（ 蔗糖250mmol，乙羟乙基哌嗪2－乙基磺酸2mmol，乙二胺四乙酸0．1mmol，pH7．4） ，采用差速低温离心分离的方法制备大鼠线粒体。采用定磷法［2］测ATP 酶活性。采用Clark 氧电极法［3］，用JYD－IA 溶氧测定仪记录线粒体氧化还原反应曲线，计算Ⅲ态、Ⅳ态呼吸率，呼吸控制率（ RCR） 和磷氧比值（ ADP／O） 。1．5 大鼠肺组织学和肺功能测定 术后16h 开胸取出肺脏左叶，称湿重后，置烤箱（80℃，20h） 烤至衡重，称干重，计算湿／干重比。肺泡灌洗液以考马氏亮蓝法测定蛋白含量，计算肺通透指数（ 肺泡灌洗液蛋白／血浆蛋白，LPI） 。按照Zhou 等［4］介绍的静脉注射伊文思（ Evans） 蓝法，测定大鼠肺血管通透性（ PVP） 变化。采用硫代巴比妥酸（ TBA） 法［5］测定大鼠肺组织丙二醛（ MDA） 活性。采用黄嘌呤氧化酶法［6］测定SOD 活性。1．6 胸腺组织学检查和细胞凋亡率测定 每组中取2～3只大鼠在术后相应的时间处死，分离完整胸腺，制作常规石蜡切片，HE 染色，光镜观察；2．5％戊二醛固定，制作电镜切片，透射电子显微镜观察。另制作胸腺细胞悬液，流式细胞仪检测位于凋亡区内的细胞数量，得到凋亡细胞的百分率。按Burton等［7，8］ 的方法（ 二苯胺法） ，酶标仪检测计算胸腺细胞基因组DNA 断裂百分率。1．7 统计处理 实验数据均以均数±标准差（ x±s） 表示，SPSS 软件进行单因素方差分析和相关分析，P ＜0．05为有统计学差异。2 结 果2．1 肝线粒体Ⅲ态，RCR 和P／O 比值的改变 对照组呼吸Ⅲ态速率，明显低于假手术组（ P ＜0．01） ，Ⅳ态呼吸速率较假手术组变化不明显，而致对照组RCR 显著低于假手术组（ P＜0．01） ，肉苁蓉治疗组RCR 较接近于假手术组。对照组ADP／O 比值降低，肉苁蓉治疗组其比值回升，与假手术组相比，具有显著性差异（ P ＜0．01） 。0.52．2 肉苁蓉对线粒体ATP 酶活性的影响 见表2。对照组肝细胞线粒体膜钙－ATP 酶，钠-钾ATP 酶，镁-ATP 酶，钙镁-ATP 酶活性明显低于假手术组。肉苁蓉治疗组的各酶活性均显著高于相应对照组，达到假手术组水平。2．3 肉苁蓉对大鼠肺组织湿／干重比（ w／d） 、PVP、LPI、MDA 和SOD 的影响 见表3。2．4 肉苁蓉对胸腺细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测结果表明，与假手术组相比，对照组术后胸腺细胞凋亡显著增加，而肉苁蓉提取物可有效降低凋亡率，DNA 断裂百分率的发生情况与流式细胞仪检测的结果基本一致（ 表4） 。2．5 肉苁蓉对胸腺组织学变化的影响 石蜡切片观察假手术组的胸腺无明显病理改变，胸腺细胞密集分布于胸腺皮质，细胞核呈圆形，深蓝色着染，胞质少；过渡到髓质后，逐渐以核较大而着色浅的上皮网状细胞为主。对照组动物胸腺皮质区细胞成分稀疏，淋巴细胞减少，巨噬细胞增多，局部可见灶状坏死及散在的细胞碎片。胸腺髓质巴细胞无明显减少，细胞分布较皮质区密集，形成所谓“皮髓倒置”现象。肉苁蓉给药组动物胸腺细胞碎片明显减少，“皮髓倒置”现象也有显著改善。电镜观察对照组可见大部分细胞体积缩小，细胞表面皱缩，起泡，染色质凝聚，有些细胞呈月牙状，细胞凋亡小体的形成，细胞坏死溶解情况常见。肉苁蓉治疗组细胞形态发生改变明显减少，细胞坏死溶解的现象得到显著改善。3 讨 论 多器官功能障碍综合症是败血症休克后期病情不可逆转和死亡率高的根本原因，保护器官功能对降低败血症休克临床高死亡率具有重要意义。肉苁蓉是我国传统补益类中草药，始载于《神龙本草经》，是传统益精血、补肾壮阳的著名珍贵中药之一。近代药理学研究表明，它能提高机体免疫功能和应激能力，促进DNA 合成，抗γ射线，抗衰老，增强细胞DNA 合成率，保护组织细胞等。其中所含的主要包括肉苁蓉多糖（ CDPS） 、D-甘露醇，能有效地清除自由基。肉苁蓉多糖还能促进T 、B 淋巴细胞的增殖反应，且与ConA、PHA 有协同刺激小鼠胸腺细胞增殖的作用。本实验立足改善和保护败血症休克重要生命器官功能和中医扶正治疗思想这一基本点出发，采用客观灵敏的检测手段观察了肉苁蓉对败血症休克大鼠肝线粒体Ⅲ态，呼吸控制率（ RCR） ，P／O 比值，膜ATP 酶和肺通透指数，肺血管通透性，肺组织MDA，SOD 活性，胸腺细胞凋亡的影响。实验结果表明，肉苁蓉能提高肝线粒体RCR，P／O 比值，增强肝线粒体呼吸功能，加快线粒体呼吸链电子传递，提高氧化磷酸化的藕联程度和膜ATP 酶的活性，增加细胞内ATP 合成量。肉苁蓉给药组肺通透指数，肺血管通透性均显著下降，肺组织丙二醛活性下降，超氧化物歧化酶显著上升。提示肉苁蓉通过其抗氧化作用减轻氧自由基对肺组织细胞的损害，对肺损伤具有良好的保护作用。败血症休克时胸腺细胞，尤其是未成熟的T-淋巴细胞大量凋亡，可能会引起释放进入外周淋巴器官中的成熟淋巴细胞减少，继而直接或间接损害机体免疫功能。纠正败血症休克中胸腺细胞凋亡异常情况对提高机体免疫力是有益的。本实验研究发现肉苁蓉提取物可明显改善胸腺细胞凋亡，对败血症动物胸腺细胞有明显的保护作用。进而增强机体在感染过程中的免疫力，减少外来毒素对重要脏器的损害。而且我们也发现给药组血压得到明显改善，死亡率显著降低，与肉苁蓉增强肝肺细胞功能，降低胸腺细胞凋亡呈显著正相关，说明肉苁蓉改善机体重要生命器官功能，增强机体免疫力可能是肉苁蓉治疗感染性休克的重要药理学基础。肉苁蓉对急性脏器损伤具有较显著的保护作用，其机制可能为：①抗膜酯质过氧化作用，增强膜稳定性，减轻自由基对膜结构的损害。②促进组织核酸合成及减缓核酸分解及破坏作用，促进蛋白质合成，加速组织细胞的修复和再生。③增强机体免疫功能，减轻致病因素对机体的损害。④抑制组织细胞的过度凋亡。⑤改善机体微循环，保证重要生命器官的血供。参考文献［1］ 金惠铭，盲肠结扎穿孔术后的败血症模型［J］．中国病理生理杂志，1990，6（2） ：126．［2］ 汪 谦，朱晓峰，赵西龙．现代医学实验方法［M ］．北京：人民卫生出版社，1997：342．［5］ 汪 谦，朱晓峰，赵西龙．现代医学实验方法［M ］．北京：人民卫生出版社，1997：508-510．［6］ 张秀明，李健斋，魏明竟，等．现代临床生化检验学［M］．北京：人民军医出版社，2001：896-899．［8］ 何维敬，李 伟，毕 正，等．检测白血病细胞凋亡的二苯胺法［J］．上海医学检测杂志，2001，16（3） ：160．

[提 要] 目的：建立1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+)诱导的原代培养新生鼠中脑多巴胺能神经细胞凋亡模型,并探讨肉苁蓉对中脑多巴胺能神经细胞的保护作用和机制。方法：采用血清药理学的方法,肉苁蓉含药血清孵育多巴胺能神经细胞,经MPP+处理后,用TUNEL 染色、流式细胞仪检测。结果：浓度为200μmol/L的MPP+使多巴胺能神经细胞发生典型的凋亡,流式细胞仪结果显示等效剂量肉苁蓉含药血清(动物灌胃浓度1.6g 原药材/kg)培养液组多巴胺神经细胞凋亡率为6.3%,空白模型组的凋亡率为30.2%,光镜下计数每视野凋亡阳性细胞数显示：含等效剂量肉苁蓉含药血清及2 倍等效剂量肉苁蓉含药血清培养液组明显低于模型组(P<0.05)。结论：肉苁蓉含药血清对神经毒素MPP+诱发的多巴胺能神经细胞凋亡具有一定的保护作用。[关键词] 肉苁蓉 多巴胺能神经元 MPP+ 凋亡目前,帕金森病(Parkinson's diseases, PD)的主要疗法为复方左旋多巴(L-dopa)制剂替代治疗,该治疗不能控制病情发展。随着病情的进展,服用剂量增大,一般在3～5 年内出现疗效减退、运动症状波动和药物性运动障碍。新近的研究发现L-dopa 对体外培养的神经元有诱导凋亡的作用[ 1、2],随后有人提出内源性多巴胺的神经毒作用导致的细胞凋亡是帕金森病多巴胺能神经元丧失的原因之一[3 ]。在长期的临床实践中,我们采用培补肝肾中药结合左旋多巴制剂治疗PD 取得了较好的疗效[4～6]。本实验从分子细胞水平探讨中药对多巴胺能神经元细胞凋亡的保护作用及其机制。1 材料与方法1.1 材料DMEM 培养基、1- 甲基-4- 苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridini um,MPP+)、胎牛血清购于Gibco公司。阿糖胞苷(cytarabine) 、多聚赖氨酸(poly-l-lysine,PLL)购于Sigma 公司。24 孔培养板,25cm2塑料培养瓶购于NUNC 公司。所用中药购于西安饮片厂。所用动物由本校动物中心提供。1.2 含药血清的制备与实验分组肉苁蓉制备为冻干粉保存,用时以蒸馏水稀释。动物血清采用新西兰大耳白兔血清制备,均为健康雄性,体重为2.5～3.0kg。按体表面积折算动物的等效剂量,针对不同的处理随机分为：空白对照组血清；1/2 等效剂量组血清(灌胃剂量为肉苁蓉原药材0.8g/kg)；等效剂量组血清(灌胃剂量为肉苁蓉原药材1.6g/kg)；2 倍等效剂量组血清(灌胃剂量为肉苁蓉原药材3.2g/kg)。每天灌胃2 次,共给药3d,于末次灌胃1h后颈动脉放血,4℃过夜,2 500r/min 离心25min,小心分离血清,于56℃、30min 灭活,经0.22μm 滤膜抽滤除菌,-20℃保存。同等条件下,以等体积的生理盐水灌胃,制备空白兔对照血清。实验分为5 组,A 组为空白兔血清培养对照组；B 组为含2 倍等效剂量血清培养+MPP 处理组；C 组为含等效剂量血清培养+MPP 处理组；D 组为含1/2 等效剂量血清培养+MPP 处理组；E 组为空白兔血清培养+MPP 处理组。1.3 中脑多巴胺能神经元的培养选用怀孕14d 的SD大鼠3只,心脏内直接注射气栓处死；无菌条件下取出胚胎鼠,置于盛有冰D-Hanks 液的平皿中。体视显微镜下解剖分离出胎鼠脑组织,参考文献[7]方法稍作改进,剥除脑膜及血管组织,分离出中脑腹侧部A8、A9、A10 区的组织,眼科剪剪碎后加0.125%胰酶1mL 置于37℃孵箱约20min 后,加含有10%胎牛血清的培养液适量终止消化,用吸管吹打成均匀的细胞悬液,室温下以1 500r/min 离心5min,小心移去上清,以细口吸管吹打15 次,静置5min 后吸取上清计数,种植于预先包被有多聚赖氨酸的24 孔培养板内,每孔补加培养液将细胞密度调整为2×105个/mL,每孔加培养液至0.5mL,培养3d 后加用阿糖胞苷(终浓度为10μmol/L),抑制非神经元的生长。1.4 酪氨酸羟化酶(TH)免疫细胞化学染色采用SABC 法,抗体稀释液含牛血清白蛋白1g/100mL(博士德公司,武汉),0.3%Tritou-100(Sigma,美国),NaN3 80mg/100mL,用PBS 稀释成100mL,调pH 值为7.6。第7 天终止培养,D-PBS冲洗5min 3 次,新鲜配置的4% 的多聚甲醛室温固定30min,D-PBS 冲洗5min 3 次；用1∶1∶8 的过氧化氢、甲醇和PBS 液室温作用30min,D-PBS 冲洗5min 3 次；加入5%的封闭用羊血清室温作用30min,D-PBS 冲洗5min 3 次,加以抗体稀释液稀释的羊抗鼠TH 抗体(1∶1 000 稀释,Calbiochem公司),4℃过夜,D-PBS 冲洗3min 3 次,加入抗体稀释液稀释的生物素化小鼠抗大鼠IgG(1∶200 稀释,Sigma 美国),室温作用4h,D-PBS 冲洗3min 3 次,加入以抗体稀释液稀释的HRP复合物室温作用2h,D-PBS 冲洗3min 3 次。DAB 稀释液冲洗3min,加即用型 DAB 显色剂(武汉博士德公司)于细胞中,在倒置显微镜下观察显色。1.5 药物处理每天在相差显微镜下进行培养神经元的形态学观察并照相记录变化。培养12h 以后在倒置显微镜下观察细胞即将汇合前加药,各组培养液中血清含量均为10%,培养3d 后,加入MPP+,终浓度为200μmol/L。置37℃、5% CO2培养箱培养24h后做各种检查。1.6 流式细胞仪检测药物处理同前,各组经处理后,以0.125%胰蛋白酶,消化贴壁的PC12 细胞取细胞约1×106,PBS 将细胞洗2 次,加入490μL结合缓冲液,充分混匀细胞,加入5μL annexin V FITC和10μL 溶解的PI 于细胞悬浮液中,轻轻混匀,将试管置于4℃,避光孵育10min, 上COULTER EPICS 流式细胞仪(美国Beckman Coulter 公司)检测。1.7 原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡培养神经元的DNA 原位末端标记采用博士德公司的细胞凋亡检测试剂盒(MK1022),其步骤如下：取MPP+处理后各组多巴胺能神经元细胞(原代培养前玻片预先用多聚赖氨酸进行处理),经40g/L 多聚甲醛固定1h,新鲜的3%乙酸(pH2.5)室温作用10min,中和碱性磷酸酶,标本片加0.1mol/L TBS(pH7.5) 1∶200 新鲜稀释蛋白酶K37℃消化20s,每张玻片加TdT 和DIG-d-UTP 各1μL 及缓冲液18μL 的混匀液37℃标记2h；每个玻片加封闭液50μL,室温30min；加封闭液稀释的生物素化抗地高辛抗体50μL；37℃湿盒中反应30min；每张玻片加0.1mol/L TBS 稀释的SABC-AP50μL；BCIP/NBT(pH9.5的0.1mol/L TBS 按1∶20 稀释)加至标本上显色30min；同时设替代对照(用TdT缓冲液替代TdT/生物素-dUTP混合液),作显微照相和在倒置相差显微镜(200×)下观察凋亡细胞。在相差显微镜下进行阳性细胞计数,每组每孔计5 个视野,共计6 孔。2 实验结果2.1 培养神经元的形态学观察采用OlympusIX70 相差显微镜观察：接种5h 后,绝大部分细胞贴壁,细胞分散,胞体圆形,核不可见,折光性强。培养至24h 时,细胞突起生长,并逐渐伸长。48h 多数细胞伸出带有分枝的细丝状突起,细胞形态多样,呈双极型、三极型、多极性,并逐渐形成稀疏的网络,胞体增大,呈圆形和椭圆形。经MPP+损伤后,细胞先肿胀,折光度增强,呈退变状态,最终细胞圆缩脱落。不同剂量的复方中药含药血清对MPP+损伤均有保护作用。培养物进行TH 免疫细胞染色后,可见TH 阳性细胞呈棕褐色,带有神经突起。加用等效剂量的中药血清作用后,TH阳性神经元的比例可达55%～60%。2.2 流式细胞仪检测结果分析(见图1)在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)迁移至细胞膜外侧。磷脂酰结合蛋白V(Annexin V)是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白,它与PS 具有高度的亲合力。因此,Annexin V 可以作为探针检测暴露在细胞膜表面的PS。同时结合PI 拒染法进行凋亡细胞双染,用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。在Fig.1 右下象限(FITC+/PI-)显示各组的凋亡细胞比例,各组细胞凋亡率分别为4.1%、5.8%、6.3%、28.6%、30.2%。2.3 TUNEL 染色结果分析细胞核中有蓝紫色颗粒者为阳性细胞,即凋亡的细胞。光镜下计数各组的凋亡细胞比例,各组每视野的凋亡细胞数分别为：A 组2.13±0.34；B 组4.92±0.67；C 组6.20±1.47；D 组10.33±1.51；E 组12.74±2.51。经t 检验分析,B、C两组与E 组相比(P <0.05)。其结果与流式细胞仪检测结果基本吻合。3 讨论帕金森病在中医属“颤证”范畴。中医认为PD 的发病多为老年人肝肾渐亏,脑髓经脉失养而出现的系列表现。治则上以滋补肝肾、平肝熄风为主。中药在治疗帕金森中可以起到“减毒增效”的目的,但其作用机理目前并不很明确。现代医学大量实验证据表明氧化应激反应是引起PD 神经细胞死亡的因子之一[3 ],研究发现肉苁蓉总苷能有效地清除各种活性氧自由基,保护OH·引发的DNA 氧化[8] 。肉苁蓉提取物tubuloside B 可以减弱MPP+诱导的细胞毒性,削弱细胞内活性氧的积聚,对MPP+诱导的凋亡和氧化应激有对抗作用[9]。中药可以启动和加强自身保护信号通路,抵抗外来损害,使其重新恢复平衡状态,这是中药现代化研究的目标之一。继多巴胺替代疗法之后,目前人们普遍看重神经保护性治疗,称之为帕金森病治疗的第二次革命。本实验采用中药含药血清培养离体的中脑多巴胺能神经细胞,发现肉苁蓉有一定的神经保护作用。本实验用流式细胞仪和TUNEL 染色两种检测手段同时发现,等效剂量组血清、2 倍等效剂量组血清的肉苁蓉含药血清培养能够降低MPP+所致的原代培养的中脑多巴胺神经细胞凋亡的细胞数目,对凋亡的细胞有一定的保护作用。中药能够早期保护多巴胺能神经元免受破坏,这是较其它疗法更具重要意义的举措。从这个意义上讲,中医中药的整体治疗就是治本之法,可以被视为目前人们所看重的神经保护性治疗方法之一。参 考 文 献1 Ziv I, Zilkha-Falb R, Offen D, et al. Levodopainduces apoptosis in cultured neuronal cells-apossible accelerator of nigrostriatal degenerationin Parkinson's disease? Mov Disord, 1997, 12(1)：172 Jenner PG,Brin MF. Levodopa neurotoxicity:experimentalstudies versus clinical relevance.Neurology,1998,50(6Suppl 6)：S393 Maruyama W, Naoi M. Cell death in Parkinson's disease.J Neurol, 2002, 249(Suppl 2)：II64 陈建宗,江 文,史 健,等.培补肝肾为主治疗帕金森病临床观察：附60 例病例报告.成都中医药大学学报,1999,22(3)：145 陈建宗,陈小莉,李军昌,等.培补肝肾法治疗帕金森病40例临床观察.中医药研究,1998,14(3)：106 陈建宗,江 文,吴宝仁,等.平颤1 号口服液治疗帕金森病40 例.安徽中医学院学报,1999,18(2)：97 Shimoda K, Sauve Y, Marini A, et al. A high percentageyield of tyrosine hydroxylase-positive cells from ratE14 mesencephalic cell culture. Brain Res,1992,586(2):3198 王晓雯,蒋晓燕,邬利娅·伊明,等.肉苁蓉总苷体外清除自由基及对OH·引发的DNA 损伤的保护作用.中国药学杂志,2001,36(1)：299 Sheng G, Pu X, Lei L,et al. Tubuloside B fromCistanche salsa R escues the PC12 neuronal cells from1-Methyl-4-phenylpyridinium ion-induced apoptosisand oxidative.Stress.Planta Med,2002,68(11)：966

摘 要：肉苁蓉作为一种保健食品原料越来越被人们所认可和接受，对其特性的研究和产品的开发被更多的专业人士和研究团队所关注。本文从肉苁蓉的资源特征，营养和功能特性，加工和应用等方面较全面的阐述了肉苁蓉的相关特性，可为下一步研究和开发打下一定基础。关键词：肉苁蓉；资源特征；营养保健特性肉苁蓉（Cistanche deserticola Y. C. Ma）属多年生寄生草本植物。别名苁蓉、地精、疆芸、大芸、寸芸或金笋等。具有提高免疫力、抗衰老、改善阳痿早泄、抗疲劳、保护肝脏、保护心脑血管、润肠排毒等作用。药用价值极高，是我国传统的名贵中药材。此外，肉苁蓉也具有极高的保健价值，而且越来越受到人们的关注和政府的重视，使肉苁蓉开始由药品向保健食品及食品的领域发展。2010 年，具有缓解疲劳保健功能的肉苁蓉黄精茶被国家食品药品监督管理局批准认证，批准文号为国食健字G20090540；2016 年，国家食品安全风险评估中心（CFSA）专家评审委员会依照法定程序审查认为，根据肉苁蓉样品的卫生学和毒理学试验及相关安全性资料，阿拉善荒漠肉苁蓉符合食品安全要求，肉苁蓉从此进入食品领域，并开启了肉苁蓉在食品加工行业的开发和应用。1 肉苁蓉的资源特征肉苁蓉作为荒漠地区的多年生寄生性草本植物,其寄主因地区和植物种而异，主要为沙漠、荒漠固沙植物梭梭属、柽柳属植物等，肉苁蓉在保护干旱荒漠地区的生态环境方面起到了重要作用。从20 世纪末开始，由于肉苁蓉寄生生长繁殖的特殊性，加上药用价值较高而被人为滥挖，其寄主梭梭树被大批砍伐破坏，使肉苁蓉的资源急剧减少，部分地区已将其列入珍稀植物保护物种，其中荒漠肉苁蓉已被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》。近年来，新疆、内蒙古等地方政府建立了较大面积的以保护肉苁蓉为重点的梭梭保护区，严禁砍伐梭梭，积极发展肉苁蓉经济，牧民通过保护梭梭林、科学采挖野生肉苁蓉获取经济收益，使保护生态环境成为人类的自觉行为。同时，积极进行人工繁殖，扩大其分布区。内蒙古自治区的乌兰布和沙漠已经退耕还林建立保护区约133 333.33 hm2，人造林地26 666.67 hm2，以专门种植肉苁蓉。使肉苁蓉种植成为一种荒漠经济产业，为其开发提供充分的原料资源。1.1 肉苁蓉的资源分布目前全世界的肉苁蓉多分布于北半球的温暖干燥地区，自欧洲的伊比利亚半岛，经非洲北部、亚洲的阿拉伯半岛、伊朗、阿富汗、巴基斯坦、印度北部、中亚地区及蒙古到我国的西北部地区等均有分布。我国肉苁蓉属植物主要分布在内蒙古自治区、新疆维吾尔自治区、宁夏回族自治区、陕西省、甘肃省及青海省等西北沙漠、荒漠地区。途经乌兰布和沙漠、腾格里沙漠、巴丹吉林沙漠、河西走廊沙地、塔克拉玛干沙漠和古尔班通古特沙漠6 个沙漠地带[1]。由于其主要生长在沙漠地带，因此被称为“沙漠人参”。内蒙古肉苁蓉产地范围为内蒙古自治区阿拉善盟、乌海市、巴彦淖尔市及鄂尔多斯市4 个盟市现辖行政区域。2015 年12 月29 日，原国家质检总局批准了对“内蒙古肉苁蓉”实施地理标志产品保护。2016 年，内蒙古肉苁蓉产量质量均居中国第一，其中阿拉善有适宜接种肉苁蓉的天然梭梭林9 666 666.67 hm2，新建梭梭肉苁蓉产业基地33 733.33 hm2，肉苁蓉年产量达1 000 多t。1.2 肉苁蓉品种分类目前，全世界约22 个肉苁蓉品种。根据中国高等植物科属检索表记载，目前我国存在肉苁蓉属植物应有5 种。分别为荒漠肉苁蓉、德赢vwin登录 、盐生肉苁蓉、沙苁蓉和兰州肉苁蓉。另外，国内大多数研究表明，国内肉苁蓉属植物有4 种和1 变种[2]，包括肉苁蓉、德赢vwin登录 、盐生肉苁蓉、沙苁蓉及盐生肉苁蓉的1个变种——白花盐苁蓉。（1）荒漠肉苁蓉（Cistanche deserticola）。寄主为梭梭属（Haloxylon）植物，顾名思义，主要生长在荒漠沙丘，且海拔在200 ～ 1 000 m 的地区。主要分布在内蒙古自治区阿拉善盟和巴彦淖尔市，宁夏回族自治区的中卫市、张掖市、嘉峪关，8 个甘肃省内地区及新疆北部的沙漠地带[3-4]。（2）盐生肉苁蓉（Cistanche salsa）。主要寄生在盐爪爪、珍珠柴、芨芨草等植物上。此品种有一变种：白花盐苁蓉。多集中在荒漠草原地区、荒漠地区的湖盆低地地带及重盐碱地区，较沙苁蓉的生存海拔范围广，约为700 ～ 2 500 多米。主要分布于内蒙古、新疆、甘肃和宁夏地区[3-6]。（3）沙苁蓉（Cistanche sinensis）。寄主为红沙（Reaumuria soongaria）。此类植物是中国特有品种，主要产地为我国内蒙古自治区、甘肃省及宁夏回族自治区[7]。主要生存在荒漠草原地区及荒漠区中的沙地、砾石或丘陵，海拔在1 000 ～ 2 000 m 的地带中。（4）德赢vwin登录 （Cistanche tubulosa）。寄主为柽柳属（Tamarix）植物红柳。主要发现于新疆维吾尔自治区南部地区如塔里木盆地等，多寄生在柽柳属植物根部。（4）兰州肉苁蓉（Cistanche lanzhouensis）。寄主为红沙（Reaumuria soongaria）。首次发现于兰州市，其标本植物保存于兰州大学。主要分布在甘肃省兰州市，生长于山坡，有学者建议将兰州肉苁蓉归为沙肉苁蓉[8-9]。2 肉苁蓉营养价值和功能特征2.1 营养特征肉苁蓉的营养成分包括脂肪、糖水化合物、维生素和矿物质等，其中含有18 种氨基酸、多种多不饱和脂肪酸、维生素。肉苁蓉矿物元素中钾、钠、铁含量较高（见表1），同时含有丰富的硒[10]。2.2 保健功效2.2.1 延缓衰老作用肉苁蓉是一味名贵的补益中药，其抗衰老、延年益寿的作用仅次于人参，居第2 位。研究发现，肉苁蓉延缓衰老的作用与其多种活性成分有密切关系，其中肉苁蓉的乙醇抽提物能显著提高小鼠体内的SOD 活性[11]。2.2.2 调节肠道作用中医认为肉苁蓉具有很好的润燥通便的疗效。肉苁蓉类药物的水煎剂可改善小肠蠕动，抑制大肠水分吸收，缩短排便时间。研究发现，肉苁蓉生品的通便作用强于制品[12]。2.2.3 抗疲劳作用肉苁蓉对阳虚患者具有明显的增强体力和抗疲劳作用。观察喂服肉苁蓉水煎液的小鼠发现，阳虚小鼠体重、自主活动次数均增加，并延长了游泳时间，同时降低了运动后的血乳酸、尿素酸的累积，血清尿素氮含量显著降低，结果说明肉苁蓉具有增强体力和抗疲劳之功效[13]。2.2.4 补肾益精作用肉苁蓉具有补肾阳、益精血的功效。肉苁蓉提取物可影响下丘脑单胺类神经递质的代谢，以此直接或间接参与调解下丘脑—垂体—性腺的功能，这可能是肉苁蓉具有补肾壮阳作用的机理[14]。2.2.5 其它作用研究发现，肉苁蓉除具有上述功能外，肉苁蓉颗粒对帕金森病大鼠模型的黑质和纹状体的多巴胺能神经元具有保护作用[15]，即具有神经保护作用；肉苁蓉提取物可增强ATP 酶活性，维持细胞线粒体膜电位，提高肝脏的抗氧化作用，减少脂质过氧化产物，保护肝细胞[16]，起到了保护肝脏的作用。研究发现，肉苁蓉多糖可明显改善小鼠巩固性记忆障碍及再现记忆性障碍，其机制与促进脑内蛋白质合成有关[17]。因此，肉苁蓉多糖也有改善再现性记忆障碍的作用。2.3 医用价值肉苁蓉为用药最广的中草药之一。肉苁蓉粗提取药物，味甘咸、微辛酸和微温。临床上多用于肾阳不足、精血亏虚所致的阳痿、不孕、腰膝酸软、筋骨不力及肠燥便秘等。3 肉苁蓉的加工和应用3.1 应用发展过程早东汉时期的《神农本草经》中，肉苁蓉被列为上品，用于治疗或作为补药，有补中、滋阴补肾、入肝和通便润肠之功能。其后古典《本草经疏》《本草汇言》《月华子本草》等多有记载。据记载史册显示，肉苁蓉的入药史已有1 000 多年。据魏晋时期的《吴普本草》记载，盐生肉苁蓉个体较小，产于人烟稀少的干旱或半干旱地区，同时一年中大部分时间都在地下生长，仅在生殖生长期出土，古代人民也多在野生肉苁蓉开花期（公历4 月—6 月）寻觅到这种植物，并挖取其肉质茎入药。南北朝陶弘景的《本草经集注》首次描述了肉苁蓉属植物的特征性形态，认为肉苁蓉是野马交配时精液掉在地上而生长起来的，这一说法虽然荒谬，但却道出了这种植物不同于大多数植物的无根、寄生生长特性，该书还记载了此物生长在西北多马的荒漠地带。陶弘景所记载的肉苁蓉应是荒漠肉苁蓉和盐生肉苁蓉，且认为前者质地更好。唐代《本草拾遗》中记载：“肉苁蓉三钱，三煎一制，热饮服之，阳物终身不衰”。现代医学也证明肉苁蓉中含有大量氨基酸、胱氨酸、维生素和矿物质珍稀营养滋补成分，对男性肾、睾丸、阴茎和海绵体等性器官都有极大的补益效果，可提高精子活力及质量。宋代《本草图经》对肉苁蓉也作了较为详细的描述，已认识到抽茎开花时的肉苁蓉肉质稍减而燥，功力大减，应在肉质茎刚出土的3 月采收。从20 世纪80 年代开始，国内外对肉苁蓉的成分进行了大量研究，其中日本起步较早，随着分离提取和检测技术的飞速发展，目前已分离出多种类型的物质，其中苯乙醇总苷是肉苁蓉中主要的活性成分，具有提高男性性功能、治疗女人宫寒不孕、抗氧化、抗衰老、提高免疫力和增强记忆力等功能。1993 年，在国际医学会日内瓦年会上爆出中国阿拉善盟查干希热跻身世界长寿之乡，人均寿命为87.5岁。中外专家组调查研究发现，这与当地居民的饮食结构有关，主要是当地居民有食用肉苁蓉的习惯。如在炖羊肉中放入肉苁蓉，饮自制苁蓉酒等，引起了医学界对肉苁蓉的广泛关注[18]。进入21 世纪以来，肉苁蓉被国家和相关人士高度重视，不断开发肉苁蓉及肉苁蓉产品。3.2 肉苁蓉应用现状作为蒙药、维吾尔族药、中药的肉苁蓉具有提高免疫力、抗衰老、改善阳痿早泄、抗疲劳、保护肝脏、保护心脑血管和润肠排毒等作用，主要在医疗领域研究使用。肉苁蓉的传统炮制方法包括浸、焙、熬、剉、煮、蒸、薄切及趁鲜用等。其中浸泡辅料以酒居多，也有用水及米泔水浸者，切片基本是薄切。炮制所用的辅料多为酒，酒的种类有清酒、烧酒、无灰酒等，炮制时间有酒浸一宿、酒浸一日夜、酒浸三日、酒拌蒸从午至酉及煮烂等。肉苁蓉炮制的显著特点就是以酒炮制，历版药典也收载了酒制法，说明酒肉苁蓉临床应用广泛，具有提高疗效之作用。近年来，随着人工种植产量的增加，对肉苁蓉的研究更加深入，在化学成分和药理作用方面均作了大量研究。截至目前，从肉苁蓉中分离提纯到34 种苯乙醇苷类成分，其中包括22 种双糖苷、10 种三糖苷、2种单糖苷[18]。目前已开发出流通于市场的产品有苁蓉酒、苁蓉养生液、养肾液、苁蓉口服液、苁蓉茶、苁蓉胶囊、苁蓉片、苁蓉颗粒和肉苁蓉煎丸等药品、保健品。肉苁蓉也常作为食品、保健品出现在人们的饮食中，较为常见的有肉苁蓉粥、苁蓉麻子仁膏、肉苁蓉酒、肉苁蓉枸杞酒和苁蓉菟丝酒等。同时，在食品加工方面，也有肉苁蓉饮等产品，但开发利用的较少。4 肉苁蓉的前景及展望肉苁蓉作为国家二级保护植物，具有极高的药用和保健价值，是我国西北部地区著名的中药材之一。近年来对肉苁蓉的人工种植、化学成分及药理作用研究都取得了可喜成绩。肉苁蓉的药用价值很高，但目前只限于基础研究，在新药、保健品、食品和饮品等领域中的开发、应用比较欠缺。随着科技的发展和人们对肉苁蓉认识的加深，今后应在药用基础上，进行更广泛和更深层的研究，扩大肉苁蓉的应用范围，使肉苁蓉这一宝贵资源有更可观的发展前景，从而推动肉苁蓉的进一步发展。参考文献：[1] 刘媖心. 中国沙漠植物志[M]. 科学出版社，1985.[2] 屠鹏飞，何燕萍. 肉苁蓉类药源调查与资源保护[J]. 中草药，1994，25（4）：205-208.[3] 李佳政. 沙漠人参——肉苁蓉[J]. 新疆农垦科技，1989（1）：23.[4] 马 强.“沙漠人参”肉苁蓉[J]. 内蒙古农业科技，1995（2）：38.[5] 孙永强，郑兴国，张小芬，等. 新疆肉苁蓉资源及人工种植研究初探[J]. 干旱区资源与环境，2003，17（3）：123-127.[6] 杨昌友，沈观冕，毛祖美. 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摘　要:肉苁蓉历来是科研工作者研究药用植物的热点。本文着重从抗氧化, 抗衰老, 抗肝炎以及提高机体免疫力等方面, 对肉苁蓉的药理作用进行了综述, 同时对肉苁蓉的开发和利用进行了展望。关键词:肉苁蓉;抗氧化;抗衰老;抗肝炎;免疫力　肉苁蓉是用途广泛的珍贵中草药之一, 自古被用作强壮滋补之草药, 至今已有1000多年的历史, 有“沙漠人参”的美称。在2000年版《中华人民共和国药典》中记载, 肉苁蓉“补肾阳、益精血、润畅通便, 用于阳痿, 不孕, 腰膝酸软, 筋骨无力, 肠燥便秘”[ 1] 。肉苁蓉分布在我国的内蒙古, 新疆, 陕西, 甘肃, 宁夏, 青海一带的荒漠。长期以来,自然因素和人为过度放牧, 不合理采挖, 不但造成沙漠, 荒漠地区生态环境的严重破坏, 也使得肉苁蓉及其寄主处于濒危状态, 现被列为国家二级保护植物。肉苁蓉在全世界约有22种, 我国有6 种, 其中沙漠地区分布如下5个种:荒漠肉苁蓉CitanchedeserticolaY, C.Ma, 通常被称为梭梭大芸, 分布于内蒙古西部、宁夏、甘肃西部、新疆、青海等地, 寄主为梭梭和白梭梭。该种为《中国药典》收载的品种;盐生肉苁蓉C.Salsa( C.A.Mey) G.Beck, 分布于内蒙古西部、陕西、宁夏、甘肃、青海、新疆。寄主为盐爪爪、凸尖盐爪爪、红沙、珍珠柴、白刺和芨芨草等。该种主要生长在盐碱较重的洼地、土坡或盐湖附近。据研究该种为大芸属植物中有效成分含量最高, 生物活性最强的一种;白花盐苁蓉C.Salsa( C.A.Mey) G.BeckvaralbifloraP.F.TuetC.1ou, 主要分布于宁夏(盐池) , 新疆(柴窝堡) 。生长环境同原变种盐生大芸, 寄主为珍珠柴, 产量很小;沙苁蓉C.SinensisG.Beck, 分布于内蒙古西部, 宁夏、甘肃, 生于荒漠草原带及荒漠区的沙质地, 砾石地或丘陵坡地。寄主为红沙, 珍珠柴、沙冬青、藏锦鸡儿、霸王、四合木、绵刺等, 目前未作药用;德赢vwin登录 Cistanchetubulosa(schenk) wight, 通常称之为红柳大芸。野生德赢vwin登录 在我国仅分布于新疆北部的奇台、吉木萨尔县;南部的塔克拉玛干沙漠周围地区, 寄生于柽柳属植物———红柳的根上[ 2] 。1　肉苁蓉的药理学作用研究概况肉苁蓉的独特的药用价值和临床疗效, 一直是众多医药工作者研究的热点。尤其在药理学方面的探究已经获得了一定的成果。对人体的众多方面起到了积极的治疗和保健作用。研究表明, 肉苁蓉、盐生肉苁蓉、德赢vwin登录 均能使小鼠体重显著增加, 持续游泳时间显著延长, 可见三者均有促进小鼠生长和增加其抗疲劳的作用, 还能提高小鼠耐缺氧能力[ 3] 。肉苁蓉的水溶液能显著提高小鼠小肠推进度, 使小鼠排便时间显著缩短, 同时对大肠的水分吸收也有明显的抑制作用, 显示肉苁蓉有明显的通便作用[ 4] 。孙云[ 5] 等应用射电透镜观察新疆肉苁蓉对实验性小鼠衰老模型的肝和大脑皮质的作用, 结果显示, 肉苁蓉对衰老模型肝具有良好的保健和治疗作用。1.1　增强免疫功能　肉苁蓉总苷对60 Co照射损伤小鼠T淋巴细胞功能的影响研究发现肉苁蓉总苷( GCs) 对Co射线损伤小鼠T淋巴细胞功能有影响。用Co照射1 Gy一次全身照射NIH小鼠, 检测小鼠的迟发型超敏反应、胸腺指数、T淋巴细胞增殖反应和IL-2 的活性。结果表明:Co照射后, 可明显抑制小鼠迟发型超敏反应, 降低胸腺指数, 并使T淋巴细胞增殖能力及IL-2 的活性明显下降,GCs能增强受照射小鼠迟发型超敏反应, 增加胸腺指数,增强T淋巴细胞增殖反应和IL-2 的活性。肉苁蓉总苷对辐射损伤小鼠的T淋巴细胞功能具有较强的保护作用。肉苁蓉粗制剂具有增强免疫功能、血系统损伤有保护作用, 并能不同程度地调节辐射损伤小鼠的体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫功能[ 6] 。1.2　补肾壮阳　肉苁蓉是名贵的补药, 具有补肾, 壮阳,强肝肾益精气等作用。研究发现肉苁蓉中起补肾壮阳的有效成分是苯乙醇苷类成分, 如松果菊苷, 洋丁香酚苷类等。它主要通过两种途径起作用:其一:增强下丘脑—垂体—肾上腺功能, 促进体内相关递质和激素的释放, 提高性欲;其二, 抗疲劳、提高身体机能作用。肉苁蓉的补肾作用与一般补肾药如淫羊藿、巴戟天等不同, 肉苁蓉补肾而不伤阴, 长期服用一般不会出现上火、口干等症状, 故《本草纲目》谓其“补而不竣, 故有从容之号”, 其意为从容补肾。肉苁蓉补肾男女皆宜, 故其既可治疗男子阳痿, 也可治疗女子不孕。由于肉苁蓉确切的补益作用, 成为历代医家处方中最常用的补益药之一。试验结果表明, 动物在较长时期使用皮质激素的同时, 加用补肾壮阳的中药肉苁蓉醇提物, 可防止单用激素所引起的肾上腺皮质萎缩。肉苁蓉醇提物对肾功能有一定的保护作用[ 7] 。1.3　增强肌体的抗衰老能力1.3.1　肉苁蓉多糖对衰老小鼠大脑神经元影响　通过对新疆肉苁蓉多糖对衰老小鼠大脑神经元形态学的研究发现肉苁蓉多糖对臭氧造成衰老小鼠大脑皮质神经元有作用。臭氧使小鼠大脑皮质神经元内单胺氧化酶、乳酸脱氢酶、脂褐索均有明显升高, 血管基底膜增厚。给药组对小鼠大脑皮质神经元内MAO-B、LDH、脂褐索明显下降, 尼氏小体、溶酶体增多。实验从细胞水平证明了肉苁蓉多塘对衰老小鼠具有抗神经元损伤和延缓衰老的作用, 能使臭氧所致的衰老小鼠的生理生化指标得到改善[ 8] 。1.3.2　肉苁蓉多糖衰老小鼠肺一氧化氮及细胞凋亡的影响　研究了肉苁蓉多糖( CDP)对肺衰老模型的细胞凋亡、一氧化氮( NO)含量及超氧化物歧化酶( SOD)活力的作用及作用机制, 发现衰老可引起血清及肺组织SOD活性降低、NO含量升高, 还可诱导肺组织细胞凋亡。CDP可以明显提高机体血清和肺的SOD活力、降低NO浓度, 明显抑制了肺组织细胞凋亡, 使细胞数减少, 凋亡百分率( APO)降低。结果证明CDP对衰老小鼠肺组织细胞的退行性变化具有改善或延缓作用。凋亡研究证实肉苁蓉具有抗氧化抗疲劳, 延缓衰老的作用。1.4　保护肝脏　通过肉苁蓉水提液对致衰大鼠肝脏氧化损伤保护作用的研究表明, 衰老时细胞内, 尤其是线粒体SOD活性下降, MDA含量增加。衰老大鼠肝组织活性氧单位( 抗氧化能力) 较青年鼠显著下降, 肝线粒体丙二醛( MDA) 含量显著上升。实验证明, 衰老大鼠肝组织Ca2 +-ATP酶活性的下降可能也是由于氧自由基从线粒体漏出后损伤细胞膜而导致的结果。衰老时出现细胞内钙稳态失调和细胞钙调节能力减低.细胞膜钙泵活性随年龄增加而显著下降, 外排Ca2+的能力明显降低, 结果导致细胞内游离钙增加, 钙稳态失调[ 11] 。实验证实, 衰老大鼠肝组织Ca2 + -ATP酶活性下降.肝线粒体PLA2 活性升高, 说明可能由于Ca2+ -ATP酶活性的下降使胞浆Ca2 +浓度升高, 导致线粒体PLA2 活性的升高。PLA2 是许多生化过程的关键酶。它可以水解自身磷脂使线粒体膜骨架脆性增加, 花生四烯酸释放增加;同时产生大量自由基, 导致膜通透性增加, 钙离子大量流人, 钙离子进一步激活PLA2[ 12],从而造成恶性循环。此外, PLA2 活性的升高可以改变膜磷脂的成分, 对膜流动性产生影响。同时PLA2 降解磷脂的产物也会损害呼吸链, 影响氧化磷酸化并造成线粒体不可逆损伤[ 13] 。PLA2 还可以直接造成质子跨线粒体内膜转运能力下降及H+ -ATP酶活性下降。PLA2 会从不同方面造成线粒体功能下降进而影响机体正常功能。实验显示, 肉苁蓉水提液可提高肝脏抗氧化能力、Ca2 + -ATP酶活性。降低肝线粒体MDA含量、PLA2 活性。这可能是由于肉苁蓉具有抗氧化功能, 使自由基生成减少, 从而减轻自由基对肝组织及线粒体的损伤作用, 进而提高肝脏抗氧化能力, 减少脂质过氧化, 也使Ca2 + -ATP酶免受损伤, 保证了Ca2 + -ATP酶的活性, 使肝细胞内外钙离子浓度保持正常水平, 避免由于胞内钙超载而导致线粒体PLA2 活性的升高。实验表明, 肉苁蓉水提液通过提高肝脏抗氧化作用, 减少脂质过氧化产物, 减轻线粒体氧化损伤起到抗衰老作用[ 11] 。1.5　抗氧化作用　荒漠肉苁蓉提取物显著降低人体脂质过氧化物( LPO)含量[ 14] 。荒漠肉苁蓉、盐生肉苁蓉、德赢vwin登录 和沙苁蓉均对兔血和小鼠肝脏的LPO生成有明显抑制作用, 其中盐生肉苁蓉作用最强, 德赢vwin登录 次之[ 15] 。李琳琳等[ 16] 研究了盐生肉苁蓉苯乙醇总苷的抗氧化作用, 结果发现其可以显著提高小鼠心、肝、脑组织中硒谷胱甘肽过氧化物酶和SOD活性, 提高肾组织中SOD活性, 并降低各组织中LPO及脂褐质含量。熊泉波等[ 17] 报道从荒漠肉苁蓉中分离得到的9 个苯乙醇苷类化合物均具有显著清除自由基活性和抗脂质过氧化的作用, 并发现分子中酚羟基越多活性越强, 推测苯乙醇苷类化合物是荒漠肉苁蓉抗氧化的主要活性成分。[ 14]2　肉苁蓉的发展前景与展望肉苁蓉为国家二级保护植物, 具有极好的药用价值,是我国中西部地区著名的中药材之一。为保护资源, 开发利用及提高中药材的质量, 一方面, 应建立肉苁蓉及其寄主植物(护沙植物) 产业化栽培基地, 对于西部沙漠、荒漠地区的环境治理和促进西部地区的开发, 具有重要的意义[ 18] 。另一方面, 利用组织培养手段获得商品蓉的研究亦需同时进行。目前, 这方面工作仍很薄弱, 其中通过诱导不同外植体产生愈伤组织, 且从中提取氨基酸已获成功[ 19] 。但如何进一步改善品种, 提高产量, 并使其优良品种迅速推广, 以保护资源, 开发利用及提高中药材的质量,仍是生物技术工作者急需解决的问题。随着科技的发展和人们对肉苁蓉认识的加深, 这一宝贵资源一定会有可观的发展前景[ 20] 。参考文献[ 1]屠鹏飞, 戴裕光.古文趣话肉苁蓉[ J] .家庭医药, 2005, ( 2) :11 .[ 2] 田海舟等.德赢vwin登录 生物学特性研究[ J] .2004, ( 5 ) :11.[ 3] 张勇等.三种肉苁蓉补肾壮阳作用的比较[ J] .中国中药杂志, 1994, 19( 3) :169.[ 4] 张自舜等.肉苁蓉的通便作用[ J] .中药材, 1992, 15( 7) :33.[ 5] 孙云等.新疆肉苁蓉对小鼠衰老模型肝和大脑皮质影响的透射电镜观察[ J] .中药新药与临床药理, 1997, 8( 1 ):30.[ 6] 蒋晓燕.肉苁蓉总苷对60Coγ射线小鼠脾损伤的影响[ J] .新疆医科大学学报, 2001, ( 24) :297[ 7] 潘玉荣等.肉苁蓉醇提物对阳虚动物模型肾脏-肾上腺的影响[ J] .实用中医药杂志, 2004, 20 ( 7) :357[ 8] 王德俊等.肉苁蓉多糖对衰老小鼠大脑神经元影响的形态学研究[ J] .实用医药杂志, 2001, 14( 1 ):1.[ 9] 孙云等.肉苁蓉多糖对衰老小鼠肺蛋白含量与抗氧化功能关系的影响[ J] .中国药理学通报, 2001, 17( 1 ):101 -103.[ 10] 孙云等.肉苁蓉多糖对衰老小鼠肺一氧化氮及细胞凋亡的影[ J] .中国药理学通报, 2003, 19( 6 ):683 -686.[ 11] 狄荣科, 马瑞, 周志强等.褪黑激素对中老年大鼠抗氧化作用的初步观察[ J] .中国老年学杂志, 2000, 20 ( 4) :232 -233.[ 12] RordorfG, UemuraY.BonventreJV.Characterizationofphos-pholipaseA2( PLA2) activityingerbilbrain:enhancedactivitiesofcytosolic,mitochondria1.andmicrosomalformsafterischemiaandreperfusion[J] 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关键词:肉苁蓉;肉苁蓉总甙;药理作用;研究进展肉苁蓉, 多年生高级寄生植物, 为列当科Cistanche deserticolaY.C.Ma 肉苁蓉的干燥带鳞叶的肉质茎。主产于我国内蒙古、新疆、甘肃和宁夏等地, 生长于盐碱地, 干河沟沙地和戈壁滩一带。在蒙医药方剂中具有补肾益精, 润燥的功能。近些年来人们采用先进的科学技术手段及大量的动物实验对肉苁蓉及有效成分进行了深入的研究, 本文综述了有关肉苁蓉的药理学方面的研究进展。1 　调节免疫功能作用日本学者木下刚等对14 种产地及来源明确的中药中的多糖成分进行了一系列免疫功能的研究, 当肉苁蓉多糖给药剂量为每只800μg·ML-1时, 血清溶血素值为49 ±3 .4。给予同样剂量的阳性对照药酵母多糖时, 溶血素值为46 ±6.3,给药剂量每只200μg·ML -1时, 肉苁蓉多糖的血清溶血素为30 ±1 .0, 而同样剂量的酵母多糖的溶血素值为25 ±2.0。在嗜异抗原反应实验中, 给豚鼠静脉注射作为溶血素的家兔血清时, 空白对照组首先出现立毛、搔鼻、呼吸急促症状, 接着便出现呼吸困难, 痉挛直至死亡, 而给予肉苁蓉多糖时, 以上症状大大的减轻, 给药组死亡率为3/ 5, 空白组的生存时间为23.8min, 给药组为47.6min, 注射溶血素前, 空白组和给药组的补体价( CH50) 分别为212 和228, 注射后分别为134 和208, 由此可以得出苁蓉多糖不仅能使动物存活时间延长, 减少死亡, 而且能够明显的抑制CH50 的降低。在抗癌实验中肉苁蓉多糖能够明显的延长接种腹水型肉瘤S180 癌细胞小鼠的生存期, 当给药剂量为100μg·kg 时, 生存期为256 天, 而空白组仅为210 天,B 细胞能分泌多种抗体, 是体液免疫的主要细胞, 经绵羊红细胞免疫后的小鼠, 其B 淋巴细胞就可以合成和分泌抗绵羊红细胞抗体— 溶血素, 也称抗体分泌细胞( PFC) 。在木下刚等人的溶血空白实验中当药物剂量为50μg·kg 和200μg·kg 时, 小鼠脾细胞的抗SRBC 抗体分泌细胞数和空白组的1 .876 相比, 分别为2.970 和2.957, 表明苁蓉多糖能促进正常小鼠B 淋巴细胞的分泌和合成PFC, 从而增强了小鼠体液的免疫功能〔1〕。2 　强壮、壮阳及通便作用华中键等人以大鼠“肾阳虚模型” 血清LDH 同工酶的活力为观察指标, 从调节机体糖代谢的角度对补肾壮阳药肉苁蓉进行考察。实验结果表明:用醋酸氢化考的松造成的“ 肾阳虚” 组, LDH2 -4活力明显增加, 而LDH5 的活力明显下降,用药后可使阳虚动物低下的LDH5 和增高的LDH4 趋于正常, LDH 同工酶在机体糖代谢中起着重要的作用, 故通过“ 肾阳虚” 模型LDH 同工酶的变化, 可反应补肾药能调整和改善肾阳虚机体的糖代谢〔2〕。刘福春等人以3H -Tdr 体内掺入DNA 的方法, 测定“ 肾阳虚” 动物模型的DNA 合成率, 考察肉苁蓉对阳虚动物脱氧核糖核酸合成率的作用。根据实验结果:空白组的DNA 合成率为11560, 阳虚组为5600, 而给药组则为9900, 说明肉苁蓉能显著提高“阳虚” 小鼠的DNA 合成率。通过调整“ 阳虚”动物的核糖代谢而起到中医理论的“ 壮阳” 作用。同时从动物外观观察, 阳虚动物活动迟缓、萎靡、倦缩体、毛枯疏, 皮肉松懈, 尾巴发凉, 个别小鼠呈片状脱毛等症状, 而用强壮药的小鼠则和正常对照组一样体肥毛润, 动作灵活, 两者形成明显对照, 在耐冻实验中, 阳虚动物明显不耐寒, 肉苁蓉不但能纠正羟基脲所致的“阳虚” 动物的耐寒力, 甚至超过了正常对照组。因此, 可以认为肉苁蓉对动物阳虚病症有着明显的强壮和治疗作用〔3〕。徐文豪等人通过动物实验证实, 肉苁蓉能引起大鼠胃底条和豚鼠回肠的收缩, 并且这种收缩可被阿托品药物所抑制, 这说明, 拟胆硷活性与其通便作用有关〔4〕。3　抗衰老作用李巧如等在研究肉苁蓉的抗衰老作用时, 发现将肉苁蓉95 %的乙醇提取物给予小鼠后, 能使小鼠体内的SOD 活性明显增强, 药物剂量在2 .5 ～ 31 .25g·kg 之间内, 均能显著增强小鼠红细胞内的SOD 活性, 同时作者还发现当培养基中含5%～ 10%的肉苁蓉时, 能使果蝇的寿命明显延长〔5〕。项平以家蚕幼虫期和毛虫生存期为观察指标, 考察了肉苁蓉的抗衰老作用, 发现肉苁蓉可延长家蚕的幼虫期和全虫的生存期〔6〕。袁朝辉等人以黑腹果蝇为对象研究了肉苁蓉的抗衰老作用, 结果表明, 肉苁蓉也能明显延长黑腹果蝇的寿命, 在5%肉苁蓉培养基中黑腹果蝇的半数死亡期比对照组长出84 .2%( 雌) 、92 .89%( 雄) , 在10 %肉苁蓉培养基中则为46.12 %( 雌) 和95 .43%( 雄) , 从平均寿命看分别延长了48.92 %( 雌) , 52 .9%( 雄) , 30 .35%( 雌) , 46 .79( 雄) , 从实验结果可以看出, 肉苁蓉的抗衰老作用对雄蝇作用明显优于对雌蝇的作用〔7〕。4 　抗氧化作用王晓霞等人采用邻苯三酚自氧化, 硫代巴比妥酶( TBA)和荧光法, 分别测定小鼠心、肝、脑、肾组织中的SOD 活性、M DA 及脂褐质含量, 用生理盐水为对照组和不同剂量的肉苁蓉总甙( GCS) 组( 62.5, 125, 250mg/kg -1·d-1 , ig) 研究发现肉苁蓉的有效成分肉苁蓉总甙( GCS) 能明显提高小鼠心、肝、脑、肾组织中自由基清除酶SOD 活性, 其中GCS( 125mg/kg,250mg/ kg) 组能显著提高脑和肾组织中SOD 的活性, 作用敏感。250mg/ kg 时提高心和肝组织中SOD 的活性, 并显著降低各组织MDA 及脂褐质含量。表明GCS 能有效地提高机体组织抗氧化能力, 防止组织脂质过氧化损伤〔8〕。5 　抗辐射作用李琳琳等人用损伤组和治疗组小鼠对肉苁蓉中的有效成分肉苁蓉总甙( GCS ) 进行了研究, 对比受60Co 照射后小鼠红细胞内SOD 活性及肝脏MDA 含量的影响, 实验表明损伤组较正常组红细胞内的SOD 活性降低46 .8%( P <0.01) ,GCS125, 250mg/kg -1 , 治疗组分别较损伤组增加52 .1%( P<0 .01) , 损伤组肝脏MDA 含量较正常组明显增加24.3 %( P <0.01) , 各治疗组分别较损伤肝脏MDA 含量明显降低18 .4%, 17 .9 %( P 均<0 .01) , 略高于正常组( P >0.05) 。通过实验, GCS 治疗组能明显促进受照射小鼠红细胞内SOD活性及脾脏核酸含量的恢复, 抑制肝脏脂质过氧化物的形成。表明GCS 对辐射后的小鼠有防护作用。通过组织形态学的比较也说明GCS 可使受照射后损伤的肝脾组织结构恢复良好〔9〕。6 　心肌缺血的保护作用毛新民等人采用结扎冠状动脉造成大鼠心肌缺血模型,研究了肉苁蓉总甙( GCS) 对缺血心肌的保护作用。结扎冠状动脉后, 心肌中SOD、CPK 活性降低, MDA 含量升高, 心电图表现为S -T 段升高, 大鼠静脉给予GCS5min 后再结扎冠脉, 结果GCS 能明显改善缺血心电图, 减少心肌梗死面积, 提高心肌组织中的CPK 活力, 但对SOD 和MDA 无显著影响,提示GCS 对缺血心肌有保护作用。GCS 可提高缺血再灌注心肌SOD 和硒谷胱甘肽过氧化物酶的活性, 降低M DA 含量, 减轻心肌超微结构的损伤〔10〕。7　结　语肉苁蓉长期以来有较广泛的临床应用, 但缺乏系统的观察和总结, 自80 年代起, 国内外学者利用现代实验手段, 对近代药理学方面进行了较深入的研究, 其成果令人瞩目。但目前对临床病种的样本观察研究尚显不足, 从上述资料表明, 它能提高机体免疫功能, 促进DNA 合成, 增强体力, 具有明显的抗衰老作用, 以及化疗后的治疗, 对缺血心肌的保护,这给临床的用药提供了很好的试验资料及科学根据, 是一味很有前景的药材, 有待进一步临床研究、试验。参考文献〔1〕木下刚.免疫功能的影响〔J〕.生药学杂志〔日〕, 1986,( 3) :325-332 .〔2〕华中键, 冯群先, 仇健明, 等.温补肾阳药对大鼠LDH 同工酶活性的影响〔J〕.中国中西医结合杂志, 1992, 12( 2) :103.〔3〕刘福春.中西医结合杂志, 1994, 8( 4) :488-489 .〔4〕徐文豪, 邱声祥, 沈连忠.肉苁蓉和盐生肉苁蓉化学成分和药理作用的比较〔J〕.中草药, 1995, 26( 3) :143 -146.〔5〕李巧如.肉苁蓉抗衰老作用的实验研究〔J〕.上海中医药杂志, 1990, ( 11) :22 .〔6〕项平.七种中药抗衰老作用的实验观察〔J〕.辽宁中医杂志, 1982, ( 3) :44.〔7〕袁朝辉.老年学杂志, 1991, 11( 2) :102 .〔8〕王晓雯, 李琳琳, 木胡牙提, 等.肉苁蓉总甙对小鼠组织的抗氧化作用〔J〕.中国中药杂志, 1998, 23( 9) :554-555 .〔9〕李琳琳, 王晓雯, 王雪飞, 等.肉苁蓉总甙的抗脂质过氧化作用及抗辐射作用〔J〕.中国中药杂志, 1997, 22( 6) :364-367.〔10〕毛新民, 王晓雯, 李琳琳, 等.肉苁蓉总甙对大鼠心肌缺血的保护作用〔J〕.中草药, 1999, 30( 2) :118-120 .

骨质疏松（Osteoporosis，OP）是一种好发于中老年人的系统性、慢性疾病，以骨密度下降和骨的显微结构破坏为主要特征。因患者的骨质脆性增加，其发生骨折的风险大大增加，轻微的外伤即可导致骨折。骨质疏松及其严重的并发症，给患者及其家庭和社会带来了沉重的经济负担，同时也严重地影响着患者的生活质量。据统计，我国老年人口总数已占总人口数的13.26％＂。因此，探究疗效更好、更安全的治疗骨质疏松的方法显得非常必要。目前对于骨质疏松的治疗主要采取药物治疗，包括以化学药为主的骨吸收抑制药、骨形成制剂、钙剂和维生素D等。另外，中医药治疗骨质疏松的报道也较多、其中尤以肉苁蓉为主要组方药材。肉苁蓉味甘、咸、性温，归肾、大肠经，具有补肾阳、益精血、润肠通便的功效，常常用于治疗由肾阳亏虚、精血不足所引起的病证“。近来，也有动物实验表明其对阿尔茨海默病模型大鼠有保护作用＂。现代药理研究结果表明，肉苁蓉可以提高骨质疏松模型大鼠血清碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素及钙离子水平，促进大鼠成骨细胞骨形成蛋白2（BMP2）的表达，加快骨髓间充质干细胞的增殖，促使大鼠成骨细胞合成ALP等，从而达到治疗骨质疏松的作用。但目前对于肉苁蓉治疗骨质疏松的作用机制研究尚停留在单项的细胞试验与动物实验上，难以详细地探究其更全面的作用机制。网络药理学以生物信息学、系统生物学、多向药理学、计算机科学等多个学科的技术和知识为基础，可多层次、全面地闸明药物治疗疾病的作用机制，使研究更能体现整体性和系统性。由于网络药理学强调从多靶标、多途径进行分析，这与中药及其复方中多成分、多靶标治疗疾病的特点不谋而合。因此，本研究采用网络药理学的方法，研究分析肉苁蓉的化学成分、作用靶标以及信号通路，并进行基因本体（Gene ontology.GO）分类富集分析及京都基因与基因组百科全书（Kyoto en-cyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析， 通过构建肉苁蓉治疗骨质疏松的“成分-靶标-通路”网络，从整体性角度揭示肉苁蓉多靶标、多通路的作用网络，为进一步探究其治疗骨质疏松的作用机制提供参考依据。1 资料本研究使用的数据库及相关分析平台见表1。2 方法21 化学成分的获取与活性成分的筛选于TCMSP中以“肉苁蓉”作为关键词，搜索获取肉苁蓉所含的所有化学成分信息。以口服利用度（OB）大于30％、类药性（DL）大于0.18作为限定条件＂”，筛选同时符合上述2个条件的成分作为活性成分。利用Pub-chem检索上述活性成分，得到各成分的3D结构并以mol2格式保存。22 活性成分作用靶标及骨质疏松作用靶标的获取本研究利用基于蛋白-配体相互作用亲合性函数的DRAR-CPI，使用该服务器通过分子对接预测各成分可表1 本研究使用的数据库及相关分析平台Tab 1 Involved database and related analysis plat-form in the study名称址版本中药系统理分析平台（TCMSP）http://pswundaca/23有机小子生物性数据Pbdemmp://pubci.achual.nh.govd反向子对接服务DRAR-CPLhtp://oiho-cn/dad更于2017-07-26Unioe知识库（Uniot Kmowledgle）htp://www.t.ng/upo/更于207-06-22Cnonapehttps://cytoscape.ong/3.40白质相互作用库Snghtp://eing.bog/op/apupl105网络务Stens Dat Whttp://wtensdai.mtot.20生物学信注开数库（DAVID）https://dril.acfcf.gov/68Caplad Prsmhttp://www.guppadcol70GeneCad数库htps://www.gmanhurg/411类基因与病数据库CMIMhttp://www.onm.on/更于2018-10-14能对应的靶标，并依据对接的紧密性进行打分。具体操作如下：将“2.1”项检索所得肉苁蓉所有活性成分的mol2格式文件上传至DRAR-CPI，选取Z-score＜-0.5 的靶点作为肉苁蓉活性成分的潜在靶点。利用UniProt知识库的UniProt Knowledgebase搜索功能，导入肉苁蓉作用的蛋白靶点的靶蛋白编号（PBD ID），限定物种为“人”，经过检索和转化操作，得到肉苁蓉活性成分的相应靶标。利用GeneCards数据库和OMIM数据库，以“Osteo-porosis＂或“OP”作为关键词检索，在数据库中收集与骨质疏松相关的靶标。将所得靶标与肉苁蓉活性成分的靶标进行对比，以此筛选出共同的靶标。2.3 “成分-靶标”网络构建与分析将“2.1”项得到的肉苁蓉的活性成分和“2.2”项收集的治疗骨质疏松的靶标导人Cytoscape软件中，构建肉苁蓉的“成分-靶标”网络。2.4 靶标相互作用网络的构建与分析利用String 数据库进行蛋白质之间及与预测蛋白质之间相互作用的搜索。将肉苁蓉的蛋白靶标导人Strin数据库，限定物种为“人”，获取肉苁蓉治疗骨质疏松的潜在靶标间的相互关系。利用Cytoscape软件，绘制蛋白相互作用网路，用Cytoscape的工具NetworkAna-lyzer进行网络分析，将节点大小和颜色设置为用于反映 Degree（连接度，即在网络中通过该点的边的个数）值的大小，边的粗细设置为用于反映结合分数的大小，最终获得靶标间的相互作用网络。2.5 分子对接利用Systems Dock WebSite进行网络药理学的预测和分析，研究配体对复杂的分子网络的作用。该服务器主要通过Dock-In评分（平台内置评分功能）的分子对接功能评估蛋白-配体结合活性，故可利用其得到相互作用网络中的Degree值，对Degree值排名前5的分子与肉苁蓉的活性成分进行分子对接验证。之后保存分子对接结果，并对其进行Docking Score评分，用以评价肉苁蓉活性成分与靶标之间的结合活性。2.6 生物过程与通路分析利用DAVID为大规模的基因或蛋白提供系统而综合的生物功能释信息的功能，获取最显著富集的生物学注释。即在DAVID中，对肉苁蓉的作用靶标进行GO通路和KEGG通路富集分析，保存结果。其中，GO通路富集分析可分为细胞组分（Cellular component，CC）、分子功能（Molecular function，MF）和生物过程（Bi-ological process，BP）3部分。设定阈值P＜0.05，并按照涉及的靶标数目多少进行排序，筛选前20名的生物过程或通路，利用GraphPad Prism 绘制GO通路分析与KEGG通路分析图。2.7“成分-靶标-通路”网络构建分析“2.6”项中排名前20的作用靶标的KEGG通路，结合文献检索，筛选出可能与治疗骨质疏松密切相关的通路，获取富集在这些通路上的肉苁蓉治疗骨质疏松的潜在靶标，并与相应的活性成分相对应，构建肉苁蓉治疗骨质疏松的“成分-靶标-通路”多维网络关系图。3 结果3.1 肉苁蓉活性成分分析在TSCMP数据库中，以OB值大于30％、DL值大于0.18为筛选条件，收集肉苁蓉的活性成分，其中符合条件的活性成分共有13个，包括益母草碱、右旋喇叭茶醇、去咖啡酰基类叶升麻苷、京尼平酸等。另外，本研究还选择了部分OB值低于30％，但含较高，具有较高药理研究价值的活性成分，如橙花醛、蝙蝠葛碱、毛蕊花糖苷等。肉苁蓉主要活性成分基本信息见表2。表2 肉苁蓉主要活性成分基本信息Tab 2 General information of active ingredients of C. deserticola编号化学分中文名08值凯值0000NNaly(Nol)橙花服19.480.34MODBSBand doba(WLN-QIR)苯甲部58.80.38MO日PPPT-(+)右发明茶酶6%0.21910030WLuie监号草9.20.22MOL003Actoade毛花糖普16703500010WDaongtooe去咖难服基类叶开麻普6.30.23%MOD568Gemposdcand京酸9.90.23MOL0M8Gmponle aoL30.%0.31MO0(X)编据其碱23.60.2MOD92Pagne薄酮9.00.2%MOLD254Engnd丁香油高0.32MOL002930Tyoel金额日期0.%0000000WMoce(MTI)胃据动素17.30.83.2 潜在靶标预测在服务器DRAR-CPI中检索肉苁蓉13个活性分子对应的潜在靶标，共得到258个，去除重复靶标后，共得137个潜在靶标。通过与GeneCards、OMIM数据库中与骨质疏松相关靶标的对比，筛选出抗骨质疏松的可能潜在靶标43个，其主要是成骨分化特异性转录分子2（RUNX2）、血管内皮生长因子（VEGF）、白细胞介素6（IL-6）、骨生长蛋白因子（BGP）等。3.3“成分-靶标”网络构建通过将肉苁蓉活性成分和潜在靶标的相关信息输人软件Cytoscape中，构建肉苁蓉的“成分-靶标”网络，见1 注：图中内圈六边形节点中的英文或缩写为活性成分名称，如Ty-rosol为酪醇，其余略：图中外圈圆形节点中英文缩写为靶标名称，如NOS1为一氧化氟合成酶，其余略Note:English or abbreviations in the hexagonal node of inner cirde represent the name of active ingredient,such as Tyrosol;the rest is ab-breviated.English or abbreviations in cirde node of cuter cirde represent the name of target,such as NOSI means nitric axide synthase:the rest is abbreviated图1 肉苁蓉“成分-靶标”网络Fig 1 "Components-targets"network of C.deserticola在图1中，共含有节点56个，边线185条。六边形节点即代表肉苁蓉活性成分，圆形节点代表潜在的靶标。边线代表活性成分与潜在靶标的相互关联。由此图可知，同一活性成分可以作用于不同靶标，同一靶标也可对应不同活性成分，体现出肉苁蓉治疗骨质疏松具有多成分、多靶标的特点。3.4 靶标间相互作用网络的构建通过数据库String获取肉苁蓉活性分子与骨质疏松相关靶标的相互关系，并将数据导人软件Cytoscape中构建靶标间相互作用网络，见图2。由图2可知，靶标间相互作用网络中包含节点59个，边线453条。其中圆形节点代表靶标，边线代表靶标之间的相关性，节点的面积大小表示靶标的Degree值大小，节点面积越大，颜色越深，表示其Degree值越大。通过比较Degree值的大小，并结合现有的研究结果，推测肉苁蓉抗骨质疏松与RUNX2、VEGF、IL-6、肿瘤坏死因子（TNF）、BGP这5个靶标有关。3.5 分子对接注：图中圆形节点上的英文缩写为靶标名称，如IL-6为白细胞介素6．其余略：节点面积大小表示靶标Degree值的大小Note:English abbreviations in circle nodes represent the name of target,such as IL-6 means interleukin-6;the rest is abbreviated.The size of node area represents the size of target Degree value图2 肉苁蓉潜在靶标间相互作用网络Fig2 Potential target interaction network of C.deser-ticola选取靶标相互作用网络中Degree值最大的5个靶标即RUNX2．VEGF、IL-6、TNF、BGP，将其名称输入软件System Dock WebSite，并与肉苁蓉的13个活性分子进行分子对接，5个靶标Docking Score值-活性成分数量结果见图3。 图3 5个靶标Docking Score值-活性成分数量柱状图Fig 3 Histogram of five targets Docking Score-active ingredient quantity由图3可知，在肉苁蓉13个活性分子与5个靶标的对接中，共有6个（占9％）的Docking Score值大于7.36个（占55％）的Docking Score值在5.0～7.0之间，18个（占28％）的Docking Score值在4.25～5.0之间，5个（占8％）的Docking Score值小于4.25。一般认为，DockingScore值大于4.25表示分子与靶标具有一定的结合能力．大于

王延涛1＊，杨智华，陈 怡，麦喆钘，黄嘉华，孙治中，周 驰＇，李伟宽＇（1．广州市番禺区中医院综合科，广州511400；2．广州中医药大学第二临床医学院，广州 510405；3．广州中医药大学第一临床医学院，广州 510405；4．广州中医药大学第一附属医院保髋病区，广州 510115）中图分类号 R932：R966 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2019）05-0645-07DOI 10.6039/.issn.1001-0408.2019.05.14摘要 目的：采用网络药理学方法研究肉苁蓉治疗骨质疏松的作用机制。方法：通过检索中药系统药理学分析平台（TCMSP）获取肉苁蓉的活性成分，采用反向分子对接服务器DRAR-CPI及相关数据库GeneCards，OMIM师选内苁蓉活性成分治疗骨质疏松的作用靶标；采用软件Cytoscape构建肉苁蒙的“成分-靶标”网络，结合数据库String和Cytoscape绘制靶标间相互作用关系；通过服务器Systems Dock WebSite将靶标与活性成分进行分子对接评估二者间的结合活性以进行验证；最后再利用数据库DAVID对靶标基因进行基因本体分类富集分析与京都基因与基因组百科全书通路富集分析。结果：从肉苁蓉中师选出的活性成分有13个，主要为毛蕊花糖苷、益母草碱、京尼平酸等；活性成分作用的潜在靶标有43个，主要有成骨分化特异性转录分子2（RUNX2）、血管内皮生长因子（VEGF）、白细胞介素6（IL-6），骨生长蛋白因子（BGP）、肿瘤坏死园子（TNF）等；靶标作用涉及的信号通路有多条，主要为WNT（Wingless／Integrated），VEGF，TNF等。结论：本研究初步探讨并验证了肉苁蓉治疗骨质疏松的主要靶标和通路，为后续进一步研究其作用机制奠定了基础。关键词 肉苁蓉：骨质疏松；网络药理学；活性成分；靶标；分子对接；信号通路

重庆市荣昌县中医院（402460）李仁生   重庆市荣昌中学医务室周敬蓉妇女更年期综合征主要表现为眩晕耳鸣头痛、潮热汗出、性情急躁易怒、心悸心烦失眠、月经异常等。我们在临床实践中，重用肉苁蓉治疗该病，疗效颇佳，举例介绍如下。高某某，女，49岁，2000年3月6日初诊。患更年期综合征5年，病情逐年加重。症见：头昏胀痛，甚则眩晕耳鸣，潮热汗出日夜阵发10余次，未发时畏风身凉，心烦躁扰，失眠多梦，月经周期紊乱，经量少，神疲形瘦，腰酸肢软，纳呆，大便结，小便黄少，咽干口渴不欲饮，舌红少苔欠润，脉弦细数。辨证：精血亏虚，阴损及阳，虚阳上亢，心肾失交。治法：补肾精，兼扶肾阳，养血平肝，宁心安神。处方：肉苁蓉60g，熟地黄20g，山茱萸20g，天冬20g，白芍20g，酸枣仁15g，炙何首乌10g，山药20g，炙甘草10g，石决明30g，龙骨30g，每日1剂。服6剂后诸症大减，畏风肢凉症除，但仍感神疲乏力。续用上方去石决明、龙骨，肉苁蓉减为30g，加人参15g．守方治疗2月后，体质增强，诸症消失。近2年中如因情绪不好，或遇炎热、闷热天时，潮热头昏痛偶发，但症轻微，用上述方加减调治，数剂即愈。

肉苁蓉善治妇人症瘕核工业成都四一六医院（610051）肉苁蓉，味甘、咸，性温，功具补肾阳，益精血，润燥滑肠。其特点是温而不热，补而不峻，暖而不燥，滑而不泄，为平补之品。临床多用于肾阳不足，精血亏虚所致的阳痿，不孕，腰膝冷痛，筋骨软弱以及肠燥便秘等。此外，民间常用此药治疗妇人症瘕，笔者试用于临床，疗效颇佳。例1：王某某，女，25岁，已婚，1998年5月4日初诊。半年前发觉左下腹有块物，不痛不胀，月经周期无异常，经量中等，每次持续4天，唯经色暗黑有块，经前腰酸痛。右侧附件（一），左侧触及囊样组织约8cmx12cmx10cm大小，无压痛。B超示：左侧卵巢囊肿。舌淡，苔白，脉弦数。拟攻补兼施之法。药用：当归10g，赤芍12g，桂枝10g，茯苓10g，桃仁10g，牡丹皮10g，黄芪25g，萹蓄10g，干姜8g，水煎服。连用20天，附件检查依旧，上方加肉苁蓉50g，服药20天后，自扪症块日渐缩小，上方再服60剂，内诊检查子宫附件：两侧阴性，左侧囊性组织未触及，B超检查，未见异常。无明显好转，上方加肉苁蓉50g，服药30剂后，囊性块物明显缩小，再服40剂，B超检查未发现异常，自觉症状消失。1年后随访，无复发。症瘕，其病有形，在血分者为多。肉苁蓉治疗症瘕在《本经》有记载，如“除茎中寒热······妇人症瘕”。现今少有报道，但民间常用之。笔者认为，肉苁蓉为补精血之要药，血盛则行，行则消症瘕；又入血分，咸能软坚，其性滑利，亦可消症瘕，况本品又善温养阳气，气壮则血流畅，气血流利则痞塞通，症瘕消。