夏美茹，张青，孙志惠，朱效兵（河套学院农学系，内蒙古 巴彦淖尔 015000）摘要：肉苁蓉具有较高的营养和保健功能。本文旨在分类总结肉苁蒙功能因子的提取及其测定方法，为肉苁蓉功能因子的提取、测定及相关领域的进一步研究提供参考。关键词：肉苁蓉；功能因子；提取测定方法肉苁蓉，多年生草本列当科肉苁蓉属植物，多寄生于藜科梭梭属植物的根部叫，生长于半荒漠和荒漠地区，主产于内蒙古自治区（阿拉善盟、巴彦淖尔市）、甘肃省、新疆维吾尔自治区等地。在历代中医补肾壮阳类药物中，使用肉苁蓉的频度很高，因为其功效显著，长于沙漠，被美誉为“沙漠人参”，2018年被列为药食同源类植物。资料显示，肉苁蓉有益肾壮阳叫、润肠通便州、护肝网、调节免疫力、抗肿瘤、抗氧化、抗疲劳呵、抗福射、保护神经系统与改善健忘等作用，遂引起了国内外众多学者的探究。本文综合有关肉苁蓉功能因子检测技术文献，旨在为肉苁蓉功能因子测定方法及提取工艺提供参考。1 肉苁蓉的功能因子从20世纪80年代以来，国内外学者对肉苁蓉的功能因子进行了大量的研究，并取得了极大的进展。研究者们对肉苁蓉进行了分析，从中分离得到28种苯乙醇苷类成分（见表1）；周玉碧等采用气相-质谱联用法分析了肉苁蓉脂溶性提取物中的化学成分，共鉴定了73种化合物。另外，文献报道肉苁蓉中还检出多糖类、黄酮类、环烯醚萜甙、木脂素类、生物碱、氨基酸与微量元素等化学成分。2 肉苁蓉主要功能因子的提取及测定2.1 多糖类多糖是肉苁蓉的主要功能因子之一，其具有抗衰老、抗肿瘤、调节免疫力等作用。连乐等叫研究得出肉苁蓉多糖超声波提取工艺：料水比1：25，提取温度60℃，提取时间75min，含量为18.90％。肖星辉等叫探究得出水浸提法提取肉苁蓉多糖：料液序号化合物名称参考文献序号化合物名称参考文献1肉苁蓉苷A13-1515毛蕊花糖苷14,162肉苁蓉苷B13-1516异毛蕊花糖苷14.163肉苁蓉苷C13-1617管花苷B14.164肉苁蓉苷D13-14.1618管花普E14.165肉苁蓉苷E13-14192-乙酰基毛蕊花糖苷14,166肉苁蓉苷F13-1420盐生肉苁蓉苷D14.167松果菊苷13-14.1621盐生肉苁蓉苷E14.168类叶升麻苷13-14228-表马钱子酸14.1692-乙酰类叶升麻苷13-1423京尼平苷14.1610Osman-thusjde B13-1424尿囊素14.1611海胆苷14-1525半乳糖醇14.1612麦角甾苷14-1526plantainosideC14,16132-乙酰麦角苷14-1527Osmanthuside B6(Z/E)14,1614肉苁蓉苷H14-1528ononin14.16间30min，多糖得率为8.17％。裴爱田叫研究得出肉苁蓉粗多糖脱蛋白工艺：蛋白酶添加量125.6U-mL酶解温度30.0℃，酶解时间96.1min，pH为5.4。肖星辉等探究肉苁蓉最适去蛋白工艺为木瓜蛋白酶用量0.2％，温度50℃，时间2h，多糖的保留率可达96.00％。在肉苁蓉多糖脱色方面，裴爱田叫的研究结果：活性炭添加量为2.5％，温度50℃，吸附40min。肖星辉等［到认为AB-8大孔树脂脱色优于活性炭脱色。其工艺为：上样浓度4gL，洗脱液为60％乙醇，流速1mL-min。2.2 黄酮类肉苁蓉黄酮类物质有改善睡眠、调节机体机能、抗衰老等功效。张瑞平叫研究乙醇提取法提取肉苁蓉总黄酮：乙醇浓度70％、料液比1：30、提取时间2h、温度40℃，提取率为9.33％。罗岩研究超声波辅助提取法提取德赢vwin登录 中黄酮类物质：乙醇体积分数70％，料液比1：30，提取40min，提取2次，测定含量为8.45mgmL＋。杨凯等研究表面活性剂水溶液作为提取剂提取肉苁蓉总黄酮：水溶液提取剂为0.2％的十二烷基硫酸钠，料液比（g：mL）1：20．提取温度80℃，提取1.0h，肉苁蓉黄酮的提取率可达7.34％。肖星辉等叫研究乙醇-盐双水相萃取法萃取肉苁蓉总黄酮的工艺：50％的乙醇，料液比1：50（g：mL）．提取时间3.5h，温度90℃，总黄酮平均得率可达到（13.04±0.06）％；最佳双水相分离体系为EtOH-K，HPO，分离条件为70％EIOH、0.2gmL＋K，HPO．．荒漠肉苁蓉提取液体积分数14％。徐常永等叫通过静态吸附实验，得到AB-8型大孔吸附树脂分离纯化肉苁蓉总黄酮的工艺条件：最佳吸附条件，上样液浓度1.5mgmL＋，流速3mL-min，pH＝6；最佳解吸附条件，80％的乙醇以3mL-min的流速洗脱，使用12倍柱床体积，分离纯化后总黄酮的质量分数为72.35％。2.3 苯乙醇苷苯乙醇苷类化合物是肉苁蓉的主要功能因子之一、其主要成分为松果菊苷和毛蕊花糖苷叫，有着补肾壮阳、保护肝脏、抗氧化与调节免疫力等作用。2.3.1 苯乙醇总苷丁慧玲等优化超声-微波回流提取肉苁蓉中苯乙醇苷工艺，得到在超声频率40kHz，功率50W，提取15min时，最优工艺条件为丙酮体积分数50％，液料比14：1（mL：g），微波功率100W，验证实验得率与理论值接近。黄翔等叫研究不同干燥方式对肉苁蓉中5种苯乙醇苷类成分的影响，得出最佳提取工艺：甲醇体积分数55.14％，液料比46.39，提取时间38.50min。刘丽莎叫等研究肉苁蓉苯乙醇苷水溶媒提取最佳工艺：原料粒径＞40目，料液比1：15.80℃下浸提2h，提取率为（175.9±1.1）mgg。刘朋龙等应用AB-8型大孔树脂分离纯化肉苁蓉苯乙醇苷：上样液浓度1.2mgmL，上样流速1.5 BV-H，吸附时间1.5h；解析时间4h，体积分数40％的乙醇洗脱，洗脱流速1.5BV-h。裴文静叫研究了高剪切均质化提取法纯化肉苁蓉苯乙醇苷：乙醇浓度50％，提取温度70℃，高剪切均质乳化机转速16000rmin，高剪切均质乳化2min，料液比1：9．提取1次。余逸凡等叫优化了大孔吸附树脂分离纯化荒漠肉苁蓉总苷的工艺条件。结果表明，D-101为纯化的较佳树脂，上样液浓度2.0mgmL＊，流速2mlmin；洗脱液体积6BV为较佳吸附条件，该条件下纯化后总苷含量为纯化前的28.85倍。2.3.2 松果菊苷周海燕等图采用HPLC法，以C。为色谱柱，甲醇-0.1％甲酸为流动相，梯度洗脱，体积流量1.0mL-min，柱温35℃，检测波长330nm，松果菊苷在0.0255～0.6120mgmL＋范围内线性关系良好。平均回收率为100.59％。初侨等采用闪式技术提取肉苁蓉中松果菊苷：60％乙醇，闪提转速5500r-min，提取90s，料液比1：30（g：mL），松果菊苷的提取率为8.87mgg。王怀煦探究采用大孔树脂纯化肉苁蓉中松果菊苷的工艺：大孔树脂运用HPD100,6BV的50％乙醇洗脱，气平均收率为91.4％。2.3.3 毛蕊花糖苷初侨等采用闪式技术提取肉苁蓉中毛蕊花糖苷，最佳提取工艺同初侨的松果菊苷提取工艺，毛蕊花糖苷的提取率为6.60mgg＇。孔征等优化提取肉苁蓉毛蕊花糖苷最优工艺为乙醇浓度63％、液料比8：1（mL：g）、浸泡2h、提取1.5h、提取2次。李明国建立了肉苁蓉中毛蕊花糖苷的高效毛细管电泳测定方法：电压8kV，运行缓冲溶液30 mmol-L＋硼酸-硼砂（pH＝9.0），室温，检测波长334nm。毛蕊花糖苷的浓度在0.015～0.375mgmL范围内线性关系良好，样品回收率为99.26％。孔征等叫测定肉苁蓉毛蕊花糖苷含量，采用高效液相色谱法：色谱柱为Inertsil-ODS-3V，甲醇-0.2％甲酸水溶液（40：60，V：V）作为流动相，进样量10μL，流速1mL-min＇，柱温30℃，检测波长330nm。毛蕊花糖苷检测质量浓度的线性范围为18.65～932.4μgmL。2.3.4 红景天苷李明国等“建立高效毛细管电泳色谱法测定肉苁蓉中红景天苷含量的方法。采用毛细管区带电泳（CZE）：运行缓冲液30mmol-L＋硼酸-硼砂缓冲液（pH-9.00），电压8kV，柱温25℃，波长278mm，红景天苷含量在0.007～0.140mgmL的浓度范围内线性关系良好1-0。2.4 多酚类物质张春玲研究建立了紫外-可见分光光度法测定肉苁蓉中多酚类物质（以没食子酸计）含量的方法：70％的乙醇、料液比为1：20、60℃、提取30min，肉苁蓉中多酚类物质的提取效果最好，平均质量百分比为0.2422％。栾朝霞优化大孔树脂纯化肉苁蓉多酚提取物：适用HPD-400大孔树脂，上样溶液60mL，6mgmL＊，流速2mL-min＊；采用60％的乙醇180mL、1mL-min流速洗脱。3 结语肉苁蓉主要功能因子的提取及测定方法较多，笔者对常用方法进行了归纳总结，选出每种测定方法的最优工艺条件供读者参考。

刘耀伟，苏子浩1．内蒙古仕博健康服务产业投资管理有限责任公司，内蒙古 鄂尔多斯017000；南方医科大学，广东 广州 510515【摘要】文章对肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷闪提工艺进行了研究，分别从肉苁蓉药材中活性成分提取工艺优化，肉苁蓉多糖的分离纯化；肉苁蓉精制多糖理化性质检测，肉苁蓉药材植物图谱的建立；肉苁蓉随机扩增DNA多态性（RAPD）指纹图谱等几个方面进行了详细的介绍。闪式提取法提取肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的操作简单、提取丰高、耗时短、节省能源，可为松果菊苷和毛蕊花糖苷的新药开发和工业化生产提供依据，有着更好的推广价值。【关键词】肉苁蓉；松果菊苷；毛蕊花糖苷；闪提工艺；工艺研究肉苁蓉是一种化学成分十分复杂化的物质，被分类为多组分复杂体系。其自身的药材品种十分珍稀的品种，无论是贮藏、产地还是药材的加工工艺，在一定程度上有着很大的难度，是当前研究肉苁蓉药材工作人员的重点关注方向。对于肉苁蓉这一药物而言，其发挥作用是众多成分共同努力的结果，每一种化学成分都不可忽略，但是现在，这一药物的有效成分依旧是一个不明确的课题，有效成分如何发挥作用也尚未明确。因此，现在很多针对这一药物的研究往往是针对其整体或者个别化学成分进行的。相关工作人员想要有效发展中药材的前进研究，需要从质控角度下手，建立健全现代肉苁蓉的质量控制的标准体系。最为常见的肉苁蓉质量稳定性的评价方法就是指纹图谱分析技术，通过谱图反应肉苁蓉材内的化学成分种类与数量，能够提供综合信息从而较好的评价药材质量。1 实验方法1.1肉苁蓉提取方式的选择 实验人员用天平精密称取3份干燥且粉状的肉苁蓉切片10.0g。首先，提取100g的纯净水，第一份粉状的肉苁蓉需要用回流法进行成分的有效提取，实际操作过程中，保证回流提取的次数为2次，每一次的提取操作控制在2h左右。第二份粉状的肉苁蓉则需要采用冷浸法进行成分的有效提取，然后提取之后，相关工作人员需要将其放在室温的环境下，遮挡全部的光线的同时，对其完全浸泡，浸泡的时间控制在2円。第三份粉状的肉苁蓉需要采用超声法对其药材内部的成本进行有效提取，实际操作过程中选择用超声提取2次，每次的提取时间控制在1h。然后，将已经加工处理的三分粉状的肉苁蓉，通过多糖含量测定方法的正确操作，合理的对其进行多糖含量的整体分析比较，分析比较结果，结合实际需求情况，从不同的提取方法挑选出最适合的提取方式。1.2提取工艺考察 在实际提取工艺考察的时候，相关工作人员需要有效的取出干燥的肉苁蓉饮片，紧接着使用60℃～90℃的石油醚中进行回流提取，其中在进行回流提取的时候，需要保证石油醚的体积含量需要是干燥的肉苁蓉饮片的10倍量体积。在回流提取的时候，需要严格控制回流提取的时长，最好控制在2h／次。回流提取之后，相关工作人员需要过滤掉石油醚，然后将肉苁蓉饮片进行干燥处理，紧接着用乙醇对其进行回流提取，其中在进行回流提取的时候，需要保证乙醚的体积含量需要是干燥的肉苁蓉饮片的10倍量体积，并且乙醚的含量为80％。在回流提取的时候，需要严格控制回流提取的时长，最好控制在2h／次，一共进行两次，回流提取之后再对剩余的肉苁蓉药渣过滤口。相关工作人员将已经烘干之后的肉苁蓉药渣，再进行蒸馏水回流提取。回流提取之后，将滤液进行合并处理，将其进行旋燕浓缩加工操作。然后，相关工作人员需要把乙醇的浓度设置为变量，选择不同的乙醒浓度浸泡烘干后的滤渣。其中在进行浸泡的时候，需要保证乙醚的体积含量需要是干燥的肉苁蓉饮片的5倍量体积，并且存在乙醚的室内温度以及乙醚的温度为4℃。静置过夜之后，相关工作人员合理施工离心机，将沉淀的多糖有效收集。将收集到的多糖经过真空干燥后，变成肉苁蓉粗多糖。13多糖的含量测定 采用苯酚-硫酸法测定肉苁蓉多糖含量件。2 肉苁蓉液相指纹图谱建立的实验方法21供试品溶液的制备 相关工作人员用天平精密称取干燥且粉状的肉苁蓉切片1.0g。首先，在1.0g干燥且粉状的肉苁蓉切片中添加甲醇，甲醇的体积控制在50ml。之后用超声提取溶液，此时需要控制超声提取的时间，需要将其控制在30min的时长，在提取过程中，相关工作人员需要及时使用甲醇溶液补重量。30min之后，相关工作人员将提取的取续滤液5ml，将其完全蒸干之后。继续在容器中添加足量的甲醇溶液，彻底溶解之后，将溶液转移到10mL容量瓶。相关工作人员添加甲醇溶液，直到溶液高度到达容量瓶的刻度，停止添加甲醇溶液。相关工作人利用0.45μm微孔滤膜有效滤过溶液，将溶液保存好，准备备用。2.2HPLC-UV 色谱条件 相关工作人员广泛的查阅相关文献资料，结果显示，试验可以通过色谱条件的优化、比较以及筛选，最终得到的结合可以很好的明确色谱条件：色谱柱 Kromasil（250x4.6mm，5μm），，分析时间共设置为90min，进样量为10μl，流动相为0.5％醋酸水（B）以及乙腈（A）梯度洗脱，将其流速控制在1.0ml／min，检测波长为310mm，柱温为28℃。23方法学考察 从精密度实验、重复性实验以及稳定性实验等对其结果进行有效验证。3 总结文章选择使用多种柱色谱联合的方式，有效实现了肉苁蓉粗多糖的分离以及纯化，与此同时，相关工作人员还用现代分析技术对其进行理化性质的测定。该实验过程与结果。为工作人员研究肉苁蓉的质量控制提供参考意义。建立肉苁蓉HPLC-DNA指纹图谱，并进行相似度评价和聚类分析。以期为肉苁蓉的科学鉴定和质量标准提供参考依据。

至到达饱和吸附，测得各自吸附率，绘制树脂吸附泄露曲线并确定最住上样液体积。1.2.6 大孔树脂动态洗脱1.2.6.1 乙醇浓度影响 以乙醇溶液作洗脱剂，分别选择体积分数40％、50％、60％、70％．80％的乙醇溶液，控制1ml／min洗脱流速，对1.2.5.3饱和吸附后的树脂进行洗脱，直至洗脱完全，收集洗脱液，测定多酚浓度，计算各自洗脱率。1.2.6.2 洗脱流速影响 配制5份1.2.6.1 试验中确定的最佳浓度乙醇溶液，分别控制流速0.5、1、2、3、4．ml／min，对1.2.5.3饱和吸附后的树脂进行洗脱，直至洗脱完全，收集洗脱液，测定多酚浓度，计算各自洗脱率。1.2.6.3 树脂洗脱曲线 精密量取1.2.6.1 实验中确定的最佳浓度乙醇溶液，以1.2.6.2实验中确定的最佳流速对1.2.5.3饱和吸附后的树脂进行洗脱，直至洗脱完全，收集洗脱液，每管体积5mL，测量每管总多酚浓度，绘制树脂洗脱曲线。1.2.7 定量分析1.2.7.1 标准曲线绘制 按照文献所述方法，准确称取没食子酸标准品20mg溶于水中，另加入 Folin-酚试剂和质量分数为20％的NaCO，溶液，配制成质量浓度为0.1-0.8mg／L的标准溶液，并于760nm处测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得到标准曲线方程y＝1.472x-0.0527（r＝0.9961)。1.2.7.2 多酚浓度测定 照上述步骤配制样品溶液后，于760nm波长处，测定吸光度后，根据方程计算样品中多酚浓度，另作空白试验，平行测定三次，按照下式计算样品中多酚的纯度。纯度（％）＿CxVxD-x100       式（10）式中m。为样品质量，mg：C为产物的多酚浓度，mg／ml；V为样品体积，mL：D为稀释倍数。1.3 体内抗疲劳研究1.3.1 模型建立 将50只健康雄性小鼠，随机分为五组，每组10只，空白对照组采用生理盐水灌胃，其它各组则按照小鼠体重灌药，其中阳性对照组采用0.1mg／g西洋参灌胃，低、中、高剂量组则依次灌胃0.05.0.10.0.20 mg／g多酚纯化物，每天灌胃1次，连续灌胃30d。每组小鼠灌胃1h后于恒温游泳池内开展游泳训练，5d为一训练周期，共训练4周。1.3.2 动物游泳运动 模型建立后于鼠尾负重自身5％的重物，进行力竭性游泳运动，记录小鼠自入水开始游泳至沉没超过10s的时间，即为游泳力竭时间。1.3.3 体内生化指标测定 小鼠游泳运动进行10min后，取出擦净，摘取眼球，抽血离心，同时分取肝与肌肉组织，采用相关试剂盒分别测得各组动物血清中乳酸、肝糖原、肌糖原含量和乳酸脱氢酶的活力。1.4 数据处理实验结果均采用均数±标准差表示，采用SPSS18.0方差分析，检验水准α＝0.05，当P＜0.05表示差异显著．P＜0.01表示差异极显著。2 结果与讨论2.1 树脂型号确定表1为不同型号大孔树脂对提取物中多酚的静态吸附与洗脱性能比较，从表1中可知，不同树脂的吸附能力不同，其中HPD-400大孔树脂对肉苁蓉多酚的吸附率最高，达到88.0％，其次为NKA-2，吸附率为77.0％，而采用60％乙醇静态洗脱时，HPD-400大孔树脂的洗脱率最大，达到91.2％，表明HPD-400大孔树脂对肉苁蓉多酚的吸附与解吸性能较好，这可能源于同其它四类树脂相较，HPD-400树脂极性适中，与多酚的相互作用较好，因此确定HPD-400大孔树脂作为该纯化研究的吸附树脂。表1 不同树脂的静态吸附与洗脱性能比较Table 1 Compare with static adsorptionand desoption perfomance of different resins树脂型号吸附量(mg/g)吸附率(%)洗脱率(%)回收率(%)HPD 10054.945.880.236.7HPD 30071.659.788.652.9HPD 400105.688.091.280.3AB-862.151.886.444.7NKA-292.477.085.365.72.2 树脂吸附等温线HPD-400大孔树脂对肉苁蓉多酚的吸附等温，如图1所示，不同温度下，随着上样液多酚浓度的增大，树脂吸附量不断增加，分别对不同温度的吸附曲线进行拟合，结果见表2所示。从表2可知，不同温度下 HPD-400大孔树脂对肉苁蓉多酚的等温吸附过程与Langnuir 吸附等温模型相近，方程相关系数r均大于0.99，同时随着温度升高，吸附量逐渐减少，表明该吸附过程为放热过程。 图1 不同温度的吸附等温曲线Figl The aborption cuve in different temperatues2.3 树脂吸附动力学曲线HPD-400 大孔树脂对肉苁蓉多酚的吸附动力学曲线，如图2所示。在0-2h时，树脂对多酚的吸附量较大，逐渐缓慢至12h后达到平衡，表明HPD-400大孔树脂对肉苁蓉多酚的吸附较快。利用相关动力学方程模型对上述吸附过程进行拟合，见表3所示，该吸附过程与准二级动力学过程更为接近，同时从Kannan拟合方程结果可知，该吸附过程分为三表2 不同温度的吸附等温线拟合方程Table 2 Fiting equations of adsorptionisotherms in different temperatures模型温度拟合方程1(℃)25Ce/r,=0.284Ce+0.120.9914Langmuir35Ce/T.=0.357Ce-0.260.993745Ce/T,=0.489Ce+0350.994225lmr,=0.27 InCe+0.680.9128Freandlich35mΓ,=0.43 InCe+0.940.905545lmr,=0.33 InCe+0.810.9558个阶段，在0-4h为薄膜扩散过程，在4-12h为粒内扩散过程，T，对均具有良好的线性关系，12h后树脂对多酚的吸附与脱附达到平衡Table 3 The fiting equations of adsorption dynamies拟合模型拟合方程1准一级动力学m(T,-T,)=10.306-038510.9642准二级动力学1/T,=10.4+1.42t0.9959Kannan 方程T,=28.351-6.7180.9907r,=213991+1.827916602.4 动态吸附条件选择2.4.1 上样液浓度选择 若上样液多酚浓度过高，树脂易过早饱和，造成树脂吸附率下降，而上样液多酚浓度过低，则影响实验效率。不同上样液浓度对吸附率的影响，见图3所示，当多酚浓度为2～6mg／ml时，随着上样液多酚浓度的增大，HPD-400大孔树脂对多酚的吸附率处于较高水平，而多酚浓度大于6mg／mL时，吸附率开始逐渐下降，这归因于样品溶液中部分多酚的泄露，因此确定上样液最佳多酚浓度为6mg／ml。2.4.2 吸附流速选择 在动态吸附时，上样流速过快，多酚与树脂接触不充分，可能造成过早泄漏，但流速过慢，又导致纯化耗时过长，且对后续树脂再生产生不良影响。不同上样流速对吸附率的影响，见图4所示，当上样流速在1-2mL／min时，HPD-400大孔树脂对多酚的吸附率无明显影响，而随着流速增大，吸附率呈下降趋势，因此选择2mL／min 作为最佳上样流速。2.4.3 动态吸附泄漏曲线 当流出液的多酚浓度为上样液浓度的10％，称为树脂吸附泄漏点，达到上样液浓度的100％时称为树脂饱和吸附点叫。肉苁蓉多酚在上样过程时不断被树脂吸附与脱附，当吸附速率等于脱附速率时，出现泄漏现象，见图5所示，当上样液体积约为60ml时，流出液中总多酚浓度急剧上升，且超出上样液浓度10％，达到泄漏点，上样液体积约为140ml时，达到饱和吸附点，因此确定HPD-400大孔树脂纯化肉苁蓉多酚化合物的最大上样体积为60ml2.5 洗脱条件选择2.5.1 乙醇浓度选择 不同浓度的乙醇溶液对肉苁蓉多酚的洗脱效果，见图6所示。随着洗脱液浓度增大，洗脱率逐渐增大，至60％开始下降。这可能因为低浓度乙醇破坏多酚与树脂形成的氢键能力较弱，而过高浓度乙醇的极性与多酚化合物相差较大，不利于洗脱，因此确定采用60％乙醇溶液作为最佳

栾朝霞（江苏警官学院，江苏南京210031）摘 要：为优化大孔树脂纯化内苁蒙多酚提取物的工艺条件，通过静态吸附与洗脱试验师选合适的大孔树脂型号，并研究其吸附等温与吸附动力学模型后，采取动态吸附与洗税单因素实验确定最佳纯化工艺条件，同时进行动物的抗运动性疲劳研究。实验结果表明，HPD-400大孔树脂的吸附等温方程符合langmair模型，吸附量随温度升高而降低，且符合准二级动力学吸附过程。采用大孔树脂纯化内苁蓉多酚提取物的最佳工艺条件为：配制体积60mL，6mg／mL上样溶液，以2mL／min流速上样至HPD-400大孔树脂饱和吸附后，采用体积为180mL，60％乙醇溶液，以1mL／min流速洗脱，提取物中内苁蒙多酚纯度由20.12％提高至42.63％。与空白对照丝相比，不同制量的肉苁蓉多酚纯化产物可显著延长小鼠游泳力竭时间（P＜0.05，P＜0.01），星著增加体内肝糖原、肌糖原含量与乳酸脱氢酶活力（P＜0.05，P＜0.01），并有极显著降低乳酸浓度水平（P＜001），国此可较好地缓解体疲劳，从而为肉苁蓉多酚化合物的后续开发利用提供参考。关键词：肉苁蓉，多酚，提取物，纯化，扰运动性疲劳Purification and Anti-motor FatigueEffect of Total Polyphenols from Cistanche ExtractionLUAN Zhao-xia(Jiangsu Palice Institute,Nanjing 210031,China)Abstract:To optimize the purification procew condition of teal polyphenole of eatract from Citanche by macroporot resin,the HPD-400 macroporous resin type was chosen through static adsorption-desorption experiments,meanwhile,isothermal adsorption model and adsorption kinetics model of the resin wew furthermore iwestigated and then anti-motor fatigue of animal experiment was carried out.The results showed that equilibrium adsorption data of HPD-400 macroporous resin for total polyphenols were fined langmur isctherm equation,the adsorption decmae with the increaing of temperature,and the kinetics fitted the quasi-second-order kinetics equation The optimum purification process conditions were as follows:the initial concentration in sample solution 6mg/ml.,flow rate 2 ml/min,Icading sample volume 60 ml.,and 60%(v/v)ethanol 180ml. was used as eluent with flow rate of 1 ml/min After purification,the purity of total polyphenols in product was increased from 20.12% to42.63%.Compared with the blank control group,the groups of polyphenols of Cisanche at all doses significantly prolonged weight-loaded swimming time of mices(P<0.05,P<001),abviously improved activity of lactie dehydrogenase and storage of hepatic glycogen and muscle glycogrn in io(P<0.05,P<0.01),decreased lactic acid level after sporting (P<0.01).Therefore,polyphenols of Cistanche could enhanced sporting stamina and had good resisting movement fatigue effect,the study could provide reference for its subequent development and exploitation.Key words:Citanche:polyphenols;etact:purification;anti-motor fatigue文章编号：1002-0306（2020）15-0059-06中图分类号：TS201.1 文献标识码：Adoi:10.13386/j.issm1002-0306.2020.15.010引文格式：栾朝霞．肉苁蓉总多酚纯化工艺及其抗运动性疲劳作用研究．食品工业科技，2020.41（15）：59-64．肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉的干燥带鳞叶肉质茎，长期服用具有“补精益血”之功效，被卫计委认定为药食同源品种。由于该植物含有多糖、多酚、生物碱、维生素及多种矿物质等营养成分，因而近年在药品和食品领域应用较多。王丽卫等“研究发现肉苁蓉可明显改善胃肠道的消化功能：Yang等另发现其可加强骨矿物质密度；而王小新、陈志豪等曾分别对肉苁蓉的抗疲劳作用进行探讨，但没有研究具体活性成分的作用。多酚化合物通常具有抗氧化、增强机体免疫及抗衰老等生理活性，而对作用的研究却鲜有报道。因此，本研究利用大孔树脂具有选性高、干扰因素少、可重复循环利用的特点-，在提取肉苁蓉多酚物质的工艺基础上，探讨大孔树脂对其纯化的最佳工艺条件，并通过相关动物实验观察其体内抗运动性疲劳的作用效果，为肉苁蓉资源的后续开发和利用提供参考。1 材料与方法1.1 材料与仪器试验动物 健康雄性小鼠50只（动物许可证号：SYXK（苏）2019-0030），体质量10～18g，由江苏省实验动物中心提供，生长环境温度20～25℃，相对湿度50％～70％：肉苁蓉 安徽亳州药材市场，经鉴定为列当科肉苁蓉属植物肉苁蓉：没食子酸标准品 Sigma公司：Folin-酚试剂、无水乙醇、碳酸钠 均为分析纯国药集团化学试剂有限公司：乳酸（BLA）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌糖原（MG）和肝糖原（HG）检测试剂盒 南京建成生物工程研究所：试验用水 为去离子水。WK-40型药材粉碎机 青州迈德森制药机械厂：UV759S型紫外-可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司：FA1004B型电子天平 上海越平科学仪器有限公司：NKA-2、HPD 100、HPD 300大孔树脂 北京英莱克科技发展有限公司：AB-8、HPD400树脂 合肥四峰生物科技有限公司：1ab-1A-50E型冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司：SHZ-82型水浴恒温振荡器 常州国旺仪器有限公司：小鼠恒温游泳池 上海艾研生物科技有限公司。1.2 实验方法1.2.1 多酚提取物制备 将干燥后的肉苁蓉完全粉碎后，过80目筛，准确称取20g，加入400mL．70％乙醇溶液，在60℃温度下回流提取30min后过滤，提取两次，合并滤液减压回收乙醇后，冷冻干燥备用叫。1.2.2 树脂型号选择1.2.2.1 树脂预处理 将大孔树脂浸泡于90％乙醇中24h，充分溶胀后湿法装柱，后用90％乙醇反复冲洗，直至流出液与水混合（Va：Vg＝1：5）无白色浑浊出现，再用水洗至无乙醇气味，加入3％ 盐酸浸泡3h．用水洗至中性；再用3％氢氧化钠溶液浸泡3h，用水洗至中性，备用。1.2.2.2 静态吸附与洗脱 准确称取5.0g六种不同极性的大孔树脂（NKA-2、HPD 100、AB-8、HPD300、HPD 400）置于锥形瓶内，分别加入6mg／ml．100ml提取液后，置于恒温振荡器内，静态吸附24h后过滤。通过下式测得不同类型大孔树脂的静态饱和吸附量与吸附率。式中：m。为提取液中多酚质量，mg：m，为饱和吸附后滤液中多酚质量，mg：m为干燥的大孔树脂质利用乙醇作洗脱剂，将饱和吸附后的树脂置于锥形瓶内，加入60％乙醇100mL后，置于恒温振荡器中，静态洗脱24h，过滤，测定滤液中多酚的浓度，通过下式测得不同类型树脂的洗脱率与回收率。式中：m，为提取液中多酚质量，mg；m，为饱和吸附后滤液中多酚质量，mg：m，为洗脱液中多酚质量，mg：D，为洗脱率.％：R为回收率，％。1.2.3 吸附等温线 准确配制100ml浓度为1、2、3、4、5、6、7mg／ml．的肉苁蓉提取物溶液加入至装有5.0g树脂的锥形瓶后，分别置于25、35、45℃恒温摇床中，振荡吸附24 h．测得滤液总多酚浓度，计算吸附量，绘制吸附等温线，同时利用 Langmuir、Freundlich吸附模型，绘制相应等温吸附方程。式中：T。为多酚饱和吸附量，mg／g：K，为Langmuir方程常数：T.为多酚吸附量，mg／g：C，为滤液多酚浓度，mg／ml；K，为Feundlich方程常数。1.2.4 吸附动力学曲线 准确称取大孔树脂5.0g置于锥形瓶内，加入100mL质量浓度为5mg／mL的多酚提取液，于25℃振荡吸附，分别于0.5、10、2.0、3.0、5.0、7.0、10.0.12.0、16.0、20.0、24.0h取样，测定总 多酚浓度，以吸附量（Γ）为纵坐标，时间（t）为横坐标，绘制静态吸附动力学曲线，分析树脂对肉苁蓉多酚的吸附动力学行为。式中：K，为准一级速率常数，min＇；K，为准二级速率常数，mL＊mg＊min；K，为颗粒内扩散速率常数，mg＊min-5·min-＇。1.2.5 大孔树脂动态吸附1.2.5.1 上样液浓度影响 分别准确量取等体积的多酚提取液2、4、6、8.10mg／mL，控制流速2mL／min，上样至预处理后的树脂内（树脂质量：5.0g：径高比：1：12），收集柱后流出液，测得不同流出液中多酚浓度，计算各自吸附率。1.2.5.2 吸附流速影响 准确量取等体积5份1.2.5.1确定的最佳浓度多酚提取液，分别控制流速1、2、3、4.5mL／min，上样至预处理后的树脂内（树脂质量：5.0g：径高比：1：12），收集柱后流出液，测得不同流出液中多酚浓度，计算各自吸附率。1.2.5.3 树脂吸附泄露曲线 准确量取1.2.5.1确定的最佳浓度多酚提取液，以1.2.5.2实验中确定的最佳流速上样至预处理后的树脂内（树脂质量：5.0g：径高比：1：12），收集柱后流出液，每管体积5mL，直

盛文，何清湖（湖南中医药大学中西医结合学院，长沙410208）摘要：少弱精子症是导致男性不育症最主要的原因，严重危害男性生殖健康。谭新华教授对男性疾病的诊治有独特的经验。谭教授认为少弱精子症的发生与肝牌肾等脏腑密切相关。在治疗中，谭教授擅于灵活运用中药药对，如用淫羊藿与肉苁蓉以温肾助阳，枸杞子与五味子以滋阴补肾，当归与熟地黄以柔肝养血，柴胡与白芍以疏肝解郁，茯苓与炒白术以健牌益气，川芎与丹参以活血通络。关键调：少弱精子症；药对；谭新华基金资助：国家自然科学基金项目（No．81774324），湖南中医药大学开放基金项目（No．2018ZXYJH14），湖南中医药大学“东健研究生创新项目”（No．19D］06）Analysis of TAN Xin-hua treating oligozoospermia by clinical couplet medicinesSHENG Wen,HE Qing-hu(College of Integrated Traditional Chinese and Westem Medicine,Hunan University of Chinese Medicine.Changsha 410208,China)Abstract:Oligoasthenospermia is the main cause of male infertility,which seriously endangers male reproductive health.Professor TAN Xin-hua is the first and third batch of national experts of traditional Chinese medicine to inherit academie experience,and he has unique experience in the diagnosis and treatment of male diseases.Professor TAN Xin-hua believes that the occurrence of asthenospermia is closely related to the liver,spleen,kidney and other zangfu organs.In the treatment.professor TAN Xin-hua is good at flexibly using traditional Chincse medicine.For example,Herba herba and Herba Cistanche are used to wam the kidney to promote yang:Chinese Wolfberry and Fructus Schisandrac are used to nourish yin and strengthen the kidney. Angelica sinensis and Fructus Schisandrac are used to nourish the liver to nourish blood.Bupleurum root and Radix Paconiae Alba are used to relieve liver depression.Poria cobolac and Fried Atractylodis thizome are used to strengthen spleen and invigorate q Chuanxiong and Salvia miltionhiza are used to promote blood circulationKey words:Oligozoospermia:Couplet medicines,TAN Xin-huaFunding:National Natural Science Foundation of China(No.81774324),Open Fund of Hunan University of Chinese Medicine(No.2018ZXYJH14),Dong Jian Graduate Innovative Research Project' of Hunan University of Chinese Medicine (No.19DJ06)谭新华教授是第一、三批国家级老中医药专家学术经验继承工作指导老师，全国名老中医药专家。谭新华教授擅长中医外科疑难杂病的诊治，尤其对男性性功能障碍、少弱精子症有丰富的治疗经验。男性不育症是指夫妻双方同居一年以上，有正常面规律的性生活且未采取避孕措施，因男方因素导致女方未能正常怀孕者，称之为男性不育症＂，近年来，全球范围内不孕不育患者中男性不育症的发病率已高达40％2-，而精子数目和活力低下是男性不育的重要原因之一“。少精子症是指每毫升精液所含精子＜15x10°，弱精子症是指精液中所含的前向运动精子＜32％，二者常常并见，故合并称之为少弱精子症。中医典籍中并无“不育”“少弱精子症”等术语，但根据其症状，可归属于“无子”“艰嗣”等范時。谭教授认为肾藏精主生殖，故肾在少弱精子症的发病过程中起关键作用，正如历代医家论述的“病精冷精薄者，多责之于肾”；《傅青主女科》载：“脾为后天，肾为先天；脾非先天之气不能化，肾非后天之气不能生，补肾而不补脾，则肾之精何以遂生也”。故谭教授也认为少弱精子症的发生与脾肾关系密切；《医宗必读》载：“乙癸同源，肝肾同治”，故谭教授还认为少弱精子症的发生与肝密不可分。谭教授常从脏腑辨证的角度论治少弱精子症，疗效颇佳，现将谭教授治疗少弱精子症的常用药对作简要分析，以期为临床医者提供参考。淫羊藿与肉苁蓉-温肾助阳淫羊藿性温，味甘辛，归肝肾二经，有补肾阳、祛风湿、强筋骨的功效，可补命门之火衰，益精气之不足，为温肾助阳之主药，《本草纲目》中记载：“味甘气香，性温不寒，能益精气，乃手足、三焦、命门药也······真阳不足者宜之”；肉苁蓉，微温而甘，质润而咸，性温而不热，暖而不燥，滋而不腻，滑而不泄。功善温补肾阳。《本草汇言》载：“肉苁蓉，养命门，滋肾气，补精血之药也。男子丹元虚冷而阳道久沉，妇人冲任失调而阴气不治，此乃平补之剂，温而不热。补而不峻，暖而不燥，滑而不泄，故有从容之名”。此二药是谭教授用以温肾助阳的常用药对，淫羊藿温肾力强且性温燥烈，肉苁蓉温肾力逊却从容和缓，二者相配温阳助阳力专且持久.肉苁蓉尚能补益精血缓和淫羊藿之燥性，二者相配，肾阳得温。《素问·阴阳应象大论》载：“阳化气，阴成形”。肾阳足则肾气旺，肾气旺则推动温煦作用强，精子动力充沛，反之则发为少弱精子症。正如《石室秘录·卷五》所言：“精寒者，肾中精寒；虽射入子宫而女子胞胎不纳，男精已泄，而女精未交着，何能生物乎”？景岳赞育丹中亦可见淫羊藿与肉苁蓉的此用法。枸杞子与五味子-滋阴补肾枸杞子性平而味甘，归肝肾二经，乃滋阴补肾、养肝明目之要药，《本草经疏》曰：“枸杞子，润而滋补，兼能退热，而专于补肾、润肺、生津、益气，为肝肾真阴不足、劳乏内热补益之要药”。五味子性温，味甘酸，归肺、心、肾经，五味子性温味酸而能润，上能敛肺生津以止咳，下能滋肾纳气以平喘，内能益气宁心以止烦渴，外能收敛固摄以止汗，《神农本草经》载其：“主益气······补不足，强阴，益男子精”。此二药是谭教授用以滋阴补肾的常用药对，枸杞子功专滋补肝肾之阴，为平补肾精肝血之品，五味子味酸收涩，甘温而润，亦为滋阴补肾之佳品，二者相配，补而不滞，涩中兼通，肾阴得滋。《素问·阴阳应象大论》载：“阳化气，阴成形”。肾阴肾精是化生精子等有形物质的基础，若肾阴亏虚，“阴不成形”致精子“成形”不足，精子数量下降，发为少弱精子症。有研究表明：枸杞子和五味子能有效缓解氧化应激导致的损害，能显著提高组织超氧化物歧化酶的活性，降低丙二醛含量，使受损的组织恢复到接近正常水平，研究表明少弱精子症的形成与睾丸组织内氧化应激失常密切相关0-。当归与熟地黄-柔肝养血当归性微温，味甘液浓，归心肝脾经，既擅补血又擅活血，疗气血之瘀滞，乃血中气药，可“内润脏腑而外达肌表”，且兼具柔肝止痛调经之功。《景岳全书·本草正》载：“当归专能补血，又能行血，补中有动，行中有补，诚血中之气药，血中之圣药”。熟地黄性温，味厚面质润，归肝肾经，能滋肝血而填肾精，《本草纲目》载其：“填骨髓，长肌肉，生精血，补五脏、内伤不足，通血脉，利耳日，黑须发，男子五劳七伤，女子伤中胞漏，经候不调，胎产百病”。此二药是谭教授用以柔肝养血的常用药对，二者均为甘温之品，皆为补血滋阴要药，当归可活血行气，性走而不守，熟地厚重沉静，性守而不走，二者相配是柔肝养血时滋而不腻，温而不燥，行而不破，补而不滞的经典药对。《格致余论·阳有余阴不足论》曰：“主闭藏者肾也，司疏泄者肝也”。指出男子精液的生成、贮藏和施泄与肝密切相关；肝血不足、肾精亏虚都会导致化生有形之精子的生殖之精不足，面发为少弱精子症，故在滋阴补肾的同时应重视柔肝养血。柴胡与白芍-疏肝解郁柴胡性微寒而味苦，归肝胆肺经，擅疏肝开郁以畅气机，条达肝气以和气血，疏散之中兼活血散瘀，能推陈致新.《神农本草经》载：“主心腹肠胃中结气，饮食积聚，寒热邪气，推陈致新”。白芍性微寒面味酸苦，归肝脾经，功擅养血以柔肝，缓急以止痛，敛阴以止汗。《医学启源》载：“安脾经，治腹痛，收胃气，止泻利，和血，固腠理，泻肝，补脾胃”。此二药是谭教授用以疏肝解郁的常用药对，柴胡味辛气轻，长于疏肝解郁兼发表，白芍味酸质重，长于养血抑阳并柔肝，二者相配，刚柔并济，畅达肝之气，滋育肝之血，为疏肝理气之佳对。男性少弱精子症患者多因不育而就诊，大多因家族原因而求子心切，故肝郁气滞者为临床之常见，更有部分患者因多次辗转全国求医，在心理、生理、经济等方面造成了巨大的压力而情志抑郁、悲忧，故谭新华教授在诊治此类患者时，不仅予以言语上的鼓励及支持，在辨证论治及选方组药时更是谨慎入微，诊治此类患者需佐以疏肝开郁。茯苓与炒白术-健脾益气

摘　要： 用先灰化、硝酸－高氯酸（４

日前，国家卫生健康委、国家市场监管总局联合印发《关于对党参等9 种物质开展按照传统既是食品又是中药材的物质管理试点工作的通知》，提出将对灵芝、天麻、党参、肉苁蓉、铁皮石斛、西洋参、黄芪、山茱萸、杜仲叶等9 种物质开展按照传统既是食品又是中药材的物质（下称食药物质）生产经营试点工作。《通知》提出，上述9 种物质作为食药物质时，建议按照传统方式适量食用，孕妇、哺乳期妇女及婴幼儿等特殊人群不推荐食用。传统方式通常指仅对原材料进行粉碎、切片、压榨等。作为食药物质时其标签、说明书、广告、宣传信息等不得含有虚假内容，不得涉及疾病预防、治疗功能。上述物质作为保健食品原料使用时，应当按保健食品有关规定管理；作为中药材使用时，应当按中药材有关规定管理。为了规范试点工作，《通知》明确，需由地方提出试点方案，包括试点的食药物质种类、风险监测计划和配套监管措施等，报请省级人民政府同意后，报国家卫生健康委与国家市场监管总局核定。试点生产经营需严格按照试点方案进行，强化事中事后监管。国家卫生健康委将会同国家市场监管总局，根据试点情况，研究适时将相关物质纳入食药物质目录管理。

摘要：在查阅、收集国内德赢vwin登录 中苯乙醇苷的提取纯化文献基础上，综述近几年德赢vwin登录 中苯乙醇苷的提取、纯化研究进展，旨在为德赢vwin登录 制剂工业化生产研究提供参考。关键词：肉苁蓉；苯乙醇苷；提取；纯化德赢vwin登录 为列当科肉苁蓉属多年生寄生植物，为新疆特有资源，是传统补肾阳的中药材，具有补肾、益精、润燥、通便的功效。现代研究表明，苯乙醇苷类是德赢vwin登录 的主要活性成分和含量最高的化合物，是《中国药典》含量测定的指标成分，具有抗氧化、促进物质代谢、改善学习记忆、增强性功能等作用。苯乙醇苷类化合物包括松果菊苷、毛蕊花糖苷、松果菊苷和麦角甾苷等。1 肉苁蓉中的苯乙醇苷的提取1.1 乙醇回流提取肉苁蓉中苯乙醇苷类化合物李蒙等利用响应面法对瓜州肉苁蓉苯乙醇苷的提取工艺进行优化。方法是，以肉苁蓉苯乙醇苷提取率为评价指标，探究乙醇体积分数、提取温度、提取时间、料液比和提取次数对肉苁蓉苯乙醇苷提取率的影响。结果表明，肉苁蓉苯乙醇苷的实际最佳提取工艺条件为乙醇体积分数60%、提取温度80℃、液料比12∶1，提取时间2 h，提取2次，此条件下的提取率为76.588 0 mg/g。本研究为瓜州肉苁蓉苯乙醇苷资源开发及工业化生产提供理论依据。1.2 乙醇浸出提取肉苁蓉中苯乙醇苷类化合物戴海蓉等优化肉苁蓉提取工艺，为肉苁蓉制剂生产研究提供科学依据。方法是，采用L9 （34）正交试验，以提取溶剂、料液比、提取次数为考察因素，出膏率、松果菊苷和毛蕊花糖苷含量为指标，优选肉苁蓉提取工艺。结果显示，肉苁蓉最佳提取工艺为肉苁蓉饮片以8 倍量30%乙醇提取2 次，每次1 h。孔征等优化德赢vwin登录 中毛蕊花糖苷的提取工艺，为该药材的深入开发和综合利用提供参考。方法是，采用高效液相色谱法对德赢vwin登录 中的毛蕊花糖苷进行含量测定；色谱柱为Inertsil-ODS-3V，流动相为甲醇-0.2%甲酸水溶液(40∶60，V/V），流速为1 mL/min，柱温为30℃，检测波长为330 nm，进样量为10 μL；以毛蕊花糖苷的提取率为考察指标，分别对浸泡时间、乙醇浓度、液料比、提取时间、提取次数进行单因素试验，根据上述试验结果，采用Box-Behnken 响应面法对乙醇浓度、液料比、提取时间等条件进行优化，并对优化后的提取工艺进行验证试验。结果显示，毛蕊花糖苷检测质量浓度的线性范围为18.65～932.4 μg/mL。最优提取工艺为乙醇浓度63%、液料比8∶1（mL/g）、浸泡2h、提取时间1.5 h、提取2次。3次平行验证试验所得毛蕊花糖苷的提取率分别为78.21%、76.95%、79.34%，与预测值76.76%的相对误差分别为1.89%、0.25%、3.36%。优化所得德赢vwin登录 中毛蕊花糖苷的提取工艺稳定、可行，适用于该化合物的提取。1.3 甲醇提取肉苁蓉中苯乙醇苷类化合物黄翔等选择肉苁蓉最佳提取工艺参数。方法是，采用单因素筛选结合Box-Behnken 响应面法优化提取工艺。结果表明，最佳提取工艺是甲醇体积分数55.14%，液料比46.39∶1，提取时间38.50 min。使用该工艺提取肉苁蓉，其5 种苯乙醇苷类成分提取完全、充分。1.4 水溶媒提取肉苁蓉中苯乙醇苷类化合物刘丽莎等以德赢vwin登录 为原料，探究原料粒径、料液比、浸提温度、时间等因素对苯乙醇苷浸提效果，开发苯乙醇苷水溶媒提取技术。经单因素优化及正交试验优化，德赢vwin登录 苯乙醇苷水溶媒提取最佳工艺为原料粒径大于40 目，料液比1∶15，浸提温度80℃，浸提时间2 h，提取率为(175.9±1.1）mg/g，松果菊苷及毛蕊花糖苷分别占总苯乙醇苷的38.85%、8.78%。研究结果为德赢vwin登录 苯乙醇苷提取降低成本及安全生产提供了参考依据。1.5 微波辅助提取肉苁蓉中苯乙醇苷类化合物刘洋为优选德赢vwin登录 苯乙醇苷提取最佳工艺并对经分离纯化的苯乙醇苷进行抗氧化活性评价研究，以德赢vwin登录 中的苯乙醇苷得率为检测指标，采用响应面分析法，分别优化乙醇浸提法、超声提取法、微波提取法3 种方法的提取效果，选出最优条件，并进行比较；采用DPPH 法体外测定苯乙醇苷的抗氧化能力。结果表明，微波辅助提取法在最短时间内具有最高的苯乙醇苷得率，超声波辅助提取法次之，而乙醇浸提法时间最长，得率最低。蒋媛等筛选德赢vwin登录 中苯乙醇苷的最佳提取工艺。方法是，采用苯乙醇苷得率评分指标，正交设计法筛选。结果表明，德赢vwin登录 中的苯乙醇苷的最佳提取工艺为采用微波辅助提取法，75%的乙醇浓度，提取2 次，每次1.5 min，微波功率200W，料液比1∶20。本试验为德赢vwin登录 中苯乙醇苷的提取提供了参考数据，为德赢vwin登录 的苯乙醇苷类成分提取提供参考书数据，为苯乙醇苷进一步分离及活性研究提供依据。1.6 超声-微波回流提取肉苁蓉中苯乙醇苷类化合物丁慧玲等为了使其充分利用，在单因素研究基础上，通过响应面法优化超声- 微波回流提取德赢vwin登录 中苯乙醇苷工艺。结果表明，在超声频率40kHz，超声功率为50 W，提取时间15 min 时由二次回归模型获得最优工艺条件为提取丙酮体积分数50%，液料比14∶1 （mL/g），微波功率100 W，理论得率为49.87%，验证实验得49.2%，与理论值接近。通过红外光谱分析可知，超声- 微波提取的是德赢vwin登录 苯乙醇苷类物质。1.7 酶解法提取肉苁蓉中苯乙醇苷类化合物高建德等研究复合酶提取肉苁蓉的工艺，比较传统水提、醇提与酶解后水提、醇提，正丁醇萃取物抗氧化活性。方法是，以肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷作为评价指标，选择酶用量、酶解温度、酶解时间为主要因素，通过正交试验确定复合酶提取肉苁蓉的最佳工艺条件，并在此基础上比较不同提取方法下提取物抗氧化活性。结果表明，复合酶强化提取肉苁蓉最佳工艺参数为复合酶0.2%、酶解温度60℃，酶解时间2.5 h；等量药材同体积肉苁蓉提取液，抗氧化活性依次为酶解后醇提＞酶解后水提＞传统醇提＞传统水提。在所得的复合酶提取肉苁蓉工艺条件下，肉苁蓉抗氧化活性可以显著提高。1.8 超声辅助提取肉苁蓉中苯乙醇苷类化合物郭雄飞等考察从德赢vwin登录 中提取，纯化苯乙醇总苷类物质的最佳工艺和条件。方法是，通过正交试验优化德赢vwin登录 中苯乙醇总苷的提取工艺，并通过筛选大孔吸附树脂，洗脱液，选择最适树脂和最佳纯化条件。结果表明，苯乙醇总苷的最佳提取工艺为12 倍60%乙醇，超声提取3 次，每次30min，提取率95%以上，从8 种大孔吸附树脂中选出纯化效果最佳的DM130 树脂、最大静态吸附量为344.49 mg/g，用60%乙醇洗脱，解析率达96%，纯度达97%。该方法简单易行，周期短，成本低，所得苯乙醇总苷纯度高，对工业生产具有指导意义.2 纯化工艺2.1 中压柱层析技术纯化苯乙醇苷类朱玉婷等建立一种快速可靠的肉苁蓉中苯乙醇苷类分离纯化方法。方法是，采用中压柱层析技术进行分离纯化，考察上样浓度、上样体积、洗脱剂体积分数、洗脱流速和收集洗脱液位置等因素，筛选出比较理想的分离纯化工艺。结果表明，确定的最佳工艺为上样浓度100 mg/mL ，上样体积100mL，30%甲醇洗脱，洗脱流速为80 mL/min，从目标成分出峰后上升段的1/4 处开始收集洗脱液。最终分离得到的松果菊苷、毛蕊花苷含量分别为93.08%、90.20% （ =6）。本试验方法简便、准确，能快速制得高质量分数的单体化合物，为其他苯乙醇苷单体化合物的纯化、富集提供技术参考。2.2 大孔树脂技术纯化苯乙醇苷类刘朋龙等应用AB-8 型大孔树脂分离纯化德赢vwin登录 ，得到最佳纯化工艺为上样液质量浓度1.2mg/mL，上样流速1.5 BV/h，吸附时间1.5 h，解析时间4 h，洗脱的乙醇体积分数为40%，洗脱流速为1.5 BV/h；收集洗脱液，减压浓缩后冷冻干燥，得到德赢vwin登录 中苯乙醇苷的初步纯化物，其纯度达到80%，纯化前纯度为42.5%，比纯化前增加了37.5%。王毓杰等优选德赢vwin登录 中苯乙醇苷的纯化工艺。方法考察7 种大孔树脂对2 种苯乙醇苷的吸附和解吸附性能，确定最佳纯化工艺条件。结果最佳提取纯化工艺为德赢vwin登录 药材加12 倍量50%乙醇，70 ℃温浸2 次，温浸时间1 h，过滤，合并滤液，回收溶剂，加水调整为含生药0.2 g/mL 的上样溶液，上样量为0.8 倍柱体积（BV），大孔树脂柱的径高比为1∶9，先用3 BV 的水除杂，再用4 BV的30%乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩至干，即得肉苁蓉苯乙醇苷纯化物，该纯化物中2 种苯乙醇苷质量分数75%。优选得到的提取纯化工艺稳定可行，适合工业化生产。2.3 膜分离技术纯化苯乙醇苷类蒋华彬等研究了膜分离技术在德赢vwin登录 苯乙醇苷及多糖同步分离纯化的应用。以新疆特色资源德赢vwin登录 为原料，采用膜分离技术，将德赢vwin登录 水提液先后经过30 ku 超滤膜、400 u 纳滤膜。得到2 种目标产物，一是多糖粗品，多糖得率为57.40%，纯度为51.82%；二是苯乙醇苷粗品，苯乙醇苷得率为66.86%，其中松果菊苷、毛蕊花糖苷、总苯乙醇苷纯度分别为26.54%、3.36%、31.11%。形成了一套采用膜分离技术加工德赢vwin登录 水提液的新工艺体系，此工艺操作简单安全、能耗及成本较低，可实现德赢vwin登录 苯乙醇苷及多糖的低碳、高效同步分离纯化。参考文献[1] 孔征,毛乐静,霍仕霞,等.Box-Behnken 响应面法优化德赢vwin登录 中毛蕊花糖苷的提取工艺研究[J].中国药房,2019,30(14):1970-1974.[2] 黄翔,郭晔红,贾存勤,等.肉苁蓉提取工艺及干燥方式研究[J].中草药,2019,50(15):3622-3630.[3] 朱玉婷,李茂星,王建,等.中压柱层析快速分离纯化肉苁蓉提取物中的松果菊苷和毛蕊花苷[J].解放军药学学报,2018,34(06):491-493.[4] 刘朋龙,王亮.应用大孔树脂分离纯化德赢vwin登录 中苯乙醇苷研究[J].农产品加工,2018(23):11-14.[5] 蒋华彬,刘丽莎,张清,等.膜分离技术同步分离纯化德赢vwin登录 苯乙醇苷及多糖[J].食品科技,2019,44(07):229-234.

摘　要:在单因素实验的基础上,通过正交实验优化了德赢vwin登录 药渣中多糖的提取工艺,并对其体外抗氧化活性进行了初步研究.结果表明,最佳提取工艺条件为:提取温度９０℃、料液比１∶５０(g∶mL)、提取时间２．０h,在此条件下,德赢vwin登录 多糖提取率为５．７６％;德赢vwin登录 多糖具有较高的抗氧化活性,其对DPPH 自由基、羟基自由基具有清除能力,对铜离子有较强的还原能力.该提取方法简便易行,节能环保,适用于德赢vwin登录 多糖的提取.关键词:德赢vwin登录 ;多糖;提取工艺;正交实验;体外抗氧化活性德赢vwin登录 (Cistanchetubulosa)为列当科德赢vwin登录 Cistanchetubulosa(Schenk)Wight的干燥带鱗叶的肉质茎,又称南疆大芸、硬大芸.德赢vwin登录 生长于海拔８００~１４００m 的沙地或半固定沙丘、干涸老河床、湖盆低地等,常寄生于柽柳和梭梭的根部.德赢vwin登录 具有补肾壮阳、润肠通便、保肝、抗衰老、抗疲劳、增强免疫力及益智等功效[１Ｇ４],主治肾阳不足、精血亏虚、阳痿不孕、腰膝酸软、筋骨无力、肠燥便秘等症[５Ｇ６].国内外对德赢vwin登录 的研究热点主要集中于醇提取的苯乙醇苷类成分[７Ｇ８],其指标性成分为松果菊苷和毛蕊花糖苷.荒漠肉苁蓉和德赢vwin登录 是«中华人民共和国药典»(２０１５年版)收载品种,均以松果菊苷和毛蕊花糖苷为指标成分进行质量控制.研究发现,荒漠肉苁蓉多糖具有抗衰老、抗肿瘤、调节免疫力、改善人体造血功能等功效,且毒副作用小[９].德赢vwin登录 主产于新疆和田地区,已实现大面积人工栽培,其产量占全国的７０％.截至２０１７年上半年,于田县德赢vwin登录 种植面积达１１７００hm２,接种德赢vwin登录 面积为１０３００hm２,年产量突破１００００t,已作为肉苁蓉的新基原进入市场[１０].和田地区肉苁蓉企业采用醇提法提取德赢vwin登录 中的苯乙醇苷类成分,进行中成药和保健品的研发,已上市产品有苁蓉总苷胶囊、复方苁蓉益智胶囊、肉苁蓉黑米保健酒等[１１],但醇提后的药渣一般作为废物处理.作者所在课题组在实验中发现德赢vwin登录 药渣中的多糖含量较为丰富,但有关多糖有效成分含量[１２]、药理药效的报道较少.为此,作者对德赢vwin登录 多糖的提取工艺及体外抗氧化活性进行研究,拟为德赢vwin登录 多糖的综合利用奠定理论基础,促进德赢vwin登录 加工产业技术升级.１　实验１．１　材料、试剂与仪器德赢vwin登录 药渣,新疆win德赢官方 .无水乙醇、浓硫酸,天津富宇精细化工有限公司;蒽酮,上海科丰实业有限责任公司;无水葡萄糖,天津致远化学试剂有限公司;抗坏血酸,天津天新精细化工开发中心;二苯代苦味酰基(DPPH),上海梯希爱化成工业发展有限公司;新亚铜试剂、过氧化氢、硫酸亚铁、水杨酸等均为分析纯.AB１３５ＧS型分析天平,瑞士梅特勒公司;SHBＧⅢ型循环水式多用真空泵,郑州长城科工贸有限公司;EYELAOSBＧ２１００型油浴锅、EYELANＧ１００１型旋转蒸发仪,上海爱郎仪器有限公司;UVＧ２５５０型紫外可见分光光度计,日本岛津公司.１．２　方法１．２．１　溶液的配制葡萄糖溶液:精密称取１０．０８mg葡萄糖于１００mL容量瓶中,加蒸馏水溶解并定容至刻度,摇匀,即得０．１００８mg

摘要: 目的: 研究德赢vwin登录 苯乙醇苷对巨噬细胞的激活作用，并筛选获得一个复方，研究其对正常小鼠的增强免疫力作用。方法: 通过巨噬细胞激活实验，考察德赢vwin登录 苯乙醇苷提取物对巨噬细胞ＲAW264.7 吞噬活性和TNF－α、IL－6 等分泌的影响; 研究当归、黄芪提取物的配伍对苯乙醇苷提取物的巨噬细胞激活作用的影响; 据此制备复方片剂，通过ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验、迟发型变态反应试验、抗体生成细胞检测、小鼠碳廓清试验和小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验，评价其对正常小鼠的免疫调节作用。结果: 75、100、125 g /L 苯乙醇苷提取物均能提高ＲAW264.7 细胞吞噬活性，以及NO、iNOS、TNF－α、IL－6 水平，其中以100 g /L 苯乙醇苷提取物效果最佳( P ＜ 0.01) ; 并且，当归、黄芪提取物对苯乙醇苷提取物的巨噬细胞激活功能具有极显著的促进作用( P ＜ 0.01) ; 以此为依据制备的复方片剂，0.4、1.2 g /kg·bw/d 组可显著促进淋巴细胞增殖( P ＜ 0.05) 、1.2 g /kg·bw/d 组可显著促进细胞免疫反应( P ＜ 0.05) ，0.4 g /kg·bw/d 组可显著促进抗体生成( P ＜ 0.05) ，1.2 g /kg·bw/d 组可显著提高小鼠碳廓清能力和巨噬细胞吞噬能力( P ＜ 0.05) 。结论: 苯乙醇苷提取物可通过诱导iNOS 表达，刺激巨噬细胞合成NO，同时刺激巨噬细胞释放TNF－α 和IL－6，激活巨噬细胞的免疫调节功能; 以其与当归、黄芪提取物制备的复方片剂，可通过调节细胞免疫、单核－巨噬细胞功能而发挥对正常小鼠的增强免疫力作用，并对体液免疫有积极影响。关键词: 德赢vwin登录 ，苯乙醇苷，当归，黄芪，巨噬细胞激活，增强免疫力列当科植物德赢vwin登录 ( Cistanche tubulosa( Schrenk) Wight) 是《中国药典》收载的肉苁蓉品种之一［1］，主产于新疆南疆地区，是著名的补益中药，“主五劳七伤，补中，除茎中寒热痛，养五脏，强阴，益精气，多子，妇人症瘕，久服轻身”。现代药理学研究表明，肉苁蓉具有抗疲劳［2－3］、抗衰老［4］、保护神经［5］、增强免疫力［6］、润肠通便［7］等多种生物活性，在保健食品开发方面具有独特的优势。苯乙醇苷和多糖被认为是肉苁蓉中的主要活性成分，其中，多糖的调节免疫活性已得到较多研究证实，它可通过免疫球蛋白受体Fcγ 依赖的吞噬作用、TNF－α NF－ κB 通路、糖酵解/糖原异生以及三羧酸循环和呼吸电子运输等实现对巨噬细胞ＲAW264.7的激活作用［8－10］，并可能通过促进细胞内钙释放促进小鼠胸腺淋巴细胞的增殖，通过促进IL－2 分泌提高正常小鼠的脾指数［10－11］。松果菊苷、毛蕊花糖苷等为代表的苯乙醇苷是肉苁蓉发挥药理活性的核心物质基础，但在调节免疫方面的研究则较少。文献报道，肉苁蓉苯乙醇苷能明显增加小鼠血中Mφ 的吞噬能力及免疫器官的重量［12］，松果菊苷为主要成分的肉苁蓉提取物可通过免疫调节等作用拮抗结肠炎，毛蕊花糖苷对免疫器官、免疫细胞和免疫因子均有明显的调节作用，对D－氨基半乳糖和脂多糖致肝功能衰竭小鼠的细胞凋亡和炎症反应也都有明显的抑制作用［6，13－14］，说明肉苁蓉中的苯乙醇苷类同样是很有潜力的免疫调节剂。本文首先研究了德赢vwin登录 苯乙醇苷对巨噬细胞的激活作用，其次，基于传统中医药理论将其与当归、黄芪配伍，通过细胞实验证明3 者对巨噬细胞激活的协同作用，并以此为依据制备复方片剂，通过动物实验考察复方片剂对正常小鼠的细胞免疫、体液免疫、单核－巨噬细胞功能的调节作用，以期为德赢vwin登录 苯乙醇苷在调节免疫产品方面的应用提供数据支持。1 材料与方法1.1 材料与仪器Hank’s 液、ＲPMI1640 培养液、DMEM 培养基、MTT、PBS 购自武汉普诺赛生命科技有限公司;DNFB 购自吴江市青云精细化工厂; SＲBC、豚鼠血清购自广州蕊特生物科技有限公司; ConA、大肠杆菌脂多糖( LPS) 购自美国Sigma 公司; NO 试剂盒、iNOS 试剂盒购自南京建成生物工程研究所;ELISA 试剂盒( Mouse TNF－α、Mouse IL－6) 购自武汉艾美捷科技有限公司; 巨噬细胞ＲAW264.7 购自中国医学科学院细胞中心; SPF 级CI /F1 代健康雌性小鼠( 生产许可证号SCXK( 沪) 2013－0016) 购自上海西普尔－ 必凯实验动物有限公司; 德赢vwin登录 购自和田秋永霞德赢vwin登录 有限责任公司; 当归、黄芪购自新疆九州通医药有限公司。JA2003 电子天平上海上天精密仪器有限公司; JJ－100 电子天平美国双杰公司; SG－603 生物安全柜美国Baker 公司; Varioskan LUX 多功能酶标仪Thermo Fisher Scientific 公司; QP80 二氧化碳培养箱山东博科科学仪器有限公司。1.2 实验方法1.2.1 各提取物及复方片剂的制备德赢vwin登录 苯乙醇苷提取物: 德赢vwin登录 以75% 乙醇溶液提取2次，浓缩干燥，即得( 松果菊苷+ 毛蕊花糖苷: 21.3%，总苷: 41%) ; 当归提取物: 当归以水提取2 次，浓缩后80%醇沉，浓缩干燥，即得( 阿魏酸: 0.3%) ; 黄芪提取物: 黄芪以水提取2 次，浓缩后70% 醇沉，干燥沉淀，即得( 多糖: 32.3%) 。复方片剂: 德赢vwin登录 苯乙醇苷提取物、当归提取物、黄芪提取物按15∶ 18∶ 12 的比例，辅以10% 微晶纤维素、9% 羧甲基淀粉钠、1% 硬脂酸镁混合均匀，湿法制粒、压片( 0.6 g /片) ，即得。1.2.2 苯乙醇苷提取物的巨噬细胞激活作用1.2.2.1 对ＲAW264.7 细胞吞噬活性的影响取对数生长期ＲAW264.7 细胞，胰酶消化后调整细胞数至5 × 106 个/mL，接种于48 孔板( 100 μL /孔) ，37 ℃，5% CO2条件下培养，待细胞贴壁后，PBS 清洗。分别加入DMEM 培养基( 空白对照组) 、LPS( 20 mg /L)和样品( 苯乙醇苷提取物25、50、75、100、125 g /L) 培养24 h，弃上清，加0.075%中性红溶液( 100 μL/孔) ，继续培养1 h，弃上清，PBS 清洗2～3 遍，加细胞裂解液( 100 μL /孔) ，4℃ 下放置2 h，酶标仪测定吸光度( 540 nm) ，计算相对细胞吞噬活性。相对细胞吞噬活性( %) = 处理组吸光度/空白对照组吸光度×100。1.2.2.2 对ＲAW264.7 细胞NO、iNOS、TNF－ α、IL－6的影响按上述方法培养ＲAW264.7 细胞，分别加入DMEM 培养基( 空白对照组) 、LPS( 20 mg /L) 和样品( 苯乙醇苷提取物25、50、75、100、125 g /L) 培养24 h，收集上清液，根据试剂盒说明测定NO、iNOS，Elisa 法测定TNF－α、IL－6 含量。1.2.3 苯乙醇苷提取物及其与当归和黄芪提取物的组合物对巨噬细胞激活的作用比较1.2.3.1 对ＲAW264.7 细胞吞噬活性的影响以苯乙醇苷提取物和当归提取物按15∶ 18 的比例混合得到组合物B，以苯乙醇苷提取物、当归提取物和黄芪提取物以15∶ 18∶ 12 的比例混合得到组合物C( 组合物配比依据《中国药典》中各药材的推荐服用量［1］和各提取物的得率折算) 。参照“1.2.2.1”方法，对比苯乙醇苷提取物( A) 、组合物B 和C( 50、75 g /L) 对ＲAW264.7 细胞吞噬活性的影响。1.2.3.2 对ＲAW264.7 细胞NO 释放量的影响参照“1.2.2.2”方法，对比苯乙醇苷提取物( A) 、组合物B和C( 50、75 g /L) 对ＲAW264.7 细胞产生NO 的影响。1.2.4 复方片剂对正常小鼠的免疫力的影响参考文献［15］的操作研究复方片剂对正常小鼠淋巴细胞等的影响。1.2.4.1 分组及处理SPF 级CI /F1 代健康雌性小鼠200 只，体重19.0～21.7 g，随机分五大组，每大组40 只，Ⅰ组进行ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验，Ⅱ组进行耳肿胀试验，Ⅲ组进行抗体生成细胞检测，Ⅳ组进行小鼠碳廓清试验，Ⅴ组进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验。每大组分别设复方片剂低、中、高剂量组0.2、0.4、1.2 g /kg·bw/d( 分别相当于受试样品人体推荐摄入量的5 倍、10 倍、30 倍; 折算人体推荐摄入量，各药材服用量均小于《中国药典》规定的用药量) 和空白对照组，灌胃体积0.1 mL/10 g·bw，空白对照组给予等体积蒸馏水，1次/d，连续灌胃30 d。1.2.4.2 ConA 诱导的小鼠淋巴细胞转化试验灌胃30 d 后，处死小鼠，无菌取脾，制细胞悬液，用ＲPMI1640 培养液调整细胞浓度为3 × 106 个/mL。将细胞悬液分两孔加入24 孔培养板，每孔1 mL，一孔加75 μL ConA 液( 100 μg /mL) ，另一孔作对照，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养72 h。培养结束后，用酶标仪按MTT 法在570 nm 测定OD 值。淋巴细胞增殖能力= 加ConA 孔的OD 值－不加ConA 孔的OD 值1.2.4.3 迟发型变态反应灌胃30 d 后，每鼠腹部剃毛( 3 cm × 3 cm) ，以10 mg /mL DNFB 溶液50 μL均匀涂抹致敏。5 d 后以10 mg /mL DNFB 溶液10 μL均匀涂抹于小鼠右耳( 两面) 攻击，攻击24 h后处死小鼠，分别以打孔器取左右耳片( d = 8 mm) ，称重。耳重差( mg) = 右耳重( mg) －左耳重( mg) 。1.2.4.4 抗体生成细胞检测灌胃30 d 后，每鼠腹腔注射0.2 mL 2%( v /v) SＲBC 悬液免疫，4d 后处死小鼠，取脾，制细胞悬液，按Jerne 改良玻片法检测溶血空斑数。溶血空斑数= 溶血空斑计数× 320。1.2.4.5 小鼠碳廓清试验灌胃30 d 后，每鼠尾静脉注入4 倍稀释的印度墨汁( 0.1 mL /10 g·bw) ，注入后2 min 及10 min 时分别从眼内眦静脉丛取血20 μL，加入2 mL 0.1% Na2CO3溶液中，用酶标仪在600 nm 处测OD 值，并取胸腺、肝、脾称重，计算胸腺/体比、脾/体比和吞噬指数a。K = ( lgOD1－ lgOD2) / ( t2－ t1) ，a = 体重/ ( 肝重+ 脾重) × K1 /3。1.2.4.6 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验试验前4 d 给每鼠腹腔注射2% 压积羊血红细胞0.2 mL。处死小鼠，腹腔注射加小牛血清的Hank’s液( 4 mL /只) ，轻轻按揉腹部20 次，然后将腹壁剪开一个小口，吸取腹腔洗液2 mL 于试管内。吸取0.5 mL腹腔洗液加入盛有0.5 mL 1% 鸡血红细胞悬液的试管内，混匀。取混合液加入玻片琼脂圈内，37 ℃孵育15～20 min。孵育后将未贴壁细胞洗掉，固定，Giemsa 染色，洗片，晾干，显微镜计数，计算吞噬率和吞噬指数。吞噬百分率( %) = 吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的吞噬细胞数× 100，吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数。1.3 数据分析数据均以珋x ± s 表示，用SPSS 软件对各实验原始数据进行方差分析。以P ＜ 0.01 作为非极显著性差异，P ＜ 0.05 作为显著性差异。2 结果与分析2.1 苯乙醇苷提取物的巨噬细胞激活作用2.1.1 苯乙醇苷提取物对ＲAW264.7 细胞吞噬活性的影响本实验首先研究了25、50、75、100、125 g /L苯乙醇苷提取物对ＲAW264.7 细胞吞噬活性的影响。结果表明，LPS 组细胞吞噬活性相比空白对照组具有极显著差异( P ＜ 0.01) ， 75、100 g /L 组样品可极显著提高细胞吞噬活性( P ＜ 0.01) ，125 g /L 组可显著增强细胞吞噬活性( P ＜ 0.05) ，提示苯乙醇苷提取物具有激活巨噬细胞的作用，见图1。2.1.2 苯乙醇苷提取物对ＲAW264.7 细胞NO、iNOS、TNF－α 和IL－6 释放的影响为了进一步明确苯乙醇苷提取物对巨噬细胞的激活作用，分别检测了巨噬细胞经不同浓度样品刺激后，细胞上清液中NO、iNOS、TNF－ α 和IL － 6 的含量。结果表明，LPS 组NO、iNOS、TNF－α 和IL－6 相比空白对照组均具有极显著差异( P ＜ 0.01) ， 75、100、125 g /L 苯乙醇苷提取物组均能改善ＲAW264.7 细胞NO 生成量、iNOS 活性和TNF－α 分泌水平，50、75、100、125 g /L 苯乙醇苷提取物组还能提高ＲAW264.7 细胞IL－6 分泌水平，其中，100、125 g /L 组样品的作用具有极显著差异( P ＜ 0.01) ，这也提示苯乙醇苷提取物可能通过促进巨噬细胞表达TNF－ α、IL－6 从而激活免疫吞噬功能，见图2～ 图5。巨噬细胞吞噬活性和NO 释放的影响，考察3 者是否具有协同增效的作用，为下一步复方片剂的制备提供依据。结果表明，LPS 组细胞吞噬活性和NO 释放量相比空白对照组均具有极显著差异( P ＜ 0.01) ，A、B 仅有高剂量组能提高巨噬细胞吞噬活性和NO 释放量( P ＜ 0.05) ，而以3 种提取物共同制备的组合物C 低、高剂量组均能提高巨噬细胞吞噬活性和NO 释放量，并且，C 高剂量组对巨噬细胞吞噬活性和NO分泌的影响具有极显著差异( P ＜ 0.01) ，即苯乙醇苷提取物、当归提取物、黄芪提取物在激活巨噬细胞方面具有协同作用，故以组合物C 的配比为依据制备复方片剂继续考察其对正常小鼠的免疫调节活性，见图6～图7。2.3 复方片剂对正常小鼠的免疫调节活性为了进一步证明苯乙醇苷提取物、当归提取物和黄芪提取物配伍在增强免疫力方面的实际效果，通过动物实验，综合考察以3 者制备的复方片剂对正常小鼠细胞免疫、体液免疫、单核－ 巨噬细胞功能和NK 细胞活性的影响。2.3.1 ConA 诱导的小鼠淋巴细胞转化试验淋巴细胞的增殖和分化是机体免疫反应中的重要阶段，淋巴细胞受到抗原或者促有丝分裂原刺激时增殖能力的大小，可以反映机体的免疫功能状态［16］。0.4、1.2 g /kg·bw /d 组小鼠淋巴细胞中加ConA 孔与不加ConA 孔的OD 值差值显著高于空白对照组( P ＜ 0.05) ，说明样品可以增强ConA 诱导的淋巴细胞增殖能力，即其可以促进机体的免疫反应，见表1。2.3.2 迟发型变态反应1.2 g /kg·bw /d 组小鼠耳壳增重显著高于空白对照组( P ＜ 0.05) ，说明抗原攻击局部引起了炎症反应导致的肿胀［17－18］，并且样品可以增强这一作用，即样品能够增强DNFB 诱发的迟发型变态反应，综合“2.3.1”结果，可以判定样品能够促进小鼠的细胞免疫功能，见表2。2.3.3 抗体生成细胞检测抗原特异性抗体的产生可以裂解抗原致敏后的绵羊红细胞，从而在抗体形成细胞周围形成溶血空斑。0.4 g /kg·bw /d 组小鼠溶血空斑数显著高于空白对照组( P ＜ 0.05) ，说明样品可以促进抗体生成，即其对小鼠特异性体液免疫有积极影响，见表3。2.3.4 小鼠碳廓清试验单核巨噬细胞系统能够快速吞噬廓清异体颗粒和某些可溶性异物，并可迅速清除自体产生的某些有害物质，是机体最重要的防御系统［19］。1.2 g /kg·bw /d 组小鼠碳廓清吞噬指数a显著高于空白对照组( P ＜ 0.05) ，表明样品可以提高小鼠碳廓清能力，增强单核－ 巨噬细胞系统吞噬功能，并且，“2.2”结果也显示混合物在体外可以激活巨噬细胞，提高其吞噬活性，说明样品可以增强机体的非特异性免疫功能［20］，见表4。2.3.5 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验鸡红细胞对于小鼠是一种较强的抗原，其与小鼠腹腔巨噬细胞共孵育一定时间后，会被吞噬，吞噬百分率和吞噬指数可以反映小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力［21］。1.2 g /kg·bw /d 组吞噬百分率及吞噬指数均显著高于空白对照组( P ＜ 0.05) ，表明样品可以提高巨噬细胞的吞噬能力，综合“2.3.4”结果可以判定样品可以通过影响正常小鼠单核－ 巨噬细胞系统的吞噬功能发挥增强免疫力的作用，见表5。3 结论巨噬细胞在机体内不仅起呈递抗原的作用，还可通过非特异性吞噬病原微生物和肿瘤细胞等维持机体稳态，在宿主防御系统中占重要地位［22］。NO 是杀伤病原微生物和肿瘤细胞的主要物质，激活的巨噬细胞可以合成大量NO，从而杀伤微生物、寄生虫和肿瘤细胞［22］。iNOS 则是其合成的关键酶之一，当巨噬细胞被激活时会大量表达iNOS，进而诱发机体产生NO，可发挥防御作用［22］。TNF－α 和IL－6 则是巨噬细胞分泌的2 种主要炎性因子，不仅参与机体免疫应答反应，而且对机体的免疫反应有重要调节作用［23］。因此，本实验选择这些指标研究德赢vwin登录 苯乙醇苷的巨噬细胞激活作用，并考察其与当归和黄芪提取物的协同作用。结果表明，75、100、125 g /L的德赢vwin登录 苯乙醇苷提取物可显著提高细胞对中性红的吞噬能力，说明其可提高机体的非特异性免疫，并且可能是通过诱导iNOS 表达提高刺激巨噬细胞合成NO，同时刺激巨噬细胞释放TNF－ α和IL－6，激活细胞免疫吞噬功能。此外，当归提取物、黄芪提取物可明显提升苯乙醇苷提取物对巨噬细胞的激活作用，即三者在巨噬细胞激活方面具有协同增效作用。肉苁蓉补肾气、益精血［24］，当归补血活血［25］，黄芪补诸虚不足、益元气、壮脾胃［26］，三者合用，平补阴阳，调养五脏，温而不燥，补而不腻，性味平和，无阴阳偏盛之弊，全方共奏补肾填精养血活血之功效，因而能够发挥增强机体免疫力的功效。动物实验也证明，以3 者作为原料制备的复方片剂，可以提高正常小鼠淋巴细胞增殖能力、促进抗原攻击下的迟发型变态反应、提高小鼠体内碳颗粒被清除的速率、巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力和脾细胞抗体生成能力，但是，对溶血素水平、NK 细胞活性没有积极影响( 数据未列出) 。根据《保健食品检验与评价技术规范》之标准［15］，受试样品在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核－巨噬细胞功能、NK 细胞活性4 个方面任2个方面结果为阳性，即具有增强免疫力功能。因此，可以判定本复方片剂具有增强免疫力功能，且主要是通过调节正常小鼠细胞免疫、单核－巨噬细胞功能发挥增强免疫力作用的。参考文献［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典( 2015 年版一部)［M］.2015 年版一部.北京: 化学工业出版社，2015: 135.［2］ＲunLan Cai Ｒ，MeiHua Yan，Yue Shi，et al.Antifatigueactivity of phenylethanoid－rich extract from Cistanche deserticola［J］.Phytotherapy Ｒesearch，2010，24( 2) : 313－315.［3］ZweLing Kong，Athira Johnson，FanChi Ko，et al.Effect ofCistanche tubulosa extracts on male reproductive function instreptozotocin－nicotinamide－ induced diabetic rats［J］.Nutrients，2018，10( 10) : 1562－1584.［4 ］ Xiaoming Wang， Jinfang Wang，Huanyu Guan， etal. 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