王琳琳，李 薇，宋新波”，余河水，苗琳，张丽娟，陶蕊天津中医药大学，天津300193摘要：研究肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的雌激素活性，采用荧光素酶报告质粒法检测受试药物松果菊苷和毛蕊花糖苷的雌激素活性：利用雌激素受体竞争性结合实验和荧光素酶报告质粒法，检测松果菊苷和毛蕊花糖苷与雌激素的竞争性作用。松果菊苷和毛蕊花糖苷有上调维激素应答元件（ERE）活性，和雌激素共同作用可以拮抗雌激素对ERE的上调作用。松果菊苷和毛蕊花糖普通过上调ERE荧光素酶活性而表现出植物雌激素活性，可作为候选SERMs.关键词：松果菊苷：毛蕊花糖苷：植物雌激素：维激素受体：SERM。中图分类号：8285.5         文献标识码：A          DOL:10.16333/j-1001-6880,2015.03.002文献标识码：AStudy on Estrogenic Effects of Echinacoside and Actsoside from Herba CistancheWANG Lin-lin.Ll Wei,SONG Xin-bo,YU He-shui,MIAO Lin.ZHANG Li-juan.TAO Rui Tianjin Unirersity of Trafitional Chinese Medicine,Tanjin 300193.ChinaAbstract: In this stuly,the estrograie effects of echinaconide and actonite of Herta Cistanche was investigated.A lucif-ense reporter plasmid law was ued to detect the estrogenie effects of echinaconide and actemide.The estrogen receptor competition binding experiments wete used to detect their competitive effect with estrogen.The tesults showed that echi-nacoside and actmide can incmase the ativity of ERE.When echinarice of aetmide adled in estmgenacts.ERE-driven eporter gone activity can be stimlated as an estragen agonist.Heace.it was concluded that echinacoside and act-oide had a plytoestragens activity thrug stimnlating ERE-inceae eporter geue activity.Echinaconide and actioside were potential SERM.Key words echinaconide:actsonide:plytoestrigens:estmgrn receptor,SERM肉苁蓉（Herba Cistanche）是列当科（Oroban-chaceael 肉苁蓉属（Cistanche）植物肉苁蓉干燥带鳞叶的肉质茎，又名地精、金笋、苁蓉、大芸。具有补肾阳，益精血，润肠通便的作用，用于肾阳不足，精血亏虚，阳痿不孕，腰膝酸软，筋骨无力，肠燥便秘。前从肉苁蓉中分离鉴定的化学成分主要有苯乙醇苷类、环烯醚萜类、木脂素类、黄酮类、多糖、低聚糖、半乳糖醇、挥发性成分、生物碱类国等。其中苯乙醇苷类是肉苁蓉中主要活性成分，也是肉苁蓉质量控制的主要检测指标，并以松果菊苷和毛蕊花糖苷为代表。现代药理研究表明肉苁蓉具有免疫调节、抗氧化、抗衰老、抗疲劳、神经保护、保肝等作用。一些药理研究还表明肉苁蓉具有促进骨再生，抑制妇女绝经后期骨质疏松形成和植物雌激素作用㎡。本实验选择肉苁蓉中的主要质量控制指标成分松果菊苷和毛蕊花糖苷，通过荧光素酶报告质粒法、雌激素受体竞争性结合实验，检测松果菊苷和毛蕊花糖苷的雌激素作用，并探讨松果菊苷和毛蕊花糖苷雌激素作用机理。图1松果菊苷和毛蕊花糖苷的结构式Fig 1 Chrmiral structues of echinacomide and acteride

【摘要】目的：研究肉苁蓉苯乙醇总苷(CPhGs)脂质体对大鼠肝星状细胞(HSCs)增殖、凋亡、周期的影响及其相关分子机制。方法：HSCs分为空白对照组和CPhGs脂质体低、中、高浓度(分别为7.36、14.72、29.45 μg/mL)处理组。采用MTT法检测CPhGs脂质体对大鼠肝星状细胞增殖的影响；流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡状况，PI染色法检测大鼠肝星状细胞的周期变化；Western blot检测caspase-3、p27蛋白的表达变化。结果：与空白对照组比较，低、中、高3个剂量的CPhGs脂质体作用于HSCs后，均可抑制细胞的增殖(P<0.05)；3个剂量的CPhGs脂质体均可促使大鼠肝星状细胞发生凋亡，使细胞阻滞在G0/G1期，上调caspase-3及p27蛋白的表达(P<0.05)。结论：CPhGs脂质体对体外培养大鼠肝星状细胞有抑制增殖、促进凋亡、阻滞细胞周期的作用。其机制可能与CPhGs脂质体上调caspase-3和p27蛋白表达有关。【关键词】肉苁蓉苯乙醇总苷；脂质体；大鼠肝星状细胞；增殖；细胞凋亡；细胞周期肝纤维化的发展和结局是一个复杂的过程，涉及实质和非实质肝细胞以及浸润的免疫细胞。由于细胞外基质(extracellular matrix，ECM)蛋白质的产生、沉积增加而形成瘢痕的纤维反应是肝脏结构变化的关键步骤[1]。活化的肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)转为静止状态及其凋亡是逆转肝纤维化的关键因素[2]。肉苁蓉是常见的补益类中药，因其疗效切实，药性温和，自古就被视为强身壮体、滋补的中药，有“沙漠人参”之佳誉。化学及药理作用研究显示肉苁蓉苯乙醇总苷(Cistanche phenylethanoidglycosides，CPhGs)具有抗氧化、抗抑郁、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗菌和免疫调节等多种生物功能，是肉苁蓉发挥药效的主要物质基础之一[3]。本课题组前期实验研究证实，CPhGs对改善肝功能、抗肝纤维化有显著疗效，且随CPhGs浓度的增加，HSCs的凋亡率逐渐增高，呈现一定的剂量依赖关系[4]。目前许多已经被批准临床应用的抗肝纤维化作用药物，对晚期肝纤维化和肝硬化的治疗效果不佳，因此，研发靶向高效、高纯度、高稳定性、低免疫原性的抗肝纤维化药物势在必行。脂质体作为新型药物载体，可以增加药物透过细胞膜的能力，能够迅速到达病灶且主要分布于肝脏，从而降低药物毒性，其缓释性更能够增强药物的作用浓度，延长作用时间，减少药物用量，提高药物疗效[5-6]。因此，本实验以脂质体为药物载体包裹传统中药制成CPhGs脂质体，研究CPhGs脂质体对体外培养大鼠肝星状细胞增殖、凋亡、周期的作用，并初步探讨其相关的分子机制，旨在研究可能为临床所用的抗肝纤维化的靶向药物治疗途径，为进一步药物开发提供实验依据。1 材料与方法1.1 实验材料HSCs，购于上海中乔新舟生物科技有限公司；胎牛血清，购于美国Gibco公司，-20 ℃分装保存；双抗(青霉素、链霉素)、DMEM高糖培养基、0.25%胰酶(1×)，均购于美国Hyclone公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期检测试剂盒，均购于美国BD公司；四甲基偶氮唑盐MTT、DMSO，均购于美国Sigma公司；兔抗β-actin多克隆抗体，购于北京博奥森生物科技有限公司。1.2 实验仪器超净工作台，美国Thermo Scientific公司；CK-40型荧光倒置显微镜，日本Olympus公司；AEL-200型电子天平；TGL-16G型台式低温高速离心机；CO2细胞培养箱，英国NEW BRUNSWICK Galaxy®系列；全波长自动酶联免疫反应检验测试仪， 美国ThermoScientific公司；低温离心机，美国Sigma公司；数显恒温水浴锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；脱色摇床，北京市六一仪器厂；电热恒温培养箱，上海一恒科技有限公司；Western blot使用的电源、电泳装置及转膜装置，美国Bio-Rad 公司；移液器，美国Thermo Scientific公司；FluorChem E化学发光高灵敏凝胶成像仪，美国Protein Simple公司。1.3 CPhGs 脂质体的制备采用薄膜分散法制备CPhGs 脂质体。称取卵磷脂、DPPC、胆固醇(质量比5 mg∶10 mg∶10 mg)，溶于适量氯仿和甲醇混合溶剂中(V 氯仿∶V 甲醇=2∶1)，在49~50 ℃下旋转使成膜状，加入250 μg/mL的苯乙醇总苷不断旋转水化，使磷脂膜转入水中形成脂质体，将所得脂质体放入4 ℃冰箱中备用。所得脂质体用0.45 μm的微孔滤膜挤压4~5次，0.22 μm的微孔滤膜挤压18~20次，即得粒径均匀的苯乙醇总苷脂质体。包封率(38.46±7.85)%；电位45 mV；粒径209nm；载药量(3.71±0.23)%。1.4 细胞培养及分组将复苏的HSCs 常规培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，培养在37 ℃、CO2体积分数为5%的厌氧培养箱中，待细胞贴壁率约为80%时即可传代，复苏后传2~3代，待细胞状态稳定后即可用于实验。将HSCs 分为4 组：空白对照组(未加入受试物，只加培养液)、CPhGs脂质体低、中、高浓度(分别为7.36、14.72、29.45 μg/mL)处理组。1.5 MTT 法检测CPhGs 脂质体对HSCs 增殖的影响选择对数生长期的细胞、弃去培养液，加入500μL 0.25%的胰酶进行消化，制备单细胞悬液，调整细胞浓度为1×105 个/mL 后接种96 孔板，每孔100 μL，12 h贴壁后，吸去上清液，加入含各浓度CPhGs脂质体药物的完全培养基，每孔100 μL，每个浓度设3个复孔。CPhGs 脂质体药物用完全培养基倍比稀释成7.36、14.72、29.45 μg/mL 共3 个浓度。分别于培养24、48、72 h后加入5 mg/mL的MTT 20 μL，4 h后吸去上清加入150 μL DMSO，492 nm处测定吸光度D(492)值，并计算其均值。抑制率=[1-D(492)实验组/D(492)对照组]×100%1.6 流式细胞术检测CPhGs 脂质体对HSCs 凋亡的影响HSCs按1×105个/mL的浓度接种至6孔板，分组情况同1.4，给予受试物24 h后将细胞吸至15 mL离心管，每孔加入500 μL胰酶消化细胞，用对应的完全培养液终止消化，轻轻吹打孔里的细胞混匀，每孔加入2 mL PBS冲洗细胞，将孔里的PBS移至15 mL离心管，尽可能多收集孔里的细胞，1 000 r/min离心5min后弃上清，加5 mL PBS 至15 mL离心管冲洗细胞， 重复1 次。每个样品加入100 μL 1×BindingBuffer，重悬细胞，将细胞移至1.5 mL EP管，各样品加Annexin V、PE双染，混匀避光放置30 min后，分别加入400 μL Binding Buffer，1 h内上机检测细胞凋亡率。1.7 流式细胞术检测CPhGs 脂质体对HSCs 周期的影响HSCs按1×105个/mL的浓度接种至6孔板，细胞分组及处理同1.4。完成后逐滴加入5 mL或更多预冷的75%的乙醇，涡旋以混匀细胞，4 ℃避光过夜(>18h)。1 000 r/min离心10 min后弃上清，清洗细胞2次以去除所有的乙醇。分析前4 ℃避光保存样本，1 h之内采用流式细胞仪检测细胞周期。1.8 CPhGs 脂质体对HSCs 中caspase-3 和p27 蛋白表达的影响HSCs按1×105个/mL的浓度接种至6孔板，分组情况同1.4，给予受试物24 h后收集细胞，提取各组细胞中的总蛋白，上样于聚丙烯酰胺凝胶进行还原性SDS-PAGE 电泳，湿转(PVDF 膜)，200 mA 恒流电转90 min。封闭液(5%脱脂奶粉)封闭PVDF膜过夜，用1×TBST缓冲液充分振荡清洗，TBST稀释抗体，一抗浓度分别为caspase-3 (1∶1 000)、p27 (1∶1 500)、β-actin (1∶5 000)，ECL 显色。FluorChem E 化学发光高灵敏凝胶成像仪上检测条带灰度值。蛋白相对表达量=目的条带灰度值/内参条带β-actin灰度值×100%1.9 统计学方法采用SPSS 19.0 软件进行统计学分析，数据以xˉ±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组样本两两比较采用LSD法，检验水准α=0.05。2 结果2.1 CPhGs 脂质体对HSCs 增殖的影响采用MTT比色法检测CPhGs脂质体对HSCs增殖的影响，结果见图1。与空白对照组相比，CPhGs脂质体低、中、高即7.36、14.72、29.45 μg/mL剂量组的细胞生长速度均明显减慢(P<0.05)。同一时间点，与空白对照组相比较，随着药物浓度升高，抑制细胞增殖作用增加(P<0.05)；同一浓度组，随时间延长，细胞活力不断降低；且随着时间以及药物浓度的增加，抑制HSCs增殖能力不断上升。提示CPhGs脂质体具有抑制HSCs增殖的作用。2.2 CPhGs 脂质体对HSCs 凋亡的影响7.36、14.72、29.45 μg/mL 的CPhGs 脂质体作用于HSCs 24 h后，早期凋亡与晚期凋亡的细胞总和分别为(18.5±2.7)%、(26.6±2.3)%、(31.6±1.9)%，与空白对照组的(5.0±0.9)%相比，差异均有统计学意义(P<0.05)，结果见表1和图2。分析表明CPhGs脂质体3个剂量组均可明显诱导HSCs的早、晚期凋亡(与空白对照组比较，P<0.05)，提示CPhGs 脂质体可通过诱导HSCs凋亡，从而抑制HSCs的激活及肝纤维化的发生。2.3 CPhGs 脂质体对HSCs 细胞周期的影响细胞周期分析结果(表2和图3)显示，CPhGs脂质体各剂量组处理的HSCs，与空白对照组相比，G0/G1期的细胞比例均明显增多(P<0.05)，而S期细胞比例明显减少(P<0.05)，G2/M期细胞比例明显减少(P<0.05)。提示CPhGs脂质体可通过诱导细胞周期阻滞抑制HSCs增殖，CPhGs脂质体可引起细胞周期明显阻滞。2.4 CPhGs 脂质体对大鼠肝星状细胞caspase-3、p27 蛋白表达水平的影响Western blot 检测结果见图4。与正常对照组比较，CPhGs脂质体(29.45、14.72 μg/mL)组大鼠肝星状细胞caspase-3蛋白的表达水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；其中CPhGs脂质体29.45 μg/mL浓度组上调作用最明显(P<0.05)； 与空白对照组比较，CPhGs脂质体各剂量组p27蛋白的表达水平均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；CPhGs脂质体29.45μg/mL浓度组上调作用最明显(P<0.05)。3 讨论肝纤维化是因ECM合成与降解失衡所致，是各种肝病发展为肝硬化的共同途径。HSCs的激活是肝纤维化形成的中心环节，在肝损伤修复过程中发挥作用。肝损伤后，HSCs受各种致病因子刺激，从静态转化为具增生性、纤维原性和可收缩性的肌成纤维细胞，肌成纤维细胞产生大量ECM沉积于肝脏，最终导致肝纤维化。近年来研究发现，随着肝星状细胞数量的减少，肝纤维化程度可得到明显改善[7-8]。因此，抗肝纤维化的药物研究多数以肝星状细胞为作用点寻找突破，经抑制炎症反应，减少肝损伤因素如酒精药物等，干扰相关细胞因子的活性调节和信号转导的正常进行，以达到抑制肝星状细胞活化及增殖，并诱导其凋亡，减少ECM 生成，寻找能以HSCs 为作用靶点，成为治疗肝纤维化的重要策略[1]。迄今为止，国内外的研究中，抑制HSCs活化并促进其凋亡、调节ECM的合成和降解等方面已取得一些成果，对肝纤维化的临床治疗提供了一些药物和方法，但总体疗效仍不理想。目前多认为，限制抗肝纤维化药物效果的原因，可能与药物无法达到靶细胞、或到达靶细胞但无法在其周围形成有效的药物浓度及半衰期短和药物对其他组织细胞的副作用大过增加剂量带来的疗效等有关[9]。随着肝脏疾病病死率的提高和中医药现代化进程的深入，中药防治肝纤维化的机制研究越来越被人们所关注，可用于肝纤维化防治药物的分子靶点也与日俱增[10]。肉苁蓉(Cistanches Herba)为列当科植物肉苁蓉(Cistanche Deserticola Y. C. Ma)或德赢vwin登录 [C. tubulosa (Schenk) Wight]的干燥带鳞叶的肉质茎，作为滋补类传统中药在中国具有悠久的应用历史化学作用及药理作用[11]。课题组前期研究结果显示，CPhGs 可明显抑制HSC 的增殖，诱导其凋亡。且随CPhGs 浓度的增加，HSCs 的凋亡率逐渐增高，预示其在治疗肝脏疾病中有着广阔的应用前景[12]。因此，研发靶向高效、高纯度、高稳定性、低免疫源性的CPhGs势在必行，同时应加强CPhGs抗肝纤维化机制的深入研究，为进一步可能的临床研究提供最扎实的理论基础。本实验在体外水平研究3种不同剂量的CPhGs脂质体对HSCs增殖、凋亡、周期及相关蛋白表达的影响，探讨CPhGs脂质体的抗肝纤维化机制，以期为肝纤维化的防治奠定基础。MTT检测结果显示，高、中及低剂量组CPhGs脂质体各浓度组24、48及72 h均能抑制HSCs的增殖(P<0.05)。细胞凋亡，又称程序性细胞死亡，细胞调亡是由基因调控的一种主动的细胞死亡过程，在某些生理或病理条件下，对维持机体正常的生理和功能活动具有重要的生物学意义[13]。Caspase蛋白家族成员组成凋亡通路的关键基因，细胞色素C是发现的第一种线粒体释放促凋亡蛋白，是线粒体呼吸链的重要组成部分。细胞色素C 使Apaf1 寡聚化并能使caspase-9 前体聚集，最终导致caspase-9前体水解形成活性酶。随后caspase-9促使其他caspase酶(如caspase-7)的执行者即caspase-3 前体转换为有活性的caspase-3。Caspase-3是细胞凋亡早期一种非常重要的物质，被认为是执行酶中最为重要的一个，能够被所有的起始凋亡蛋白酶活化，并降解细胞主要结构，最终瓦解细胞[14]。本次细胞凋亡检测结果显示，CPhGs脂质体3个剂量组均可明显诱导大鼠肝星状细胞的早、晚期凋亡(与空白对照组比较，P<0.05)。蛋白水平检测结果显示，与正常对照组细胞相比，在CPhGs脂质体(29.45、14.72 μg/mL)处理的细胞中，caspase-3 蛋白水平表达显著上调。这与细胞凋亡分析结果显示的CPhGs脂质体处理的HSCs出现了明显凋亡，证实CPhGs脂质体可能是通过上调caspase-3 基因的表达而抑制细胞的增殖能力，从而诱导HSCs发生凋亡。细胞周期分为分裂间期和分裂期，其中分裂期又可分为：DNA 合成前期(G1 期)、DNA 合成期(S 期)和DNA合成后期(G2期)[15]。细胞周期的正常运行依赖于正、负调节因子的共同参与。正调节因子包括细胞周期蛋白(cyclin)和细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclindependent kinase，CDK)；负调节因子主要是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(cyclin dependent kinaseinhibitor，CKI)。以上3种调控因子在维持细胞有序的增殖、分裂活动中起重要作用，三者相互作用，共同参与细胞周期调控[16]。p27 属于CKI， 可通过抑制cyclin/CDK形成异二聚体结构，使细胞停滞于G1期，从而实现对细胞周期的调控功能[17]。细胞周期检测结果显示，CPhGs脂质体3个剂量组处理的HSCs，与空白对照组相比，G0/G1 期的细胞比例均明显增多(P<0.05)，而S期细胞比例明显减少(P<0.05)，G2/M期细胞比例明显减少(P<0.05)，且呈一定的剂量依赖关系。与正常对照组细胞相比，在CPhGs脂质体(7.36、14.72、29.45 μg/mL)处理的细胞中，p27蛋白水平表达显著上调。这与细胞凋亡分析结果显示的CPhGs脂质体处理的细胞出现明显的G1期阻滞，S期和G2/M期细胞比例显著减少是一致的。说明p27在CPhGs脂质体抑制HSCs增殖中可能具有重要作用。本研究结果显示，在细胞水平上，探讨了CPhGs脂质体对HSCs的影响。将不同剂量的CPhGs脂质体药物对HSC进行处理，CPhGs脂质体3个剂量组均可以抑制HSC的增殖，增加了HSC的凋亡，这一过程可能是通过激活以及caspase-3蛋白表达而引起细胞凋亡。此外，CPhGs脂质体可使HSC细胞周期更多地停滞在S期，可能的作用机制是影响了细胞周期蛋白p27蛋白的表达，从而抑制细胞周期的能力。提示细胞凋亡和细胞周期调节是CPhGs脂质体防治肝纤维化的两个靶点，根据这一结论，可对细胞周期和凋亡相关的信号通道进行更深入的研究，进一步揭示CPhGs脂质体的抗纤维化机制，以达到靶向或抑制肝纤维化的目的。参考文献[1] 胡潇, 胡光荣, 刘思达, 等. 肝纤维化治疗进展[J]. 肝脏,2018, 23(10): 931-933.[2] SUN H, CHEN G, WEN B, et al. 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摘要: 目的探讨肉苁蓉苯乙醇总苷( phenylethanol glycosidesfrom cistanche tubuiosa，CPhGs) 脂质体对大鼠肝星状细胞( HSC-T6) 凋亡的影响及其抗肝纤维化的相关分子机制。方法培养HSC-T6，取生长状态良好的对数生长期细胞用于实验，采用重组大鼠血小板衍生生长因子BB( rrPDGFBB)刺激HSC-T6，构建体外肝纤维化模型。MTT 法测定CPhGs 脂质体( 29. 45、14. 72、7. 36 mg·L － 1 ) 对HSC-T6 增殖的影响; AnnexinV-FITC/PI 细胞凋亡双染试剂标记后，流式细胞仪检测CPhGs 脂质体不同浓度组的细胞凋亡率; 实时荧光定量PCＲ( qＲT-PCＲ) 检测α-SMA、Collagen I、CollagenⅢ mＲNA 的表达水平; Western blot 法检测CPhGs 脂质体对p-JNK 蛋白表达的影响。结果不同浓度CPhGs 脂质体均可抑制rrPDGF-BB 诱导的HSC-T6 的增殖; CPhGs 脂质体( 29. 45、14. 72 mg·L － 1 ) 组凋亡率明显升高; qＲT-PCＲ 结果显示，CPhGs 脂质体不同浓度组均可下调α-SMA、Collagen I、Collagen Ⅲ mＲNA 水平的表达，并能降低p-JNK 蛋白的表达。结论CPhGs 脂质体能抑制大鼠HSC-T6 的增殖并诱导其凋亡，其作用可能与抗肝纤维化有关。关键词: 肉苁蓉; 苯乙醇总苷; 肝星状细胞; 细胞凋亡; 脂质体; 肝纤维化肝纤维化( hepatic fibrosis，HF) 是一种慢性的瘢痕形成与修复过程，是发病率和死亡率都很高的世界医学难题。HF 的特点是细胞外基质过度沉积，晚期HF 可诊断为肝硬化，并最终可能发展为肝衰竭，甚至肝细胞癌［1］。目前公认肝星状细胞( hepaticstellate cell，HSC) 的活化是HF 进展过程中的关键事件［2］。在HF 进程中，HSC 激活成肌成纤维细胞是瘢痕形成的关键环节［3 － 4］。中医具有治疗复杂疾病及相关疾病的功效，肉苁蓉( Cistanche) 是著名的名贵补益类中药，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、免疫调节等作用。课题组前期研究证实，肉苁蓉苯乙醇苷类化合物具有良好的保肝护肝作用，且其能引起Fas 诱导的HSC 凋亡［5］。本研究旨在探讨肉苁蓉苯乙醇总苷( phenylethanol glycosides from cistanche tubuiosa，CPhGs) 脂质体对HSC 凋亡的影响及其分子机制，通过靶向载药系统转运药物，来克服一些药物半衰期短、无法到达靶器官，或到达了但无法在其周围形成有效药物浓度等缺点，最大程度发挥药物疗效，达到长效、靶向及减轻药物副作用等目的，期望能寻求更多的可以应用于临床治疗HF 的靶向药物治疗途径，为HF 的治疗提供理论基础。1 材料与方法1． 1 材料1． 1． 1 细胞株大鼠HSC-T6 细胞株，购自上海中乔新舟生物科技有限公司，货号: ZQ0780。1． 1． 2 药物与试剂用薄膜分散二次包封法制备pPB 修饰的肉苁蓉总苷靶向脂质体，其粒径为212. 7 nm，电位35 ～ 50 mV，包封率( 38. 46 ±7. 85) %，由本实验室保存。胎牛血清( 美国Gibco公司) ; DMEM 高糖培养基( 美国Hyclone 公司) ;MTT( 美国Sigma 公司) ; Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒( 美国BD 公司) ; TＲIzol Ｒeagent ( Lifetechnologies) ; ＲevertAid First Strand cDNA SynthesisKit、ＲIPA 裂解液( 赛默飞公司) ; SYBＲ Premix ExTaqTMⅡ( TaKaＲa 公司) ; 蛋白定量试剂盒( Biomiga公司) ; 重组大鼠血小板衍生生长因子BB( recombinantrat platelet-derived growth factor BB， rrPDGF-BB)( Ｒ＆D 公司) ; 抗β-actin、JNK、p-JNK 多克隆抗体( 北京博奥森生物科技有限公司) 。1． 1． 3 仪器超净工作台、全波长自动酶联免疫反应检验测试仪( 美国Thermo Scientific 公司) ; CK-40型荧光倒置显微镜( 日本Olympus 公司) ; 低温离心机( 美国Sigma 公司) ; Western blot 电泳装置及转膜装置( 美国Bio-Ｒad 公司) ; QuantStudio 6 Flex 型实时荧光定量PCＲ 仪( 美国ABI 公司) 。1． 2 方法1． 2． 1 细胞培养与传代HSC-T6 在含有100 kU·L － 1青霉素、100 mg·L － 1 链霉素和10% 胎牛血清的高糖DMEM 细胞培养液，于37℃、5% CO2培养箱中培养。细胞隔日换液，待生长融合至80% ～90% 时，使用0. 25% 胰蛋白酶消化收集细胞，按1 ∶ 2进行传代培养，所有实验采用对数生长期细胞。1． 2． 2 细胞分组实验分为Normal 组、rrPDGF-BB组、rrPDGF-BB + CPhGs 脂质体( 29. 45、14. 72、7. 36mg·L － 1 ) 组。各组细胞均培养24 h 后，收集细胞进行后续实验。1． 2． 3 MTT 法检测细胞增殖HSC-T6 以5 000个/孔密度接种至96 孔板，待细胞贴壁后进行分组干预，每组设3 个复孔。分别培养24、48、72 h，向每孔加入10 μL MTT 溶液，培养箱内37℃培养4 h 后，弃去MTT 溶液，再向各孔加入100 μL DMSO，置于摇床室温摇动10 min，待结晶充分溶解后，于酶标仪492 nm 波长处测定吸光度。1． 2． 4 流式细胞术检测细胞凋亡取生长状态良好的对数生长期细胞，经胰酶消化后接种于6 孔板，每孔细胞数为1 ×105 个， 24 h 后按相应浓度加药，继续培养48 h 后，每孔加入500 μL 胰酶消化细胞，加完全培养液终止消化，吹打混匀移至15 mL 离心管，PBS冲洗细胞，1000 r·min － 1离心5 min。弃上清，加PBS冲洗细胞2 次，用AnnexinV-FITC/PI 细胞凋亡双染试剂标记后，用流式细胞仪检测细胞凋亡。1． 2． 5 实时荧光定量PCＲ 检测α-SMA、Collagen I、Collagen Ⅲ mＲNA 的表达TＲIzol 试剂盒提取HSC-T6 总ＲNA，经纯度及完整性鉴定后反转录反应生成cDNA。按照实时荧光定量PCＲ 试剂盒说明书建立PCＲ 反应体系，使用实时荧光定量PCＲ 检测仪进行检测。PCＲ 热循环参数为: 95℃预变性30s，95℃变性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，共40个循环。结果分析以β-actin 为内参基因，确定每个样本、每个基因扩增的循环阈值( CT) ，按照2 －△△CT计算目的基因的相对表达量，所用引物序列见Tab1。1． 2． 6 Western blot 法分析p-JNK 蛋白表达水平收集细胞，ＲIPA 细胞裂解液提取各组细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，取相同质量的蛋白上样，经SDS-PAGE 凝胶电泳转移至硝酸纤维素膜，5% 的脱脂奶粉室温封闭1 h，p-JNK、JNK 一抗( 1 ∶ 5 000 稀释) 4℃ 摇床孵育过夜，TBST 漂洗3 次，二抗( 1 ∶ 5 000) 室温孵育1 h，TBST 漂洗3 次后，化学发光显影试剂盒( ECL) 曝光显影。利用图像分析软件Image J 对条带进行灰度值的测定，计算分析各组蛋白相对表达量，以p-JNK 与JNK 条带信号强度的比值表示p-JNK 蛋白表达水平。1． 3 统计学分析采用SPSS 17. 0 软件进行统计学分析，计量资料以珋x ± s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组样本两两比较采用LSD 法。2 结果2． 1 CPhGs 脂质体对rrPDGF-BB 刺激的HSCT6增殖的影响Fig 1 的MTT 结果显示，在24 h时，与Normal 组比较， rrPDGF-BB 组OD 值明显增加( P ＜ 0. 05) ; 与rrPDGF-BB 组比较，除CPhGs 脂质体7. 36 mg·L － 1组外，其余CPhGs 脂质体不同浓度组OD 值均明显下降( P ＜ 0. 05 ) ; 与CPhGs 脂质体7. 36 mg·L － 1组相比，CPhGs 脂质体29. 45 mg·L － 1组OD 值明显降低( P ＜ 0. 05) 。在48、72 h 时，与Normal 组比较， rrPDGF-BB 组和CPhGs 脂质体不同浓度组OD值均明显增加( P ＜ 0. 05) ; 与rrPDGF-BB组比较，CPhGs 脂质体不同浓度组OD 值明显下降( P ＜ 0. 05) ; 与CPhGs 脂质体7. 36 mg·L － 1 组比较，CPhGs 脂质体( 14. 72、29. 45 mg·L － 1 ) 组OD 值明显下降( P ＜ 0. 05) ; 与CPhGs 脂质体14. 72 mg·L － 1组比较，CPhGs 脂质体29. 45 mg·L － 1 组OD 值明显下降( P ＜ 0. 05) 。结果提示，随着药物浓度增大和干预时间的延长，CPhGs 脂质体各剂量组抑制HSC-T6 增殖的作用呈现明显的剂量－ 效应关系。2． 2 CPhGs 脂质体对rrPDGF-BB 刺激的HSCT6凋亡的影响如Fig 2 所示，与Normal 组相比，rrPDGF-BB 组凋亡率下降( P ＜ 0. 05) ; 与rrPDGF-BB组相比，CPhGs 脂质体不同浓度组凋亡率均明显上升( P ＜ 0. 05) ; 与CPhGs 脂质体7. 36 mg·L － 1 组比较，CPhGs 脂质体( 14. 72、29. 45 mg·L － 1 ) 组凋亡率明显上升( P ＜ 0. 05) ; 与CPhGs 脂质体14. 72 mg·L － 1组比较，CPhGs 脂质体29. 45 mg·L － 1 组凋亡率明显增高( P ＜ 0. 05) 。结果显示，随着CPhGs 脂质体药物浓度的升高，HSC-T6 凋亡率也逐渐增高，CPhGs 脂质体各剂量组间呈现剂量－ 效应关系。2． 3 CPhGs 脂质体对rrPDGF-BB 刺激的HSCT6α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ mＲNA 表达的影响如Fig 3 所示，与Normal 组比较，α-SMA、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ mＲNA 在rrPDGF-BB 组表达明显增加( P ＜ 0. 05 ) ; 与rrPDGF-BB 组比较，α-SMA、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ mＲNA 在CPhGs 脂质体不同浓度组表达均下降( P ＜ 0. 05) ; CPhGs 脂质体各剂量组间比较，可见随CPhGs 脂质体浓度增大，α-SMA、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ mＲNA 表达明显下降，差异具有统计学意义( P ＜ 0. 05 ) ，其中以CPhGs 脂质体29. 45 mg·L － 1组抑制效果最明显。2． 4 CPhGs 脂质体对rrPDGF-BB 刺激的HSCT6p-JNK 蛋白表达的影响如Fig 4 所示，与Normal组比较，p-JNK 蛋白在rrPDGF-BB 和CPhGs 脂质体不同浓度组表达明显增加( P ＜ 0. 05) ; 与rrPDGF-BB 组比较，p-JNK 蛋白在CPhGs 脂质体不同浓度组表达下降( P ＜ 0. 05) ; CPhGs 脂质体各剂量组间比较，p-JNK 蛋白随CPhGs 脂质体干预剂量增加表达明显下降，呈现剂量－ 效应关系( P ＜ 0. 05) ，其中以29. 45 mg·L － 1组效果最明显。3 讨论在慢性肝病中，HSC 的反复激活导致HF，其特征是广泛的瘢痕形成和干扰肝脏正常结构与功能［6］。目前，抗HF 的主要策略是抑制HSC 活化、增殖、收缩，诱导HSC 凋亡。HSC 的活化是HF 的主要过程［7］，HF 主要是由于细胞外基质过度沉积所致，而活化的肝HSC是细胞外基质的主要来源。肝损伤后，HSC 经历一个复杂的从静止状态向肌成纤维细胞转换或激活过程，α-SMA 是HSC 活化的标志物，α-SMA 在肌成纤维细胞分化中起作用。α-SMA 降低了收缩力和Collagen I 合成，并抑制伤口收缩。Collagen I 和α-SMA 被认为是HF 中诱导HSC 活化的标志物，可以减少α-SMA 的含量，促进HSC 凋亡，逆转HF 进程。宋阳等［8］的研究结果证实，其研究的药物可明显抑制HSC 的增殖，促进其凋亡，并使α-SMA 蛋白表达明显降低，以此降低细胞外基质的沉积，从而起到逆转HF 的作用。由淑萍等［9］研究表明，肉苁蓉苯乙醇总苷可以抑制rrPDGF-BB 诱导的HSC 增殖。上述研究结果提示，抑制HSC 的激活和增殖，促进HSC 凋亡已成为阻止HF 发生、发展的关键事件。最近的临床实验证据也提示，HF 具有可逆性的［10］。HF 的逆转与HSC 的凋亡有着密切关联。HF 逆转期，活化的HSC 数量减少主要依靠细胞凋亡，而不是活化状态细胞向静止状态转化。细胞凋亡是细胞的主动“自杀”过程，与坏死不同，细胞凋亡发生于HF 的产生和发展过程中。HSC 凋亡在HF 发展过程中不仅起着主动作用，而且贯穿整个纤维化形成的过程。本研究用不同浓度的CPhGs 脂质体药物作用于HSC-T6 48 h后，用流式细胞仪检测细胞凋亡，结果显示，与Normal组相比， rrPDGF-BB 组凋亡率下降，CPhGs 脂质体( 29. 45、14. 72 mg·L － 1 ) 组凋亡率上升，与rrPDGF-BB 组相比，CPhGs 脂质体不同浓度组凋亡率均明显上升，且CPhGs 脂质体不同浓度组相比，差异具有统计学意义。实验结果表明，CPhGs 脂质体可诱导HSC-T6 的凋亡，且凋亡程度与CPhGs 脂质体浓度存在联系，CPhGs 脂质体各剂量组间表现出明显的剂量－ 效应关系。HF 是指结缔组织过度增殖和异常沉积，特别是胶原蛋白、非胶原蛋白和肝小叶门管区的蛋白多糖等。因此，细胞外基质降解和生成之间的不平衡是HF 发生与发展的关键因素。因此，保护肝细胞，促进肝再生，保持胶原蛋白的正常代谢也成为预防和治疗HF 的重要措施。人类有19 种胶原蛋白，在肝脏中存在的有5 种类型，在HF 的总蛋白中胶原蛋白约占50%，主要涉及Collagen I 和Collagen Ⅲ。在肝脏中，Collagen I 占60% ～ 70%，Collagen Ⅲ占20% ～ 30%，是构成细胞外基质的主要成分。因此，Collagen I 和Collagen Ⅲ被认为是反映胶原蛋白在肝脏中进行新陈代谢的重要参数。李伟伟等［11］的研究结果显示所研究药物可通过抑制CollagenⅢ沉积而起到抗HF 作用。张扬武等［12］的实验结果也证实了可通过抑制HSC 的活化，降低Collagen I 的表达，达到逆转HF 的作用。本研究采用实时荧光定量PCＲ 检测α-SMA、Collagen I 和Collagen Ⅲ基因表达，研究结果显示，与Normal 组相比， rrPDGFBB组α-SMA、Collagen I、Collagen Ⅲ mＲNA 表达明显增高，与rrPDGF-BB 组相比，不同浓度的CPhGs脂质体组均可不同程度下调α-SMA、Collagen I 和Collagen Ⅲ的mＲNA 表达，其中29. 45 mg·L － 1CPhGs 脂质体组下调作用最明显，且随着药物浓度的升高，其下调程度越明显。我们认为产生这种现象的原因在于浓度越高，其对rrPDGF-BB 引起的HSC 增殖的抑制效果越明显，越趋近于正常。因此，我们认为其能抑制HSC 增殖，促进其凋亡，以此来阻止HF 的形成。JNK 已显示对不同细胞类型的细胞增殖有积极的调节作用，JNK 通过负性调节作用来抑制静止HSC 的活化，从而阻止HSC 的增殖，刺激MAPK 信号通路，从而使其下游通路阻断，起到预防HF 的作用。本研究结果显示，与Normal 组比较， rrPDGF-BB组p-JNK 的蛋白表达量明显增高，表明rrPDGF-BB可通过影响MAPK 信号，使HSC 活化增殖。不同浓度的CPhGs 脂质体组，p-JNK 的蛋白表达量随着药物浓度的升高逐渐降低，且不同浓度的CPhGs 脂质体组p-JNK 的蛋白表达量与rrPDGF-BB 组比较，差异均有统计学意义。由此可见，CPhGs 脂质体可在一定程度上抑制rrPDGF-BB 诱导的HSC 增殖与活化，促进HSC 凋亡，从而抑制HF 的发生、发展。本研究结果为后续实验进一步研究CPhGs 脂质体抗HF 作用机制提供了扎实的理论基础。期望能够寻求更多抗HF的靶向给药途径，给HF 患者带来福音。参考文献:［1］ Huang Y，Deng X，Liang J，et al． Modulation of hepatic stellatecells and reversibility of hepatic fibrosis［J］． Exp Cell Ｒes，2017，352( 2) : 420 － 6．［2］ Zhao G N，Jiang D S，Li H，et al． Interferon regulatory factors: atthe crossroads of immunity，metabolism，and disease． ［J］． BiochimBiophys Acta，2015，1852( 2) : 365 － 78．［3］ Mederacke I，Hsu C C，Troeger J S，et al． Fate tracing revealshepatic stellate cells as dominant contributors to liver fibrosis independentof its aetiology［J］． Nat Commun，2013，4( 7) : 2823．［4］ Iwaisako K，Jiang C，Zhang M，et al． Origin of myofibroblasts inthe fibrotic liver in mice［J］． Proc Natl Acad Sci USA，2014，111( 32) : 3297 － 305．［5］ Liu T，Zhao J，Ma L，et al． Hepatoprotective effects of total triterpenoidsand total flavonoids from Vitis vinifera L against immunologicalliver injury in mice［J］． Evid Based Complement AlternatMed，2012，2012( 1) : 969 － 86．［6］ Yin C，Evason K J，Asahina K，et al． Hepatic stellate cells in liverdevelopment，regeneration，and cancer［J］． J Clin Invest，2013，123( 5) : 1902 － 10．［7］ Puche J E，Lee Y A，Jiao J，et al． A novel murine model to depletehepatic stellate cells uncovers their role in amplifying liverdamage in mice［J］． Hepatology，2013，57( 1) : 339 － 50．［8］ 宋阳，詹磊，黄成，等． 瞬时感受器电位离子通道香草素受体亚家族4 调控肝星状细胞活化增殖作用研究［J］． 中国药理学通报，2016，32( 5) : 681 － 7．［9］ 由淑萍，赵军，马龙，等． 肉苁蓉苯乙醇总苷对血小板衍生生长因子诱导的肝星状细胞增殖的影响及机制［J］． 中国药理学通报，2016，32( 9) : 1231 － 5．．［10］ Xu D D，Li X F，Li Y H，et al． TIPE2 attenuates liver fibrosisby reversing the activated hepatic stellate cells［J］． Biochem BiophysＲes Commun，2018，498( 1) : 199 － 206．［11］ 李伟伟，高海丽，宋新文，等． 吡咯烷二硫代氨基甲酸酯在二甲基亚硝胺诱导肝纤维化大鼠中的作用及机制［J］． 中华实用诊断与治疗杂志，2018，32( 1) : 5 － 9．［12］ 张扬武，罗伟生，陈姗，等． 枇杷叶熊果酸对大鼠肝星状细胞增殖抑制作用及对PPAＲ-γ、TGF-β1 表达的影响［J］． 中国药理学通报，2017，33( 4) : 517 － 21．

［摘要］　目的　探讨肉苁蓉苯乙醇总苷（ＣＰｈＧｓ）脂质体对重组大鼠血小板衍生生长因子－ＢＢ（ｒｒＰＤＧＦＢＢ）诱导的大鼠肝星状细胞（ＨＳＣ）增殖作用的影响及其抗肝纤维化的相关分子机制。方法　取生长状态良好的对数生长期ＨＳＣ用于实验，置于ＣＰｈＧｓ脂质体浓度为１１７．７９、５８．９０、２９．４５、１４．７２、７．３６、３．６８、１．８４、０．９２和０．４６ｍｇ／Ｌ的完全培养液，求出半数抑制浓度（ＩＣ５０）；ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ刺激后，采用四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ）法测定２９．４５、１４．７２、７．３６ｍｇ／Ｌ　ＣＰｈＧｓ脂质体对ＨＳＣ增殖的影响；采用实时荧光定量聚合酶链反应（ｑＲＴ－ＰＣＲ）检测α－平滑肌肌动蛋白（α－ＳＭＡ）、Ⅰ型胶原、ＡＴＦ－２ｍＲＮＡ的表达水平；采用Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法检测ＣＰｈＧｓ脂质体对ｐ－ｐ３８蛋白表达的影响。结果　（１）对细胞增殖的影响：对不同时间点结果分析显示，与Ｎｏｒｍａｌ组比较，细胞培养４８ｈ时，ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组ＨＳＣ细胞明显增多；ＣＰｈＧｓ脂质体各剂量组抑制ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ诱导的ＨＳＣ增殖作用，培养４８ｈ效率最高；对不同浓度结果分析显示，与ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组比较，不同浓度ＣＰｈＧｓ脂质体组均可抑制ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ诱导的ＨＳＣ－Ｔ６的增殖。（２）ｑＲＴ－ＰＣＲ结果：ＣＰｈＧｓ脂质体各剂量组间比较，随ＣＰｈＧｓ脂质体药物浓度增大，α－ＳＭＡ、Ⅰ型胶原和ＡＴＦ－２ｍＲＮＡ 水平显著下降，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５），其中以ＣＰｈＧｓ脂质体２９．４５ｍｇ／Ｌ组抑制效果最明显。（３）Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ分析结果：ｐ－ｐ３８蛋白的表达水平在ＣＰｈＧｓ脂质体不同浓度组表达均下降，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；ＣＰｈＧｓ脂质体各剂量组间比较，ｐ－Ｐ３８蛋白随ＣＰｈＧｓ脂质体干预剂量增大，表达水平显著下降（Ｐ＜０．０５）。结论　ＣＰｈＧｓ脂质体能抑制ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ诱导的大鼠ＨＳＣ增殖，从而起到抗肝纤维化的作用。［关键词］　肝星状细胞；肝纤维化；重组大鼠血小板衍生生长因子－ＢＢ；肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体肝纤维化（ｈｅｐａｔｉｃ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ，ＨＦ）是一种常见的慢性肝损伤过程，许多与肝损伤相关的因素都可以导致ＨＦ［１］。在ＨＦ病理过程中常出现以下症状：肝细胞坏死、结缔组织异常增生、肝循环紊乱等，最终导致肝硬化继而引发肝衰竭［２］。之前的研究报道指出，ＨＦ是一种可逆的病理现象，早期预防或治疗ＨＦ对慢性肝病的治疗有重要意义［３］。目前研究的重点是寻找疗效确切、不良反应小的药物，以延缓、抑制甚至逆转ＨＦ的进程［４］。一些临床实践和试验研究证明，中医药通过多成分、多路径、多层次、多目标的综合药理作用能减缓ＨＦ的进程［５－７］。肉苁蓉是名贵的补益类中药，分布于中国北部的干旱地区和沙漠地区［８］。脂质体作为载体在临床应用中具有安全性好、生物相容性好、载药及靶向效果明确的优点，也是最早用于靶向给药的载体［９］。本研究旨在探讨肉苁蓉苯乙醇总苷（ＣＰｈＧｓ）脂质体对重组大鼠血小板衍生生长因子（ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ）诱导的肝星状细胞（ｈｅｐａｔｉｃ　ｓｔｅｌｌａｔｅｃｅｌｌ，ＨＳＣ）增殖的作用，为肝纤维化的治疗提供依据。１　材料与方法１．１　材料　用薄膜分散二次包封法制备ｐＰＢ修饰的肉苁蓉总苷靶向脂质体，其粒径为２１２．７ｎｍ，电位３５～５０ｍＶ，包封率（３８．４６±７．８５）％，由本实验室保存。ＨＳＣ（中乔新舟），胎牛血清（美国Ｇｉｂｃｏ公司），青霉素（美国Ｈｙｃｌｏｎｅ公司），链霉素（美国Ｈｙｃｌｏｎｅ公司），ＤＭＥＭ 高糖培养基（美国Ｈｙｃｌｏｎｅ公司），四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ，美国Ｓｉｇｍａ公司），二甲基亚砜（ＤＭＳＯ，美国Ｓｉｇｍａ公司），磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ，ＢＩ公司），０．２５％胰酶（美国Ｈｙｃｌｏｎｅ公司），ＴＲＩｚｏｌ　Ｒｅａｇｅｎｔ（赛默飞公司），ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ　Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（赛默飞公司），ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　ＴａｑＴＭⅡ（ＴａＫａＲａ公司），ＰＩＰＡ裂解液（赛默飞公司），蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（ＰＭＳＦ，博士德生物），蛋白定量试剂盒（ＢｉｏＭＩＧＡ公司），十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）凝胶制备试剂盒（北京索莱宝公司），５×Ｔｒｉｓ－甘氨酸电泳缓冲液（北京索莱宝公司），１０×电转液（北京索莱宝公司），１０×ＴＢＳＴ（北京索莱宝公司），无水乙醇（天津大茂化学试剂厂），异丙醇（天津富宇精细化工有限公司），氯仿（天津大茂化学试剂厂），甲醇（天津市大茂化学试剂厂），辣根过氧化物酶标记山羊抗兔ＩｇＧ（中杉金桥），ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ（Ｒ＆Ｄ公司），４×蛋白上样缓冲液（北京索莱宝公司），兔抗β－ａｃｔｉｎ多克隆抗体（北京博奥森生物科技有限公司），兔抗ｐ３８丝裂原活化蛋白激酶（ＭＡＰＫ）多克隆抗体（北京博奥森生物科技有限公司），兔抗ｐ－ｐ３８ＭＡＰＫ多克隆抗体（北京博奥森生物科技有限公司）。１．２　方法１．２．１　细胞培养与传代　大鼠ＨＳＣ 在含有１００Ｕ／ｍＬ青霉素、１００ｍｇ／Ｌ链霉素和１０％胎牛血清的高糖ＤＭＥＭ 细胞培养液，于３７℃、５％ ＣＯ２培养箱中培养。细胞隔日换液，待生长融合至８０％～９０％时，使用０．２５％胰蛋白酶消化收集细胞，按１∶２进行传代培养，实验均采用对数生长期细胞。１．２．２　抑制率为５０％时的药物浓度计算　实验设９个ＣＰｈＧｓ脂质体系列浓度组和１个空白对照组，共１０组，每组３个复孔。ＣＰｈＧｓ脂质体系列浓度组剂量分别为１１７．７９、５８．９０、２９．４５、１４．７２、７．３６、３．６８、１．８４、０．９２和０．４６ｍｇ／Ｌ。将处于对数生长期，浓度为５×１０４／ｍＬ的ＨＳＣ－Ｔ６细胞悬液接种于９６孔板，每孔添加量为１００μＬ，每组设３个复孔，于３７℃、５％ＣＯ２培养箱中培养２４ｈ后，观察细胞生长状态，若贴壁则弃上清液，根据分组设计分别更换含１１７．７９、５８．９０、２９．４５、１４．７２、７．３６、３．６８、１．８４、０．９２和０．４６ｍｇ／ＬＣＰｈＧｓ脂质体的完全培养液和空白完全培养液。加药后轻晃混匀，放至培养箱继续培养４８ｈ，镜下观察细胞状态，拿至工作台，避光，每孔加浓度为５ｍｇ／ｍＬ的ＭＴＴ　２０μＬ，放至培养箱，４ｈ后，吸去孔里的液体，每孔加入ＤＭＳＯ　１５０μＬ，于摇床轻晃１０ｍｉｎ，用酶标仪于４９２ｎｍ 波长测定，记录吸光度（Ａ）值。计算各复孔Ａ 值能平均值，计算抑制率，以此找寻ＣｐｈＧｓ脂质体的最佳作用浓度。抑制率（％）＝（１－各浓度的平均Ａ 值）／空白组平均Ａ 值×１００％）；以ＣＰｈＧｓ脂质体作用浓度为横轴，细胞生长抑制率为纵轴，绘制ＣＰｈＧｓ脂质体作用于ＨＳＣ－Ｔ６的量效反应曲线，采用Ｐｒｏｂｉｔ分析计算５０％ 存活率的ＣＰｈＧｓ脂质体浓度，即为半数抑制浓度（ＩＣ５０）。１．２．３　细胞分组　（１）Ｎｏｒｍａｌ组；（２）ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组；（３）ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ＋２９．４５ｍｇ／Ｌ　ＣＰｈＧｓ脂质体组；（４）ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ＋１４．７２ｍｇ／Ｌ　ＣＰｈＧｓ脂质体组；（５）ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ＋７．３６ｍｇ／Ｌ　ＣＰｈＧｓ脂质体组。各组细胞均培养２４ｈ后进行后续实验。１．２．４　不同浓度ＣＰｈＧｓ脂质体对ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ诱导的ＨＳＣ增殖的影响　大鼠ＨＳＣ以１×１０５／ｍＬ密度接种至９６孔板，待细胞贴壁后进行分组干预，每组设３个复孔。分别培养２４、４８和７２ｈ，每孔加入２０μＬ的ＭＴＴ溶液，培养箱内３７℃培养４ｈ后，弃去ＭＴＴ溶液，再向各孔内加入１５０μＬ的ＤＭＳＯ，置于摇床室温摇动１０ｍｉｎ，待结晶充分溶解后，于酶标仪４９２ｎｍ波长处测定Ａ 值。抑制率＝［（模型组－空白组）－（用药组－空白组）］／（模型组－空白组）×１００％。１．２．５　实时荧光定量聚合酶链反应（ｑＲＴ－ＰＣＲ）检测α－平滑肌肌动蛋白（α－ＳＭＡ）、Ⅰ型胶原和ＡＴＦ－２的ｍＲＮＡ 的表达　Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒提取大鼠ＨＳＣ 总ＲＮＡ，经纯度及完整性鉴定后反转录反应生成ｃＤＮＡ。按照ｑＲＴ－ＰＣＲ 试剂盒说明书建立ｑＲＴ－ＰＣＲ反应体系，使用ｑＲＴ－ＰＣＲ 检测仪进行检测。ｑＲＴＰＣＲ热循环参数：９５℃预变性３０ｓ，９５ ℃变性５ｓ，６０℃退火３０ｓ，７２℃延伸４５ｓ，共４０个循环。结果分析以β－ａｃｔｉｎ为内参基因，确定每个样品、每个基因扩增的循环阈值（ＣＴ），按照２－△△ＣＴ计算目的基因的相对表达水平，所用引物序列见表１。１．２．６　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法分析ｐ－ｐ３８蛋白表达水平　收集细胞，运用ＲＩＰＡ 裂解液提取各组细胞总蛋白，ＢＣＡ法测定蛋白浓度，取相同质量的蛋白上样，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ转移至硝酸纤维素膜，５％的脱脂奶粉室温封闭１ｈ，一抗（１∶１　０００兔抗ｐ－ｐ３８多克隆抗体；１∶１　０００兔抗ｐ３８多克隆抗体）４ ℃摇床孵育过夜，ＴＢＳＴ漂洗３次，二抗（１∶２５　０００辣根过氧化物酶标记山羊抗兔ＩｇＧ）室温避光孵育１ｈ，ＴＢＳＴ漂洗３次后，电化学发光（ＥＣＬ）显影试剂盒曝光显影。利用图像分析软件Ｉｍａｇｅ　Ｊ对条带进行灰度值的测定，计算分析各组蛋白相对表达水平，以ｐ－ｐ３８与ｐ３８条带信号强度的比值表示ｐ－ｐ３８蛋白表达水平。１．３　统计学处理　采用ＳＰＳＳ　１７．０软件进行统计学分析。计量资料以ｘ±ｓ表示，两组间计量资料比较采用两独立样本ｔ检验，多组间计量资料比较采用单因素方差分析，以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。２　结　　果２．１　ＧＰｈＧｓ脂质体对ＨＳＣ的ＩＣ５０　由于ＣＰｈＧｓ脂质体药物浓度的递增，ＨＳＣ 的抑制率随之增加，当ＣＰｈＧｓ脂质体药物浓度为１１７．７９ｍｇ／Ｌ时，抑制率为（６９．０９±１．０６）％，经过Ｐｒｏｂｉｔ分析，ＣＰｈＧｓ脂质体药物的ＩＣ５０为２９．０６ｍｇ／Ｌ，见图１。２．２　不同时间、不同浓度ＧＰｈＧｓ脂质体对ｒｒＰＤＧＦＢＢ诱导的ＨＳＣ增殖的影响　ＭＴＴ实验结果显示在２４ｈ时，与Ｎｏｒｍａｌ组比较，ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组和不同浓度ＣＰｈＧｓ脂质体组Ａ 值显著升高，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；与ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组比较，除７．３６ｍｇ／ＬＣＰｈＧｓ脂质体组外，其余浓度ＣＰｈＧｓ脂质体组Ａ 值显著下降，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。在４８ｈ和７２ｈ时，与Ｎｏｍａｌ组比较，ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组和不同浓度ＣＰｈＧｓ脂质体组Ａ 值显著升高，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；与ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组比较，不同浓度ＣＰｈＧｓ脂质体组Ａ 值显著下降，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５），见表２。２．３　不同时间、不同浓度ＧＰｈＧｓ脂质体对ｒｒＰＤＧＦ － ＢＢ诱导的ＨＳＣ 增殖抑制的影响　在２４ｈ时，与２９．４５ｍｇ／Ｌ和１４．７２ｍｇ／Ｌ　ＣＰｈＧｓ脂质体组比较，７．３６ｍｇ／Ｌ　ＣＰｈＧｓ脂质体组抑制率显著降低，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。在４８ｈ和７２ｈ与２９．４５ｍｇ／Ｌ　ＣＰｈＧｓ脂质体组比较，１４．７２ｍｇ／Ｌ 和７．３６ｍｇ／Ｌ　ＣＰｈＧｓ脂质体组抑制率显著降低，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；与１４．７２ｍｇ／Ｌ　ＣＰｈＧｓ脂质体组比较，７．３６ｍｇ／Ｌ　ＣＰｈＧｓ脂质体组抑制率显著降低，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５），见表３。２．４　ＧＰｈＧｓ脂质体对ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ诱导的ＨＳＣα－ＳＭＡ、Ⅰ型胶原、ＡＴＦ－２ｍＲＮＡ 表达的影响　ｑＲＴＰＣＲ实验结果显示，与Ｎｏｒｍａｌ组比较，α－ＳＭＡ 和Ⅰ型胶原基因在ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组、１４．７２ｍｇ／Ｌ和７．３６ｍｇ／Ｌ　ＣＰｈＧｓ脂质体组表达显著增加，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；与ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组比较，α－ＳＭＡ和Ⅰ型胶原基因在不同浓度ＣＰｈＧｓ脂质体组表达下降，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。与Ｎｏｒｍａｌ组比较，ＡＴＦ－２基因在ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组和不同浓度ＣＰｈＧｓ脂质体组表达显著升高，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；与ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ 组比较，ＡＴＦ－２ 基因在不同浓度ＣＰｈＧｓ脂质体组表达下降，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５），见图２。２．５　ＧＰｈＧｓ脂质体对ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ诱导的ＨＳＣ　ｐｐ３８蛋白表达的影响　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ实验结果显示，与Ｎｏｒｍａｌ组比较，ｐ－ｐ３８蛋白在ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组和不同浓度ＣＰｈＧｓ脂质体组表达显著增加，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；与ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组比较，ｐ－ｐ３８蛋白在不同浓度ＣＰｈＧｓ脂质体组表达下降，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５），见图３。３　讨　　论　　ＨＦ是世界范围内的健康问题，５０％的肝癌患者死于ＨＦ［１０］。尽管ＨＦ发病率高，但目前尚无有效的治疗方法。目前抗ＨＦ的治疗策略的主要目的是抑制ＨＳＣ活化和增殖。血小板生长因子（ＰＤＧＦ）－ＢＢ存在于肝脏中，对ＨＳＣ的增殖有着较强的促进作用，能促进ＨＳＣ活化增殖及胶原分泌，是一个高度有效的ＨＳＣ促有丝分裂原，ＰＤＧＦ与其受体ＰＤＧＦＲ结合形成二聚体后，激活ＭＡＰＫ 信号通路，诱导ＨＳＣ持续活化；促进ＨＳＣ迁移、增殖的同时抑制其凋亡［１１］。ＰＤＧＦ信号中断，通过其受体阻断ＭＡＰＫ信号通路，ＨＳＣ的增殖和胶原的分泌受到抑制。有学者在研究羟基红花黄色素Ａ（ＨＳＹＡ）对ＨＦ的作用时发现，ＨＳＹＡ 对ＰＤＧＦ－ＢＢ诱导的ＨＳＣ的增殖有明显的抑制作用［１２］。本研究用５０μｇ／Ｌ的ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ刺激ＨＳＣ，所有实验分组在同一刺激因子作用下进行。ＭＴＴ实验结果显示：ＣＰｈＧｓ 脂质体作用２４ ｈ 抑制率为１０．７７％～３２．４５％，且抑制率与实验时间和药物浓度呈线性增加关系，４８ｈ抑制率为２６．５０％～５０．７３％，７２ｈ抑制率为２０．７５％～５４．６８％。从实验结果可以看出，实验时间的延长并没有使抑制率发生较大的改变，作者认为４８ｈ是药物的最佳反应时间。研究结果表明，不同浓度的ＣＰｈＧｓ脂质体均能抑制ＨＳＣ 的增殖。任何病因的肝损伤最终都会导致ＨＳＣ的活化、肌成纤维细胞分化转为ＨＦ。也就是说，肌成纤维细胞来自活化和增殖的ＨＳＣ，且被视为是ＨＦ形成的中介［１３］。而ＨＳＣ的活化则是ＨＦ的主要过程［１４］。活化的ＨＳＣ通过积累产生ＥＣＭ，分泌细胞因子，增强趋化能力进而促进肝上皮细胞的再生［１５］。在慢性肝病中，ＨＳＣ的反复激活导致肝纤维化，其特征是广泛的瘢痕形成和干扰肝脏正常结构与功能。最近的临床试验提示，ＨＦ在清除潜在病原体过程中是可逆的［１６］。肝损伤后ＨＳＣ经历一个复杂的从静止状态向肌成纤维细胞转换或激活过程，其中α－ＳＭＡ 在肌成纤维细胞分化中起作用。α－ＳＭＡ降低了收缩力和Ⅰ型胶原合成并抑制伤口收缩。Ⅰ型胶原和α－ＳＭＡ被认为是肝纤维化中诱导ＨＳＣ活化的标志物。在四氯化碳（ＣＣｌ４）所致的ＨＦ研究中发现，ＨＳＣ活化过程中α－ＳＭＡ 和Ⅰ型胶原表达上调［１７］。而最近的研究表明，ＨＳＣ的活化可以由几个促有丝分裂原推动，包括ＰＤＧＦ、胰岛素样生长因子－１（ＩＧＦ－１）［１８］和结缔组织生长因子（ＣＴＧＦ）［１９］。在关于ＴＲＰＭ７ 通道调节ＰＤＧＦ－ＢＢ诱导的ＨＳＣ 增殖的研究数据表明，ＴＲＰＭ７可降低α－ＳＭＡ和Ⅰ型胶原的表达，抑制ＨＦ［２０］。ＡＴＦ－２参与多条信号通路的传导，同时在肝组织表达的ＡＴＦ－２的碱基在ｐ３８磷酸化后出现转录活性和ＤＮＡ结合的增加。本研究探讨不同浓度ＣＰｈＧｓ脂质体对ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ诱导的ＨＳＣ增殖的影响。ｑＲＴＰＣＲ扩增检测α－ＳＭＡ、Ⅰ型胶原、ＡＴＦ－２ｍＲＮＡ 结果提示，与Ｎｏｒｍａｌ组相比，ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组α－ＳＭＡ、Ⅰ型胶原、ＡＴＦ－２ｍＲＮＡ表达明显增高；与ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组相比，不同浓度的ＣＰｈＧｓ脂质体均可不同程度下调α－ＳＭＡ、Ⅰ型胶原、ＡＴＦ－２ｍＲＮＡ表达，其中２９．４５ｍｇ／Ｌ　ＣＰｈＧｓ脂质体组下调作用最明显，α－ＳＭＡ，Ⅰ型胶原ｍＲＮＡ 与Ｎｏｒｍａｌ组比较，差异无统计学差异，作者认为产生这种现象的原因在于浓度越高，其对ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ引起的ＨＳＣ增殖的抑制效果越明显，越趋近于正常。作者认为ＣＰｈＧｓ脂质体能有效抑制ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ刺激的ＨＳＣ中Ⅰ型胶原和ＡＴＦ－２ｍＲＮＡ表达、下调α－ＳＭＡ　ｍＲＮＡ表达，进而减少ＥＣＭ合成与分泌，阻止ＨＦ的形成。此外，ＭＡＰＫ信号转导途径及其子系统ｐ３８通路参与ＨＳＣ的活化，因而可能成为治疗ＨＦ的靶点。ｐ３８ＭＡＰＫ是ＭＡＰＫ 家族成员之一，ｐ３８是由各种刺激引起的许多细胞的传感器，且在调节棕色脂肪细胞、肌肉细胞和肝细胞的能量平衡过程中起着重要的作用，ｐ３８ＭＡＰＫ也被认为在调节炎性因子方面扮演重要角色。因此，ｐ３８ＭＡＰＫ激活可能在ＨＳＣ损伤与炎症过程中发挥作用。研究证明ＰＤＧＦ－ＢＢ可通过ＭＡＰＫ信号通路诱导ＨＳＣ细胞活化与增殖［２１］。栀子苷可抑制ｐ－ｐ３８蛋白的表达从而起到抑制ＨＦ的作用［２２］。本研究结果显示，与Ｎｏｒｍａｌ组比较，ｒｒＰＤＧＦＢＢ组ｐ－ｐ３８的蛋白表达水平明显增高，表明ｒｒＰＤＧＦＢＢ可通过影响ＭＡＰＫ信号而使ＨＳＣ活化增殖。不同浓度的ＣＰｈＧｓ脂质体组，ｐ－ｐ３８的蛋白表达水平随着药物浓度的升高逐渐降低，且将不同浓度的ＣＰｈＧｓ脂质体组ｐ－ｐ３８的蛋白表达水平与ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ组比较，差异均有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。由此可见，ＣＰｈＧｓ脂质体可在一定程度上抑制ｒｒＰＤＧＦ－ＢＢ诱导的ＨＳＣ增殖与活化，从而抑制ＨＦ的形成。当前，对ＨＦ的了解较少，全新的方法及技术手段将会对ＨＦ进行深入研究，从而对干预、早期诊断和治疗ＨＦ提供全新的治疗策略。参考文献［１］ 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【摘要】目的：比较肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体与未脂质化的肉苁蓉苯乙醇总苷原料药对肝纤维化大鼠肝脏的保护作用。方法：采用真空冷冻干燥法制备肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体，测量其粒径、药物含量及包封率。将肝纤维化模型大鼠随机分组后给予相应受试物，比较空白对照组、模型组、空白脂质体组、肉苁蓉苯乙醇总苷原料药组、肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体组各组大鼠的血清肝功能指标(AST、ALT)、肝脏纤维化指标(LN、H A、PC III、IV-C)，Masson染色观察各组大鼠肝纤维化病变程度，实时荧光定量PCR(qPCR)检测大鼠肝组织Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ mRNA表达，Western blot法检测大鼠肝脏组织α-平滑肌肌动蛋白(α-sma)、Collagen Ⅰ蛋白表达。结果：肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体组大鼠血清AST、ALT、LN、HA、PC III、IV-C等指标总体较肉苁蓉苯乙醇总苷原料药组及空白脂质体组大鼠下降(P<0.01)，肉苁蓉总苷脂质体组、肉苁蓉总苷原料药组大鼠肝组织中胶原纤维明显减少，其中肉苁蓉总苷脂质体组大鼠肝组织结构恢复良好，趋向正常。与肉苁蓉苯乙醇总苷原料药相比，肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体可使大鼠肝脏组织Collagen Ⅰ、Collagen III mRNA表达下降(P<0.01)，α-sma、Collagen Ⅰ蛋白表达下降(P<0.05)。结论：肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体对模型大鼠的肝脏保护优于未脂质体化的肉苁蓉苯乙醇总苷原料药及空白脂质体，其机制可能与减少α-sma、Collagen Ⅰ合成有关。【关键词】肉苁蓉苯乙醇总苷；脂质体；大鼠；肝纤维化近年来，化学及药理学研究显示，肉苁蓉苯乙醇总苷(Cistanche phenylethanoid glycosides，CPhGs)是肉苁蓉发挥药效的主要物质基础之一[1]。CPhGs具有抗氧化、抗抑郁、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗菌和免疫调节等多种生物活性， 本课题组的前期研究发现，CPhGs对牛血清白蛋白诱导的肝纤维化大鼠有一定的预防和治疗作用[2]。有文献报道，CPhGs存在吸收差、口服利用度低等缺点，使其应用受到影响[3]。脂质体药物递送系统具有生物相容性良好，改善药物的稳定性、溶解性，增强药物疗效，降低给药频率的作用，近年来在基础及临床医学领域逐渐受到关注[4]。因此本文以脂质体为药物载体包裹中药成分CPhGs 制成CPhGs 脂质体，然后应用于肝纤维化模型动物考察CPhGs 脂质体对肝纤维化大鼠血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(aspartateaminotransferase， AST)、层粘连蛋白(Laminin， LN)，透明质酸酶(Hyaluronidase， HA)， III 型前胶原(Procollagen III， PC III) 和IV 型胶原(Collagen-IV，IV-C)含量的影响，肝脏组织胶原纤维分布情况的变化，胶原蛋白Ⅰ(Collagen Ⅰ)和胶原蛋白III(CollagenIII)mRNA 表达含量的差异，以及α-平滑肌肌动蛋白(α smooth muscle actin，α-sma)和Collagen Ⅰ蛋白表达水平的差异，阐明其对肝脏的保护作用。1 材料与方法1.1 试剂牛血清白蛋白购于美国Sigma-Aldrich公司；谷丙转氨酶(ALT/GPT)测试盒、谷草转氨酶(AST/GOT)测试盒购自南京建成生物工程研究所；大鼠Hyaluronidase-1(HYAL1) ELISA Kit，大鼠laminin(LN) ELISA Kit 购于武汉华美生物工程有限公司；大鼠PCⅢ(ProcollagenⅢ) ELISA Kit， Rat COL4(Collagen Type Ⅳ) ELISAKit购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；辣根酶标记山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Precision Plus ProteinTM Dual Color Standards购于美国BIO-RAD公司；兔抗β-actin多克隆抗体、兔抗α-SMA多克隆抗体、兔抗Collagen Ⅰ多克隆抗体购于北京博奥森生物科技有限公司。1.2 仪器CK-40 型荧光倒置显微镜购于日本Olympus 公司；全波长自动酶联免疫反应检验测试仪购于美国Thermo Scientific公司；FluorChem E化学发光高灵敏凝胶成像仪购于美国Protein Simple 公司；Zeta sizerNano series ZS90粒径分析仪购于英国Malvern公司。1.3 CPhGs 脂质体的制备采用薄膜分散法制备CPhGs 脂质体。称取卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇(质量比为1∶2∶2)， 溶于适量氯仿和甲醇混合溶剂中(体积比为2∶1)，在49~50 ℃下旋转使其成为膜状，加入250μg/mL的CPhGs不断旋转水化，使磷脂膜转入水中形成脂质体，所得脂质体用0.45 μm的微孔滤膜挤压4~5次，0.22 μm的微孔滤膜挤压18~20次，真空冷冻干燥24 h，即得粒径均匀的苯乙醇总苷脂质体。使用激光粒度分析仪检测其粒径分布，在透射电镜下观察粒子外形，HPLC法测定其载药量及包封率。1.4 实验动物、模型制备和给药SPF级雄性健康SD大鼠，体质量180~220 g，由新疆医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号SCXK(新)2018-0002。SPF环境实验动物使用许可证号SYXK( 新)2018-0003， 饲养受控环境条件为室温25 ℃、光/暗周期12 h，大鼠自由进食与饮水，喂饲标准颗粒饲料，常规适应性饲养3 d后使用。65 只SD 大鼠随机分为2 组，即正常对照组13只，BSA致敏模型组52只。模型组大鼠采用课题组前期[2]建立的方法制备大鼠免疫性肝纤维化模型，造模分为致敏阶段和尾静脉攻击阶段。致敏阶段：大鼠均多点皮下注射sc含BSA 9 g/L弗氏不完全佐剂，每次0.5 mL，共5次。前2次注射间隔为14 d，后3次注射间隔为7 d。末次致敏注射后1周，每只大鼠于眼内眦静脉丛采血，采用双向琼脂扩散法检测大鼠血清抗BSA 抗体。攻击阶段：剔除模型组中4 只未检测到BSA 抗体的大鼠，余48 只大鼠随机分为4 组即模型组、空白脂质体组、肉苁蓉苯乙醇总苷原料药组、肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体组，每组12只，继续尾静脉注射BSA，每周2次，连续5周，注射剂量由每只2 mL逐渐递增至每只4 mL。正常对照组大鼠尾静脉注射生理盐水尾静脉攻击造模同时按设定剂量灌胃给药每日1次，肉苁蓉苯乙醇总苷原料药组、肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体组给予相当于肉苁蓉苯乙醇总苷原料药物量125 mg/kg灌胃受试物(剂量参照文献)[2]，正常对照组和模型组灌胃等体积蒸馏水，空白脂质体组按肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体组脂质体的量给药。造模结束后继续给予受试物4 周，每日1 次，总实验周期共计15周。末次给药后，禁食不禁水，24 h后按3~4 mL/kg用10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉采血，4 ℃放置2 h后以3 000 r/min离心10 min，留取血清待检；处死所有大鼠，迅速剖取肝脏相同部位组织，以生理盐水漂洗后，一部分用作组织病理学Masson染色，另一部分存于冻存管投于液氮并在-80 ℃条件下保存用作实时荧光定量PCR和Western blot检测。1.5 血清生化指标检测取大鼠血清样品采用微板法检测各组大鼠血清中ALT、AST 浓度，ELISA 法检测中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C浓度的变化。1.6 Masson 染色切取肝脏中间部分肝组织(约1 cm3)用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切成4~5 μm 薄片，Masson 染色，在光学显微下观察肝脏组织胶原纤维分布情况。1.7 实时荧光定量PCR 检测大鼠肝组织Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ mRNA 表达的影响分别取每只大鼠肝组织30 mg，经匀浆后用Trizol提取各组肝组织中的总RNA，逆转录后进行实时荧光定量PCR Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ mRNA检测，程序为：预变性95 ℃、30 s；变性95 ℃、3 s，退火60 ℃、30s，总共40个循环。引物由华大基因设计合成。Collagen Ⅰ：上游5′-TGTTGGTCCTGCTGGCAAGAATG-3′， 下游5′-GTCACCTTGTTCGCCTGTCTCAC-3′。Collagen Ⅲ：上游5′-GACACGCTGGTGCTCAAGGAC-3′，下游5′-GTTCGCCTGAAGGACCTCGTTG-3′。目的基因CT值经同一样本的内参基因校正后计算各组间每个基因的ΔCT，通过2-ΔΔCT 计算组间对应基因的表达差异。1.8 Western blot 检测大鼠肝组织α-sma 和Collagen Ⅰ蛋白表达水平分别取每只大鼠肝组织30 mg，经匀浆后用RIPA裂解液及离心处理，提取各组肝组织中的总蛋白，上样于聚丙烯酰胺凝胶进行还原性SDS-PAGE电泳，湿转(PVDF 膜)，200 mA 恒流电转90 min。封闭液(5%脱脂奶粉)封闭PVDF膜过夜，用1×TBST缓冲液充分振荡清洗，TBST稀释抗体，一抗稀释度为：α-sma，1∶ 5 000； Collagen Ⅰ ， 1∶ 5 000； β-actin， 1∶5 000。ECL显色。FluorChem E 化学发光高灵敏凝胶成像仪上检测条带灰度值。蛋白相对表达水平=目的条带灰度/β-actin条带灰度×100%1.9 统计学分析应用SPSS 16.0软件进行统计分析，各组数据结果以xˉ±s 表示，计量资料采用方差分析，组间比较采用LSD法，等级资料采用秩和检验，检验水准α=0.05。2 结果2.1 肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体的物理性质采用前述方法制得的肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体的粒径为(207.7 ± 2.31) nm， Zeta 电位为(-61.5 ± 3.18)mV，图1~3分别为肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体的透射电镜图像、粒度分布、Zeta电位分析图谱，可见表面有厚度均匀的包衣包裹，且粒度分布均匀。肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体载药量为(3.77±0.07)%，包封率为(37.2±0.30)%。2.2 大鼠肝功能生化指标变化大鼠血清肝功能生化指标ALT、AST浓度的变化见表1， 与正常对照组相比较， 模型组大鼠血清ALT、AST浓度显著增加(P<0.05)，且差异具有统计学意义；与模型组相比较，肉苁蓉总苷脂质体组、肉苁蓉总苷原料药组均能显著降低模型大鼠血清ALT、AST浓度(P<0.01)，空白脂质体组ALT、AST浓度下降不明显(P>0.05)；与肉苁蓉总苷脂质体组比较，空白脂质体组、肉苁蓉总苷原料药组ALT、AST浓度显著升高(P<0.01)，差异具有统计学意义。2.3 大鼠血清LN、HA、PC III 和IV-C 浓度比较大鼠血清LN、HA、PC III和IV-C浓度的比较见表2，与正常对照组相比较，模型组大鼠血清中LN、IV-C、HA、PC III浓度显著增加(P<0.05)。与模型组相比较，肉苁蓉总苷脂质体组、肉苁蓉总苷原料药组均能显著降低模型大鼠血清中LN、HA、PC III浓度(P<0.01)，空白脂质体组LN、HA、PC III浓度无明显变化(P>0.05)；与肉苁蓉总苷脂质体组相比较，肉苁蓉总苷原料药组血清中PC III 浓度变化不明显(P>0.05)，HA 浓度显著增加(P<0.01)，LN 水平有所上升(P<0.05)；与模型组相比较，肉苁蓉总苷脂质体组能显著降低大鼠血清中IV-C浓度(P<0.01)，肉苁蓉总苷原料药组能降低大鼠血清中IV-C浓度(P<0.05)；肉苁蓉总苷原料药组大鼠血清中IV-C浓度高于肉苁蓉总苷脂质体组(P<0.01)。2.4 大鼠肝组织Masson 染色结果Masson胶原染色结果见图4，显示正常对照组的大鼠肝组织并无明显的异常，未见炎细胞浸润，肝小叶构造清晰而完整，肝细胞呈条索状分布，未见有不规则血窦，汇管区无扩大，肝脏汇管区有极少量胶原纤维存在，肝小叶间未见纤维组织。与正常对照组相比较，模型组大鼠肝组织中纤维明显增多，分布广泛，可相互连接形成较粗大的纤维间隔，多位于汇管区和血管周围。肉苁蓉总苷脂质体组、肉苁蓉总苷原料药组大鼠肝组织中胶原纤维明显减少，其中肉苁蓉总苷脂质体组组肝组织结构恢复良好，趋向正常，效果优于肉苁蓉总苷原料药组。2.5 大鼠肝组织Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ mRNA表达情况qPCR 检测结果见图5，显示模型组大鼠肝组织ECM调节因子(Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ)mRNA的表达水平较正常对照组大鼠肝组织明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。肉苁蓉总苷脂质体组、肉苁蓉总苷原料药组与模型组相比，Collagen Ⅰ、Collagen ⅢmRNA的表达水平显著降低(P<0.01)，空白脂质体组较模型组无显著性差异；与肉苁蓉总苷脂质体组相比，肉苁蓉总苷原料药组肝组织Collagen Ⅰ、CollagenⅢ mRNA表达水平显著升高(P<0.01)。2.6 各组大鼠肝组织α-sma 和Collagen Ⅰ蛋白表达情况Western blot检测结果见图6，显示与正常对照组相比，模型组大鼠肝组织α-sma和Collagen Ⅰ蛋白的表达水平明显增加(P<0.05)。与模型组相比较，肉苁蓉总苷脂质体组、肉苁蓉总苷原料药组显著降低了肝组织α-sma和Collagen Ⅰ蛋白的表达，空白脂质体组α-sma和Collagen Ⅰ蛋白表达水平较模型组相比无显著性差异；与肉苁蓉总苷脂质体组相比，肉苁蓉总苷原料药组肝组织α-sma和Collagen Ⅰ蛋白的表达水平明显增加(P<0.05)。3 讨论肝纤维化是肝脏对各种慢性刺激进行损伤修复时发生的病理变化， 其特征为细胞外基(extracellularmatrix，ECM)合成增多而降解相对减少，导致其在肝内过多沉积[5]。目前抗肝纤维化的主要策略包括：治疗原发病，抑制ECM 增生，促进ECM 降解，抑制HSCs活化与诱导其凋亡[6]。现代药理研究表明，肉苁蓉有润肠通便、保肝、抗骨质疏松、抗氧化、抗衰老、抗疲劳等作用[7]。其中起主要作用的一类成分便是苯乙醇苷类物质。但是有研究发现，苯乙醇总苷渗透性差，肠道吸收不良、体内生物利用度低，口服剂量(100 mg/kg)后大鼠血清中松果菊苷水平极低， 绝对生物利用度仅为0.83%[8-9]。脂质体靶向递药系统能在病变局部形成相对较高的药物浓度，而脂质体就是其中一种重要的纳米微粒，可提高药物稳定性，增加药物的溶解度[10]。Zhu[11]等人研究发现，与高良姜素原料药相比，高良姜素脂质体能够更好地在CCl4致小鼠肝毒性方面起到保护作用。本实验Masson染色结果显示，模型组大鼠纤维组织明显增生并向肝小叶内伸展，分布广泛，可相互连接形成较粗大的纤维间隔，肉苁蓉总苷脂质体组大鼠肝组织结构恢复良好，趋向正常，且效果优于肉苁蓉总苷原料药组。实验中损伤模型大鼠的血清AST、ALT均明显升高，肉苁蓉总苷原料药组、肉苁蓉总苷脂质体药物组对大鼠肝功能均有所改善，尤其以肉苁蓉总苷脂质体药物组的改善情况最为理想，较接近于正常组水平。肉苁蓉总苷脂质体组能够更有效的降低肝纤维化指标(LN、HA、PCⅢ、IV-C)，较其他组更接近于正常水平，但肉苁蓉总苷原料药组稍差。提示肉苁蓉总苷脂质体组能够改善肝纤维化大鼠的一般情况及肝功能，缓解肝脏纤维化程度，其作用强于相同剂量的肉苁蓉总苷原料药组，Masson 染色结果也显示，肉苁蓉总苷脂质体组胶原沉积较原料药组有所减轻，说明肉苁蓉总苷脂质体组对抗肝细胞损伤作用比纯药有着明显优势，对肝脏保护，特别是对肝细胞保护有着确切的作用。在肝纤维化初期，ECM主要成分由正常Ⅰ、Ⅳ型胶原为主转变为Ⅰ、Ⅲ型胶原所占比例增大[12]。当HSC被激活后，α-SMA表达大量增加，并附着于假小叶增生的纤维膈内，与HSC的活化、增殖、复制呈正相关，是HSC活化的特有标志物[13]。本实验研究结果显示，与肉苁蓉总苷脂质体组相比，肉苁蓉总苷原料药组大鼠肝组织α-sma和Collagen Ⅰ蛋白表达水平显著升高，提示可能是由于脂质体通过与靶细胞内吞、融合、释放和吸附过程，增加肉苁蓉总苷原料药体内稳定性，从而达到提高保肝作用。综上可见，肉苁蓉总苷脂质体组具有更强的抗肝纤维化作用。能够使肝靶向性显著增强，从而达到更好的保护肝脏细胞的作用。无论从肝功能数据还是病理结果分析均显示肉苁蓉总苷脂质体组均优于肉苁蓉总苷原料药组对肝纤维化大鼠肝脏的保护。参考文献[1] 由淑萍, 赵军, 马龙, 等. 肉苁蓉乙醇提取物抗大鼠免疫性肝纤维化的作用及其机制[J]. 中国药理学与毒理学杂志,2016, 30(5): 504-510.[2] 由淑萍, 赵军, 木克热木·吐地买提, 等. 肉苁蓉苯乙醇苷类成分对BSA诱导的肝纤维化大鼠转化生长因子β1表达的影响[J]. 癌变·畸变·突变, 2015, 27(6): 409-414.[3] 闫暾, 齐海平, 常欣荣, 等. 蒙药肉苁蓉提取物稳定性研究[J]. 中国民族医药杂志, 2018, 24(10): 43-45.[4] 汤晗霄, 赵天文, 郑婷, 等. 脂质体肝靶向递药系统及其在肝脏疾病中的研究进展[J]. 世界华人消化杂志, 2016, 24(31):4238-4246.[5] 张楚焌, 孙天石, 董一昕, 等. 甘参复方对大鼠肝星状细胞增殖和胶原合成的影响[J]. 中医学报, 2019, 34(5): 959-962.[6] SETO W K, LEE C F, LAI C L, et al. 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【摘要】目的： 研究肉苁蓉苯乙醇总苷(CPhGs)的抗肝癌作用，并探讨其可能的作用机制。方法：采用前肢右侧腋部皮下注射法建立小鼠肝癌H22荷瘤模型，实验设空白对照组、肝癌H22荷瘤模型组、肝复乐阳性治疗组(1 351.5 mg/kg)、CPhGs高剂量组(500mg/kg)、中剂量组(250 mg/kg)、低剂量组(125 mg/kg)，共6组，每组10只。除空白对照组和模型组外，其余各组分别灌胃给予肝复乐或CPhGs，连续10 d。期间监测小鼠的一般状况，观察各组H22荷瘤小鼠瘤体生长情况，实验结束时，摘眼球取血，酶联免疫(ELISA)法检测血清白介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和甲胎蛋白(AFP)含量；分离脾脏、肝脏，称质量，计算脏器系数；完整剥取瘤体，计算各组小鼠的肿瘤抑制率；HE染色观察瘤体病理组织学变化。结果：荷瘤模型组动物腋下肿瘤出现早且生长最快，CPhGs低、中剂量组次之，高剂量组和阳性治疗组瘤体生长较慢。与模型组比较，CPhGs中、高剂量组瘤质量均明显降低(P<0.05)，各剂量组抑癌率随CPhGs剂量增加依次升高(P<0.05)；阳性治疗组和CPhGs各剂量组脾脏系数均明显升高及肝脏系数均明显降低(P<0.05)；CPhGs中、高剂量组和阳性治疗组IL-2含量均明显升高(P<0.05)，而AFP含量均明显降低(P<0.05)；CPhGs各剂量组和阳性治疗组TNF-α含量均明显降低(P<0.05)。病理结果发现CPhGs各剂量组小鼠肝癌细胞生长受到抑制、数目较少、异质性降低、并伴有大量坏死细胞。结论：CPhGs能降低肝癌H22荷瘤小鼠肝脏损伤，并对其肿瘤生长有抑制作用，可能与CPhGs降低荷瘤小鼠血清中AFP含量及提高荷瘤小鼠免疫能力有关。【关键词】肉苁蓉；苯乙醇总苷；H22细胞；肝癌肉苁蓉(cistanche)主产于新疆、内蒙古阿拉善盟，素有“沙漠人参”之美誉，具有极高的药用价值，是[1] 中国传统的名贵中药材。始载于《神农本草经》，被列为上品，其味甘、咸，性温，具有补肾阳、益精血、润肠通便的作用，常用于治疗男子阳痿、女子不[2] 孕、腰膝冷痛、血枯便秘等症。国内学者对肉苁蓉的化学成分进行了大量的研究，包括苯乙醇总苷(phenylethanol glycosides from cistanche，CPhGs)、环烯醚萜类、木脂素类、多糖、生物碱等，其中最主要的[3-4] 成分为CPhGs ，现代药理研究表明CPhGs具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、增强记忆、助阳等多种药理活性，同时课题组成员前期对CPhGs进行的大量研究表明CPhGs具有抗肝纤维化的作[5-7] 用。本实验用肉苁蓉药材中分离得到的CPhGs，研究其对肝癌H22荷瘤小鼠的抗肝癌作用，旨在为CPhGs的抗肝癌作用机制及相关健康产品及药品的开发提供依据。1 材料与方法1.1 受试物及实验动物肉苁蓉苯乙醇总苷(CPhGs)由新疆药物研究所赵军[8] 研究员提取分离并鉴定，纯度为70% ，试验时用0.5%羧甲基纤维素钠(0.5% CMC-Na)溶解，配制成不同浓度，4 ℃保存，1周内使用。SPF级昆明种小鼠，雄性，60只，体质量18~22g，购自新疆医科大学实验动物研究中心，合格证号为SCXK(新)2016-0002，使用许可证号为SYXK(新)2016-0003。1.2 细胞株小鼠H22肝癌细胞株，由武汉普诺赛生命科技有限公司提供，货号CL-0341。1.3 仪器及主要试剂低速离心机(70L-5-A型，上海安亭)；CO 培养箱2(Heal Force，HF240)；电热恒温水槽(DK-8D，上海一恒科技有限公司)；酶标仪(Bio-rad)；游标卡尺(上海将来实验设备有限公司)；电子天平(常州万泰天平仪器有限公司)。肝复乐为康普药业股份有限公司产品(国药准字Z20060389)；RPMI-1640培养基和1%双抗(以色列BI公司)；胎牛血清(Gibco，美国)；0.4%台盼蓝和4%多聚甲醛(北京索莱宝)；小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素2(IL-2)、甲胎蛋白(AFP)ELISA试剂盒(武汉华美)。1.4 试验方法1.4.1 肝癌H22荷瘤小鼠模型的建立●于37 ℃复苏H22细胞，离心弃上清，加入新鲜RPMI-1640完全培养基重悬细胞快速复苏，体外培养活细胞达95%以6 上，至细胞密度达1×10 /mL时接种于小鼠腹腔，每只0.2 mL。约8~l0 d传代一次。无菌抽取培养至8 d左右的小鼠腹腔H22瘤液，生理盐水稀释调整瘤细胞数7 为l×10 /mL，充分混匀，备用。除空白对照组在同部位注射等量生理盐水外，其余各组小鼠经消毒后，于其前肢右侧腋下接种H22瘤细胞悬液， 每只0.2[9-10] mL ，造模24 h后每天观察瘤体生长情况。1.4.2 分组及给药●随机将上述造模的H22荷瘤小鼠分为5组，分别为模型组，阳性治疗组(肝复乐1 351.5[11] mg/kg) ，CPhGs高(500 mg/kg)、中(250 mg/kg)、低(125mg/kg)剂量组，每组10只。于造模24 h后开始灌胃给药，除空白对照组和模型组给予同体积的0.5% CMCNa溶液外，其余各组分别按照给定剂量灌胃给予阳性[12-13] 药物或CPhGs，连续10 d 。期间每天观察荷瘤小鼠精神活动状态、右腋膨隆大小及出现时间、毛色及食欲等情况。末次给药24 h后，称质量，摘眼球取血，分离血清备用；颈椎脱臼法处死小鼠，分离脾脏、肝脏，称质量，计算肝脾系数；完整剥取瘤体，滤纸拭干净后称质量，计算各组小鼠的肿瘤抑制率；瘤体组织行病理组织学检测。1.4.3 检测指标●①脾脏和肝脏系数测定：各组小鼠处死后分别剪取脾脏和肝脏并称质量，计算脏器系数，脏器系数=脏器质量/小鼠体质量×100%。②瘤质量及抑瘤率测定：末次给药24 h后，颈椎脱臼法处死小鼠并称体质量，完整剥取瘤体，用滤纸擦拭干净后置电子天平上称瘤质量，根据瘤质量计算各给药组小鼠的肿瘤抑制率，抑癌率=(模型组瘤质量-实验组瘤质量)/模型组瘤质量×100%。③摘眼球取血后，分离血清-80 ℃保存待检。按ELISA试剂盒说明书检测血清中IL-2、TNF-α和AFP含量。④肿瘤组织病理学检查：各组瘤体用4%多聚甲醛固定24 h后，石蜡包埋切片，常规HE染色，在光镜下观察肿瘤组织病理学改变，以肿瘤细胞坏死的面积大小初步判定CPhGs药物的治疗效果。1.5 统计学方法应用SPSS 17.0软件进行统计分析，各组数据结果以 x-±s 表示，以单因素方差分析进行多组间数据比较，检验水准α=0.05。2 结●果2.1 小鼠的一般情况观察给药前，各组间小鼠体质量差异均无统计学意义(P>0.05)。模型组在试验过程中由于灌胃操作有2只小鼠死亡。给药后，与空白对照组比较，模型组小鼠体质量随肿瘤的生长而增加，但差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，阳性治疗组和CPhGs各剂量组小鼠体质量均有一定的下降，但差异无统计学意义(P>0.05)。试验第4 d开始，小鼠腋下开始出现膨隆，动物精神活动状态变差，对外界刺激反应迟钝，食欲减退，毛色变暗淡。模型组最先出现肿瘤块，且生长速度最快，以上反应最明显，CPhGs低、中剂量组次之，高剂量组和阳性治疗组肿瘤生长较慢，生存质量较好，未见明显的不良反应(见表1)。2.2 肉苁蓉CPhGs对H22荷瘤小鼠脾脏和肝脏系数的影响表2结果显示，与空白对照组相比，模型组脾脏系数明显减少、肝脏系数明显增大(P均<0.01)；与模型组比较，阳性治疗组、CPhGs各剂量组脾脏系数明显增大、肝脏系数明显降低(P均<0.01)，表明CPhGs可在一定程度上提高荷瘤小鼠的免疫功能，抑制肝脏受损。2.3 肉苁蓉CPhGs对H22荷瘤小鼠瘤体生长的影响表3结果显示，与模型组比较，阳性治疗组与CPhGs中、高剂量组H22荷瘤小鼠瘤质量明显下降，差异具有统计学意义(P均<0.01)，阳性治疗组及CPhGs中、高剂量组肿瘤抑制率分别为56.91%、52.97%和35.80%。2.4 肉苁蓉CPhGs对H22荷瘤小鼠血清IL-2、TNF-α和AFP含量的影响由表4可见，与空白对照组比较，模型组TNF-α和AFP含量显著增加， 差异均具有统计学意义(P均<0.05)；与模型组比较，阳性治疗组与CPhGs中、高剂量组IL-2含量均明显增加(P均<0.05)；阳性治疗组和CPhGs各剂量组TNF-α含量均明显减少(P<0.05)；阳性治疗组与CPhGs中、高剂量组AFP含量均明显下降(P<0.05)； CPhGs高剂量组IL-2含量、TNF-α含量及AFP含量与阳性治疗组更接近，但差异无统计学意义(P>0.05)。提示肉苁蓉CPhGs可促进IL-2的表达，抑制TNF-α与AFP的表达，且高剂量组效果更好。2.5 肿瘤组织病理学观察大体可见：模型组瘤体较大，表面颜色淡红，质地较软，与周围组织分界较清楚，剖面渗血较多。CPhGs各剂量组肿瘤组织边缘区毛细血管明显减少，肿瘤瘤体较小，表面灰白，质地较韧，剖面灰白，中央区可见坏死，切面渗血较少。光镜HE染色(图1)可见：模型组荷瘤小鼠的癌组织中，有大量的肿瘤细胞，细胞排列紧密，细胞核着色均匀，形态清晰，细胞间质较少。与模型组相比较，给药组肿瘤组织中细胞数明显减少，形态不规则，异质性降低，细胞核破碎，并伴有大量细胞坏死，坏死周边有大量的炎细胞浸润(包括中性粒细胞、淋巴细胞和浆细胞，如图中箭头所示)，且高剂量组CPhGs肿瘤细胞坏死区域出现肉芽组织的修复，其中CPhGs不同剂量组随着给药剂量的增加，肿瘤细胞的坏死面积也在增大，而CPhGs高剂量组与阳性治疗组有相当量的肿瘤细胞坏死，因此，可以初步判断CPhGs对H22肝癌荷瘤小鼠具有良好的治疗效果。3 讨●论原发性肝癌是一种临床上常见的恶性肿瘤，占我[14] 国肿瘤发病率的第4位，死亡率的第2位，其防治仍是我国目前研究的热点问题。传统中药在控制患者病情发展、改善症状体征及提高生存质量等方面的优势日渐显现，为从我国中药中寻找低毒、高效的抗肝癌作用的药物，本课题采用H22肝癌细胞制备H22荷瘤小鼠肿瘤模型，将不同剂量的CPhGs处理组与模型对照组和肝复乐阳性治疗组进行比较，探索CPhGs对H22荷瘤小鼠体内抗肿瘤的作用及其机制。结果显示，模型组最先出现腋下肿瘤膨隆且生长最快，小鼠精神状态变差、食欲下降、毛色开始暗淡等反应，CPhGs低、中剂量组次之，高剂量组和肝复乐阳性治疗组较慢，且CPhGs各剂量组小鼠体质量和肝复乐阳性治疗组均无明显的下降，提示CPhGs药物可以相对改善H22荷瘤小鼠的生存质量、降低肿瘤对机体的毒性。CPhGs各剂量组、肝复乐阳性治疗组瘤质量均明显低于模型对照组，且高剂量组肿瘤抑制率与肝复乐阳性治疗组相当，提示CPhGs对H22荷瘤小鼠体内肿瘤具有一定的抑制作用，另外，本研究结果显示，肝复乐阳性治疗组和CPhGs各剂量组的脾脏系数均高于模型组，而肝脏系数均低于模型对照组，提示CPhGs在发挥抑制肿瘤作用的同时在一定程度上提高了荷瘤小鼠的免疫功能且对肝脏也有保护作用，但对脾脏及肝脏的作用与肝复乐无明显差异。IL-2是免疫系统中的一类细胞生长因子，参与细胞免疫，在机体复杂免疫网络中起中心调节作用，能够通过促进T细胞增殖和分化等作用提高机体的免疫机能，并能产生具有抗肿瘤活性的免疫细胞。研究发现IL-2可促进淋巴因子激活的杀伤细胞的存活、扩增及活化，这种细胞是淋巴细胞与IL-2接触后产生的一种具有高效抗肿瘤细胞的杀伤细胞，且这种杀伤细胞[15-16] 只识别肿瘤抗原，对宿主正常细胞无影响。本实验结果显示，CPhGs高、中剂量组可显著提高小鼠IL-2的含量，表明CPhGs可增强H22荷瘤小鼠的免疫能力，有利于机体杀伤肿瘤细胞。TNF-α是迄今为止所发现的直接抗肿瘤作用最强[17-18] 的生物活性因子之一。TNF通过与受体结合诱导肿瘤细胞凋亡、增强宿主免疫功能、作用肿瘤血管内皮细胞，导致血管功能紊乱，继而引起肿瘤出血坏死等[19] 途径来发挥抗肿瘤作用，但TNF-α在肿瘤中表现出[20-21] 两重性，既可致肿瘤坏死，也可促肿瘤的生长。在正常机体内TNF-α的浓度较低，具有抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞血管形成血栓而发生出血坏死、增强机体抗肿瘤免疫功能等作用；同时TNF作为一个内源性的肿瘤促进因素，由肿瘤细胞本身产生的TNF-α可以刺激肿瘤细胞生长，并抑制免疫效应细胞对肿瘤细胞的毒性作用；因此，TNF-α的生物学作用与其体内的水平高低密切相关。本实验中发现，与正常组比较，模型组TNF-α明显升高，这与肿瘤的TNF-α升高一致，CPhGs各剂量组小鼠TNF-α水平显著下降，表明CPhGs具有抑制H22荷瘤小鼠血清中TNF-α异常升高的作用，抑制肿瘤的发生。正常情况下，AFP主要来自胚胎的肝细胞，胎儿出生后约两周AFP从血液中消失，因此正常成年人血[22] 清中AFP的含量尚不到20 μg/mL 。在成人，AFP可以[23] 在大约80%肝癌患者血清中升高。当人肝细胞发生癌变时，其恢复产生AFP这种蛋白的功能，而且随着病情恶化它在血清中的含量也会急剧增加。AFP作为诊断原发性肝癌的一个特异型临床指标，血清AFP浓[24] 度通常与肝癌大小呈正相关。本实验结果显示CPhGs高、中剂量组可显著降低小鼠AFP的含量，表明CPhGs能够抑制H22荷瘤小鼠血清中AFP的表达，抑制肿瘤的生长。HE染色可见，与模型组比较，CPhGs能明显促进肿瘤细胞凋亡，使肿瘤细胞生长受抑制，瘤细胞异质性降低，并伴有大量细胞坏死，其中CPhGs不同剂量组随着给药剂量的增加，肿瘤细胞的坏死面积也在增大，而CPhGs高剂量组与肝复乐阳性治疗组有相当量的肿瘤细胞坏死，提示CPhGs对H22肝癌荷瘤小鼠具有良好的抑瘤效果。综上，CPhGs具有良好的抗肝癌作用，可能与CPhGs降低荷瘤小鼠血清中AFP含量及提高荷瘤小鼠免疫能力有关。本研究为利用肉苁蓉中CPhGs成分开发新的抗肝癌药物提供了基础数据。参考文献[1] 彭芳，徐荣，王夏，等. 肉苁蓉属药材加工炮制研究进展[J].中国现代中药，2015，17(4)：406-412.[2] 钟耀欣. 解读《神农本草经》32[J]. 开卷有益(求医问药)，2015，35(8)：40-41.[3] 刘雄，李成明，高建德，等. 肉苁蓉的研究进展[J]. 中国中医药科技，2013，20(5)：575-576.[4] 耿惠杰，于光恩. 肉苁蓉属植物的开发与利用[J]. 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【摘要】目的： 探讨肉苁蓉苯乙醇总苷(CPhGs)及其单体(毛蕊花糖苷和松果菊苷)对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)增殖及凋亡的影响。方法：分别以含不同浓度(0、3.91、7.81、15.63、31.25、62.50、125.00、250.00和500.00 μg/mL)CPhGs、毛蕊花糖苷及松果菊苷的DMEM(高糖)完全培养液处理HSC-T6细胞48 h，用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖情况并分别获得半数抑制浓度(IC )；再分50别用不同浓度受试物诱导HSC-T6细胞48 h，试验分为正常对照组，CPhGs(25、50、100 μg/mL)组，毛蕊花糖苷(1.5、3、6.0μg/mL)组及松果菊苷(125、250、500 μg/mL)组，流式细胞仪检测细胞凋亡的比例，Western blot检测细胞中凋亡蛋白Bcl-2和Bax的表达。结果：CPhGs、毛蕊花糖苷及松果菊苷对HSC-T6细胞的增殖抑制率随着浓度的增加逐渐升高，IC 分别为119.1、7.0和520.3 50μg/mL；与正常对照组比较，3种受试物诱导HSC-T6细胞的凋亡率差异均具有统计学意义(P<0.01)，其中，CPhGs 100 μg/mL、毛蕊花糖苷6.0 μg/mL 及松果菊苷500 μg/mL浓度组的凋亡率分别为24.40%±3.16%，34.73%±1.16%和21.13%±0.98%；除毛蕊花糖苷1.5 μg/mL组外，其余不同浓度的受试物组均可引起HSC-T6细胞中Bax蛋白表达上调，Bcl-2蛋白表达下调(Bcl-2/Bax比值降低)(P<0.05)。结论：CPhGs及其单体(毛蕊花糖苷和松果菊苷)可诱导HSC-T6细胞凋亡而抑制其增殖，从而起到抗肝纤维化的作用，3种受试物的抗肝纤维化效果排序为毛蕊花糖苷>CPhGs>松果菊苷。【关键词】肉苁蓉苯乙醇总苷；毛蕊花糖苷；松果菊苷；肝星状细胞；凋亡肝星状细胞-T6 (hepatic stellate cells，HSC-T6)的[1-4] 活化是肝纤维化发生发展的关键环节，也是细胞外基质(extracellular matrixc，ECM)的主要来源。目前认为，肝纤维化的形成，主要是由HSC-T6激活，ECM分泌过多、降解相对不足，胶原等ECM在肝内大量沉积所致。抑制HSC-T6的活化和增殖并诱导其凋亡已经成为肝纤维化治疗的重要理论依据。肉苁蓉属多年生根[5] 寄生的草本植物；肉苁蓉苯乙醇总苷(cistanchephenylethanoid glycosides，CPhGs)及其主要单体(毛蕊花糖苷、松果菊苷)具有良好的抗病毒、抑制炎症及调[6-8] 节细胞因子等多种生物功效，课题组前期研究表明， CPhGs对牛血清白蛋白(bovine serum albumin，[9-10] BSA)所致肝纤维化大鼠具有一定的防治作用。本研究进一步从体外实验探讨CPhGs及其单体(毛蕊花糖苷及松果菊苷)对HSC-T6细胞的增殖、凋亡及对B细胞淋巴瘤/白血病-2相关蛋白(B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)和Bax表达的影响，为进一步深入研究CPhGs 及其单体(毛蕊花糖苷及松果菊苷)治疗肝纤维化的作用提供科学依据。1 材料与方法1.1 材料和试剂大鼠HSC-T6购自武汉Procell生物科技有限公司；CPhGs、毛蕊花糖苷及松果菊苷纯品由新疆维吾尔族自治区药物研究所提供，纯度分别为70%、98.89%和98.70%。胎牛血清购自美国Gibco公司， DMEM(高糖)培养基购自美国Hyclone公司，四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)及二甲基亚砜(DMSO)均购自美国Sigma公司，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司，Bcl-2(ab7973)和Bax(ab7977)一抗购自美国Abcam公司， β-actin购自于武汉Proteintech 公司，碱性磷酸酶标记的二抗购自于美国Invitrogen公司， RIPA裂解液购自美国Thermo FisherScientific公司， 聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自于美国Millipore公司。1.2 CPhGs、毛蕊花糖苷及松果菊苷贮存液的配制用DMEM(高糖)完全培养液溶解CPhGs、毛蕊花糖苷及松果菊苷配制成浓度分别为5、1和20 mg/mL的贮存液，滤器除菌，使用时用完全培养液稀释至所需浓度。1.3 分组及细胞增殖实验取对数生长期HSC-T6细胞， 调整密度为5×4 10 /mL，接种于96孔板中；细胞同步化后孵育24 h，依次加入含0、3.91、7.81、15.63、31.25、62.50、125.00、250.00和500.00 μg/mL受试物的培养液，同步化孵育48 h后，MTT法用酶标仪检测吸光度D(490) 值，按下式计算细胞半数抑制率 (half inhibition rate，IC )。50每个浓度设4个复孔，实验重复3次。抑制率(%)=(1-各浓度平均吸光度值/空白组平均吸光度值)×100％1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率实验分组为正常对照组， CPhGs(25、50、100μg/mL)组，毛蕊花糖苷(1.5、3、6.0 μg/mL)组及松果菊苷(125、250、500 μg/mL)组，每组设3个复孔。收集各6 组细胞，约为1×10 /mL，冷PBS缓冲液洗两次，弃上清，每管加入100 μL Annexin V结合缓冲液(主要成分包括：HEPES 10 mmol/L，NaCl 140 mmol/L，CaCl 2.5 2mmol/L，NaOH调pH至7.4)，加入5 μL Annexin VFITC和5 μL PI，轻轻混匀，室温避光孵育15 min，再分别加入400 μL Annexin V 结合缓冲液，1 h内上流式细胞仪检测。实验重复3次。结果判断标准：在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示的是活细胞- - + + (FITC /PI )；左上象限是坏死细胞(FITC /PI )；而右下+ - 象限显现为凋亡细胞(FITC /PI )。1.5 Western blot检测各药物组HSC-T6 细胞中Bcl-2、Bax蛋白的表达分组同1.4，取等量的蛋白质样品30 μg，电泳、转膜、5% BSA封闭，分别加入兔抗大鼠Bcl-2抗体(1∶100)、Bax抗体(1∶1 000)及β-actin抗体(1∶5 000)4 ℃孵育过夜，洗膜后加入二抗，室温孵育2 h，显色剂显影， GEL DOC XR凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)扫描，GEL DOC软件分析结果。以β-actin表达水平作为内参照。实验重复3次。1.6 统计学方法应用SPSS for Windows 16.0统计软件进行分析。数据采用 x-±s 表示，多组间比较用单因素方差分析(OnewayANOVA)， 多组样本两两比较采用LSD法； 以α=0.05为检验水准。2 结●果2.1 CPhGs、毛蕊花糖苷及松果菊苷对HSC-T6细胞增殖的影响与正常对照组比较， 随着受试物浓度(0~500μg/mL)的增加，不同浓度组的CPhGs、毛蕊花糖苷和松果菊苷作用48 h对HSC-T6细胞的增殖抑制作用逐渐升高， CPhGs (31.25~500 μg/mL)、毛蕊花糖苷(3.91~500 μg/mL)及松果菊苷500 μg/mL浓度组HSC-T6细胞活力逐渐降低，差异有统计学意义(P<0.05)。测得CPhGs、毛蕊花糖苷及松果菊苷的IC 分别为119.1、507.0和520.3 μg/mL，见图1。2.2 流式细胞仪检测CPhGs、毛蕊花糖苷及松果菊苷对HSC-T6细胞凋亡的影响结果显示，正常对照组有少数细胞凋亡，与正常对照组比较，CPhGs、毛蕊花糖苷及松果菊苷不同浓度组的HSC-T6细胞均存在不同程度的凋亡，凋亡率差异均具有统计学意义(P<0.01)；且随着受试药物浓度的增加，HSC-T6细胞的凋亡率逐渐增加，呈现一定的量效关系(r =0.980，P<0.01；r =0.891，P<0.01； CPhGs 毛蕊花糖苷r =0.834，P<0.01)。见图2。2.3 CPhGs、毛蕊花糖苷及松果菊苷对HSC-T6细胞Bcl-2及Bax蛋白表达的影响与正常对照组比较，CPhGs(50~100 μg/mL)组，毛蕊花糖苷(1.5~6.0 μg/mL)组及松果菊苷(125~500 μg/mL)组HSC-T6细胞中Bcl-2蛋白表达明显减少，差异均有统计学意义(P均<0.05)；CPhGs 100 μg/mL组、毛蕊花糖苷(1.5~6.0 μg/mL)组的Bax蛋白表达明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。2.4 不同浓度的CPhGs、毛蕊花糖苷及松果菊苷组对HSC-T6细胞Bcl-2 /Bax的比较与正常对照组比较，除毛蕊花糖苷1.5 μg/mL组外，其余受试物组HSCT6细胞的 Bcl-2/Bax比值明显降低，差异均具有统计学意义(P均<0.05)，见表1。3 讨●论肝纤维化的发生发展是一个非常复杂的过程，他涉及多种细胞因子及信号转导通路之间的相互作用。肝纤维化是慢性肝病向肝硬化转化的病理学基础及必经之路，很大程度上影响着慢性肝病的后期[11] 治疗。因此对肝纤维化的发展进程进行阻止或逆转，是医学界的一项热点课题。抑制HSC-T6活化、增殖、收缩，诱导其凋亡已成为理想的肝纤维[12] 化治疗方案之 一， 以HSC-T6细胞为靶点来研发抗肝纤维化药物已成为目前研究肝病治疗领域的热点。细胞增殖是细胞生命活动的重要特征之一，它是以细胞遗传物质DNA的复制和细胞分裂为基本事件，本研究将CPhGs及其主要单体成分(毛蕊花糖苷、松果菊苷)作用于体外培养大鼠的HSC-T6，结果显示各不同浓度的CPhGs、毛蕊花糖苷及松果菊苷均可抑制HSC-T6细胞增殖，光镜下可见HSC-T6细胞体积缩小，形态失去规则，提示CPhGs、毛蕊花糖苷及松果菊苷对HSC-T6有体外抑制作用，随着受试物浓度的增高，HSC-T6的数量呈递减趋势，且抑制作用强度与药物浓度呈现明显的剂量依赖性(r =0.881，P<0.01； CPhGsr =0.923，P<0.01；r =0.802，P<0.01)，表明毛蕊花糖苷松果菊苷不同浓度的上述3种受试物均可以直接杀伤 HSC-T6。促进HSC-T6凋亡也是肝纤维化逆转的重要机制之一，本研究采用不同浓度的CPhGs及其主要单体成分(毛蕊花糖苷、松果菊苷)作用于HSC-T6 48 h后，采用流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染色检测HSC-T6细胞的凋亡，结果显示随CPhGs、毛蕊花糖苷及松果菊苷浓度的增加，HSC-T6的凋亡率逐渐增高，呈现一定的量效关系(r =0.980，P<0.01；r =0.891，P< 0.01； CPhGs 毛蕊花糖苷r =0.834，P<0.01)。流式细胞术结果显示，与正常松果菊苷对照组比较，CPhGs、毛蕊花糖苷及松果菊苷组的HSC-T6细胞明显向右上及右下象限移动，处于右上和右下象限之间，较接近中期凋亡。其中，CPhGs 100μg/mL浓度组的凋亡率为24.40％±3.16％，毛蕊花糖苷6.0 μg/mL浓度组的凋亡率为34.73％±1.16%， 松果菊苷500 μg/mL浓度组的凋亡率为21.13％± 0.98%，提示了各受试药物体外抗肝纤维化的最佳药物作用浓度；并显示出3种受试物的抗肝纤维化能力存在一定的差异，其抗肝纤维化的效果排序为毛蕊花糖苷>CPhGs>松果菊苷。为了进一步阐明CPhGs、松果菊苷和毛蕊花糖苷防治肝纤维化差异的原因，我们对其化学结构进行了分析。苯乙醇苷具有明显的抗炎、抗[13] 菌、抗氧化、保肝等药理作用，两种单体成分的化学结构都具有苯乙醇苷化合物，差别在于毛蕊花糖苷(C29H36O15)为双糖苷，而松果菊苷(C35H46O20)为三糖苷，多出的糖苷使空间位阻变大，增大的空间位阻效应使得松果菊苷不易与自由基接近，因此其抗氧化能力相对较弱，对HSC活化的抑制剂保肝效果略弱于毛蕊花糖苷。细胞凋亡是一系列基因的激活、表达以及调控等[14-15] 作用的结果。本研究结果显示正常对照组的HSCT6高表达抗凋亡基因Bcl-2，促凋亡基因Bax呈现静止态，而CPhGs、毛蕊花糖苷及松果菊苷诱导HSC-T6的Bcl-2表达下降，促凋亡基因Bax表达增加，Bcl-2/Bax的比值下降，提示不同浓度的受试药物诱发HSC-T6细胞凋亡的机制可能是通过上调Bax蛋白，下调Bcl-2蛋白以及降低Bcl-2/Bax比值，促使线粒体通透性增加，从而引起Fas诱导的凋亡发生。本研究采用CPhGs及其主要单体成分(毛蕊花糖苷、松果菊苷)干预大鼠HSC-T6细胞，发现这3种受试物均能抑制HSC-T6细胞的增殖，诱导其凋亡，并使凋亡相关蛋白的表达发生改变，显示CPhGs及其主要单体(松果菊苷和毛蕊花糖苷)成分具有显著的抗肝纤维化作用。其中，毛蕊花糖苷的效果最为显著，CPhGs活性介于两者之间，提示CPhGs及其主要单体成分(毛蕊花糖苷、松果菊苷)可能具有抗肝纤维化药物的开发前景。参考文献[1] SCHON H T，BARTNECK M，BORKHAM-KAMPHORSTE，et al. 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3 总结文章选择使用多种住色谱联合的方式，有效实现了肉苁蓉粗多糖的分离以及纯化，与此同时，相关工作人员还用现代分析技术对其进行理化性质的测定。该实验过程与结果。为工作人员研究内苁蓉的质量控制提供参考意义。建立肉苁蓉HPLC-DNA 指纹图谱、并进行相似度评价和聚类分析。以期为肉苁蓉的科学鉴定和质量标准提供参考依据。参考文献［1］初侨，席兴军，杨丽，内苁善中松果菊苷和毛流花糖苷闪提工艺研究食研究与开发，2015.36（16）：49-52［2］王茜，王啟之，时维静，等，响应面法与正交设计法优化黄蜀葵总黄酮闪提工艺比较门安徽科技学院学报，2015.29（05）24-31（3）周康，刘延泽、王中博，等，积雪草苷的闪提工艺优选及不同提取方法的比较研究门中国中药杂志，2011,36（23）：3265-3267．［4］董沾琼，王意敏，李建霞，等，激素诱导和非生物胁迫对虎杖根中白黎芦醇含量影响及虎杖根中白黎芦醇闪提工艺优化门食品工业科技 2016.37（21）210-215作者简介：刘银伟（1961.7-）．男，本科，研究方向：大健康养老结合产业：苏子浩（1996.8-）．男、大学本科，研究方向；生物医学工程专业。

1．内蒙古仕博健康服务产业投资管理有限责任公司，内蒙古 鄂尔多斯 017000；南方医科大学，广东广州 510515【摘要】文章对肉苁蓉中松果菊苷和毛葛花糖苷闪提工艺进行了研究，分别从肉双码材中活性成分提取工艺优化，肉苁蓉多糖的分离纯化；肉苁蓉精制多糖理化性质检测，肉苁营药材植物图道的建立；肉苁蓉随机扩增DNA多态性（RAPD）指纹图道等几个方面进行了详细的介绍。闪式提取法提取肉苁营中松果菊苷和毛蕊花糖苷的操作院单、提取车高、耗时短、节省能源，可为松果精苷和毛蕊花糖苷的新药开发和工业化生产提供依据，有着更好的推广价值。【关键词】肉苁蓉：松果菊苷；毛蕊花糖苷；闪提工艺；工艺研究肉苁蓉是一种化学成分十分复杂化的物质，被分类为多组分复杂体系。其自身的药材品种十分珍稀的品种，无论是贮藏、产地还是药材的加工工艺，在一定程度上有着很大的难度，是当前研究肉苁蓉药材工作人员的重点关注方向。对于肉苁蓉这一药物而言，其发挥作用是众多成分共同努力的结果、每一种化学成分都不可急略，但是现在，这一药物的有效成分依旧是一个不明确的课题，有效成分如何发挥作用也尚未明确。因此，现在很多针对这一药物的研究往往是针对其整体或者个别化学成分进行的。相关工作人员想要有效发展中药材的前进研究，需要从质控角度下手。建立健全现代肉苁蓉的质量控制的标准体系。最为常见的内苁蓉质量稳定性的评价方法就是指纹图谱分析技术，通过请图反应肉苁蓉材内的化学成分种类与数量，能够提供综合信息从而较好的评价药材质量。1 实验方法1.1肉苁蓉提取方式的选择 实验人员用天平精密称取3份干燥且粉状的肉苁蓉切片10.0g。首先，提取100g的纯净水，第一份粉状的肉苁蓉需要用回流法进行成分的有效提取，实际操作过程中，保证回流提取的次数为2次，每一次的提取操作控制在2h左右。第二份粉状的肉苁蓉则需要采用冷浸法进行成分的有效提取，然后提取之后，相关工作人员需要将其放在室盟的环境下，遮挡全部的光线的同时，对其完全浸泡。浸泡的时间控制在2d第三份粉状的肉苁蓉需要采用超声法对其药材内部的成本进行有效提取，实际操作过程中选择用超声提取2次，每次的提取时间控制在1h。然后，将已经加工处理的三分粉状的肉苁蓉，通过多糖含量测定方法的正确操作，合理的对其进行多糖含量的整体分析比较，分析比较结果，结合实际需求情况，从不同的提取方法挑选出最适合的提取方式。1.2提取工艺考察 在实际提取工艺考察的时候，相关工作人员需要有效的取出干燥的肉苁蓉饮片，紧接看使用60℃-90℃的石油醚中进行回流提取，其中在进行回流提取的时候，需要保证石油醚的体积含量需要是干燥的内苁蓉饮片的10倍量体积。在回流提取的时候，需要严格控制回流提取的时长，最好控制在2h／次。回流提取之后，相关工作人员需要过滤掉石油醚，然后将肉苁蓉饮片进行千燥处理，紧接着用乙醇对其进行回流提取，其中在进行回流提取的时候，需要保证乙醚的体积含量需要是干燥的肉苁蓉饮片的10倍量体积，并且乙醚的含量为80％。在回流提取的时候，需要严格控制回流提取的时长。最好控制在2W／次，一共进行两次，回流提取之后再对剩余的肉苁蓉药渣过滤円。相关工作人员将已经烘干之后的肉苁蓉药渣，再进行蒸馏水回流提取。回流提取之后，将滤液进行合并处理，将其进行旋蒸浓缩加工操作。然后，相关工作人员需要把乙醇的浓度设置为变量，选择不同的乙醚浓度浸泡烘干后的滤渣。其中在进行浸泡的时候，需要保证乙醚的体积含量需要是干燥的肉苁蓉饮片的5倍量体积。并且存在乙醚的室内温度以及乙醒的温度为4℃。静置过夜之后，相关工作人员合理施工离心机，将沉淀的多糖有效收集。将收集到的多糖经过真空干燥后，变成肉苁蓉租多糖。1.3多糖的含量测定 采用苯酚-硫酸法测定肉苁蓉多糖含量2 肉苁蓉液相指纹图谱建立的实验方2.1供试品溶流的制备 相关工作人员用天平精密称取干操且粉状的肉苁蓉切片1.0g、首先，在1.0g干燥且粉状的肉苁蓉切片中添加甲醇，甲醇的体积控制在50mL。之后用超声提取溶液，此时需要控制超声提取的时间，需要将其控制在30min的时长，在提取过程中，相关工作人员需要及时使用甲醇溶液补重量。30min之后，相关工作人员将提取的取续滤液5ml，将其完全蒸干之后。继续在容器中添加足量的甲醇溶液、彻底溶解之后，将溶液转移到10mL容量瓶。相关工作人员添加甲醇溶液，直到溶液高度到达容量瓶的制度，停止添加甲醇溶液。相关工作人利用0.45μm微孔滤膜有效滤过溶液。将溶液保存好，准备备用。2.2HPLC-UV色谱条件 相关工作人员广泛的查阅相关文献资料，结果显示，试验可以通过色谱条件的优化，比较以及筛选，最终得到的结合可以很好的明确色谱条件：色谱柱 Kromasil（250x4.6mm．5μm），，分析时间共设置为90min，进样量为10μl，流动相为0.5％醋酸水（B）以及乙脑（A）梯度洗脱，将其流速控制在1.0mL／min，检测波长为310mm，柱温为28℃。23方法学考察 从精密度实验、重复性实验以及稳定性实验等对其结果进行有效验证。

杨杰，白雪，肖海涛，张一，刘昌福，吴文利，郝小燕”（贵阳医学院药学院，贵州 贵阳550004）摘 要：目的：研究中药肉苁蓉中异麦角器苷标准品的制备及含量测定方法。方法：采用微晶纤维素色谱与半制备高效液相色谱组合分离技术，分离纯化异麦角福苷，采用筹层色谱法和高效液相色谱面积归一化法检测纯度波谱法鉴定其结构，反相高效液相色谱法测定其含量，结果；制备的化合物鉴定为异麦角留苷，纯度为98.6％；含量测定在0.218～1.308g，里良好线性关系，r＝0.9995，平均回放率为102.8％．RSD为2.60％，n＝6，结论：该制备方法效率高，所得化合物纯度高，可用于大量制备；含量测肉苁蓉，定方法准确，简便，可靠，重复性好。           关键词：肉苁蓉：异麦角福苷：半制备高效液相色谱法：反相高效液相色谱法：含量测定肉苁蓉（Herba Cistanches）为列当科肉苁蓉 Cistanchedeserticola Y-C-Ma的干燥带鳞叶的肉质茎，因其生长在干旱荒漠中，又有补精益髓、壮阳润肠之功效，故有“沙漠人参”之美称，其主要活性成分为苯乙醇苷类化合物。近代药理学研究表明，肉苁蓉具有广泛的免疫调节、抗氧化、增强体力、抗疲劳”等药理作用，在防治神经退行性疾病上具有较好的应用价值。2005年版中国药典及成方制剂中均采用松果菊苷为对照品进行评价”，本课题组研究发现，肉苁蓉中的苯乙醇苷能上调a7尼古丁受体表达，具有较好的神经保护作用，其中异麦角甾苷是主要活性成分之一，因此，有必要对肉苁蓉中异麦角甾苷进行定性鉴别和含量测定。目前市场上还没有异麦角甾苷对照品的销售，并且也未见采用异麦角甾苷为对照品来评价肉苁蓉质量的报道。本文现将肉苁蓉中异麦角甾苷对照品的制备方法和含量测定方法报道如下。1 仪器与试剂X-4型显微熔点仪（国产，温度计未校正）：INOVA-400型核磁共振仪（TMS为内标）：HP 5973质谱仪（电离条件为70eV）：KQ-250B型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司），聚酰胺薄层层析板，高效薄层层析板（GF254，青岛海洋化工厂生产）；甲醇、乙睛为色谱醇，其他化学试剂均为分析醇，水为纯净水。肉苁蓉药材采自新疆，经贵阳中医学院陈德媛教授鉴定为列当科肉苁蓉属植物的干燥肉质茎。2 方法与结果2.1 异麦角留苷的制备取肉苁蓉粗粉3kg，用10倍量的水提取3次，每次2h，合并煎煮液，滤过，滤液浓缩至相对密度约为1.1（70～80℃）的清膏，在搅拌下加入乙醇，醇沉质量分数为70％，沉淀24h-取上清液，滤过。滤液回收乙醇并浓缩至相对密度约1.2（70～80℃）的清膏乙醇。取浸膏加水分散，用石油醚、乙酸乙酯，正丁醇分别萃取，回收溶媒得Rether萃取物（ASP）．E1OAc萃取物（ASE），nBuOH萃取物（ASB），余下水层回收溶媒后得H：0部分（ASW），E：OAc萃取物（ASE）上Sephadex LH-20．用氯仿一甲醇（1：1）洗脱，薄层点板跟踪，合并12～15流份，经微晶纤维素柱层析，用乙酸乙酯：甲醇：水（30：1：0.5）→（1：1：0.5）洗脱，合并第21～22流份得到异麦角甾苷粗提物0.42g。2.2 色谱条件2.2.1 制备HPLC 色谱条件 Waters 2475：SunFireTM-C18（10＃m，10x150mm）；柱温：室温；检测波长335nm；流动相：35％甲醇：流速：2.0mL／min。2.2.2 分析HPLC色谱条件 HP1100：DiamonsilTM C18 柱（5m，250x4.6mm）：柱温：30℃：检测波长，335mm：流动相：乙腈-1％乙酸（20：80）：流速1.0mL／min。2.2.3 异麦角留苷对照品的制备纯化 取异麦角甾苷粗提物1.0g，用10mL甲醇超声溶解，过0.45Fm滤膜，备用，吸取1.0mL样品进半制备型高效液相色谱仪，收集保留时间所在的组分，减压回收溶剂，得异麦角甾苷粉末。2.3 样品纯度检测及结构鉴定2.3.1 薄层色谱检测 高效薄层层析板（GF254）。取本品加甲醇制成1mg／mL溶液，作为供试品溶液。采取上行展开方式，展距：8～10cm。3种展开剂系统：氯仿：甲醇：9％乙酸（10：3：0.5）；二氯甲烷：甲醇：9％乙酸（10：20.4）；乙酸乙酯：甲醇：9％乙酸（10：0.5：0.6）。定位后经紫外254nm、碘、FeCl溶液显色检视。结果显示经3个展开系统3种观察方式检识均呈单一斑点，未见杂质斑点。符合化学品要求。2.3.2 紫外检测 取异麦角甾苷对照品乙醇溶液经紫外光谱扫描，结果表明最大吸收波长为335mm，因此，确定335nm为测定波长。2.3.3 面积归一化法 精密称取异麦角甾苷对照品（1mg／mL），按2.2.1，进样10L，样品显示为单峰，用面积归一化法计算含量为98.6％（保留时间为12.1min）·符合中药化学对照品含量测定用要求，结果见图1．2.3.4 结构鉴定 灰白色粉末，UVs＝下显蓝色荧光．FeClK：［Fe（CN）］显蓝色。EI-MSm／z：624［M］，分子式为C＝HOs,'HNMR(400MHz,MeOH)8,1.24(3H.d.J= 6.5Hz,RhaCH),2.78(2H.m.H-7),4.36(1H.d.J= 8.0Hz,H-1'),4.39(1H.dd.J=12.0 Hz,6.0 H2,H-6'). 4.53(1H,dd,J=12.0 H2,1.5H.H-6'),5.17(IH.d.J= 1.5 Hz,Rha-1),6.30(1H,d,J=16.0 Hz,H-8"),6.53(1H. dd.J=8.0 Hz.2.0 Hz、H-6),6.65(1H,d.J=8.0 Hz.H 5).6.76(1H,d.J=2.0 H2.H-2),6.87(1H,d.J=8.0 Hz.d-J=2.0 Hz.H-2):7.57(1H.d.J=16.0Hz,H-7). "CNMR(100MHz-MeOH),130.6(Aglycone-1),116.4(Ag lycone-2),145.4(Aglycone-3),144.0(Aglycone-4),115.8 (Aglycone-5).120.4(Aglycone 6).71.1(Aglycone-A8).36.0 (Aglycone B7),127.0(Ester1),114.3(Ester 2),146.1(Es ter-3).149.0(Estert),115.7(Ester5),122.5(Ester-6). 114.1(Ester A8).145.4(Ester B7),168.4(Ester CO),103.7 (Gle-1).75.1(Gle-2).83.2(Gle-3).69.7(Gle-4),74.7(Gle 5).63.9(Gle-6),102.0(Rha-1),71.8(Rha-2).71.6(Rha-3), 73.3（Rha-4），69.4（Rha-5）．17.2（Rha-6）。分析以上数据符合文献报道的异麦角甾苷。2.4 肉苁蓉药材中异麦角甾苷的含量测定2.4.1 色谱条件与系统适应性实验 DiamonsilTC18柱（5／＇m．250x4.6mm）-柱温：30℃，检测波长，335mm，流动相：乙腈-1％乙酸（20：80），流速1.0mL／min。样品的理论塔板数均大于4000，分离度均大于1.5，说明该方法用于肉苁蓉样品异麦角甾苷的含量测定可行。2.4.2 供试品的制备 称取肉苁蓉粗粉（过40目筛）约1g精密称定，置25mL容量瓶中，加入无水乙醇适量，称重，浸泡30min后，40℃超声提取30min．取出，补足减失重量，冷却，滤过，流动相定容至25.00mL，过0.45m滤膜，备用。2.4.3 对照品溶液的制备 精密称取异麦角甾苷对照品0.0109g于10ml容量瓶中，用甲醇定容，得异麦角甾苷储备液，再从中取1.00mL于10mL容量瓶中，用流动相定容，得浓度为109＃g／mL的对照品标准溶液。2.4.4 线性范围考察 分别精密吸取对照品标准溶液2、4,6,8,10,124．注入色谱仪，记录峰面积。以色谱峰积分面积为纵坐标（Y），异麦角甾苷的进样量为横坐标（X），绘制标准曲线，得回归方程：Y＝854.64X＋36.39，r＝0.9995．样品在0.218／g～1.308rg范围内线性关系良好。2.4.5 精密度实验 精密吸取同一对照品液5L，照前述色谱条件重复进样6次，测得异麦角甾苷面积积分值的RSD为0.34％，表明测定仪器精密度良好。2.4.6 重现性试验 取同一批样品，按“供试品溶液的制备”方法，平行制备供试品溶液6份，按前述色谱条件进样20PL，测得峰面积并计算含量，结果异麦角甾苷的平均含量为0.91mg／g-RSD为2.54％，表明测定方法重现性良好。2.4.7 稳定性实验 将同一份供试品溶液放置2,4,6.8h后，照前述色谱条件进样5PL，测得异麦角甾苷在8h内峰面积的RSD为3.60％，表明供试品溶液在8h内稳定性良好。2.4.8 回收率试验 取已知含量的样品约0.5g，共6份，精密称定，分别加入异麦角甾苷对照品2.180mg，按“供试品溶液的制备”方法制备，按前述色谱条件进样10FL，测得异麦角甾苷的平均回收率为102.8％，RSD为2.60％（n＝表1 回收率试验      (n-6)编取样量样品中含异麦角丽实测含量回收 收率平均回率（％）(%)RSD号/(g)异麦角甾普加入(%)苷量／（mg）量／（mg）10.50220.54242.180945101.020.51070.55152.1802.8328104.630.50030.54032.1802.8412105.5102.8 26040.49980.53982.1802.7824102.950.50210.54232.1802.689898.560.50360.54392.1802.8125104.12.4.9 不同来源的肉苁蓉中异麦角锱苷的含量测定（见表2）表2 不同来源肉苁蓉药材中异麦角甾苷的含量（a＝3）来源含量(mgg)贵阳市三桥药材批发市场0.96/贵阳市北京路阜康堂药店1.06贵阳市大十字同济堂西店1.123 讨论肉苁蓉中的主要成分为苯乙醇苷类，它们是一类由苯乙基、咖啡酰基和若干个糖基组成的分子量较大的、结构彼此相似的水溶性成分，常含有羟基、甲氧基等取代基，这类化合物极性相近，完全通过依靠极性分离的硅胶柱难以将其完全分开，且在硅胶上有很强的吸附，使得含量本来就极低的此类化合物损失较大，同时苯乙醇苷类化合物分子内都含有两个或两个以上的糖基，糖苷类化合物难于结晶，纯化较困难。目前，苯乙醇苷类化合物的分离多数采用的方法是先用大孔吸附树脂柱吸附，然后用硅胶柱反复层析，再用Sephadex LH-20纯化，此方法损失的目标物较多，并且浪费试剂。微晶纤维素是天然纤维素经稀酸水解并经一系列处理后得到的葡萄糖的聚合体。由于微晶纤维素具有良好的物理和化学稳定性，对含糖基类的化合物吸附稳定，我们以微晶纤维素为层析介质分离纯化异麦角甾苷，再用制备液相法提纯异麦角甾苷，制备其标准品，方法简便易行，产品纯度好，成本低，适合异麦角甾苷对照品的大量制备。参考文献：[1] 叶水泉、沙漠人参-肉苁蓉［J］·东方药脯，2006（9），46．[2] 杨明·何广新、药材肉苁蓉活性成分的研究和开发［J］，中国民族民间医药杂志，2004（4），235-236．[3] 施大文，何松春、中药肉苁蓉及其同属生药对免疫功能及菌质过氧化的作用［J］上海医科大学学报，1995.22（4），306-308[4] 王晓雯，李琳琳、肉苁蓉总贰对小鼠组织的抗氧化作用［J］，中国中药杂志，1998,23（9），554-555．[5] 王志强，张颖，肉苁蓉煎剂对小鼠抗缺氧和疲劳耐受性的影响D］中草药，1996.27（A09），137-138．[9] 韩丽春，纪志华，肉苁蓉对小鼠血清肌酸激酶和骨骼肌超微结构的影响［］，中国中药杂志，1993.18（12），743-745．国家药典委员会、中华人民共和国药典（一部）［S］·北京；化学工业出版社，2005．[8] KOBAYASHI H.OGUCHI H New phenylethannid glycosides from Cistanche tubalosa[J]Chem:Pharm:Bull,1987.35(8): 3309-3314[9] 欧阳杰，赵兵，王晓东、等，肉苁蓉有效成分提取集成方法的研克［J］武汉植物学研究，2003.21（6）：526-530．[10] 李勇、熊元君，贾晓光，等，德赢vwin登录 的提取与分离［J］，新疆中医药，2007.25（5）：81-82．