图2 乙醇含量对肉苁蓉中多酚提取的影响图3 提取温度对肉苁蓉中多酚提取的影响Fig.3 Efect of temperature on the estaction of polyphenols from Cistanche选择合适的料液比能使提取液发挥最大的效用。故本实验选择1：20、1：30、1：40的料液比进行实验。测定结果见图4，由图可知，当乙醇含量为70％，提取时间为30min，温度为60℃时，料液比为1：20、1：30和1：40的测定结果差别不大，本着节省原材料的原则，故料液比选择为1：20时较好。3.1.4 提取时间的确定溶解速度的快慢决定着提取时间的大小，为使溶解充分，需确定最佳提取时间，分别以10min、20min、30min为提取时间进行实验，测定结果见图5．由图可知，当乙醇含量为70％，料液比为1：20时，温度为60℃时，30mm效果最好，提取时间为30min3.2 肉苁蓉中水分含量的测定测定肉苁蓉多酚含量时，需同时测定样品中水分含量，以便计算绝干样中的多酚含量。（1）取一只称量瓶洗干净，烘干备用。（2）称肉苁蓉1.0000g左右于称量瓶内，将不盖盖子，称肉苁蓉和称量瓶的质量，将其放入恒温干燥箱内放置1小时，温度设为105℃。（3）取出放入干燥器内冷却至室温后，用同一台天平调零后称量干燥后的质量。（4）水分含量％＝m前-m后／m肉苁蓉x100％3.3 肉苁蓉中多酚含量的测定取肉苁蓉供试品溶液1ml到25mL的容量瓶中，加2.5mL的Folin-酚试剂，再加7.5ml．20％的Na：CO，混匀，蒸馏水定容至标线，放置2h后进行测定，测定结果见表5。3.3 紫外-可见分光光度法测定肉苁蓉中多酚类物质的方法评价3.3.1 精密度实验对紫外-可见分光光度法测定肉苁蓉中多酚类物质进行精密度实验，同一肉苁蓉供试品溶液平行测定6次，测定结果见表6，相对标准偏差为0.4804％，表明该试验方法独立测量结果一致程度较高，随机误差较小。3.3.2 稳定性实验对紫外-可见分光光度法测定肉苁蓉中多酚类物质进行稳定性实验，同一肉苁蓉供试品溶液每间隔1h测定1次，重复测4次，测定结果见表7。相对标准偏差为0.9333％，表明该方法仪器的计量特性随时间不变化的能力较好，能够满足实验对稳定性的要求。3.3.3 加标回收实验准确量取已知含量的肉苁蓉供试品溶液0.5mL3份，分别加人7号的没食子酸工作液（2.0mg／L）11mL，12mL、13mL，加2.5mL的Folin-酚试剂，再加 7.5ml．20％的Na2CO，混匀，蒸馏水定容至50ml，放置2h后分别进行测定。测定结果见表8．由实验结表4 肉苁蓉中水分含量测定结果Table 4 Resus of determination of moisture in Cistanche序号样品：样品2样品3m初始200011.0015g1.0005gm干燥前肉苁蓉和称量瓶11.2771g11.5263g120551gm干燥后肉苁蓉和称量瓶11.2239g11.4726g120018g水分含量5.319%5.362%5.327%平均水分含量％5.336%表5 多酚含量测定Table 5 Determination of polyphenols content序号样品1样品2样品3A0.86700.83950.8510浓度（mg／L）1.9801.8991.933质量百分比（％）0.24750.23740.2416平均质量百分比（％）0.2422表6精密度测定结果Table 6 Result of precision esperiment序号1234S6A0.85400.84780.84800.84790.84660.8448浓度（mg／L）1.94219241.9241.9241.9201915质量百分比（％）0.24280.24050.24050.2405.24000.2394RSD%0.4804 表7 稳定性测定结果Table 7 Resul of sability experiment时间1h2h3h4hA0.84200.84350.84300.8545浓度（mg／L）1.9061.9111.9091.944质量百分比（％）0.23820.23890.23860.2430RSD%0.9333表8 加标回收试验结果Table & Reuls of recovery experiment样品123已知含量（ug）247.5252.2244.6加入量（g）220.0240.0260.0测定值466.5488.5506.8回收率院99.5498.46100.8平均回收率／％99.65% 

［摘　要］　目的：探讨肉苁蓉醇提物（ＣＤＥ）对骨质疏松大鼠的治疗作用，阐明其作用机制。方法：７２只雌性ＳＤ 大鼠随机分为对照组，模型组，雌二醇组（０．３ ｍｇ·ｋｇ－１）， 低、中和高剂量（０．５、１．０ 和２．０ｇ·ｋｇ－１）ＣＤＥ 组；每组１２只。对照组大鼠摘除少量卵巢周围脂肪，其余各组大鼠手术摘除双侧卵巢，制备骨质疏松模型。手术后第５天，雌二醇组大鼠皮下注射雌二醇，不同剂量ＣＤＥ 组大鼠分别开始灌胃相应剂量的ＣＤＥ，对照组和模型组大鼠给予等量蒸馏水。给药２０周后，质体比法检测大鼠右侧股骨密度，骨力度仪检测大鼠左侧股骨生物力学指标，ＥＬＩＳＡ 法检测大鼠血清中碱性磷酸酶（ＡＬＰ） 及骨钙素水平，全自动生化仪检测大鼠血清中钙离子和磷离子水平，ＨＥ 染色观察大鼠子宫组织形态。结果：与模型组比较，雌二醇组及低、中和高剂量ＣＤＥ组大鼠右侧股骨密度明显升高（犘＜０．０５ 或犘＜０．０１），各剂量ＣＤＥ 组间比较差异无统计学意义（犘＞０．０５）；与模型组和低剂量ＣＤＥ 组比较，中和高剂量ＣＤＥ 组大鼠左侧股骨的最大弯曲力、最大应变和骨刚性明显升高（犘＜０．０５），血清中ＡＬＰ水平降低（犘＜０．０５）。与模型组及低、中剂量ＣＤＥ 组比较，高剂量ＣＤＥ 组大鼠血清中骨钙素水平明显降低（犘＜０．０５）。与模型组比较， 低、中和高剂量ＣＤＥ 组大鼠血清钙离子水平明显升高（犘＜０．０５），各剂量ＣＤＥ 组间比较差异无统计学意义（犘＞０．０５）。与模型组比较，低、中和高剂量ＣＤＥ 组大鼠子宫组织形态表现均有不同程度改善。结论：ＣＤＥ 可以通过升高大鼠血清ＡＬＰ、骨钙素及钙离子水平起到治疗骨质疏松的作用。［关键词］　肉苁蓉；醇提物；碱性磷酸酶；骨钙素；钙离子骨质疏松是以骨密度降低及其显微结构发生实质性变化为主要特征的一类型疾病。骨质疏松的发病与年龄呈明显的正相关关系，尤其在４０ 岁以上人群其相关性更加明显［１２］。目前，我国６０岁及以上人口总数已达到总人口数的１３．２６％［３］。对于骨质疏松的治疗现以使用骨吸收抑制剂、骨形成促进剂等治疗为主，虽然药物疗效确切，但不良反应也十分明显，寻找毒副作用小的治疗药物显得尤为重要［４］。肉苁蓉是名贵中药之一，又有沙漠人参的美誉。中国药典记载，肉苁蓉具有补肝肾、益精气的功效［５］。现代药理研究［６］证实：肉苁蓉具有一定的雌激素样作用。而雌激素是治疗女性骨质疏松的临床常用药物之一。国内外暂无使用肉苁蓉醇提物（ｃｉｓｔａｎｃｈｅ ｄｅｓｅｒｔｉｃｏｌａ ｅｔｈａｎｏｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ＣＤＥ）进行骨质疏松治疗的研究，因此本文作者旨在探讨ＣＤＥ 对去卵巢所致的骨质疏松大鼠的治疗作用及其机制，为肉苁蓉的临床应用奠定基础。１　材料与方法１．１　实验动物、药物、主要试剂和仪器　雌性ＳＤ大鼠７２只，ＳＰＦ 级，体质量１４０～１８０ｇ，购于河南省实验动物中心，动物合格证号：ＳＣＸＫ （豫）２００５０００１。饲养于ＳＰＦ 级实验动物房， 室温（２３±２）℃，光照与黑暗时间各１２ｈ。戊酸雌二醇，购于德国拜耳公司，使用前用生理盐水配置成０．３ｇ·Ｌ－１注射液。肉苁蓉，购于北京同仁堂，打粉过１０ｍｍ 筛，加入７５％乙醇溶液利用索氏提取器，回流提取４ｈ，共提取２次，合并２次提取液，置于负压的旋转蒸发仪中，６０℃ 浓缩至生药量为１ｇ·ｍＬ－１。骨钙素试剂盒（南京建成生物工程研究所），碱性磷酸酶（ＡＬＰ）ＥＬＩＳＡ 试剂盒（美国Ｒ＆Ｄ 公司），多聚甲醛（天津大茂化学试剂有限公司），其余化学试剂均为国产分析纯。恒温水浴槽（上海精宏实验设备有限公司），骨密度仪（美国ＨＯＬＯＧＩＣ 公司），全自动生化仪（河北厚德汉方医疗器械公司），常温低速离心机（湖南湘仪仪器有限公司），酶标仪（美国Ｂｉｏｒａｄ 公司），骨密度仪和生物力学试验仪（英国ＬＬＯＹＤ 公司），游标卡尺（广州晨光科技有限公司）。１．２　实验动物分组、造模和给药　７２ 只雌性ＳＤ 大鼠随机分为对照组， 模型组， 雌二醇组（０．３ｍｇ·ｋｇ－１），低、中和高剂量（０．５、１．０ 和２．０ｇ·ｋｇ－１）ＣＤＥ 组；每组１２ 只。除对照组外，其余各组大鼠进行双侧卵巢摘除手术。３％ 戊巴比妥钠麻醉大鼠，使用剃毛器剔除背部中下部分毛发，酒精及碘酒双重消毒后，背部正中间开口，分别往两边扯动找到卵巢位置。使用手术线结扎子宫顶端后，剪除双侧卵巢，最后伤口缝合，并撒上青霉素。对照组大鼠于卵巢周围剪去少量脂肪。手术完成后，大鼠置于暖炉旁恢复，并连续３ｄ肌肉注射青霉素预防感染（每天20万单位）。手术后第５天，待动物状态恢复正常后，开始灌胃给药。１．３　大鼠右侧股骨密度测定　给药２０周后，麻醉大鼠，腹主动脉取血完成后，分离大鼠右侧股骨。钝性分离股骨后，使用纱布擦去股骨附近肌肉及组织，采用骨密度仪对离体大鼠右侧股骨进行密度分析。１．４　大鼠左侧股骨生物力学测定　给药２０ 周后，麻醉大鼠，腹主动脉取血完成后，分离大鼠左侧股骨。４℃储存股骨，直至实验前２４ｈ，室温解冻股骨，并与实验前用滤纸吸干表面水分。置于生物力学实验仪上测定左侧股骨生物力学变化。设定参数为跨距２０ ｍｍ，加速度为１ ｍｍ·ｍｉｎ－１。实验完成后，使用游标卡尺测定股骨断面内外径。按文献［６］中的方法，计算左侧股骨最大弯曲力、最大应变和骨刚性。１．５　大鼠血清中ＡＬＰ 和骨钙素水平测定　给药２０周后，麻醉大鼠， 腹部下部开口， 使用草纸拨开肠及肠下黏膜，暴露腹主动脉，使用一次性采血针与配套的采血管，与腹主动脉下部Ｙ 字岔口处进针取血， 每只大鼠约取５ ｍＬ 全血。室温静止４ｈ，使得血液完全凝固。３５００ｒ·ｍｉｎ－１、离心１０ｍｉｎ，取血清。按照ＡＬＰ及骨钙素ＥＬＩＳＡ 试剂盒说明，测定血清中ＡＬＰ和骨钙素水平。１．６　大鼠血清中钙离子和磷离子水平测定　按１．７中所述分离血清，取１ ｍＬ 血清置于全自动生化仪中，测定血清中钙离子和磷离子的水平。１．７　观察ＨＥ 染色大鼠子宫组织形态表现　给药２０周后，麻醉大鼠， 腹主动脉取血完成后， 分离大鼠子宫。取大鼠子宫左侧靠中部的部分，４％ 多聚甲醛固定４８ｈ。送检本医院病理科进行石蜡切片，ＨＥ 染色后观察子宫组织形态表现。１．８　统计学分析　采用ＳＰＳＳ１６．０统计软件进行统计学分析。各组大鼠右侧股骨密度、左侧股骨最大弯曲力、左侧股骨最大应变、左侧股骨骨刚性及血清中ＡＬＰ、骨钙素、钙离子和磷离子水平均以狓±狊表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析。以犘＜０．０５表示差异有统计学意义。２　结　果２．１　各组大鼠右侧股骨密度　与对照组比较，模型组大鼠右侧股骨密度明显降低（犘＜０．０１）。与模型组比较，雌二醇组及低、中和高剂量ＣＤＥ 组大鼠右侧股骨密度明显升高（犘＜０．０５ 或犘＜０．０１）。见表１。２．２　各组大鼠左侧股骨生物力学指标　与对照组比较，模型组大鼠左侧股骨的最大弯曲力、最大应变及骨刚性明显降低（犘＜０．０１）。与模型组比较，雌二醇组、中和高剂量ＣＤＥ 组大鼠的最大弯曲力、最大应变及骨刚性明显升高（犘＜０．０５ 或犘＜０．０１），且中和高剂量ＣＤＥ 组大鼠上述指标明显高于低剂量ＣＤＥ 组（犘＜０．０５）。见表１。２．３　各组大鼠血清中ＡＬＰ和骨钙素水平　与对照组比较，模型组大鼠血清ＡＬＰ 和骨钙素水平明显升高（犘＜０．０１）。与模型组比较，雌二醇组和中、高剂量ＣＤＥ 组大鼠血清ＡＬＰ 水平明显降低（犘＜０．０５或犘＜０．０１），且中和高剂量ＣＤＥ 组大鼠血清ＡＬＰ 水平低于低剂量ＣＤＥ 组（犘＜０．０５）。与模型组比较，雌二醇组和高剂量ＣＤＥ 组大鼠血清骨钙素水平明显降低（犘＜０．０５ 或犘＜０．０１），且高剂量ＣＤＥ 组大鼠血清骨钙素水平明显低于低和中剂量ＣＤＥ 组（犘＜０．０５）。见表２。２．４　各组大鼠血清中钙离子和磷离子水平　与对照组比较，模型组大鼠血清钙离子的水平明显降低（犘＜０．０１）。与模型组比较，雌二醇组及低、中和高剂量ＣＤＥ 组大鼠的钙离子水平明显升高（犘＜０．０５或犘＜０．０１）。各组大鼠血清磷离子水平比较差异无统计学意义（犘＞０．０５）。见表３。２．５　ＨＥ 染色观察各组大鼠子宫组织形态表现　对照组大鼠子宫内膜细胞排列整齐，腺体上皮呈高柱状，间质疏松，腺腔较大。模型组大鼠子宫内膜萎缩，腺体上皮呈低柱状，固有层组织较致密，上皮细胞细胞质较少。雌二醇组大鼠子宫内膜增厚，腺体上皮呈高柱状，上皮细胞肥大，胞浆丰富，腺体肥大。低、中和高剂量ＣＤＥ 组大鼠子宫内膜上皮较模型组明显增厚， 腺体上皮呈高柱状致密排列，间质较为致密，且随剂量增加，腺体数量明显增加。见图１ （插页三）。３　讨　论骨质疏松是老年常见病之一，尤以女性发病率较高，其根本原因在于女性更年期后，机体雌激素水平的降低［７８］。随着年龄的增加，人体各类型的激素水平产生波动，女性的雌激素分泌水平明显降低，这些因素均会导致骨质疏松的产生。卵巢摘除手术建立大鼠骨质疏松模型，模拟了这一疾病的进程，是目前筛选骨质疏松药物的首选动物模型［９］。本研究在手术造模后，使用青霉素注射的方法，消除了动物感染对实验造成的误差，并且明显提高手术后动物的成活率。中医认为骨质疏松属于“骨萎”的范围，病因以肾虚、肝血亏虚为主。肉苁蓉有沙漠人参的美誉，是中药中的上品［１０］，肉苁蓉补肾的中医功效与骨质疏松“骨萎”的中医本质相对应，中医认为“肾主骨，生髓”。补肾不仅可以纠正免疫力低下，加强下丘脑垂体性腺功能，还可以改善肠道对钙离子等关键离子的吸收，促进骨吸收，加快骨形成，起到调节机体内环境微量元素平衡的作用［１１］。本研究采用现代药理学研究的手段和方法证实了这一中医内涵，发现ＣＤＥ 具有提高骨质疏松大鼠骨密度、改善骨生物力学功能的作用。ＡＬＰ及骨钙素大部分由骨细胞合成，在骨的矿化过程中起到关键性的作用，而去卵巢大鼠由于雌激素的缺失会代偿性增加ＡＬＰ 和骨钙素的分泌［１２１３］。临床研究［１４］表明：妇女的骨钙素和ＡＬＰ在绝经后的一段时间内均会保持在较高水平。血清中的多项指标，现在均已经作为诊断和预防措施选择的指标之一［１５］。去卵巢大鼠模拟是高转换型骨质疏松，即卵巢摘除后破骨细胞骨吸收活性明显增强，伴随成骨细胞活性代谢性上调，骨代谢速率加快，ＡＬＰ作为成骨细胞分泌物，可与血液中的钙离子相互作用共同促进骨质的合成［１６１７］。因此血清中的ＡＬＰ和钙离子水平可以反映骨代谢的速率。本研究结果显示：去卵巢模型大鼠血清ＡＬＰ 水平明显升高，钙离子浓度降低，而肉苁蓉给药组则能够有效地逆转这一趋势， 起到治疗骨质疏松的作用。骨骼是运动系统的重要组成部分，而骨骼的质量主要体现在生物力学功能上，骨质疏松患者骨组织中钙质大量流失，可以导致包括最大弯曲力、最大应变、骨刚性在内的多种骨功能下降［１８］。本研究结果显示：ＣＤＥ 给药后可以有效地改善去卵巢所导致大鼠股骨生物力学功能下降。而现代药理学研究证实了肉苁蓉具有雌激素样作用，这也是肉苁蓉能够起到治疗骨质疏松的原因之一。［参考文献］［１］ 严孙杰，冯　霖，沈喜妹， 等． 健康成人体成分差异对不同年龄段人群骨密度的影响［Ｊ］． 福建医科大学学报，２００９，４３ （４）：３０１３０５．［２］ 张萌萌．中国老年学学会骨质疏松委员会骨代谢生化指标临床应用专家共识［Ｊ］．中国骨质疏松杂志，２０１４，２０ （１１）：１２６３１２７２．［３］ 胡鞍钢，刘生龙，马振国． 人口老龄化、人口增长与经济增长———来自中国省际面板数据的实证证据［Ｊ］． 人口研究，２０１２，３６ （３）：１４２６．［４］ 胡一梅． 老年性骨质疏松症病理研究及治疗进展［Ｄ］． 成都：成都中医药大学，２００６．［５］ 赖青海，王琳琳，丁　辉， 等． 肉苁蓉治疗骨质疏松症研究进展［Ｊ］．辽宁中医药大学学报，２０１６，１８ （３）：１０２１０４．［６］ 魏珍珍． 肉苁蓉苯乙醇苷对大、小鼠围绝经期模型的影响［Ｄ］．郑州：河南中医学院，２０１４．［７］ ＧｅｉｓｌｅｒＪ，ＬｏｎｎｉｎｇＰＥ，ＫｒａｇＬＥ，ｅｔａｌ．Ｅｓｔｒｏｇｅｎｓａｎｄｂｏｎｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌｗｏｍｅｎｗｉｔｈｅａｒｌｙｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒａｔｌｏｗ ｒｉｓｋｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈｅｘｅｍｅｓｔａｎｅ：ａｒａｎｄｏｍｉｚｅｄｐｌａｃｅｂｏｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｓｔｕｄｙ ［Ｊ］．ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ，２００４，２２ （１４）：５３１．［８］ ＦｌｏｒｅｓＲ， Ｄｈｒｍａｎｎ Ｓ，Ｓｃｈａａｌ Ｃ，ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｔｒａｐｆｏｒｍａｔｉｏｎ ［Ｊ］．ＦｒｏｎｔＩｍｍｕｎｏｌ，２０１６，７：５６６．［９］ 李素萍．骨质疏松动物模型的研究现状［Ｊ］． 中国组织工程研究与临床康复，２０１１，１５ （２０）：３７６７３７７０．［１０］ 杨峻山． 沙漠人参—肉苁蓉［Ｊ］． 中国药学杂志，２０１１，４６ （１２）：８８１．［１１］ 黄继锋，宋　敏，李泽佳，等．补肾固本方对去卵巢大鼠骨质疏松症骨密度、骨矿盐含量及ＣＴ 含量的影响［Ｊ］． 中国实验方剂学杂志，２０１５，２１ （４）：１４９１５２．［１２］ 司会群，卜淑敏，赵俊勇，等．全身垂直振动对去卵巢骨质疏松大鼠胫骨和子宫血管内皮生长因子蛋白表达的影响［Ｊ］．中国老年学杂志，２０１６，３６ （１８）：４４２３４４２５．［１３］ Ｙａｎｇ Ｓ，Ｚｈｏｕ Ｙ，ＳｈｕａｉＢ，ｅｔａｌ．Ｒｏｌｅｏｆｔｈｅ ＥＲ／ＮＯ／ｃＧＭＰ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ ｏｆ ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｒａｔｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｂｙａｃｔａｅａ ｒａｃｅｍｏｓａ ｅｘｔｒａｃｔ ［Ｊ］． Ｅｖｉｄ Ｂａｓｅｄ ＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔＡｌｔｅｒｎａｔＭｅｄ，２０１６，２０１６：２６１５６２０．［１４］ＬｆｍａｎＯ， Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ Ｐ， Ｔｏｓｓ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｍｏｎｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｍａｒｋｅｒｓｏｆｂｏｎｅｔｕｒｎｏｖｅｒｐｒｅｄｉｃｔｆｕｔｕｒｅｂｏｎｅｌｏｓｓ：ａ ５ｙｅａｒ ｆｏｌｌｏｗｕｐ ｓｔｕｄｙ ［Ｊ］． Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ，２００５，３５６ （１／２）：６７７５．［１５］ 薛昊罡，冷　冰，马恩元，等．血清细胞因子水平检测在辅助诊断和治疗老年骨质疏松中的作用［Ｊ］．中国老年学杂志，２０１１，３１ （１１）：１９８４１９８５．［１６］ Ｚｈａｏ Ｄ， ＷａｎｇＪ，Ｌｉｕ Ｙ，ｅｔａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｂｏｎｅ Ｇｌａｐｒｏｔｅｉｎ， ｂｏｎｅ ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅａｎｄ ＣｔｅｒｍｉｎａｌｔｅｌｏｐｅｐｔｉｄｅｏｆｔｙｐｅＩｃｏｌｌａｇｅｎｉｎｂｏｎｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ ［Ｊ］．Ｐａｋ ＪＭｅｄＳｃｉ，２０１５，３１ （１）：９１９４．［１７］ Ｘｕ ＭＨ，Ｌｉ Ｘ， Ｙｕａｎ ＦＬ．Ｉｓｉｔｎｅｃｅｓｓａｒｙｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｒａｐａｍｙｃｉｎｍｏｄｕｌａｔｅｄ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓｉｎｆｅｍａｌｅｒａｔ ［Ｊ］．ＯｓｔｅｏｐｏｒｏｓＩｎｔ，２０１６，２７ （１２）：３６６５３６６６．［１８］ＰｅｎｇＳ，Ｌｉｕ ＸＳ， Ｈｕａｎｇ Ｓ，ｅｔａｌ．Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｔｉｍｉｎｇ ｏｆｓｔｒｏｎｔｉｕｍ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｎ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎｉｎｄｕｃｅｄｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓｉｎｒａｔｓ：ｂｏｎｅｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｍｅｃｈａｎｉｃｓ ［Ｊ］．ＪＯｒｔｈｏｐＲｅｓ，２０１４，３２ （３）：４７７４８４．

摘要：现代药理研究表明，肉苁蓉具有抗疲劳、抗衰老、调节分泌代谢等作用。肉苁蓉醇提物对肾虚小鼠的作用研究多集中表现在激素水平，但未见对小鼠糖代谢的研究报道。为探究苁蓉醇提物对小鼠肾虚和糖代谢水平的影响，建立肾虚小鼠和糖尿病小鼠模型，连续灌胃21d后，检测肾虚小鼠血清激素水平，测定酶活力，取睾丸组织进行石蜡包埋切片和HE染色，观察其病理学状态。检测糖尿病小鼠体重、空腹血糖和总蛋白变化情况。结果表明：醇提物可使肾虚小鼠的体重增加，灌胃给药组超氧化物歧化酶（SOD）活力降低，显示醇提物有调节清除自由基的作用（p＜0.001）；组织切片显示，肉苁蓉灌胃给药组的生精小管内精子数增多，表示醇提物使肾虚小鼠的生精能力提高。低剂量醇提物可显著降低雌性糖尿病小鼠的血糖水平（p＜0.05），醇提物可调节糖尿病造成的总蛋白水平异常（p＜0.05）。因此，肉苁蓉醇水提取物对雄性肾虚小鼠模型具有生殖改善作用，同时对糖尿病小鼠模型的血糖水平有一定的影响。关键词：荒漠肉苁蓉；氢化可的松；肾虚；降血糖肉苁蓉产自我国西部地区沙漠地带，是一种特殊的寄生植物，含有多种活性成分，如苯乙醇苷类、环烯醚萜类、木脂素类、多糖、氨基酸、生物碱、微量元素［1-2］等。相关研究显示，肉苁蓉除了具有调节内分泌［3］、抗疲劳［4］、润肠通便［5］、神经保护［6］等作用之外，还可以起到雄性激素的作用［7］。目前，关于肉苁蓉醇提物对肾虚小鼠的作用研究主要集中于激素水平，且国内外未见研究醇提物对小鼠血糖水平的影响，只有少数研究报道包含肉苁蓉的复方药剂具有降糖作用［8-9］。2018年4月，国家卫计委将肉苁蓉（荒漠）列为药食同源的物质，大大增加了其市场与临床应用的潜力，但目前市场上关于肉苁蓉的功能产品还不是非常知名，人们对于肉苁蓉的认识并不多，主要产品仍为肉苁蓉酒［10］、茶包一类。随着中医不断被国人所重视，中药的相关基础研究也显得尤为迫切。肉苁蓉作为我国传统的名贵中药，具有广泛的研究价值和开发应用的潜力。本研究拟建立氢化可的松诱导的雄性肾阳虚小鼠，记录小鼠自灌胃肉苁蓉后的体重变化，测定血清激素水平和组织酶活力，对小鼠睾丸组织进行病理研究来探究肉苁蓉对肾虚小鼠的影响。建立链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠模型，检测小鼠自灌胃肉苁蓉后的体重和空腹血糖变化，以及血浆总蛋白含量，以探究肉苁蓉对小鼠糖代谢的影响，以期为肉苁蓉这一药食两用的植物资源的研究开发提供试验依据。1 材料与方法1.1 材料与试剂C57BL/6J雄性小鼠和ICR小鼠，购自上海西普尔-必凯实验动物有限责任公司；链脲佐菌素，上海源叶生物公司；氢化可的松，上海源叶生物公司；野生荒漠肉苁蓉，内蒙古自治区阿拉善地区；戊巴比妥钠，Sigma公司；小鼠游离血清睾酮（T）酶联免疫试剂盒、小鼠血清促性腺激素释放激素（GnRH）试剂盒和丙二醛（MDA）酶联免疫吸附测定试剂盒，均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒，南京建成有限公司；伊红溶液（B液），上海虹桥乐翔医用试剂技术有限公司；苏木素溶液，上海虹桥乐翔医用试剂技术有限公司；通用型组织固定液，武汉赛维尔生物科技有限公司；食用乙醇，江苏省华兴生物科技有限公司。1.2 仪器与设备MS32000LE 电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；TDL-5-A离心机，上海安亭科学仪器厂；HH-S恒温水浴锅，江苏国胜实验仪器厂；RE-5299旋转蒸发仪，上海况胜实业发展有限公司；-80℃低温冰箱，HARRIS公司；酶标仪（MR3），赛默飞世尔（上海）仪器有限公司；欧姆龙血糖仪HGM-121，苏州尔达医疗设备有限公司。1.3 方法1.3.1 肉苁蓉提取物的制备挑选新鲜的肉苁蓉，切片，取100g粉碎，粉碎时以料液比1∶2加入蒸馏水，打成糊状匀浆，置于冰箱冷冻存放备用。将肉苁蓉匀浆和52%的食用酒精按1∶16的比例混合，65℃水浴加热46min，8000r/min离心5min后将滤渣加入同第1次等量的酒精水溶液，同等条件再次水浴加热，2次加入的乙醇水溶液共计10000mL，将2次离心出的上清液进行浓缩，使乙醇蒸发出来，浓缩条件为旋转蒸发仪85℃加热50min，得到2200mL浓缩液，即为肉苁蓉醇提取液。1.3.2 动物模型建造及分组1.3.2.1 肾虚小鼠动物模型6周龄的C57BL/6J雄性小鼠引进后适应性饲养7d，随机选取5只小鼠作为空白对照组，每天进行灭菌生理盐水皮下注射，0.1mL/只，1d1次，连续10d。其余26只小鼠用氢化可的松皮下注射造模，按照25mg/kg BW（体重）的剂量连续注射10d［11-16］。小鼠如果有拱背蜷缩、肢尾冷、精神不振等肾虚症状，则认为氢化可的松诱导雄性小鼠肾虚模型造模成功。肾阳虚小鼠模型建造成功后，空白组和模型组给予等体积的蒸馏水灌胃，低剂量组和高剂量组分别按药物临床用药量的1倍，2倍计算，1d灌胃1次，连续灌胃21d。具体分组情况为：C0空白组（5只），以0.4mL/（kg·BW）的灌胃剂量灌服纯水；M0模型组（8只）：以0.4mL/（kg·BW）的灌胃剂量灌服纯水；M1低剂量组（9只），灌胃剂量为1.6mL/（kg·BW）的肉苁蓉醇提取液；M2高剂量组（9只），灌胃剂量为3.2mL/（kg·BW）的肉苁蓉醇提取液。1.3.2.2 糖尿病小鼠模型8周龄ICR雌性小鼠20只，雄性小鼠21只。雌雄小鼠分别随机分为：空白组（C0），模型组（M0），肉苁蓉低剂量组（M1），肉苁蓉高剂量组（M2），每组各5只或6只，每组灌胃剂量同肾虚组。除空白组（C0）外，其余小鼠8周龄开始每日喂高脂饲料，喂28d后（11周龄）注射链脲佐菌素［17-19］120mg/（kg·BW），造模前将ICR小鼠禁食12h。72h后采血测定空腹血糖（前一晚动物禁食）。第1次测血糖未达标，12周龄重复1次实验（注射时间点、剂量均一致），空腹血糖≥11.1mmol/L视为糖尿病动物模型造模成功。1.3.3 主要检测指标的测定每周测量小鼠的体重，每周对ICR小鼠剪尾取血，用血糖检测系统测定空腹血糖水平，并比较各组差异。灌胃实验结束后，心脏采血，血液以3500r/min离心15min。血清分离后，用ELISA法检测C57BL/6J小鼠血清中睾酮（T）、促性腺激素释放激素（GnRH）的激素水平。小鼠断头处死后，速取睾丸组织，称重，以组织重：生理盐水（mg∶mL）=1∶0.9，离心15min，组织上清液冷冻保存备用，酶联免疫吸附测定睾丸组织丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）酶活力，操作均严格按照试剂盒说明进行。ICR小鼠每组抽取3~4个样品取其血浆送往上海实验动物研究中心，对总蛋白水平（TP）进行检测。1.3.4 苏木素-伊红（HE）染色小鼠取血完毕后立即处死小鼠，立即取出睾丸和附睾，将其分别精确称重。小鼠睾丸组织取材后，石蜡包埋切片，再用苏木精染液染色2min使细胞核呈蓝色，0.1％伊红染液染色2min，使细胞质呈红色。1.3.5 统计分析数据以平均值±标准误差（Xˉ±S）表示，显著性标准为P＜0.05，极显著性指标为P＜0.01，组间差异的统计学意义采用ANOVA（单因素方差分析）中的LSD（最小显著差法）和Duncan（多范围检验法），数据用SPSS22.0软件处理。各组数据取试剂盒灵敏度范围内的，超出范围部分的数据应舍去。2 结果与分析2.1 肉苁蓉醇提物对雄性肾虚小鼠的影响2.1.1 小鼠体重的变化由图1可知，在注射氢化可的松造模后，模型组M0的体重增长小于空白组C0，提示雄性小鼠肾虚模型建造成功，为以后的实验打下基础。给药组在10周龄之后体重出现增长，低剂量组M1的体重增长1.54g，高剂量组M2的体重增长1.09g，而空白组C0增长0.95g，提示肉苁蓉提取物可能有促进雄性肾虚小鼠体重增加的作用，但是各组之间差异不显著。2.1.2 睾酮（T）检测结果与模型组相比，本试验小鼠睾酮组间差异显著性为p＞0.05，没有统计学意义。由图2可知，模型组M0小鼠睾酮水平与C0相比没有太大变化，与M0相比，低剂量组M1小鼠睾酮降低，高剂量组M2小鼠睾酮水平均值（2.71ng/mL）将近M0的3倍（1.07ng/mL），说明高剂量的肉苁蓉提取物对雄性小鼠的睾酮具升高作用，对肾虚小鼠的雄性激素有促进分泌的作用，而低剂量的肉苁蓉提取物却呈现对小鼠雄性激素的分泌有抑制的拮抗作用。2.1.3 促性腺激素释放激素（GnRH）检测结果小鼠促性腺激素释放激素各组间差异显著性为p=0.342＞0.05，即本次试验小鼠各组间促性腺激素释放激素无显著性差异，不具有统计学意义。由表1和图3可知，与模型对照组M0相比，肉苁蓉提取物使给药组小鼠M1、M2的促性腺激素释放激素升高，提示肉苁蓉提取物可能促进肾虚小鼠释放促性腺激素释放激素，促进雄性激素分泌，且高剂量组M2的促进效果更强。2.1.4 丙二醛（MDA）检测结果经SPSS差异显著性分析得出，各组间差异显著性p＞0.05，不具有统计学意义。由由表2和图4可知，模型对照组M0的丙二醛含量比空白组C0的更高，即肾虚小鼠的丙二醛含量升高，说明机体的膜脂过氧化程度升高，组织抗氧化程度降低。与M0相比，给药组M1、M2的MDA含量降低，说明肉苁蓉提取物能清除脂质氧化反应的终产物丙二醛，使膜系统得到一定程度的恢复。2.1.5 超氧化物歧化酶（SOD）检测结果SOD各组间差异显著性为p＜0.01。由图5和表3可知，模型组M0与低剂量组M1的差异显著性为p＜0.05，C0组与各组间差异显著性均为p＜0.05。肾虚小鼠SOD的活力显著增加，为空白组的2.5倍，可能是由于氢化可的松这种激素引起的小鼠SOD活力的显著改变。肉苁蓉提取物对肾虚小鼠的SOD活力有一定降低作用，说明肉苁蓉提取物可以使小鼠SOD的活力趋于正常水平，说明其对小鼠体内自由基代谢状态有一定调节作用。2.1.6 睾丸组织病理学影响10倍光学显微镜下观察睾丸和附睾病理组织切片，其结果如图6所示。由图6可知，正常组C0小鼠睾丸生精小管基膜完整，膜内可见致密且结构正常的细胞，树枝状的支持细胞较多，生精能力强，生精小管管腔内可见大量精子。模型对照组M0小鼠生精小管基膜变薄，基膜内间质细胞排列不整齐，支持细胞减少，腔内间质出现较大空隙，腔内精子减少。与M0组相比，肉苁蓉给药组M1、M2小鼠睾丸生精小管基膜较完整，支持细胞较多，间质细胞排列较规整，精子数增多，生精小管管腔内间质的空隙相对于模型组都有一定程度的减小。2.2 肉苁蓉醇提物对小鼠糖代谢的影响2.2.1 肉苁蓉醇提物对小鼠体重的影响2.2.1.1 肉苁蓉醇提物对雄性糖尿病小鼠体重的影响在连续21d喂养高脂饲料后，雄鼠体重在不断增加。第1次和第2次注射链脲佐菌素（11周龄和12周龄）后，进行灌胃，M1组体重在实验期间不断下降（p＜0.05），说明低剂量组可以显著降低糖尿病小鼠的体重，M2与M0组相比体重变化趋势基本一致（见图7）。而M0组体重与C0组相比更大，这可能是在实验过程中小鼠发育不均的原因，有待进一步研究。2.2.1.2 肉苁蓉提取物对雌性糖尿病小鼠体重的影响连续21d喂养高脂饲料后，雌鼠体重不断增加，在第1次和第2次注射链脲佐菌素（11周龄和12周龄）后，所有雌鼠体重都在缓慢下降。灌胃后，与M0组相比，M1组显著降低了小鼠的体重下降率（p＜0.05），M2组极显著降低了小鼠的体重下降率（p＜0.01）（见图8）。2组相比，M2组的改善效果最佳。2.2.2 肉苁蓉醇提物对小鼠空腹血糖水平的影响2.2.2.1 肉苁蓉醇提物对雄性糖尿病小鼠空腹血糖的影响从表4可以看出，与C0比较，M0组血糖并没有升高，说明与M0组相比，M1组在灌胃7d后空腹血糖下降8.45%，在灌胃14d后空腹血糖水平下降1.03%，在灌胃21d后空腹血糖水平下降3.58%。由此可以看出，M1组对雄性糖尿病小鼠表现出降糖作用，但差异不显著。与M0组相比，M2组在灌胃7d后空腹血糖下降2.82%，在灌胃14d后空腹血糖水平升高28.52%（p＜0.05），灌胃21d后空腹血糖水平升高52.88%（p＜0.01）。这可能是因为肉苁蓉提取物浓度过高而使小鼠在灌胃14d后血糖恢复到之前的水平，有待进一步研究分析。2.3.2.2 肉苁蓉提取物对雌性糖尿病小鼠空腹血糖的影响从表5可以看出，试验开始时，M1、M2组与M0组雌性小鼠空腹血糖含量无显著差异。与M0组相比，M1组在灌胃1周后空腹血糖升高24.66%（P＜0.01），在灌胃14d后空腹血糖水平下降14.95%（p＜0.01）。与M0组相比，M2组在灌胃7d后空腹血糖升高20.09%（p＜0.05），在灌胃14d后空腹血糖水平下降12.77%（p＜0.05），推测肉苁蓉提取物在一定时间内对血糖有显著的降糖效果。3 讨论（1）探究肉苁蓉醇提物对肾虚小鼠的作用研究显示，从小鼠的体重变化来看，模型组小鼠的体重增加较空白组更为缓慢。肉苁蓉醇提物灌胃给药21d后，给药组小鼠体重的增加均大于空白组和模型组，提示肉苁蓉对肾虚小鼠有一定的治疗作用。从血清激素水平来看，肉苁蓉提取物可能提高了睾丸的生精能力。超氧化物歧化酶（SOD）各组间差异显著性为p＜0.01，说明肉苁蓉提取物可以调节小鼠自由基的代谢水平。从组织病理学的角度来看，观察睾丸病理组织切片，肉苁蓉给药组M1、M2小鼠睾丸生精小管管腔内间质的空隙相对于模型组都有一定程度的减小，说明肉苁蓉提取物对肾虚小鼠具有一定的治疗作用。但丙二醛、睾酮和促性腺激素释放激素水平均无显著变化，说明肉苁蓉粗提物在对这些激素的调控作用不够特异，在体综合调节作用掩盖了其疗效的显著呈现。（2）探究肉苁蓉醇提物对小鼠糖代谢的作用研究显示，对于雌性糖尿病小鼠，与M0组相比，M1组体重显著增加（p＜0.05），M2组体重极显著增加（p＜0.01），说明肉苁蓉醇提物能增加糖尿病小鼠的体重。空腹血糖水平变化来看，对于雄性糖尿病小鼠，灌胃过程中，低剂量组对雄性糖尿病小鼠表现出降糖作用（p＜0.05）。但M2组小鼠在灌胃两周后空腹血糖水平明显升高，这可能是肉苁蓉浓度过高引起的，有待于后续的进一步研究。对于雌性糖尿病小鼠，M1组和M2组均在灌胃两周后表现出降糖作用（p＜0.05），但在灌胃21d后血糖又升高到灌胃之前的水平，推测是由于肉苁蓉醇提取物在一定时间内对血糖有显著的降糖效果，但效果不稳定。接下来，需要对不同浓度和更长时间的灌胃实验进行进一步研究，以明确肉苁蓉提取物的降血糖和改善肾虚的作用机制。参考文献［1］Wang Ye，Zhang Li，Du Zhixia，et al.Chemical Diversity and Pre⁃diction of Potential Cultivation Areas of Cistanche Herbs.［J］.Pubmed，2019，9（1）.［2］Qi Xin，Wang,Jianteng，Dong,Wenji，et al.Phenylethanol glycosidesfrom Cistanche tubulosa improved reproductive dysfunction by reg⁃ulating testicular 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摘要：目的：研究肉苁蓉醇溶成分对D－半乳糖所致衰老大鼠模型肝线粒体的保护作用。方法：用D－半乳糖制备衰老模型大鼠，连续灌服肉苁蓉醇溶成分6周，测定肝脏Ca2＋－ATP 酶活性、肝线粒体MDA 含量、膜流动性、PLA2 活性。结果：肉苁蓉醇溶成分显著提高衰老模型大鼠肝脏Ca2＋－ATP 酶活性，肝线粒体膜流动性（ P ＜0．01） ，显著降低肝线粒体MDA 含量、PLA2 活性（ P ＜0．01） ，但各指标不能恢复到青年组水平。结论：肉苁蓉醇溶成分对衰老模型大鼠肝线粒体具有保护作用，是其抗衰老作用的有效成分。关键词：肉苁蓉；致衰大鼠；肝线粒体肉苁蓉又名苁蓉、大芸、金笋、地精［1］，为列当科植物肉苁蓉（ Cistanvhe deseticola Y C Ma） 的带鳞片的干燥肉质茎。始载于《神农本草经》，列为上品，《本草经疏》、《本草汇言》、《月华子本草》等也多有记载。李时珍曰：“此物补而不峻，故有从容之兮。”肉苁蓉味甘、咸，性温，主产于我国的内蒙古、新疆、甘肃、青海、陕西等省区，具有补肾阳、益精血、润肠通便的功能，在我国已有两千多年的使用历史，现代药理学表明，肉苁蓉除作为传统的补肾壮阳中药外，更兼具有抗衰老、增强记忆、提高免疫力等多种功能。但有关肉苁蓉醇溶成分对D－半乳糖致衰大鼠肝脏Ca2＋－ATP 酶活性以及肝线粒体MDA 含量、膜流动性和PLA2 活性的影响未见报道。本实验通过肉苁蓉醇溶成分对致衰大鼠肝脏线粒体保护作用的研究以期进一步探讨肉苁蓉的抗衰老的有效成分。1 实验材料1．1 动物纯系Wistar 大鼠30只，3～4月龄，体重180～210g，雌雄各半，由黑龙江省佳木斯大学实验动物中心提供。1．2 药剂制备肉苁蓉，由佳木斯药材公司提供。取肉苁蓉400g 用水浸泡30min，超声提取两次，每次30min，抽滤器抽滤后合并滤液，加乙醇反复多次沉淀，将乙醇溶解部分减压浓缩至无醇味，4℃贮存，临用时配成所需浓度使用。1．3 主要仪器、试剂仪器：岛津RF－5000型荧光分光光度计；赛多利斯PP－25型高灵敏度pH 计；GL－21M 高速冷冻离心机；722光栅分光光度计等。试剂：1，6－二苯基－1，3，5－己三烯（ DPH）由Sigma 公司提供；去氧胆酸钠由Amresco 公司提供；MDA试剂盒、活性氧试剂盒、Ca2＋－ATP 酶试剂盒、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒、双缩脲蛋白测定试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供；D－半乳糖（ D－gal） 由上海试剂二厂提供。2 实验方法2．1 动物分组、给药及处理将30只大鼠随机分为3组，青年对照组、衰老模型组和模型给药组，每组10只。青年对照组每日上午皮下注射生理盐水，同时灌服温开水；衰老模型组每日上午按50mg／kg 剂量皮下注射D－gal，同时灌服温开水；模型给药组每日上午按50mg／kg 剂量皮下注射D－gal，同时按生药量2g／kg 灌服肉苁蓉醇溶成分。连续给药6周后，将动物处死，取材。2．2 肝匀浆及肝线粒体制备参照南京建成生物工程研究所提供的实验方法学，取肝脏1g 左右，用冷生理盐水漂洗，拭干称重，加入9倍体积预冷的匀浆介质，用电动匀浆机充分磨碎得肝组织匀浆，将肝组织匀浆3000r／min，离心10min，取上清液冻存待测。再按上述方法制备肝匀浆，取肝匀浆2000r／min 离心10min，弃沉淀，上清液在高速冷冻离心机中10000r／min 离心15min，沉淀物即为线粒体，将线粒体悬浮于介质中，进行指标测定。2．3 指标测定肝组织Ca2＋－ATP 酶活性、肝线粒体丙二醛（ MDA） 含量测定按试剂盒说明进行，Ca2＋－ATP 酶活性定义为每小时每毫克组织蛋白的ATP 酶分解ATP 产生1μmol 无机磷的量为一个ATP 酶活力单位。肝线粒体膜流动性、磷脂酶A2 活性测定参照文献方法进行［2，3］。线粒体膜流动性的大小通过肝线粒体膜的荧光偏振度（ P） 的高低表示，P 越高，膜流动性越小，反之，P 越低，则膜流动性越大。2．4 统计学分析实验数据以均数±标准差（ x ± s） 表示，应用SPSS11．5统计学软件进行统计学分析。3 结果肉苁蓉醇溶成分显著提高衰老模型大鼠肝脏Ca2＋ －ATP 酶活性，肝线粒体膜流动性（ P ＜0．01） ，显著降低肝线粒体MDA 含量、PLA2 活性（ P ＜0．01） ，但其并不能使所有指标恢复到青年组水平，见表1。4 讨论衰老是一种非常复杂的生物学过程，是机体在退化时期功能下降及生理紊乱的综合表现。近年来，研究发现在细胞、组织、器官衰老过程中，线粒体氧化损伤和功能的改变有着重要的作用和意义［4］。线粒体是细胞内重要的细胞器，是生成ATP 的主要场所。但是一旦线粒体受损，它还可以进一步引起机体自由基平衡的破坏，逐步导致全身性生理功能的下降。在生物体内，90％以上的氧分子在线粒体中被消耗，在生物氧化反应过程中，氧作为一种必需物质，一方面是维持生命能量代谢过程的重要成分；另一方面，氧可通过一系列化学反应生成有害的氧自由基，造成细胞损伤和机体衰老［5］。实验表明，衰老时细胞内，尤其是线粒体SOD 活性下降，MDA 含量增加［6］。自由基和活性氧直接或间接启动膜脂的过氧化作用对机体产生伤害，导致膜的损伤和破坏，严重时导致细胞死亡。本实验结果表明，衰老时机体抗氧化能力下降，氧自由基在细胞内堆积损伤生物膜。由于线粒体膜直接接触活性氧，受到直接攻击，使膜脂质氧化形成大量过氧化脂质及丙二醛，而Ca2＋－ATP 酶活性的下降使胞浆Ca2＋浓度升高，Ca2＋是PLA2 的激活剂，导致线粒体PLA2 活性的升高。PLA2 会从不同方面造成线粒体功能下降进而影响机体正常功能：①水解自身磷脂使线粒体膜骨架脆性增加，产生大量自由基，导致膜受损，通透性增加；②改变膜磷脂的成分，影响膜流动性；③降解磷脂的产物损害呼吸链，影响氧化磷酸化并造成线粒体不可逆损伤［7］。④造成质子跨线粒体内膜转运能力下降及H＋－ATP 酶活性下降［8］。本研究发现，衰老大鼠肝线粒体膜流动性较青年组显著下降，证实衰老时会出现线粒体膜流动性的改变。其机制可能是：①氧自由基的作用：衰老大鼠肝脏抗氧化能力下降，自由基的增多会引起线粒体膜蛋白分子及脂质分子化学结构及构象的改变，并改变分子间的排列和相互作用，导致线粒体膜流动性降低；②脂质过氧化的作用：MDA 是脂质过氧化的主要产物，它能进入水相和膜蛋白、膜脂上的NH2 交联形成Schiff’s 碱而降低膜流动性［9］。③PLA2 活性的提高：PLA2 活性的提高必将导致膜磷脂水解，改变膜磷脂成分，进而改变膜结构导致膜流动性下降。本实验结果显示，肉苁蓉醇溶成分可提高肝脏Ca2＋－ATP 酶活性，肝线粒体膜流动性，降低肝线粒体MDA含量、PLA2 活性，但其并不能使各指标达到青年组水平。肉苁蓉醇溶成分具有提高免疫能力和雄性激素样作用［10］，本实验发现其也具有一定的抗衰老作用，估计可能是其中所含的黄酮类和苷类化合物使自由基生成减少，减轻自由基的损伤作用，保证Ca2＋－ATP 酶的活性，避免线粒体PLA2 活性的升高，从而减少了降低线粒体膜流动性各种因素的影响，使线粒体膜流动性保持正常，保证了线粒体的功能。但其并不能使各指标达到青年组水平，也表明单纯的肉苁蓉醇溶成分并不能起到很好的抗衰老作用，它可能会与肉苁蓉的其它有效成分共同发挥作用。参考文献：［1］中国卫生管理局．中华人民共和国药典（ 第1部） ［M］．北京：化学工业出版社，2000，103［2］邵擎东，肖建如，杨金华，等．颈髓损伤对颈髓细胞线粒体膜流动性与线粒体呼吸功能的影响［J］．中华创伤杂志，2000，16（8） ：469－470［3］陈思锋，吴中立．体液和组织磷脂酶A2简便快速测定法［J］．第二军医大学学报，1989，10（3） ：254－256［4］ Ames BN，Shigenaga MK，Hagen TM．Mitochondrial decay inaging［J］．Biochim Biophys Acta，1995，1271（1） ：165－170［5］赵云罡，徐建兴．线粒体、活性氧和细胞凋亡［J］．生物化学与生物物理进展，2001，28（2） ：168－171［6］Vohra BP，Sharma SP，Kansal VK．Age－dependent variations inmitochondrial and cytosolic antioxidant enzymes and lipidperoxidation in different regions of central nervous system ofguinea pigs［J］．Indian J Biochem Biophys，2001，38（5） ：321－326［7］梁晚益，黄跃生，杨宗城．严重烧伤早期心肌线粒体磷脂变化及其机制［J］．中华创伤杂志，2001，17（7） ：416－419［8］陆松敏，杨鹤鸣，宋双明，等．LPS、PLA2 及氧自由基对线粒体跨膜质子转运和H＋ －ATPase 的影响［J］．第三军医大学学报，1998，20（4） ：329－332［9］林克椿，聂松青．细胞膜的流动性［J］．生理科学进展，1985，16（1） ：83－89［10］何伟，舒小奋，宗桂珍，等．肉苁蓉炮制前后补肾壮阳作用的研究［J］．中国中药杂志，1996，21（9） ：534－537

肉苁蓉具有补肾益精作用，用于治疗阳萎和不育症。本研究从肉苁蓉中分离得到1 个新化合物和13个已知化合物。干燥的肉苁蓉全株（10kg）用甲醇提取，提取物用水混悬，依次用乙醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取。乙酸乙酯萃取物用Wakosil 40C18 进行中压柱层析，乙腈-水-乙酸（10∶89∶1→60∶39∶1）洗脱，得到E-1～E-9 共9 个部分。其中E-2（0.2g）经中压柱层析，凝胶过滤及制备HPLC，得到化合物3（106 mg）。E-3 以同法得到化合物5（38 mg）、6（55 mg）和7（600 mg）。从E-4～E-6 部分分别得到化合物1（80mg）、2（232 mg）和9（150 mg）。正丁醇萃取物（495.0 g）溶于水中，经DiaionHP-20 柱层析，用10%、20%、40%、60% 和100% 甲醇洗脱，依次得到B-1～B-5 共5 个部分。其中B-1（28.1g）经Cosmosil 75C18-OPN 柱层析、中压柱层析和凝胶过滤，得到化合物12（226 mg）、13（608 mg）和14（94 mg）。B-2（9.3g）经中压柱层析和凝胶过滤，得到化合物4（113 mg）、10（853 mg）和11（309mg）。B-4（12.9g）以同法得化合物2（108 mg）。新化合物1 为无定形粉末，IR 显示有羟基及芳环存在。UV 最大吸收在219、290、331nm。负离子LC/MS 谱显示m/z 637（[M-H]－）。其酸水解产物的TLC 表明存在葡萄糖、鼠李糖、咖啡酸及3-甲氧基-4-羟基苯乙醇。通过NMR 等检测，确定其结构为2-(4-羟基-3-甲氧苯基)-乙基1-O-L-吡喃鼠李糖基(1→3)-(6-O-咖啡酰)-β-D-吡喃葡糖苷，命名为异肉苁蓉苷C（isocistanoside C）。其他已知化合物为：肉苁蓉苷C、异阿克替苷、阿克替苷、紫丁香苷A 3'-α-L-吡喃鼠李糖苷、异紫丁香苷A 3'-α-L-吡喃鼠李糖苷、2'-乙酰基阿克替苷、osmanthuside B、tubuloside B、海胆苷、肉苁蓉苷A、肉苁蓉苷F、6-脱氧梓醇、8-表马钱子酸。

[ 关键词] 1-甲基-4-苯基吡啶离子;campneoside Ⅱ ;肉苁蓉/ 药理学;神经毒素类;细胞凋亡/药物作用[ 摘　要] 目的:建立1-甲基-4 苯基吡啶离子( 1-methyl-4-phenylpyridinium ion, MPP+) 诱导的大鼠小脑颗粒细胞凋亡模型, 探讨肉苁蓉成分是否对MPP+诱导的大鼠小脑颗粒细胞凋亡有保护作用。方法:用肉苁蓉成分预先孵育大鼠小脑颗粒细胞, 经MPP+处理这些细胞后, 用甲基绿-派诺宁染色、DNA 凝胶电泳、流式细胞术检测。结果:浓度为50 μmol·L-1MPP+使小脑颗粒细胞发生典型的凋亡, 25 mg·L -1campneoside Ⅱ 具有抗凋亡作用。结论:以M PP+为诱导剂建立的大鼠小脑颗粒细胞凋亡模型, 可用于研究与帕金森病( Parkinson' s disease, PD) 有关的细胞凋亡的调控机制和筛选抗PD 药物, 中药肉苁蓉成分campneoside Ⅱ 对神经毒素MPP+诱发细胞凋亡具有明显的保护作用。　用神经毒素1-甲基4-苯基-1, 2, 3, 6-四氢吡啶( 1-methyl-4-pheny l-1, 2, 3, 6-tet rahydropy ridiniumion, MPTP+) 制作的帕金森病( Parkinson' s disease,PD) 样动物模型常用于抗PD 药物的研究和开发[ 1] 。MPTP 在脑中被单胺氧化酶氧化成活性代谢衍生物1-甲基-4-苯基吡啶离子( 1-methyl-4-phenylpy ridinium ion, MPP+) , MPP+可以导致多巴胺能神经细胞损伤。近年研究表明, PD 的病理过程中存在细胞凋亡机制[ 2] 。为建立与PD 有关的神经细胞凋亡模型, 筛选中药抗凋亡剂, 本研究以MPP+为凋亡诱导剂, 用甲基绿-派诺宁染色, DNA凝胶电泳, 流式细胞术检测MPP+诱发的大鼠小脑颗粒细胞。并对临床常用的补肾中药肉苁蓉成分campneoside Ⅱ( 图1) 等进行了筛选。1 　材料与方法1 .1 　动物7 ～ 8 d Wistar 大鼠, 北京大学医学部实验动物科学部提供。1 .2 　试剂MEM 培养基( Gibco) , 蛋白酶K ( Merck) , 多聚赖氨酸( 相对分子质量大于30 ×103, Sigma) , 碘化丙啶( propidium iodide, PI) 及MPP+( Sigma) , 其余试剂为国产分析纯。肉苁蓉成分campneoside Ⅰ ,campneoside Ⅱ, acteoside 由本院天然药物学系宋志宏博士提供。1 .3 　仪器CO2 培养箱( 美国Precision Scientif ic) , JJT-900型超净工作台( 北京半导体设备一厂) , 倒置显微镜( 重庆光学仪器厂) , 高速低温离心机( 美国So rvall) ,紫外荧光观察照像仪、DNA 电泳仪( 北京六一仪器厂) 。FACS Calibur 流式细胞仪( USA) , 凋亡分析采用ModFit LT 软件。1 .4 　方法1 .4 .1 　小脑颗粒细胞的培养与药物处理[ 3, 4]7 ～ 8 d Wistar 大鼠, 常规消毒后, 无菌分离小脑颗粒细胞, 1 000 ×g 离心5 min, 沉淀悬浮于含10 %( 体积分数) 小牛血清MEM 培养液中, 细胞计数后,2 ×109cells·L-1接种于预先经5 mg ·L-1多聚赖氨酸铺板的培养皿或培养瓶。置于37 ℃含5 %( 体积分数) CO2 培养箱中培养, 24 h 后更换含10μmol·L-1阿糖胞苷的培养液, 以抑制非神经细胞的增殖, 分为空白对照组, 模型组和药物组。培养第3天药物组分别加入肉苁蓉成分25 mg·L-1 campneosideⅠ , 25 mg ·L-1 campneoside Ⅱ, 25 mg · L-1acteoside, 培养第4 天, 模型组和药物组分别加50μmol ·L-1 MPP+溶液, 空白对照组加等体积的培养基, 37 ℃ 含5 %( 体积分数) CO2 培养箱中继续培养, 观察12 、24 、48 、72 h 不同组别细胞生长状况, 并进行以下检测。1 .4 .2 　MPP+诱导凋亡的检测凋亡细胞的形态学观察:将细胞培养在盖玻片上, 培养第4 天, 加50 μmol·L-1MPP+溶液, 于24 、48 、72 、96 h 后, 用PBS 洗涤2 次, 细胞置于Carnoy液[ 无水乙醇∶氯仿∶冰醋酸, 体积比为6∶3∶1] 固定3min, 用甲基绿-派诺宁染色液染色3 ～ 5 min[ 5, 6], 丙酮脱水, 二甲苯透明, 中性树胶封片, 光镜下做凋亡细胞的形态学观察。凋亡细胞DNA 电泳[ 7, 8] :小脑颗粒细胞培养方法同上。加50 μmol·L-1 MPP+溶液后, 分别于24 、48 、72 h 收集模型组、药物组和对照组细胞3 ×109cells·L-1, 预冷PBS 洗2 次, 用适量细胞裂解液悬浮细胞, 加蛋白酶K 使其终质量浓度为200 mg·L-1,37 ℃水浴过夜, 加入等体积饱和酚溶液, 抽提2 次,加入2 倍体积无水乙醇混匀, 再加入1/10 倍体积3mol·L-1醋酸钠溶液混合, -20 ℃放置2 h, 105 ×g离心10 min 沉淀DNA, 弃无水乙醇后用70 %( 体积分数) 乙醇漂洗两次, 沉淀溶于适量TE 缓冲液中,再加入25 μl RNA 酶( 10 g·L-1) 放置37 ℃ 30 min,加热68 ℃ 10 min, 以除去RNA 。置4 ℃冰箱保存备用, 提取产物进行DNA 琼脂糖凝胶电泳( 60 V,1 .5 h) , 以检测MPP+诱导细胞凋亡中所产生的DNA 梯状裂解。流式细胞仪分析:用流式细胞仪定量检测细胞凋亡的百分率[ 9] 。收集对照组、模型组、药物组不同时间的细胞1 ×109cell·L-1, 用PBS 离心( 500 ×g, 5 min) 洗涤2 次弃上清, 加入70 %( 体积比) 乙醇1 .0 ml 。500 ×g 离心5 min 洗涤制成单细胞悬液,每毫升细胞悬液加PI( 1 g·L-1) 100 μl 染色, 暗室放置30 min 后, 用流式细胞仪检测, 实验数据经凋亡分析软件ModFit LT 处理。凋亡细胞乳酸脱氢酶( LDH) 的测定[ 7] :以培养神经细胞释放LDH 的量作为定量评价细胞损伤程度的指标。测定培养液中LDH 活性, 并将相应的培养细胞置于-20 ℃, 3 h 以上, 溶解后以同法测定总LDH 。细胞损伤程度以培养细胞释放的LDH 占总LDH 活力的百分比LDH %表示。2 　结果2 .1 　诱发细胞凋亡的形态学观察在显微镜下可见MPP+诱发的凋亡细胞较正常细胞明显缩小, 约为正常细胞的1/3, 胞膜皱缩不规则, 染色体凝聚成颗粒状或团块状, 形成凋亡小体( 图略) , 该形态学改变为凋亡细胞所特有。2 .2 　campneoside Ⅱ 抑制凋亡DNA 梯状裂解( 图2)细胞凋亡的生化标志是DNA 被有规律切割,在凝胶电泳上形成相隔约200 bp 阶梯状条带( DNAladder) , 观察50 μmol·L-1MPP+作用24 、48 、72 h的电泳结果, 均看到DNA 梯带, 24 h 出现DNA 梯状条带, 而48 h 梯状条带最明显, 在48 h 加25mg·L-1campneoside Ⅱ 药物组DNA 梯状裂解消失。2 .3 　campneoside Ⅱ抑制细胞凋亡率在流式细胞仪测定中, 50 μmol·L-1 MPP+作用12 h 就有明显的诱发凋亡的作用, 此时在G1 期前就出现低于二倍体的凋亡峰, 根据峰值的高低定量细胞凋亡的百分率, 加入50 μmol·L-1 MPP+12 ～48 h, 凋亡细胞数从31 .9 %上升至67 .9 %, 呈增强趋势( 图3) , 48 h 细胞凋亡率最大, 与DNA 凝胶电泳结果一致。利用此方法, 我们观察了肉苁蓉成分campneoside Ⅱ 对小脑颗粒细胞凋亡的影响, 25mg·L-1campneoside Ⅱ( 终浓度) 和小脑颗粒细胞预先孵育24 h, 然后用50 μmol·L-1 MPP+致凋亡,之后12 h 可见campneoside Ⅱ有弱的抗凋亡作用,致凋亡48 h 后药物作用最强, campneoside Ⅱ 明显抑制细胞凋亡率, 细胞凋亡的亚二倍体峰变小。2 .4 　campneoside Ⅱ抑制细胞LDH 漏出率经MPP+处理48 h 后, 细胞LDH 漏出率显著增加, campneoside Ⅱ可降低LDH 漏出率, 而campneosideⅠ和acteoside 不影响LDH 漏出率( 表1) 。3 　讨论本文采用原代培养的大鼠小脑颗粒神经元, 以MPP+诱导神经元凋亡, 然后从细胞核形态观察、DNA 裂解的凝胶电泳分析及流式细胞仪凋亡峰的定量分析等方面均证明MPP+诱导的小脑颗粒神经元死亡是典型的细胞凋亡。虽然小脑不是MPTP毒性的最初靶标, 但MPTP 也作用于小脑[ 10] 。由于MPTP 需从国外购买, 价格昂贵, 而且用MPTP制作动物模型用药量大, 成功率仅达30 %左右, 为开展抗PD 的药物研究带来困难。细胞凋亡是PD发病机制中必不可少的环节, 我们建立的该细胞模型, 具有简便、可靠的特点, 为从中草药及合成化合物中筛选抗PD 剂提供了新方法、新途径。　我们用以上方法观察到campneoside Ⅱ具有拮抗MPP+诱导的小脑颗粒细胞凋亡的作用。虽然肉苁蓉成分campneoside Ⅰ 、campneoside Ⅱ 和acteoside都是苯乙醇甙类化合物, 结构相似。但在LDH漏出率的测定中, campneoside Ⅱ 的作用较强, 而campneoside Ⅰ和acteoside 的作用较弱, 这可能与这些化合物对细胞膜通透性的差异有关。有文献[ 11]报道acteoside 对细胞膜的通透性较弱。肉苁蓉为历代补肾壮阳处方中使用频度最高的补益药物之一, 具有明显的抗疲劳、抗老年痴呆、抗衰老等作用。陈建宗等[ 12] 用含有肉苁蓉的平颤一号口服液治疗PD, 获良好效果, 我们研究了肉苁蓉成分campneoside Ⅱ抗PD 细胞模型的凋亡作用, 为抗凋亡剂用于预防和延缓PD 等中枢神经退行性疾病提供实验依据, 但其抗凋亡机制有待进一步研究。参考文献1 Garcia E, Rios C, Sotelo J .Vent ricular injection of nerve growthf act or increases dopamine content in the st riata of MPTP-t reat edmice[ J] .Neurochem Res, 1992, 17 :979-9822 Bruno D, Ann MM, Richard JY .Apopt osis and DNA degradationinduced by 1-methyl-4-phenylpy ridinium in neurons[ J] .BiochemBiophys Res Commou, 1991, 181 :1442-14483 Levi G, Aloisi F, Ciot ti M T, et al .Autoradiographic locali zationand depolarizat ion induced release of acidi c amino acids in diff erent iatingcerebellar granule cell cultures[ J] .Brain Res, 1984, 290:77-864 鄂　征.基本培养技术, 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and lipopolysaccharide-induced liver injury[ J] .Lif e Sci, 1999, 65, ( 4) :421-43012 陈建宗, 江　文, 吴宝仁, 等.平颤1 号口服液治疗帕金森病40例[ J] .安徽中医学院学报, 1999, 18( 2) :9-11

张春玲，许新兵，任小娜（酒泉职业技术学院化学工程系，甘肃 酒泉 735000）摘要：本研究建立了紫外-可见分光光度法测定肉苁蓉中多酚类物质（以没食子酸计）含量的方法。当乙醇浓度为70％、温度为60℃、提取时间为30min，料液比为1：20时，肉苁蓉中多酚类物质（以没食子酸计）的提取效果最好。同时肉苁蓉样品中多酚类物质（以没食子酸计）的平均质量百分比为0.2422％。精密度、稳定性和加标回收结果显示该方法可行可靠。关键词：肉苁蓉；紫外-可见光分光光度法；多酚类物质；没食子酸中图分类号：TU991.2 文献标识码：A 文章编号：1009-8143（2019）02-0052-06Doil:10.3969/j.issn.1009-8143.2019.02.12Extraction and Determination of Polyphenols from CistancheZhang Chun-ling,Xv Xin-bing,Ren Xiao-naCJinquan Vecational Technical College.Jiuquan,Gamu 735000,China)Abstract:A method for the determination of polypbenols in Citanche wa established by ultravinlet-visible spectropbotom-ety.The resuls indicate that the estraction iate is best when the concentration of ethanol is 70%:the temperature is 60* C:the extraction time is 30min:the ratie of material to liquid is 1:20.Meaehile,the avenge mass percentage of polyphe-nals in Citanche dese ticola samples is 0.2422.The esults of precision,stability and recovery show that the method is feasible and reliable.Key words:Cistanche:Uaviolet-visille spectrophotometry:Polyphenols;Gallieacid肉苁蓉素有“沙漠人参”之美誉，它具有改善性功能障碍、抗衰老、抗疲劳、抗阿尔兹海默症等效用，具有极高的药用价值，是中国传统的名贵中药材。同时肉苁蓉还可入菜，李保定研究出具有独特风味的肉苁蓉炖鸡滋补类菜肴。主要产于甘肃、新疆等地。植物单宁，又称植物多酚，是一类广泛存在于植物体内的多元酚化合物，是植物的次生代谢产物，大部分存在于植物的果皮中”。多酚具有抗病作用、抗衰老、抗氧化、抗癌防癌、抗诱变、抗病毒、抗微生物、减缓骨质疏松、健齿、降血脂和血糖等很多方面具有良好的作用。植物总多酚常用的含量测定方法有高锰酸钾法、紫外-可见光分光光度法、原子吸收光度法、化学发光发等，本实验对紫外-可见光分光光度法进行了研究，以没食子酸为标准品，确定了肉苁蓉提取的最佳条件（乙醇含量、料液比、提取时间、提取温度），并对肉苁蓉中多酚的含量进行了测定。1 仪器与试剂仪器：756型紫外-可见分光光度计（上海旦鼎国际贸易有限公司）、1cm石英比色（宜兴创新光学玻璃有限公司）、KH3200DB数控超声波清洗器（上海双旭电子有限公司为）、HH-4数显恒温水浴锅（聚创环保）、电子天平（梅特勒-托利多）、TG16高速台式离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）。试剂：肉苁蓉（甘肃省酒泉市瓜州县）、没食子将在阴暗通风处进行自然风干的肉苁蓉原料进行粉碎后过40目筛。然后准确称取粉末状肉苁蓉样品1.0000g，先用25ml乙醇（70％）进行初步溶解，再在水浴（60℃）中进行超声提取，提取时间为20min，料液比为1：30．最后定容至50ml。2.2 工作曲线的绘制表1 标准曲线测定结果Table I The meastrement results of stardand curves序号1234567浓度（mg／L）0.10.20.40.81.21.62.0A0.21200.29950.34700.44450.59450.730001680图1 标准曲线测定方法为Folin-酚法，具体操作如下：分别吸取0.5mL不同浓度的没食子酸工作液加人到50ml容量瓶中，分别加入30mL蒸馏水混合、2.5ml的Folin-酚试剂，混匀；5min内加入7.5mL质量分数为20％的Na，CO，溶液，混合并定容至50mL；将上述配置的溶液在20℃下放置2h后，在760mm下测定吸光值。然后以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，见图1，得到线性回归方程Y＝0.3372X+0.1992,R=0.9925。酸（标准品，sigma公司）、无水乙醇、Folin-酚试剂、碳酸钠，均为国产分析纯。2 实验方法2.1 溶液的配置2.1.1 没食子酸标准储备液的配制准确称取0.2500g没食子酸，先用5mL乙醇进行溶解，再用蒸馏水准确定容至50mL（现配），浓度为5000mg／L；2.1.2 没食子酸工作液的配制分别准确移取没食子酸标准储备液0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL至25mL容量瓶中并用蒸馏水进行定容。浓度分别为：0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mg/L。2.1.3 肉苁蓉供试品溶液的制备

Fig.7Effect of ultrasonic number on the extraction of catechin3.3 正交试验在单因素试验基础上，设计料液比、提取温度、超声时间、提取次数的4因素3水平正交实验，因素水平见表1，正交试验结果见表2。通过正交试验和方差分析结果表明，影响肉苁蓉儿茶素提取的因素主次顺序为：A＞B＞D＞C，即甲醇体积对儿茶素提取效果影响最大，其次为提取温度和提取次数，超声时间影响较小。综合考虑，儿茶素的最佳提取条件为：甲醇体积25mL，提取温度60℃、提取次数1次，超声时间30min。表1 因素及水平Tabl Factors and level实验因素水平甲醇体积提取温度/C超声时间/min提取次数ABCD110402012155030232560403 表2 正交试验结果与分析Tab.2 Regilts of orthogonal est项目甲醇体积A提取温度／C율超时间AminC提取次数D质量百分比／％110402016497210503021.96531060432.036415403031.945%15504012.0586156020--2.468725404022.289825502032,415925603012.396K:5.68059136.5626,133K:6,4716.4386.3066,722%7.1006.9006.3836.39%액1.8931.9712.1872.044A>B>D>CABCID액2.15721462.1022.241%R2.3670.47423000.3292.1280.0062.1320,197 3.4 肉苁蓉中儿茶素含量的测定采用标准物加入法对肉苁蓉中儿茶素进行定性，保留时间3.423min处色诺峰为儿茶素，见表1.2。通过峰面积定量法计算得到肉苁蓉中儿茶素的含量为26.77mg／g。4 结论本文建立了高效液相色谱法测定肉苁蓉中儿茶素含量的方法，为中肉苁蓉标准的制定提供依据。通过优化料液比、提取温度、超声时间、提取次数等实验参数，确定儿茶素的最佳提取条件为：甲醇料液比2g：25mL、提取温度60℃、提取1次、超声提取 30 min。在此条件下，肉苁蓉中儿茶素含量为26.77mg/g.参考文献 [1］谭德远，郭泉水，王春玲，我国肉苁蓉资源状况及开发利用研究］.林业资源管理。2004.2（4）：29-32［2］赵奎君，采丽娟、毕丹、等、HHPLC-ELSD测定肉苁蓉及管花肉苁容中半乳糖醇含量，Chinese Jounal of Information on TCM，2012.18）

1 材料与仪器1.1 材料肉苁蓉产自甘肃省酒泉市瓜州县。1.2 仪器与试剂STI型液相色谱仪（赛智科技有限公司）；SHB-2V循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）：80-2离心机江苏大地自动化仪器厂）：BSA124S 型分析天平（赛多利斯科学有限公司）：KQ-500型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。儿茶素标准品购自坛墨质检标准物质中心（批号 00003310-01A）：乙脑、甲醇均为色谱纯：实验用水为超纯水。2 实验方法2.1 色谱条件色谱柱：KromsstaTM柱（4.6x250mm．5pm）：流动相为乙腈-水（30：70．VN），流动：相流速为0.8mlAmin；进样量：10pL；紫外检测波长：260mm：柱温：25℃．2.2 儿茶素标准曲线的绘制准确称取 15 ℃干燥至恒重的儿茶素标准品 0.0155精确至0.0001g），用甲醇溶解并定容至25mL，配制0.602g／μL的标准溶液。精密吸取1.00、2.00、4.00、600、8.00mL对照品储备液于10mL容量瓶中。用甲醇定容，混合均匀，得标准系列溶液。进样并测定峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，计算线性回归方程。FiglThe standard cuve of the catechin2.3 样品中儿茶素的提取2.3.1 提取工艺精密称取腺干并粉碎的肉苁蓉药材2.0000g，加入15mL甲醇，在40kHz和50℃条件下超声提取30min，抽滤，滤渣再加入15mL甲醇重复提取3次，抽滤，合并滤液。将滤液浓缩近干，浓缩残余物以甲醇溶解并定容至5mL，静置过夜。测定前取出，放至室温。取上清液，过0.45μm滤膜后进行HPLC分析。2.3.2 提取的单因素试验对可能影响儿茶素得率的几个因素（科液比、超声温度、提取时间、重复提取次数）分别作单因素试验，测定提取液中儿茶素的峰面积值。计算儿茶素含量。2.3.3 最佳提取条件的选择以料液比、超声温度、提取时间、重复提取次数为因素，选择L3正交表进行四因素三水平试验，各处理重复3次，并进行方差分析。2.4方法评价2.4.1 精密度检查吸取20pl样品溶液，重复进样6次，样品峰面积积分值的RSD为1.28％，表明仪器精密度良好。2.4.2 重复性实验制备5份样品溶液，分别吸取20pL进样，测定，峰面积积分值的RSD为123％。2.4.3 稳定性实验精密吸取同一样品溶液，在12小时内按05h的时间间隔重复进样7次，每次进样20pL，样品中儿茶素峰面积积分值的RSD为1.94％。2.4.4 加标回收率实验吸取已知浓度的供试品溶液05mL，加入0.602pg／uL的儿茶素标准品溶液0.1、0.2、0.3mL稀释至10mL混匀，分别进样20μL测定其峰面积积分值，求得儿茶素平均回收率为98.56％。3 结果与讨论3.1 色谱分析结果标准品和样品提取液中儿茶素色道图分别见图和图2．在该条件下，保留时间3.423min处儿茶素可有效分离。 Fig2 The HPLC chromatogram of catechin standard3.2 肉苁蓉中儿茶素提取的单因素试验3.2.1 料液比其它实验条件同23.1．按不同料比2g：10ml．2g：15mL、2g：20mL、2g：25ml加入甲醇溶液提取，实验结果见图3。如图可知，料液比对儿茶素的提取有较大影响，最终选择2g：15mL为最佳料液比3.2.2 超声温度其它实验条件同2.3.1．按照不同的超声温度 30、40、50、60、70、80℃，实验结果见图4．如图可知，随着温度升高，儿茶素的提取率逐渐上升。50℃为最佳提取温度。 图4溶剂体积对儿茶素提取效果的影响Fgs Effect of solvent volumes on the extraction of catechin3.2.3超声时间其它实验条件同23.1．按照不同的超声时间10、20、30、40、50.60min，实验结果见图5。如图可知，随着时间的增加，儿茶素的提取率有所上升，但是在30min以后，提取率基本保持不变。因此从节约时间成本的角度考虑选择最佳提取时间为30min。 图5 超声温度对儿茶素提取效果的影响Fig.5 Effect of uhrasonic temperature on the extraction of catechin 图6 超声时间对儿茶素提取效果的影响Fig.6 Effect of ultrasonic time on the extraction of catechin3.2.4 提取次数参照23.1方法分别提取1-4次，合并滤液分析，实验结果见图7．

王华，任小娜，许新兵，陈维铅，许世鹏（甘肃省太阳能发电系统工程重点实验室 酒泉职业技术学院，甘肃 酒泉 735000）［摘 要］采用超声波辅助草取法提取，高效液相色请法测定了内器（Cinhe）中的儿茶素含量。在单因素试验基础上，以料液比、提取温度、超声时间、提取次数为研究对象，进行了4因素3水平正交试验。结果表明内欢蓉中儿茶素最佳提取工艺为。甲醇料液比2g：25ml，提取温度60℃，超声提取30min，提取1次。儿茶素在0.602-15.05 pghL．范围内呈良好线性关系，回归方程为y-19300x＋421095.1-0.9996．加样回收率为98.25％。在条件下，肉成蓉中儿茶素含量为25.77mg／g。［关键词］高效液相色谱：内苁蓉：儿茶素：提取：含量测定        ［文章编号］1007-1865（2020）05-0196-03［中分类号］0657.7＋2          ［文献标识码］AStudy on Extraction Conditions and Content Determination of Catechin fromCistancheWang Hua,Ren Xiaona,Xu Xinbing,Cheng Weiqian,Xu Shipeng(Gansu Key Laboratory of Solar Power Generation System Project,Jiuquan Vecational Technical College,Jiuquan 735000,China)Abstractt Catechin in Citanche was alrasonically extracted and detectod by HPLC.Acconding o single-factor experiments,three level of four factors incliting material -lkguid ratio,uhravonic emperature,alrasonic tme and ulrasonic mumber were sleced for the orthogonal design.The resuls showed that the optimum extraction condtions as follows:makrialiqud ratio was2g:25ml nih 30 mn ulrasonicansiod extaction under 60 C,with anlyone ultrasound was performed.Uinder the aptimal conditions,the cahbration cure of Chiectin was linca(-0.9996)in the range of 0.502-15.05 ughl,The equation was y-19300x+421095,-0.9998,the recovery was 98.26 %and the conent of Catectin from Catnche was 26.77 mg/g This process can effectively extrat catechin from cistanche,and provide a bavis for the improvement of pharmacopocia sandard in the fture.Keywordst high performance lipud chromaograply:Caunche Catechin estactions desermination肉苁蓉（Catanche deserticola YC.Ma）是我国中医用途最广的珍贵中草药之一，习称大芸、苁蓉、为列当科（Oobanchancae）肉苁蓉属（Cistanche）多年生寄生草本植物，专性寄生在藜科（Chenopodiaceae）校梭（Haloncylon ammodendon（C.A.Mey）Bunge） 和白梭梭（H.Persicum Bungeex Boss）的根部。主产于我国内蒙、新疆、甘肃、宁夏、青海等省（区）以及伊朗、蒙古、印度等国。其味甘咸微辛酸、微温。在《神农本草经》中将其列为上品，中国药真规定正品为干燥带鳞叶的肉质。肉苁蓉具有强肝肾。益精血，滑肠通便之功效，动物实验显示有降压作用，其中所含儿茶素具有提高免疫功能、清除自由基、抗氧化作用、防突变。抗癌等活性，与肉苁蓉主要药理作用相吻合。本课题经 HPLC预试验发现儿茶素含量较高，但中国药典对其含量的测定方法却没有具体标准，面对肉苁蓉中儿茶素的含量测定目前尚未见有文献报道。因此，本文将对肉苁蓉中儿茶素的提取及含量测定进行条件优化及探索，希望找到一条切实可行的测定方法，为今后肉苁蓉的进一步研究开发提供依据。