表3 7种苯乙醇苷类物质的线性回归方程、相关系数、检测限和定量限对照品标准曲线R2(检测限定量限μg/mL)(μg/mL)麦角甾苷y=29.71x+42.746266600.42异麦角甾苷y=22.939x+22.5690.99980.54松果菊苷y=23.087x+26.1180.99990.54管花苷Ay=43.163x+9.4738 0.99960.542＊-乙酰毛y=17.656x-10.493 0.99960.54蕊花糖苷肉苁蓉苷Ay=19.948x+10.462 0.9997210肉苁蓉苷Fy=31.918x+7.8740.999516 由表3可知，7种苯乙醇苷类成分在各自线性范围内与色谱峰面积线性关系良好。7种苯乙醇苷类物质的检测限在0.4-2μg／ml．之间，定量限在2-10μg／mL．之间。（三）精密度实验吸取同一混合标准品溶液，上机验证精密度，分别重复测定6次，记录7种苯乙醇苷类成分的峰面积，并计算相对标准偏差，结果列于表4。结果表明7种苯乙醇苷类成分的峰面积对应的RSD值分别为1.52％、1.29％、1.79％、1.67％、1.80％、1.67％、1.71，表明该方法精密度良好。表4 精密度实验结果组分麦角甾苷异麦角甾苷松果菊苷管花苷A2＇-乙酰毛蕊花糖苷肉苁蓉苷A肉苁蓉苷F489.121359.569374.582336.554236.156156.71523250.587485.506354.319368.369342.756242.265151.71523258.156峰面积486.453356.328379.956334.852238.158149.71523254.161473.489347.745361.158344.248235.474151.1523245.165476,652351.259367.489349.756231.253152.7152253.584492.418348.842374.369337.258242.415154.71523252.641平均值483.939353.010370.987340.904237.620252.382152.673RSD/%1.521.291.791.671.81.671.71 （四）稳定性试验精密吸取同一混合标准品溶液10μL，分别于0.2、4、8.12、24h进样测定，分别重复测定3次，计录各特征峰的相对保留时间及相对峰面积，计算RSD值。结果表明7种苯乙醇苷的特征峰的相对保留时间的RSD＜0.5％，峰面积的RSD值分别为1.85％、0.92％、1.63％、0.87％、1.24％、1.65％、1.43％，峰面积的RSD＜2％，故7种苯乙醇苷类成分于24h内测定结果稳定。（五）回收率实验对7种苯乙醇苷类物质在1,5.20mg／kg3个水平下进行加标回收实验，平行测定6次，计算加标回收率，结果见表5。7种苯乙醇苷类物质的回收率在85.12％～97.21％之间，相对标准偏差RSD均低于5％，由此可以看出表明该方法精密度良好，结果稳定。表5 7种苯乙醇苷类物质方法平均回收率和相对标准偏差对照品1mg/kg回收率％ RSD/%5mg/kg回收率％ RSD/%20mg/kg回收率／％ RSD/%麦角甾苷异麦角甾苷松果菊苷管花苷A2＊-乙酰毛蕊花糖苷肉苁蓉苷A85.1287.2090.4589.5491.2487.642.23 92.53.62 95.62.89 97.211.24 92.153.67 94.282.56 87.260.892.124.082.243.254.2591.5095.1494.2586.273.111.642.411.253.652.741.4391.6487.56肉苁蓉苷F 92.361.48 89.25 1.95 93.25 （六）实际样品的测定分别按方法制备供试品样品，测定色谱峰面积，由标准曲线计算7种苯乙醇苷类成分含量。测定10个批次的样品，每个样品重复测定3次，结果见表6。表6 含量测定结果及相对标准偏差<td width="96" valign="center" style="

徐圣，柴莎莎（武汉职业技术学院生物工程学院，湖北武汉430074）摘要：建立HPLC-DAD同时检测肉苁蓉中主要活性物质7种苯乙醇苷类成分的快速分析方法。使用Agilent ZORBAXC18色谱柱（150mmx4.6mm，5μm），以乙腈-0.1％甲酸为流动相进行梯度洗脱，二极管阵列检测器，波长330nm，外标法定量。7种苯乙醇苷类成分在检测范围内有良好的线性，相关系数均在0.9995以上，检出限为0.5-2μg／mL，定量限为2-10μg／mL。在3个水平下加标回收率为85.12％-97.21％，相对标准偏差低于5％。该方法快速、准确、简便，适用于肉苁蓉苯乙醇苷类成分的检测需求，后续可以为控制肉苁蓉质量提供有力支持和有效保障。关键词：HPLC；肉苁蓉；活性物质；检测；质量控制一、材料与方法（一）材料与试剂麦角甾苷对照品（纯度98％）、异麦角甾苷对照品（纯度98％）、松果菊苷对照品（纯度98％）、管花苷A对照品（纯度98％）、2＇-乙酰毛蕊花糖苷对照品（纯度98％）、肉苁蓉苷A对照品（纯度98％）、肉苁蓉苷F对照品（纯度98％），成都曼思特生物科技技术有限公司：甲醇（色谱纯）。Fisher公司；乙腈（色谱纯），Fisher公司；甲酸（色谱纯），Fisher公司；水为屈臣氏纯净水。市购：试验采用的肉苁蓉原料采自主产区，经湖北省中医药研究院鉴定为肉苁蓉，共10批，见表1。表1 肉苁蓉原料产地信息编号批号来源批号批号来源1190315新61903122190701新疆7190611内蒙古31907218190722内蒙古4200311新疆9200112内蒙古5200311新疆10200923内蒙古（二）主要仪器与设备1260高效液相色谱仪：美国安捷伦公司，配有二极管阵列检测器：SB-800D数显普通型超声波清洗机：宁波新芝公司；XSR105电子天平：美国梅特勒公司。十万分之一天平：美国梅特勒公司；DJ-04B小型破碎机：上海鼎广机械设备有限公司。ZORBAXC18色谱柱（150mmx4.6mm，5μm）：美国安捷伦公司。（三）方法1．溶液配制（1）标准溶液分别精密称取麦角留苷对照品20mg、异麦角甾苷对照品20mg、松果菊苷对照品20mg、管花苷A对照品10mg、2＇-乙酰毛蕊花糖苷对照品10mg、肉苁蓉苷A对照品10mg，肉苁蓉苷F对照品10mg，于25mL容量瓶中，以甲醇-水（1：1）混合溶液定容至刻度，即得各标准溶液储备液。分别取各对标准溶液储备液适量于量瓶中，甲醇-水（1：1）混合溶液定容至刻度，即得标准混合溶液。（2）样品溶液取肉苁蓉粉末，过4号筛，精密称取1g，置100mL棕色量瓶中，加入甲醇-水（1：1）50mL，盖上瓶塞，摇匀，称定质量，然后浸泡30min，超声处理40min后放置室温，再称定质量，加甲醇-水（1：1）补足减失的质量．摇匀，静置，取上清液［1］．过0.45μm滤膜，备用。2．色谱条件以0.1％甲酸水溶液为流动相A．乙腈为流动相B．进样量10微升，柱温30℃，检测波长为330nm，梯度洗脱程序见表2。表2 梯度洗脱程序时间（min）流动相A（％）流动相B（％）流速（mL／min）090200.41080200.42260400.42560400.42830700.43030700.4二、结果与讨论（一）流动相条件的优化1．流动相的选择比较甲醇-水、甲醇-甲酸水、乙腈-水和乙腈-甲酸水系统溶液梯度洗脱对7种目标物的分离效果，结果表明，在相同色谱条件下，不加甲酸，各组分峰形较差，有明显的拖尾现象：使用甲醇-0.1％甲酸水溶液，各组分的峰出现较密集，面使用乙腩-0.1％甲酸水溶液作为流动相梯度洗脱时，7个苯乙醇苷类成分均可获得良好的分离度和峰形。因此采用乙腈-0.1％甲酸水溶液作为流动相对7种苯乙醇苷类物质进行色谱分离。2．波长的确定通过紫外吸收光谱对7种苯乙醇苷类成分进行全波长扫描，发现7个苯乙醇苷类成分在330nm处有最大吸收，故确定本实验的测定波长为330nm。3．柱温的选择比较了25℃，30℃、35℃柱温条件下，对7种苯乙醇苷类成分的分离效果，结果表明在相同色谱条件下，30℃时分离效果最好，确定本实验的柱温为30℃。（二）线性方程、线性范围和检出限按照2．色谱条件，依次对7种苯乙醇苷类成分的系列标准工作溶液进样分析，以保留时间定性，色谱峰面积定量。以质量浓度为横坐标，色谱峰的面积为纵坐标，进行线性回归，绘制标准曲线。将信噪比等于3时的7种苯乙醇苷类物质对应的浓度作为检测限，信噪比等于10时对应的7种苯乙醇苷类成分浓度作为定量限，得到各苯乙醇苷类成分的线性回归方程、相关系数、检测限和定量限，结果见表3

摘要:目的探讨肉苁蓉苯乙醇总苷( CPhGs) 对压力超负荷大鼠心肌肥厚的抑制作用及其可能的作用机制。方法♂SPF 级SD 大鼠70 只，随机分为空白组( Con) 、假手术组( Sham) 、模型组( Mod) 、阳性药对照组( Vst) 、CPhGs 125、250、500 mg·kg － 1组。检测心脏超声指标、心脏体质量指数( HWI) 、心肌组织病理学变化、心肌细胞面积( AMC) ，Elisa法检测血浆ET-1、BNP 水平，Western blot 法检测p-PI3K、PI3K 、p-PKB、PKB 蛋白表达变化。结果与Mod 组相比，CPhGs 不同剂量给药后，LVPWT、HWI、血浆ET-1 和BNP、AMC 均有不同程度下降，LVEDD、LVEF、LVFS 以及心肌组织p-PI3K、p-PKB 蛋白表达有不同程度的增加，其中CPhGs250、500 mg·kg － 1组相比于Mod 组各指标有明显差异( P ＜0. 05 或0. 01) ; 与Vst 组相比，CPhGs 500 mg·kg － 1组各指标，没有明显差异。结论CPhGs 对压力超负荷引起的大鼠心肌肥厚具有抑制作用，其作用可能与PI3K/PKB 信号通路的激活有关。关键词:肉苁蓉苯乙醇总苷; 压力超负荷; 心肌肥厚; PI3K/PKB; 腹主动脉缩窄术; 磷酸化心肌肥厚是一种为维持心输出量和保证组织灌流的适应性反应，压力超负荷引起的心肌肥厚与高血压的发生密切相关［1］。研究表明［2］，心肌肥厚的逆转可以降低心血管疾病的死亡率。肉苁蓉( Cistance) 素有“沙漠人参”之美誉。苯乙醇总苷( Cistanche phenylethanoid glycosides，CPhGs) 是肉苁蓉发挥药效的主要物质基础之一［3］，具有抗痴呆、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、缓解疲劳、抗脑缺血/再灌注损伤等多种药理作用［4］。研究显示［5］，CPhGs可以抑制因缺血再灌注损伤引起的心肌细胞凋亡并发挥保护心肌组织的作用。然而，肉苁蓉CPhGs 能否对压力超负荷引起的心肌肥厚能起到抑制作用，尚不可知。因此，本研究通过构建大鼠腹主动脉缩窄( abdominal aorta coarctation，AAC ) 模型，探讨CPhGs 对压力超负荷大鼠心肌肥厚的作用，以及对磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B( phosphatidylinositol3-kinase / protein kinase B，PI3K/PKB) 通路相关蛋白表达的影响，以研究CPhGs 抑制压力超负荷大鼠心肌肥厚的作用机制，为进一步研发对心肌肥厚防控的药物提供实验依据。1 材料1． 1 实验动物健康雄性SPF 级大鼠，70 只，体质量( 200 ± 20) g，由新疆医科大学动物实验中心提供。动物生产许可证号与合格证号分别为: SYXK( 新) 2016 － 0003，SCXK( 新) 2016-0002。1． 2 药物与试剂肉苁蓉苯乙醇总苷CPhGs( win德赢官方 ，批号: 20180502) ，缬沙坦( 北京诺华制药有限公司，规格: 80 mg) ，0. 5%羧甲基纤维素钠( carboxymethylcellulose sodium，CMCNa)( 西安正天药用辅料有限公司) ，戊巴比妥钠( 德国Meck 公司) ，ＲIPA( 美国Thermo 公司) ，p-PI3K、PI3K、p-PKB、PKB、β-actin 兔抗单克隆抗体、大鼠血浆内皮素1( endothelin 1，ET-1) 和脑利钠肽( brainnatriuretic peptide，BNP) 酶联免疫吸附试验试剂盒( 北京博奥森公司) ，辣根过氧化酶标记二抗( 北京中杉金桥公司) ，蛋白酶抑制剂、蛋白磷酸酶抑制剂混合物、BCA 蛋白定量试剂盒( 北京索莱宝公司) ，ECL 显色液( 中国Biosharp 公司) 、PVDF 膜( 英国Ｒoche 公司) 。1． 3 主要仪器飞利浦HD11 XE 超声诊断仪( 德国Philips 公司) ; 移液器( 德国Eppendorf 公司) ; 低温离心机( 美国Sigma 公司) ; 全波长自动酶联免疫反应检测仪( ( 美国Thermo 公司) ; 电泳和转膜装置( 美国Bio-Ｒad 公司) ; FluorChem E 化学发光高灵敏凝胶成像仪( 美国Protein Simple 公司) ; 电热恒温培养箱( 上海一恒科学仪器有限公司) 。2 方法2． 1 动物分组、模型制备及给药根据文献［6］采用AAC 术制备大鼠压力超负荷心肌肥厚模型。雄性SD 大鼠70 只，随机分为7 组: 空白组( Control，Con) 、假手术组( Sham) 、模型组( Mod) 、缬沙坦阳性药对照组( Valsartan，Vst) 、CPhGs 125、250、250 mg·kg － 1组，涉及药物剂量参照文献［7 － 8］及预实验结果设置。Con 组不进行手术，Sham 组分离腹主动脉不予结扎，其余五组建立压力超负荷心肌肥厚模型。术后d 3，CPhGs 各剂量组及Vst 组( 10 mg·kg － 1 )按每天设定剂量灌胃给予受试物，其余3 组均灌胃给予相同体积的0. 5% CMC-Na，连续42 d，每日1次; d 43，以2. 5%戊巴比妥钠麻醉后，行心脏超声检查，开腹采取腹主动脉血处死大鼠，立即开胸，取出心脏。2． 2 大鼠心脏超声指标的检测在2. 5%戊巴比妥钠麻醉下，剃毛后，使用超声诊断仪检测各组大鼠的心功能指标: ( 1) 左心室舒张末期后壁厚度( leftventricular posterior wall thickness，LVPWT) ( 2) 左心室舒张末期内径( left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD) ( 3) 左心室短轴收缩率( left ventricularfractional shortening，LVFS) ( 4) 左心室射血分数( leftventricular ejection fractions，LVEF) 。每只大鼠重复3 次测量后，计算平均值。2． 3 大鼠心脏体质量指数( heart weight /bodyweight index，HWI) 计算大鼠结束心脏超声学检测后，打开腹腔，腹主动脉取血至大鼠死亡后，立即开胸，取出大鼠心脏，用预冷的生理盐水冲洗心腔3次，用干净的滤纸吸干水分，称心脏质量( heartweight，HW) 。HWI = HW/体质量( body weight，BW) 。2． 4 酶联免疫吸附试验检测大鼠血浆ET-1 和BNP 水平腹主动脉血液储存于EDTA 抗凝采血管，混匀后3 000 r·min － 1离心15min，收集上清，－ 20 ℃条件下冻存。按试剂盒说明书操作。2． 5 显微镜观察大鼠心肌组织病理学改变大鼠心肌组织以4%多聚甲醛固定、石蜡包埋后，经伊红苏木素染色后以中性树胶封片，电子显微镜下观察心肌组织和细胞形态并拍图。用Image J 测量细胞表面积，每组选取四张标本，每张随机选取3 个视野，每视野测量10 ～ 15 个心肌细胞面积( area of myocardialcells，AMC) ，计算平均值。2． 6 Western blot 检测p-PI3K，PI3K，p-PKB，PKB 蛋白的表达称取心肌组织50mg，加入液氮研磨充分后加入ＲIPA 裂解液、蛋白酶抑制剂、蛋白磷酸酶抑制剂混合物，提取总蛋白，采用BCA 法进行蛋白定量至60 μg，加入4 × Loading buffer 后在100 ℃下热变性5 min，上样到10% 聚丙烯酰胺凝胶，120 V 电泳60 min，200 mA 恒流电转90 min，PVDF 膜湿转。5%脱脂奶粉室温下封闭PVDF 膜1h，1 × TBST 缓冲液置于摇床振荡清洗10 min，3 次，加入相应比例稀释的一抗( 目的基因p-PI3K，PI3K，p-PKB，PKB 为1 ∶ 1 000，内参β-actin 为1∶ 20 000) ，4 ℃下孵育过夜，清洗3 次后室温下孵育二抗1 h。FluorChem E 化学发光高灵敏凝胶成像仪拍照显色，分析条带灰度值。蛋白相对表达水平=目的条带灰度值/内参条带灰度值× 100%2． 7 统计学分析采用珋x ± s 表示，用SPSS25. 0 软件进行数据分析，通过单因素方差分析( one-wayANOVA) 比较各组数据，组间比较采用LSD 法。3 结果3． 1 CPhGs 对压力超负荷心肌肥厚大鼠的心脏超声指标的影响Tab 1 可见，与Con 组和Sham 组相比，Mod 组的LVPWT 显著增加，LVEDD、LVEF、LVFS 显著减小( P ＜ 0. 01) ; 与Mod 组相比，Vst 组和CPhGs 125、250、500 mg·kg － 1组大鼠的LVPWT减少，LVEDD、LVEF、LVFS 增加，CPhGs 组随着剂量的增加呈现改变逐渐明显的趋势，Vst 组及CPhGs250、500 mg·kg － 1组作用显著( P ＜ 0. 05 或P ＜0. 01) ; 与Vst 组相比，CPhGs 250、500 mg·kg － 1组各指标没有统计学差异。表明中、高剂量的CPhGs对压力超负荷心肌肥厚大鼠有保护作用，其作用与阳性药物相当。3． 2 CPhGs 对压力超负荷心肌肥厚大鼠的HWI的影响Tab 2 可见，各组大鼠的BW 没有明显差异; 与Con 组和Sham 组相比，Mod 组大鼠的HW 和HWI 显著相加( P ＜ 0. 01) ; 与Mod 组相比，Vst 组HW 和HWI 显著减小( P ＜ 0. 01) ，CPhGs 125、250、500 mg·kg － 1组( P ＜ 0. 05 或0. 01) HW 和HWI 有不同程度的减小，且随着剂量的增加呈现逐渐减小的趋势; 与Vst 组相比，CPhGs 500 mg·kg － 1组与其接近，差异无统计学意义。表明中、高剂量CPhGs可以减小压力超负荷心肌肥厚大鼠的心肌肥厚程度，保护心肌，与Vst 作用相当。3． 3 CPhGs 对压力超负荷心肌肥厚大鼠血浆BNP和ET-1 水平的影响Tab 3 可见，与Con 组和Sham组相比，Mod 组大鼠的血浆BNP 和ET-1 水平显著上升( P ＜ 0. 01) ; 与Mod 组相比，Vst 组大鼠的血浆BNP 和ET-1 水平显著下降( P ＜ 0. 01) ，CPhGs 125、250、500 mg·kg － 1组血浆BNP 和ET-1 水平有不同程度下降，并且随着剂量的增加呈现逐渐减小的趋势，其中CPhGs 250 组BNP 显著下降( P ＜ 0. 01) 、500 mg·kg － 1 组BNP 和ET-1 均显著下降( P ＜0. 01) ; 与Vst 组相比，CPhGs 500 mg·kg － 1组BNP和ET-1 水平降低，没有统计学差异。表明250、500mg·kg － 1中、高剂量的CPhGs 可以降低压力超负荷心肌肥厚大鼠的血浆BNP 和ET-1 水平，高剂量组作用强度与Vst 相当。3． 4 心肌组织病理学观察结果Fig 1 和Fig 2 可见，与Con 组和Sham 组相比，Mod 组心肌细胞排列紊乱，组织中可见炎性细胞浸润，单位视野内细胞核的数量减少，AMC 显著增大( P ＜ 0. 01) ; 与Mod 组相比，Vst 组单位视野内的细胞数量增加，AMC 显著减小( P ＜ 0. 01) ，CPhGs 125、250、500 mg·kg － 1组的AMC 也有不同程度减小，并且随着剂量的增加呈现逐渐减小的趋势，其中CPhGs 250、500 mg·kg － 1组较Mod 组有明显差异( P ＜ 0. 05 或0. 01) ; 与Vst 组相比，CPhGs 500 mg·kg － 1组AMC 与其接近，差异无统计学意义。表明中、高剂量CPhGs 在一定程度有减小压力超负荷型心肌肥厚大鼠AMC 的作用，当剂量达500 mg·kg － 1作用与Vst 接近。3． 5 CPhGs 对压力超负荷心肌肥厚大鼠心肌组织PI3K/PKB 通路相关蛋白表达的影响Fig 3 和Fig4 可见，与Con 组和Sham 组相比，Mod 组p-PI3K、p-PKB 蛋白的相对表达量显著降低( P ＜ 0. 01) ; 与Mod 组相比，Vst 组p-PI3K、p-PKB 蛋白的相对表达量显著升高( P ＜ 0. 01) ，CPhGs 125、250、500 mg·kg － 1组有不同程度升高，随着剂量的增加，p-PI3K、p-PKB 蛋白相对表达量呈逐步增加趋势，其中CPhGs 250、500 mg·kg － 1组较Mod 组有明显统计学意义( P ＜ 0. 01) ; 与Vst 组相比，CPhGs 500 mg·kg － 1组p-PI3K、p-PKB 蛋白的相对表达量与其接近，无明显差异。表明中、高剂量CPhGs 能够增加压力负荷型心肌肥厚大鼠心肌组织的p-PI3K、p-PKB 蛋白的相对表达量，高剂量组与Vst 的作用相当。4 讨论心肌肥厚作为高血压的主要并发症之一，同时也参与了慢性心衰、冠心病等心血管疾病的病理过程。在高血压前期，心肌通过增加心室壁张力从而适应增加的压力负荷，心肌细胞代偿性增大，导致左室心肌肥厚。心肌肥厚的抑制可以降低心血管疾病发病率及总死亡率，其作用优于单纯降压治疗［9］。因此，高血压的治疗方案不应局限于血压的控制，逆转心肌肥厚是治疗高血压的亟待解决的问题。肉苁蓉被列为德赢vwin登录 Cistanche tubulosaWight 干燥带鳞叶肉质茎。近年来，肉苁蓉以其显著的生物活性备受人们的关注，国内学者对肉苁蓉的心血管等方面的药理作用进行了较为深入的研究，发现肉苁蓉对心肌具有一定保护作用，但其具体的分子作用机制仍不清楚。研究表明［10］，CPhGs 能减轻自由基对心肌线粒体膜和浆网膜造成的损伤，降低丙二醛含量，减轻心肌超微结构损伤，提高大鼠心肌线粒体抗氧化酶活性，减少心肌梗死面积，提高心肌组织磷酸肌酸激酶活性，对缺血心肌有保护作用。本实验发现，CPhGs 可减小心肌肥厚大鼠的LVPWT、HWI、AMC 及心肌肥厚标志物ET-1、BNP水平，同时增加LVEDD、EF、FS，而抑制心肌肥厚，改善大鼠的心功能。随药物浓度增加，CPhGs 作用效果增加，呈现剂量依赖关系，其中CPhGs 中高剂量组肌肥厚大鼠有明显的保护作用，高剂量组与缬沙坦阳性药组作用相当。PI3K 是心肌细胞肥大和由收缩型向肥厚型转换的最后通路［11］，PI3K 的2 种亚型可参与心肌细胞肥大，其中pll0α 参与生理性心肌肥厚，而p110γ参与病理性心肌肥厚，小鼠敲除p110γ 后，对心肌病理性刺激可产生保护作用，对于心肌细胞肥大的发生、发展起着至关重要的作用［12］。PKB 途径与心肌细胞增殖、生长、代谢、凋亡等多种生物学活动密切相关［13］。叶芳杏等［14］报道玉郎伞单体17-甲氧基-7-羟基-苯并呋喃查尔酮可以通过调控心肌内皮细胞的p-PI3K、p-PKB、p-eNOS 等蛋白逆转大鼠压力超负荷心室的重构。杨洋等［15］报道，绿原酸可通过PI3K/PKB 通路调控细胞凋亡，抑制异丙肾上腺素诱导的心肌细胞肥大。本研究中，CPhGs 中、高剂量组显著增加p-PI3K、p-PKB 蛋白相对表达量，且CPhGs 高剂量组与Vst 组作用相当，进一步证明CPhGs 可以通过激活PI3K/PKB 信号通路，抑制压力超负荷大鼠心肌肥厚。综上，本研究证实CPhGs 对AAC 术后压力超负荷心肌肥厚大鼠有保护作用，可能与其增加PI3K、PKB 磷酸化而激活PI3K/PKB 信号通路有关。这为临床研究高血压心肌肥厚提供了新思路，可能为高血压心肌肥厚的防控和逆转提供了新的治疗药物。参考文献:［1］ Chahal N S，Lim T K，Jain P，et al． New insights into the relationshipof left ventricular geometry and left ventricular mass withcardiac function: A population study of hypertensive subjects［J］．Eur Heart J，2010，31( 5) : 588 － 94．［2］ McCullough P A，Chan C T，Weinhandl E D，et al． Intensive hemodialysis，left ventricular hypertrophy，and cardiovascular disease［J］． Am J Kidney Dis，2016，68( 5S1) : S5 － 14．［3］ 星学军，刁治民，许正泽． 药用植物肉苁蓉生物学特性及应用价值［J］． 青海草业，2018，27( 2) : 17 － 20，29．［3］ Xing X J，Diao Z M，Xu Z Z． Desert medicinal plants cistanchebiological characteristics and application value［J］． Qinghai Pratacult，2018，27( 2) : 17 － 20，29．［4］ 曾克武，廖理曦，万彦军，等． 基于靶点“钩钓”策略的肉苁蓉苯乙醇苷药理靶点鉴定及功效解析［J］． 中草药，2018，49( 1) : 173 － 8．［5］ 于倩． 蒙花苷和肉苁蓉苯乙醇苷对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究［D］． 吉林: 吉林大学，2017．［6］ 朱林强，周永焯，谢晓明，等． 大鼠腹主动脉缩窄术致大鼠慢性心衰的建模与体会［J］． 现代医院，2015，( 10) : 21 － 4．［7］ 施洋，樊官伟． 参附注射液对慢性充血性心力衰竭大鼠心肌miＲNA 表达谱的影响［J］． 中国药房，2017，28( 22) : 3048－ 52．［8］ 王建发，赵国安． 芍药苷通过cAMP-PKA 信号通路对心肌梗死大鼠保护作用的实验研究［J］． 中国循证心血管医学杂志，2018，10( 4) : 479 － 83．［9］ Okwuosa T M，Soliman E Z，Lopez F，et al． Left ventricular hypertrophyand cardiovascular disease risk prediction and reclassificationin blacks and whites: the Atherosclerosis Ｒisk in CommunitiesStudy［J］． Am Heart J，2015，169( 1) : 155 － 61．［10］ 吾买尔江·牙合甫，赵红琼，冯亮，等． 德赢vwin登录 醇提物对大鼠血液生化指标及心血管功能的影响［J］． 畜牧与饲料科学，2016，37( 6 － 7) : 16 － 20．［11］ Qian W，Yu D，Zhang J，et al． Wogonin attenuates isoprenalineinducedmyocardial hypertrophy in mice by suppressing the PI3K/Akt pathway［J］． Front Pharmacol，2018，9: 896．［12］ Shao M，Zhuo C，Jiang Ｒ，et al． Protective effect of hydrogen sulphideagainst myocardial hypertrophy in mice［J］． Oncotarget，2017，8( 14) : 22344 － 52．［13］ Song D，Liu X，Diao Y，et al． Hydrogen-rich solution against myocardialinjury and aquaporin expression via the PI3K/Akt signalingpathway during cardiopulmonary bypass in rats［J］． Mol MedＲep，2018，18( 2) : 1925 － 38．［14］ 叶芳杏，何俊慧，李梅兰，等． 玉郎伞MHBFC 调控eNOS-NO信号通路逆转大鼠心室重构的机制研究［J］． 中国药理学通报，2018，34( 11) : 1516 － 20．［15］ 杨洋，李觉． 绿原酸通过PI3K/Akt 信号通路抑制异丙肾上腺素诱导的心肌肥大［J］． 同济大学学报( 医学版) ，2019，40( 2) : 184 － 9．

摘要: 目的探讨肉苁蓉苯乙醇总苷( CPhGs) 抑制血小板衍生生长因子-BB( rrPDGF-BB) 介导的大鼠肝星状细胞( HSC)增殖活化作用及对PDGF/EＲK1 /2信号通路表达的影响。方法培养HSC 细胞，体外给予不同浓度( 0、3. 91、7. 81、15. 63、31. 25、62. 50、125. 00、250. 00 和500. 00 mg·L － 1 ) 的CPhGs 测定半数抑制率( IC50) ，选取25、50、75、100 mg·L － 1的CPhGs，rrPDGF-BB 刺激后，通过四甲基偶氮唑盐法( MTT) 检测细胞的增殖; 采用荧光定量PCＲ( ＲT-PCＲ) 检测EＲK1 /2、α-SMA、c-fos、c-jun 和Collagen I mＲNA 的表达; 进一步采用Western blot 法检测CPhGs 对PDGF/EＲK1 /2通路中EＲK1 /2、P-EＲK1 /2和Collagen I 蛋白的表达。结果( 50 ～100) mg·L － 1 的CPhGs 可以抑制rrPDGF-BB 诱导的HSC 的增殖( P ＜ 0. 05) ; ( 25 ～ 100) mg·L － 1 剂量组的CPhGs 均可抑制EＲK1 /2、α-SMA、c-fos、c-jun 和Collagen Ⅰ mＲNA 水平的表达，并且明显抑制EＲK1 /2、P-EＲK1 /2和Collagen Ⅰ通路蛋白的表达。结论CPhGs 的抗肝纤维化作用可能与其阻断PDGF/EＲK1 /2通路进而阻断HSC 的活化、增殖有关。关键词: 肉苁蓉苯乙醇总苷; 血小板衍生生长因子; 肝星状细胞; 肝纤维化; 细胞增殖; 信号通路; 作用机制肝纤维化是慢性肝病发展为晚期肝硬化的中间环节，由细胞外基质( extracellular matrix，ECM) 合成与降解失衡所致，已成为肝病死亡的主要原因［1］。纤维化ECM 产生于肌成纤维细胞( myofibroblast，MFB) ，MFB 主要来源于活化的肝星状细胞( hepaticstellate cells，HSC) ［2 － 3］; 因此，抑制HSC 的激活，减少其增殖、活化是有效阻断肝纤维化发生、发展进程的重要途径，对预防肝硬化［4］、逆转肝纤维化的病程［5］具有重要的意义。肉苁蓉( Cistanche) 是列当科肉苁蓉属，一种在沙漠树木梭梭根部的寄生植物，中国传统的名贵中药材，其主要成分中苯乙醇总苷( phenylethanol glycosides from cistanche tubulosa，CPhGs) ［6］系发挥药效的主要物质，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等多种生物活性。前期研究显示，CPhGs对牛血清白蛋白( bovine serum albumin，BSA) 所致肝纤维化大鼠具有一定的防治作用［7 － 8］，血小板衍生生长因子( PDGF) -BB 已被证实在刺激HSC 生长和相关细胞间信号传递方面较为重要，本研究旨在观察CPhGs 在rrPDGF-BB 诱导的HSC 细胞增殖中的作用及其对EＲK 信号转导通路的影响。1 材料与方法1． 1 试剂与仪器肉苁蓉苯乙醇总苷: 德赢vwin登录 取自新疆吐鲁番地区，物种标本凭证存放于新疆省中药研究所，CPhGs 由新疆维吾尔自治区药物研究所植物化学室提取纯化，纯度为70%，以含10% 胎牛血清的DMEM( 高糖) 培养液配成不同浓度的混悬液，经0. 22 μm 滤器过滤后使用; 大鼠HSC 购自武汉Procell 生物科技有限公司; Ｒecombinant ratPDGF-BB 购自Peprotech 公司; EＲK1 /2、α-SMA、β-actin 引物委托上海生工生物工程服务有限公司设计，经Genbank 核实后合成; cDNA 反转录试剂盒购自Thermo scientific 公司; 荧光定量PCＲ( real-timePCＲ，ＲT-PCＲ) 试剂盒购自QIAGEN GmbH 公司; β-actin 单克隆抗体购自武汉Proteintech 公司; p44 /42MAPK( EＲK1 /2) Antibody 和Phospho-p44 /42 MAPK( EＲK1 /2) Antibody 购自Cell signaling technology 公司; Collagen Ⅰ( ab34710) 抗体购自Abcam 公司; 碱性磷酸酶标记的二抗购自于美国Invitrogen 公司;ＲIPA 裂解液购自于Thermo Fisher Scientific 公司。1． 2 HSC 的培养和传代和半数抑制率( IC50)HSC 常规复苏后，用含10% 的胎牛血清的DMEM( 高糖) 完全培养液，在37℃、5% CO2及饱和湿度下培养; 当细胞呈单层致密状时，常规胰蛋白酶消化传代，24 h 换液，72 h 再传代; 实验选用对数生长期细胞，以5 × 104·L － 1 接种于96 孔板，24 h后换液，加入不同浓度组( 0、3. 91、7. 81、15. 63、31. 25、62. 50、125. 00、250. 00 和500. 00 mg · L － 1 ) 的CPhGs，每组4 个复孔，作用48 h，MTT 法于酶标仪490 nm 测定吸光度A 值并取均数，计算IC50。1． 3 MTT 法检测CPhGs 对rrPDGF-BB 刺激HSC 增殖影响实验分组为空白对照组、rrPDGFBB刺激组、PDGF-BB + 不同终浓度( 25、50、75、100mg·L － 1 ) CPhGs 给药组。另设与试验平行不加细胞只加DMEM 培养液的空白组。rrPDGF-BB 的终浓度为10 ng·L － 1，每组4 个复孔，分别在加药后24、48、72 h 后进行MTT 法检测HSC 的增殖抑制作用。抑制率/% = ［( A 模型组－ A 空白组) － ( A 用药组－ A 空白组) ］/( A 模型组－ A 空白组) ×100%。1． 4 CPhGs 对rrPDGF-BB 刺激的HSC EＲK1 /2、α-SMA、c-fos、c-jun 和Collagen Ⅰ mＲNA 表达的影响收集各组细胞，提取细胞总ＲNA，cDNA 合成参照公司的逆转录试剂盒合成。引物的设计及合成: 由上海生工生物有限公司采用引物设计软件Batch Primer 3 设计，经Genbank 核实后合成。引物序列见Tab 1。反应条件: 94℃变性3 min，变性94℃ 30 s，退火30 s，延伸72℃ 45 s，循环30 次，终末延伸72℃10 min，其他步骤按说明书进行操作。以β-actin 为内参，以目的基因与β-actin 的比值表示目的基因mＲNA 的相对表达量( 2 － ΔΔCt ) 。1． 5 CPhGs 对rrPDGF-BB 刺激的HSC p44 /42MAPK ( EＲK1 /2) 、Phospho-p44 /42 MAPK ( PEＲK1/2) 和Collagen Ⅰ蛋白表达的影响细胞分组同上。ＲIPA 裂解液裂解细胞，4℃ 12 000 × g 离心收集上清液，BCA 法测定蛋白含量，加4 × loadingbuffer 煮沸蛋白，上样蛋白量30 μg，制备10% 的SDS-PAGE 凝胶进行电泳。100 V 恒压转膜70 ～100 min，用10% 脱脂奶粉封闭1 h。一抗为兔抗p44 /42 MAPK( EＲK1 /2) antibody 和Phospho-p44 /42MAPK ( EＲK1 /2) antibody ( 1 ∶ 1 000 ) 及β-actin( 1 ∶ 5 000) 单克隆抗体，二抗为碱性磷酸酶标记的抗兔抗体( InvitrogenTM) ，显色剂显影，GEL DOC XＲ凝胶成像系统分析结果。1． 6 统计学方法应用SPSS 16. 0 统计软件分析数据。结果以珋x ± s 表示，组间比较用单因素方差分析及Tukey’s 法; Probit 进行HSC IC50分析。2 结果2． 1 CPhGs 对HSC 的IC50由Fig 1 可知，随着CPhGs 药物浓度的增加，HSC 的抑制率逐渐增加，CPhGs 在500 mg·L － 1浓度时，抑制率达到73. 4%，采用Probit 分析，计算CPhGs 药物的IC50为119. 125mg·L － 1。2． 2 不同浓度、不同时间CPhGs 对rrPDGF-BB诱导HSC 细胞的增殖抑制作用与正常对照组比较， rrPDGF-BB( 10 ng·L － 1 ) 组的HSC 细胞明显增加，其中以48 h 增殖最为明显( P ＜ 0. 01) ，提示模型构建成功; 与rrPDGF-BB 组比较，除25 mg·L － 1 的CPhGs 对HSC 的抑制作用在24 h 及48 h 作用不明显以外，余CPhGs 组均能不同程度地抑制rrPDGFBB诱导的HSC 的增殖，差异有统计学意义( P ＜0. 05) ，其中rrPDGF-BB + CPhGs 100 mg·L － 1 剂量组的抑制率最高达47. 20%; 以抑制率表现最佳的CPhGs 100 mg·L － 1进行药物作用时间的考察，CPhGs作用于细胞48 h 较24 h 时抑制率明显增加，但48 h后抑制率增加逐渐平缓，72 h 时抑制率最佳。说明CPhGs 发挥作用的最佳时间为rrPDGF-BB 刺激HSC 细胞48 h，后续时间，CPhGs 的抑制率增加趋于稳定，见Tab 2。2． 3 CPhGs 对rrPDGF-BB 刺激的HSC EＲK1 /2、α-SMA、c-fos、c-jun 和Collagen Ⅰ mＲNA 表达的影响ＲT-PCＲ 检测EＲK1 /2、α-SMA、c-fos、c-jun、Collagen Ⅰ及β-actin 基因表达，25 ～ 100 mg·L － 1浓度的CPhGs 均可不同程度地下调细胞EＲK1 /2、α-SMA、c-fos、c-jun、Collagen I 的mＲNA 表达，结果显示: 与正常对照组比较，在rrPDGF-BB 组EＲK1 /2、α-SMA、c-fos、c-jun 和Collagen Ⅰ mＲNA 的表达水平( P ＜ 0. 05) 明显增高; 与rrPDGF-BB 组比较，CPhGs不同浓度药物组的EＲK1 /2、α-SMA、c-fos、c-jun 和Collagen Ⅰ mＲNA 表达强度均有所下降( P ＜0. 05) ，差异有统计学意义( Fig 2) 。2． 4 CPhGs 对rrPDGF-BB 刺激的HSC EＲK1 /2、p-EＲK1 /2和Collagen Ⅰ蛋白表达的影响如Fig 3所示， rrPDGF-BB 刺激的HSC EＲK1 /2、p-EＲK1 /2和Collagen Ⅰ蛋白表达较正常组明显增加，CPhGs( 25、50、75、100 mg·L － 1 ) 给药组均可不同程度地抑制rrPDGF-BB 诱导的HSC EＲK1 /2、p-EＲK1 /2和CollagenⅠ蛋白表达，其中以CPhGs100 mg·L － 1 给药组作用效果最为明显。3 讨论PDGF 主要源于血液中的血小板、肝窦内皮细胞、HSC、单核细胞、肝库普弗细胞等［9］。PDGF 包括-AA，-AB，-BB 3 种亚型，其中PDGF-BB 主要位于肝脏，促HSC 增殖的作用也最强，能促进HSC 活化增殖、胶原分泌，是目前已知的促HSC 增殖的细胞因子和促有丝分裂原; 病理条件下静止的HSC 表型会被激活，在肝纤维化进程中扮演着重要角色，能促使肝内的细胞－ 细胞、细胞－ 基质、基质－ 介质间相互作用，在复杂的网络系统中，促使细胞大量增殖;合成并分泌以胶原为主的ECM 和细胞因子、表达α-SMA、多种细胞因子及其受体、同时具有收缩功能。因此抑制rrPDGF-BB 对HSC 的生物学作用对防治肝纤维化有重要的意义。EＲK1 /2可被多种癌基因产物激活后向核内传递信号，磷酸化和活化核内的效应分子，调节下游核转录因子的表达，如c-myc、c-fos、c-jun、cyclin-D1、Bcl-2 等，最终启动与调节细胞的生长、发育、分化、凋亡等多种生理过程相关的靶基因转录，发挥促进细胞的增殖、浸润、转移与恶性转化的功能［10］。c-fos 和c-jun 在成人正常组织中低表达，而在许多恶性肿瘤及其癌前病变中出现过度表达［11 － 12］。提示c-fos 和c-jun 的激活是细胞由正常状态向疾病状态转化的一个重要的生物学标志［13］。ＲT-PCＲ 扩增检测EＲK1 /2、α-SMA、c-fos、c-jun、Collagen Ⅰ mＲNA 研究结果提示，PDGF /EＲK1 /2信号通路被激活，CPhGs 可能通过阻断PDGF /EＲK 信号通路中EＲK1 /2、c-fos、c-jun、α-SMA、Collagen Ⅰ mＲNA 表达而起到治疗肝纤维化的作用。所以rrPDGF-BB 作为一种损伤因素参与到肝纤维化的过程中，防治肝纤维化的重要途径之一是阻断rrPDGF-BB 对HSC 的生物学作用。有研究［14 － 15］发现HSC 中Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达与EＲK1 /2有关，抑制HSC EＲK1 /2的活化或表达后，Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达将被抑制，EＲK1 /2的表达随着肝纤维化的进展而明显增加，且与α-SMA 的分布正相关［16］。因此以CPhGs 作为干预药物，观察CPhGs对rrPDGF-BB 刺激的HSC 增殖活性、Ⅰ型胶原、EＲK1 /2与α-SMA 表达的影响，可能成为CPhGs 治疗肝纤维化的作用靶点。本研究结果显示，50 ～ 100mg·L － 1 浓度的CPhGs，对rrPDGF-BB 刺激的HSC增殖活性具有明显的抑制作用，除25 mg·L － 1 浓度的CPhGs 对rrPDGF-BB 刺激的HSC EＲK1 /2 mＲNA的表达无明显差异外，其余浓度组的CPhGs EＲK1 /2及α-SMA mＲNA 的表达均有明显抑制作用，对rrPDGF-BB 刺激的HSC EＲK1 /2、p-EＲK1 /2和Collagen Ⅰ蛋白表达也具有抑制作用，随CPhGs 浓度的增加抑制作用增强。肉苁蓉作为一种名贵的中药材，在推动新疆特色沙漠产业的发展中具有重要地位; 本研究对CPhGs 药物的抗肝纤维化作用及机制进行研究，显示CPhGs 能够阻断PDGF 介导的HSC 的活化及增殖作用，同时抑制胶原纤维蛋白的分泌，这可能是通过CPhGs 药物干扰PDGF /EＲK 信号级联系统的相关信号分子及其磷酸化水平、抑制PDGF 诱导的HSC 活化和增殖来实现的。参考文献:［1］ Kostadinova Ｒ，Montagner A，Gouranton E，et al． GW501516-activatedPPAＲbeta /delta promotes liver fibrosis via p38-JNKMAPK-induced hepatic stellate cell proliferation［J］． Cell Bio Sci，2012，2: 34 － 50．［2］ Mallat A，Lotersztajn S． Cellular mechanisms of tissue fibrosis． 5．novel insights into liver fibrosis［J］． Am J Physiol，2013，305:C789 － 99．［3］ 彭龙希，高思楠，王媛，等． 青蒿琥酯在大鼠体内外抗肝纤维化的作用［J］． 中国药理学通报，2016，32( 5) : 658 － 63．［4］ 陈小霞，谢娟，黄成，等． EZH2 对HSC-T6 细胞增殖活化的影响及其部分机制研究［J］． 中国药理学通报，2015，31( 8) : 1061 － 5．［5］ Sohrabpour A A，Mohamadnejad M，Malekzadeh Ｒ． Ｒeview article:the reversibility of cirrhosis［J］． Aliment Pharmacol Ther，2012，36: 824 － 32．［6］ 李媛，宋媛媛，张洪泉． 肉苁蓉的化学成分及药理作用研究进展［J］． 中国野生植物资源，2010，29( 1) : 7 － 12．［7］ 由淑萍，赵军，木克热木·吐地买提，等． 肉苁蓉苯乙醇苷类成分对BSA 诱导的肝纤维化大鼠转化生长因子β1表达的影响［J］． 癌变·畸变﹒突变，2015，27( 6) : 409 － 14．［8］ You S P，Zhao J，Ma L，et al． Preventive effects of phenylethanolglycosides from Cistanche tubulosa on bovine serum albumin inducedhepatic fibrosis in rats［J］． DAＲU J Pharm Sci，2015，23:52．［9］ Kwiecinski M，Elfimova N，Noetel A，et al． Expression of platelet-derived growth factor-Cand insulin-like growth factor I in hepaticstellate cell is inhibited by miＲ-29［J］． Lab Invest，2012，92( 7) : 978 － 87．［10］ Borkham-Kamphort E，Herrmann J，Stoll D，et al． Dominantnegativesoluhle PDGF-beta receptorin hibitshepatics tellate cell activationattenuates liver fibrosis［J］． Lab Invest，2004，84( 6) : 766 －77．［11］ Cheung T H，Leung J O． c-fos overexpression is associated withthe pathoneogenesisof invasive cervicalcancer［J］． Gynecol Obstet-Invest，1997，43( 3) : 200 － 3．［12］ Hartl M，Ｒeiter F，Andreas G，et al． JAC，adirecttargetofoncogenictranscriptionfactorJun，is involved in cell transformation andtumorigenesis［J］． PNAS，2001，94( 24) : 13601 － 6．［13］ 陈建勇，王聪，王娟，等． MAPK 信号通路研究进展［J］．中国医药科学，2011，1( 8) : 32 － 4．［14］ Svegliati-Baroni G，Ｒidolfi F，Di Sario A， et al． Intracellular signalingpathways involved in acetaldehyde-induced collagen and fibronectingene expression in human hepatic stellate cells［J］． Hepatology，2001，33( 5) : 1130 － 40．［15］ Qiang H，Lin Y，Zhong X，et al． Differential expression genes analyzedby cDNA array in the regulation of rat hepatic fibrogenesis［J］． Liver Int，2006，26( 9) : 1126 － 37．［16］ Zhang X L，Liu J M，Yang C C， et al． Dynamic expression of extracellularsignal-regulated kinase in rat liver tissue during hepatic fibrogenesis［J］． World J Gastroenterol， 2006，12( 39) : 6376 － 81．

摘要：目的　研究肉苁蓉苯乙醇总苷（ｐｈＧｓ）对庆大霉素诱导大鼠急性肾损伤的保护作用。方法　将５４只雄性ＳＤ大鼠随机分为１０ｄ、１５ｄ空白对照组（生理盐水１０ｍＬ／ｋｇ体质量），１０ｄ、１５ｄ模型组（生理盐水１０ｍＬ／ｋｇ体质量），１０ｄ、１５ｄｐｈＧｓ高剂量组（ｐｈＧｓ　５００ｍｇ／ｋｇ体质量），１０ｄ、１５ｄｐｈＧｓ低剂量组（ｐｈＧｓ　２５０ｍｇ／ｋｇ体质量）以及２１ｄ模拟临床治疗组（生理盐水１０ｍＬ／ｋｇ体质量），每组６只，除１０ｄ、１５ｄ空白对照组外其他各组大鼠连续１０ｄ腹腔注射庆大霉素（７５ｍｇ／ｋｇ体质量）建立急性肾损伤模型。各组实验结束后留取大鼠２４ｈ尿液并记录尿量，腹主动脉取血，取双侧肾脏并计算肾脏指数。采用全自动生化分析仪测定各组大鼠血清中肌酐（Ｓｃｒ）和尿素氮（ＢＵＮ）含量，采用生化试剂盒检测各组大鼠肾脏组织中丙二醛（ＭＤＡ）、超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）、过氧化氢酶（ＣＡＴ）、谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＳＨ－ＰＸ）表达量。结果　与空白对照组比较，１０ｄ、１５ｄ模型组大鼠血清Ｓｃｒ、ＢＵＮ、２４ｈ尿量及肾脏组织中ＭＤＡ 表达量均升高，肾脏组织中ＳＯＤ、ＣＡＴ、ＧＳＨ－ＰＸ酶的活性均降低，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０１）。与模型组比较，１０ｄ、１５ｄｐｈＧｓ高、低剂量组大鼠血清Ｓｃｒ、ＢＵＮ、２４ｈ尿量及肾脏组织中ＭＤＡ表达量均降低，肾脏组织中ＳＯＤ、ＣＡＴ、ＧＳＨ－ＰＸ酶的活性均升高，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０５）。结论　肉苁蓉苯乙醇总苷对庆大霉素诱导的大鼠急性肾损伤具有一定保护作用。关键词：肉苁蓉；苯乙醇总苷；庆大霉素；急性肾损伤急性肾损伤（ａｃｕｔｅ　ｋｉｄｎｅｙ　ｉｎｊｕｒｙ，ＡＫＩ）是各种原因引起的肾脏滤过功能突然快速下降或丧失的临床综合征［１］。目前ＡＫＩ的发病率呈逐年上升趋势，其病因多样并能够导致多种并发症，临床治疗的干预手段十分有限［２，３］。研究发现连续接受氨基糖苷类抗生素治疗是ＡＫＩ的独立危险因素［４］，其诱发机制与药物介导的自由基产生、磷脂沉积、肾血流减少及局部炎症有关［５］。临床多采用治疗药物监测技术手段治疗氨基糖苷类抗生素诱导的急性肾功能损伤，但无法从根源上改善或逆转由该类抗生素所产生的肾脏损伤风险［６］。早期干预氨基糖苷类抗生素的肾毒性是目前氨基糖苷类抗生素合理应用研究中的热点。中药肉苁蓉（Ｃｉｓｔａｎｃｈｅｓ　Ｈｅｒｂａ）为列当科Ｏｒｏｂａｎｃｈａｃｅａｅ肉苁蓉属Ｃｉｓｔａｎｃｈｅｓ植物干燥带鳞叶的肉质茎，具有补肾阳、益精血等功效［７］，其性温，味甘，归肾经。苯乙醇总苷是肉苁蓉中主要化学成分，能够增加血清超氧化物歧化酶的活性，抑制丙二醛表达，增强机体对氧自由基的清除能力，减少体内自由基累积，发挥保护机体免受过氧化损伤功效［８］。本研究采用庆大霉素构建大鼠急性肾损伤模型，探究肉苁蓉苯乙醇总苷对庆大霉素诱导急性肾损伤的防治作用，现报道如下。１　材料与方法１．１　实验动物　ＳＤ大鼠５４只，雄性，体质量（２００±２０）ｇ，购于新疆医科大学动物实验中心，动物生产许可证号：ＳＣＸＫ（新）２０１６－０００３，所有动物饲养于新疆医科大学动物实验中心ＳＰＦ屏障环境，使用许可证号：ＳＹＸＫ（新）２０１６－０００２，环境温度２４～２６℃，恒温恒湿，相对湿度在４０％～７０％，大鼠自由进食和饮水。１．２　试药　肉苁蓉苯乙醇总苷（本课题组从德赢vwin登录 中富集纯化而得，苯乙醇总苷含量达８９．５％，松果菊苷含量大于４０％，毛蕊花糖苷含量大于１６．０％），硫酸庆大霉素注射液（河南辅仁怀庆堂制药有限公司，批号１６１２２４１１），丙二醛（ＭＤＡ）检测试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号ＶＡＡＡＫ６Ｓ２８６），超氧化岐化酶（ＳＯＤ）检测试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号ＷＳＨ２７ＳＳ９ＧＢ），过氧化氢酶（ＣＡＴ）检测试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号ＦＧＳ３Ｊ６６Ｄ２Ｋ），谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＳＨ－ＰＸ）检测试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号ＤＫ８Ａ６２２ＸＺＰ），ＢＣＡ 蛋白定量试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号２０１９０６２２）。１．３　实验仪器　ＴＤ５０００２Ａ型电子天平（余姚市金诺天平仪器有限公司），Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ全波长酶标仪（美国Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ公司），ＢＳ－３２０型全自动生化分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司），Ｂｉｏｆｕｇｅｐｒｉｍｏ台式冷冻离心机（美国Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ公司）。１．４　造模、分组及给药方法　５４只雄性ＳＤ大鼠适应性喂养１周后，随机分为１０ｄ、１５ｄ空白对照组，１０ｄ、１５ｄ模型组，１０ｄ、１５ｄ肉苁蓉苯乙醇总苷高剂量组，１０ｄ、１５ｄ肉苁蓉苯乙醇总苷低剂量组、以及２１ｄ模拟临床治疗组，每组６只。除１０ｄ、１５ｄ空白对照组外其他各组大鼠连续１０ｄ腹腔注射庆大霉素（７５ｍｇ／ｋｇ体质量）建立急性肾损伤模型。给药方法：（１）１０ｄ、１５ｄ空白对照组大鼠分别给予生理盐水（１０ｍＬ／ｋｇ体质量）腹腔注射与灌胃至１０ｄ与１５ｄ；（２）１０ｄ、１５ｄ模型组大鼠造模同时分别给予生理盐水（１０ｍＬ／ｋｇ体质量）灌胃至１０ｄ与１５ｄ；（３）１０ｄ、１５ｄ高剂量组大鼠每日造模同时分别给予肉苁蓉苯乙醇总苷（５００ｍｇ／ｋｇ体质量）灌胃至１０ｄ与１５ｄ；（４）１０ｄ、１５ｄ低剂量组大鼠每日造模同时分别给予肉苁蓉苯乙醇总苷（２５０ｍｇ／ｋｇ体质量）灌胃至１０ｄ与１５ｄ；（５）２１ｄ模拟临床组大鼠造模同时给予生理盐水（１０ｍＬ／ｋｇ体质量）灌胃至２１ｄ。大鼠每周称重，根据体质量调整药物用量。１．５　标本采集　各组大鼠第１０ｄ、１５ｄ和２１ｄ收集２４ｈ尿液（动物于前一天放入代谢笼中，每个代谢笼放１只动物，２４ｈ后取出），４℃，３　０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，收集上清液－２０℃冻存，备用。实验结束后各组大鼠禁食不禁水，腹腔注射１０％水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，室温静置１ｈ后４℃，３　５００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，取上层淡黄色澄清液体分装，－２０℃冻存，备用。将各组大鼠麻醉，充分暴露腹腔，用止血钳固定双侧肾组织远心端和近心端的动静脉，剪开肾静脉后经腹主动脉注入４℃等渗生理盐水，灌注至肾脏颜色转为苍白，快速取出双侧肾置于滤纸上吸干水分后称重，计算脏器指数。取大鼠新鲜右肾皮质部分０．４ｇ，按１∶９加入预冷后的生理盐水，低温环境下制成１０％肾组织匀浆，冻存，备用。脏器指数计算公式如下：肾脏指数＝双侧肾质量×１０３／大鼠体质量。１．６　大鼠血清肌酐和尿素氮水平的检测　取待测血清样本置于全自动生化分析仪测定，按试剂盒说明操作测定大鼠血清中肌酐和尿素氮含量。１．７　大鼠肾脏组织ＳＯＤ、ＣＡＴ、ＧＳＨ－ＰＸ、ＭＤＡ的检测　取大鼠肾脏匀浆液室温放置融化，４℃，３　０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，收集上清液，采用ＢＣＡ试剂盒检测各组大鼠肾脏组织蛋白浓度。按照试剂盒说明操作测定肾组织中超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）、过氧化氢酶（ＣＡＴ）谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＳＨ－ＰＸ）活性和丙二醛（ＭＤＡ）含量。１．８　统计学处理　采用ＳＰＳＳ　２１．０统计软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（－ｘ ±ｓ）表示，两组组间比较采用ｔ检验，检验水准α＝０．０５。２　结果２．１　肉苁蓉苯乙醇总苷对各组大鼠体质量、肾指数和２４ｈ尿量的影响　造模前各组大鼠体质量差异无统计学意义（Ｐ ＞０．０５）。造模后，与空白对照组比较，各模型组大鼠体质量降低，肾指数和２４ｈ尿量升高，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０１）；与模型组比较，１０ｄ、１５ｄ肉苁蓉苯乙醇总苷高、低剂量组大鼠体质量升高，肾指数和２４ｈ尿量降低，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０５）；模拟临床组大鼠体质量升高，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０５），肾指数和２４ｈ尿量差异无统计学意义（Ｐ ＞０．０５），见表１。２．２　肉苁蓉苯乙醇总苷对各组大鼠血清肌酐含量的影响　与空白对照组比较，各模型组大鼠血清肌酐含量升高，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０１）；与模型组比较，１０ｄ、１５ｄ肉苁蓉苯乙醇总苷高、低剂量组大鼠血清肌酐含量降低，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０５）；模拟临床组大鼠血清肌酐含量差异无统计学意义（Ｐ ＞０．０５），见表２。２．３　肉苁蓉苯乙醇总苷对各组大鼠血清尿素氮含量的影响　与空白对照组比较，各模型组大鼠血清尿素氮含量升高，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０１）；与模型组比较，１０ｄ、１５ｄ肉苁蓉苯乙醇总苷高、低剂量组大鼠血清尿素氮含量均降低，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０１）；模拟临床组大鼠血清尿素氮含量差异无统计学意义（Ｐ ＞０．０５），见表３。２．４　肉苁蓉苯乙醇总苷对各组大鼠肾组织中ＳＯＤ活力的影响　与空白对照组比较，各模型组大鼠肾组织中ＳＯＤ活力降低，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０１）；与模型组相比较，１０ｄ、１５ｄ肉苁蓉苯乙醇总苷高、低剂量组大鼠肾组织中ＳＯＤ活力升高，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０１）；模拟临床组大鼠肾组织中ＳＯＤ活力升高，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０１），见表４。２．５　肉苁蓉苯乙醇总苷对各组大鼠肾组织中ＣＡＴ活力的影响　与空白对照组比较，各模型组大鼠肾组织中ＣＡＴ活力降低，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０１）；与模型组相比较，１０ｄ、１５ｄ肉苁蓉苯乙醇总苷高、低剂量组大鼠肾组织中ＣＡＴ活力升高，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０１）；模拟临床组大鼠肾组织中ＣＡＴ活力无统计学意义（Ｐ ＞０．０５），见表５。２．６　肉苁蓉苯乙醇总苷对各组大鼠肾组织中ＧＳＨＰＸ活力的影响　与空白对照组比较，各模型组大鼠肾组织中ＧＳＨ－ＰＸ活力降低，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０１）；与模型组相比较，１０ｄ、１５ｄ肉苁蓉苯乙醇总苷高、低剂量组大鼠肾组织中ＧＳＨ－ＰＸ活力升高，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０５）；模拟临床组大鼠肾组织中ＧＳＨ－ＰＸ 活力无统计学意义（Ｐ ＞０．０５），见表６。２．７　肉苁蓉苯乙醇总苷对各组大鼠肾组织中ＭＤＡ含量的影响　与空白对照组比较，各模型组大鼠肾组织中ＭＤＡ含量升高，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０１）；与模型组相比较，１０ｄ、１５ｄ肉苁蓉苯乙醇总苷高、低剂量组大鼠肾组织中ＭＤＡ含量降低，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０１）。模拟临床组大鼠肾组织中ＭＤＡ含量差异无统计学意义（Ｐ ＞０．０５），见表７。３　讨论氨基糖苷类抗生素常见严重不良反应是肾毒性［９］。该类药物极易以原型药物通过肾小球滤过，部分药物分泌入尿液，而绝大部分药物选择性蓄积在肾皮质，使得在该部位的浓度高于血清中药物浓度几倍［１０］，这种药物蓄积不可避免的造成细胞损伤及肾功能下降。长期以来，临床上对氨基糖苷类药物引起的ＡＫＩ始终沿袭停药、常规补液的对症支持治疗原则，静待肾脏病变自身的转归，目前尚无其他药物可以减轻氨基糖苷类药物对肾组织的损伤。因此本研究设立了２１ｄ模拟临床治疗组，尽可能模拟临床常规治疗及机体康复过程，以便进一步客观考察肉苁蓉苯乙醇总苷的治疗效果。在临床治疗中，Ｓｃｒ和ＢＵＮ常作为评价肾功能的指标，Ｓｃｒ和ＢＵＮ水平越高则反映肾功能损伤越严重［１１］。本研究通过大鼠连续１０ｄ腹腔注射庆大霉素７５ｍｇ／ｋｇ建立ＡＫＩ模型，与空白对照组相比，模型组大鼠Ｓｃｒ和ＢＵＮ水平升高，提示造模成功。经过肉苁蓉苯乙醇总苷干预１０ｄ、１５ｄ后，各给药组大鼠Ｓｃｒ和ＢＵＮ下降，表明肉苁蓉苯乙醇总苷对庆大霉素所致ＡＫＩ具有良好的改善作用。研究发现，活性氧簇（ＲＯＳ）的增加在庆大霉素引起的肾小管损伤的病理过程中扮演着重要的角色［１２］。ＭＤＡ是反应机体内ＲＯＳ水平的主要物质之一［１３－１４］，生物体内抵抗ＲＯＳ的抗氧化剂（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ）防御系统包括主要包括ＳＯＤ、ＣＡＴ、ＧＳＨＰＸ等。苯乙醇总苷作为肉苁蓉主要有效成分，能够在动物体内发挥显著的抗氧化活性［１５］。肉苁蓉苯乙醇总苷干预后，给药组大鼠肾脏组织ＭＤＡ 含量则明显降低，ＳＯＤ、ＣＡＴ和ＧＳＨ－ＰＸ活性明显升高，提示肉苁蓉苯乙醇总苷能够改善肾脏氧化应激损伤状况并减轻肾脏损伤。综上所述，肉苁蓉苯乙醇总苷对庆大霉素诱导的急性肾损伤具有保护作用，通过抑制自由基产生和激活自由基清除酶发挥抗氧化作用，改善机体氧化应激状态，增强机体抗氧化能力，减轻肾脏损伤。参考文献：［１］　李明，刘勇强，敖华，等．葛根素减轻庆大霉素诱导的大鼠急性肾损伤［Ｊ］．中国实验方剂学杂志，２０１７，２３（１７）：１７７－１８２．［２］　雷莹，聂晟，孙丹华，等．中国危重症住院患者急性肾损伤的流行病学分析［Ｊ］．南方医科大学学报，２０１６，３６（６）：７４４－７５０．［３］　于乐成，何长伦．肝硬化住院患者急性肾损伤（ＡＫＩ）与病死率及并发症的相关性［Ｊ］．肝脏，２０１３，１８（１１）：４２－４７．［４］　ＫＩＳＨＯＲＥ　Ｂ　Ｋ，ＬＡＭＢＲＩＣＨＴ　Ｐ，ＩＢＲＡＨＩＭ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆ　ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｎｅｐｈｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｉｎ　ｒａｔｓ　ｂｙ　ｐｏｌｙａｎｉｏｎｉｃｐｅｐｔｉｄｅｓ［Ｊ］．Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ　Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，２０１５，８３（８３）：１９１－２０１．［５］　ＡＮ　Ｃ　Ｎ，ＰＵ　Ｘ　Ｐ，ＷＡＮＧ　Ｑ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｉｓｔａｎｃｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓｔｈｅ　ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｈｙｄｒｏｇｅｎ　ｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｉｎ　ｎｅｗｍｕｔａｎｔ　ＤＪ－１－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｍｏｄｅｌｓ［Ｊ］．Ｂｒａｉｎ　Ｂｅｈａｖｉｏｒ，２０１９，９（７）：１－７．［６］　ＫＡＲＡ　Ａ，ＣＥＴＩＮ　Ｈ，ＯＫＴＥＭ　Ｆ，ｅｔ　ａｌ．Ａｍｉｋａｃｉｎ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｒｅｎａｌ　ｄａｍａｇｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ　ｏｎ　ｎｅｏｎａｔａｌ　ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｒｅｎ　Ｆａｉｌ，２０１６，３８（５）：６７１－６７７．［７］　曹丹丹，杨建华，胡君萍．肉苁蓉苯乙醇苷纳米乳鼻腔给药的安全性评价［Ｊ］．新疆医科大学学报，２０１８，４１（１１）：１４１１－１４１５．［８］　居博伟，杨建华，闫瑶，等．肉苁蓉苯乙醇总苷对Ａβ＿（１－４２）诱导的ＰＣ１２细胞损伤的保护作用［Ｊ］．新疆医科大学学报，２０１７，４０（５）：８４－８７．［９］　许桓，唐春雷，范为正．氨基糖苷类抗生素的研究进展［Ｊ］．中国新药杂志，２０１９，２８（１５）：１８２８－１８３３．［１０］　ＫＡＨＹＡ　Ｖ，ＯＺＵＣＥＲ　Ｂ，ＤＯＧＡＮ　Ｒ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅｅｘｔｒａｃｔ：ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｐｒｏｔｅｃｔｏｒ　ａｇａｉｎｓｔ　ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅｏｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ［Ｊ］．Ｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ　Ｏｔｏｌｏｇｙ，２０１４，１２８（１）：４３－４８．［１１］　付玉华，菅建国．血尿素氮、血肌酐与血清胱抑素Ｃ联合检测对肾功能损害程度的诊断价值研究［Ｊ］．中国疗养医学，２０１７，２６（５）：４６６－４６８．［１２］　ＺＨＡＮＧ　Ｌ，ＳＵＮ　Ｄ，ＢＡＯ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．Ｎｅｒｏｌｉｄｏｌ　Ｐｐｒｏｔｅｃｔｓ　ａｇａｉｎｓｔＬＰＳ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｃｕｔｅ　ｋｉｄｎｅｙ　ｉｎｊｕｒｙ　ｖｉａ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ＴＬＲ４／ＮＦ－κＢ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１７，３１（３）：４５９－４６５．［１３］　夏莉莉，汤瑜斌，邵侃．前列地尔对糖尿病肾病患者血液流变学、免疫功能及ＭＤＡ、ＳＯＤ、ＲＯＳ的影响［Ｊ］．海南医学院学报，２０１６，２２（１４）：１５２８－１５３１．［１４］　徐小惠，范氏泰，韦晓洁，等．杨桃根总提取物对糖尿病小鼠肾功能及其抗氧化应激作用的研究［Ｊ］．中国药理学通报，２０１７，３３（１）：９５－１００．［１５］　薛海燕，焦婵媛，姚军．肉苁蓉总苷药理作用的研究现状［Ｊ］．中国临床药理学杂志，２０１８，３４（４）：４８６－４８８．

摘要: 目的研究肉苁蓉苯乙醇总苷对酪氨酸酶活性的抑制作用。方法用L － 酪氨酸作为底物，测定药物干预前后酪氨酸酶的活性，计算酪氨酸酶的抑制率，并以Lineweaver － Burk 双倒数法绘制酶动力学曲线，推断抑制类型。结果苯乙醇总苷对酪氨酸酶的活性具有明显下调作用，对酪氨酸酶的效应表现为竞争型可逆性抑制。结论本研究可为开发利用肉苁蓉中的美白成分提供依据。关键词: 肉苁蓉; 苯乙醇总苷; 酶氨酸酶; 抑制作用黑素( melanin) 是决定人体肤色最重要的因素，它的合成是表皮基底层中黑素细胞的一种应激反应，反应过强，可引起雀斑、黄褐斑、老年斑等色素增加性皮肤病的形成。酪氨酸酶( tyrosinase) 是皮肤黑素生物合成过程的主要限速酶，能将机体内制造黑素的主要原料酪氨酸( tyrosine) 羟化，产生L － 多巴( L － Dopa) ，然后再将多巴氧化成多巴醌( dopaquinone)，多巴醌经过系列的代谢过程，重新排列并聚合，最后与蛋白质结合生成一系列引起褐化的黑素蛋白［1］。近年来，美白化妆品的研制和色素增加性皮肤病防治的研究热点趋向于天然产物，特别是天然药物活性成分对酪氨酸酶的抑制作用［2 － 3］。肉苁蓉是传统的名贵补益类中药，主要含有苯乙醇苷、环烯醚萜苷、木脂素及甾醇等化学成分，其中，苯乙醇苷是肉苁蓉的主要活性成分，目前已从肉苁蓉属植物中分离得到30 余种此类单体成分。作者已对肉苁蓉的化学成分、质量控制、药理活性等进行了系统研究［4 － 8］。现采用酪氨酸多巴速率氧化法对肉苁蓉中的苯乙醇苷进行了酪氨酸酶活性的调控及动力学特点的研究。1 实验部分1． 1 仪器与试药酶联免疫检测仪( 美国Biorad) ; UV － 2550 紫外可见分光光度仪( 日本Shimadzu ) 。酪氨酸酶( 2. 35 × 103 U·mg － 1 ，美国Sigma) ; L － 酪氨酸( 天津光复精细化工研究所) ; 德赢vwin登录 药材采自新疆阿克苏地区阿瓦提县，鉴定为列当科植物德赢vwin登录 Cistanche tubulosa ( Schenk) Wight 的带鳞叶的肉质茎; 苯乙醇总苷( 自制) ; 熊果苷( 北京耐确生化技术研究所) ; 大孔吸附树脂( SP825 ) 、MCI 小孔树脂( 75 ～ 150 μm) ( 日本三菱) ; 水为重蒸水; 其余试剂为分析纯。1． 2 方法与结果1． 2． 1 苯乙醇总苷的制备称取德赢vwin登录 干燥肉质茎适量，粉碎后分别以3 倍量80% 乙醇回流提取3 次，合并滤液，减压浓缩后得乙醇浸膏，浸膏用适量水混悬，经大孔吸附树脂柱层析，依次以水、30%、50%、70%、95% 乙醇梯度洗脱，合并30% ～50% 乙醇洗脱馏份段，减压浓缩得浸膏，浸膏用适量水混悬，经MCI 小孔树脂柱层析，以H2O － CH3OH体系梯度洗脱，收集30% ～ 60% 的CH3OH 洗脱馏份段，减压浓缩至稠膏状，冷冻干燥，制成粉末，即得。用紫外分光光度法测定，苯乙醇总苷含量为48． 2% ，以HPLC 法测定，松果菊苷含量为27． 5%、毛蕊花糖苷含量为9． 6%。1． 2． 2 酪氨酸酶活性的测定采用酪氨酸酶多巴速率氧化法检测酪氨酸酶活性，以酶联免疫检测仪检测反应产物特异性吸光度( A490) 。反应在96 孔培养板中进行，总反应体系150 μL。取50 μL 测试物，加入50 μL 酪氨酸，待充分混匀后在冰浴中迅速加入50 μL( 25 U) 酪氨酸酶，混匀，在25 ℃ 下温育15 min，立即置酶标仪下测定每孔的A490。每组平行试验5 次。酪氨酸酶抑制率I = ［( A － B) － ( C －D) ］/ ( A － B) × 100% ，其中，A 为未加总苷而加酶的混合液吸光度，B 为未加总苷亦未加酶的混合液吸光度，C 为加入总苷和酶的混合液吸光度，D 为加入总苷而未加酶的混合液吸光度。1 ． 2 ． 3 统计学处理计量资料以珋x ± s表示，数据采用SPSS 16． 0 统计软件进行分析。1． 2． 4 苯乙醇总苷对酪氨酸酶活性的影响不同浓度的苯乙醇总苷对酪氨酸酶均有不同程度的抑制作用，抑制率的大小在一定浓度范围内( 0． 5 ～ 2． 0mg·mL － 1 ) 与效应物呈剂量依赖关系，标准曲线为:Y = － 0． 054X + 0. 459 ( r = 0． 9982) 。表现为在相同底物浓度条件下，苯乙醇总苷对酪氨酸酶抑制作用随浓度增大而增加。与空白对照组相比，1． 0 mg·mL － 1 熊果苷组和1． 0 mg·mL － 1 苯乙醇总苷组均有显著性差异( P ＜ 0． 05) ，苯乙醇总苷( 1． 5 ～ 3． 0 mg·mL － 1 ) 组则有极显著性差异( P ＜ 0． 01) ( 表1) ，说明苯乙醇总苷具有抑制酪氨酸酶活性的作用。1． 2． 5 苯乙醇总苷抑制酪氨酸酶的动力学考察在不同浓度的酪氨酸底物溶液中，分别测定不同浓度苯乙醇总苷的A490，绘制Lineweaver － Burk 双倒数曲线( 1 /A ～ 1 / S) ，结果见表2。苯乙醇总苷的Lineweaver － Burk 双倒数方程显示: 在一定浓度内，效应物的纵坐标截距基本固定( 2． 15 ～ 2． 43) ，表明苯乙醇总苷作为酪氨酸酶抑制剂并不改变酶促反应的最大反应速度，只能引起米氏常数( Km) 的改变，说明抑制剂与底物和酶的结合是互相竞争的，增加底物浓度可降低抑制剂对酶的效应，提示苯乙醇总苷对酪氨酸酶为竞争型抑制。1． 2． 6 苯乙醇总苷对酪氨酸酶作用类型的判别绘制苯乙醇总苷对酪氨酸酶抑制作用的A － E 曲线，回归方程为: Y = 0． 024X + 0． 288 ( r = 0. 97 ) ，提示苯乙醇总苷对酪氨酸酶为可逆性抑制( 表3) 。2 讨论上世纪九十年代日本资生堂化妆品株式会社开发了高效、低毒的酪氨酸酶抑制剂—熊果苷，故实验选择熊果苷作为阳性对照药物。苯乙醇苷类化合物是肉苁蓉的主要活性成分，在抗衰老、抗疲劳、补肾助阳、治疗老年性痴呆症等方面显示了较强的生理活性。实验研究结果表明: 苯乙醇总苷能够有效下调酪氨酸酶的活性，具有抑制黑色素生成的作用。为肉苁蓉在天然美白化妆品领域的开发应用价值提供了理论依据，有助于拓展肉苁蓉属资源的应用范围。研究表明: 在皮肤黑素的生物合成过程中，超氧自由基起着引发作用，而氧的存在又可以加快黑素的合成速度。苯乙醇苷类化合物具有还原性酚羟基结构片断，由此推断苯乙醇苷对酪氨酸酶的抑制作用可能是通过拮抗氧对酪氨酸酶的激活和( 或) 清除超氧自由基从而终止自由基链的引发来实现的。参考文献:［1］ Gong SZ，Cheng J，Yang ZR． Inhibitory effect of ferulic acid onoxidation of L － DOPA catalyzed by mushroom tyrosinase［J］．Chin J Chem，2 005，13( 6) : 771 － 775．［2］ 康琰琰，张美英，邢少璟，等． 几种天然活性物对黑色素细胞毒性及美白功效的［J］． 日用化学工业，2005，35 ( 6 ) : 361 －363．［3］ 唐海谊，何冠邦，周喜林． 美白中药之水及乙醇提取物对酪氨酸酶抑制功效之比较［J］． 中国药学杂志，2005，40 ( 5 ) : 342 －343．［4］ Yang JH，Du NS，Rena KSM． Phenylethanoid glycosides fromcultivated Cistanche salsa［J］． J Chin Pharm Sci，2005，14 ( 4 ) :242 － 245．［5］ 杨建华，堵年生，热娜·卡斯木． 高效液相法测定肉苁蓉中8 － 表马钱子苷酸的含量［J］． 药物分析杂志，2006，26 ( 10 ) :1395 － 1397．［6］ 杨建华，胡君萍，热娜·卡斯木，等． 肉苁蓉属植物中6 种苯乙醇苷类化合物抗氧化活性的构效关系研究［J］． 中药材，2009，32( 7) : 1067 － 1069．［7］ 杨建华，胡君萍，热娜·卡斯木，等． HPLC 测定肉苁蓉中的尿囊素［J］． 华西药学杂志，2009，24 ( 2) : 175 － 176．［8］ 杨建华，胡君萍，热娜·卡斯木，等． 盐生肉苁蓉栽培品中苯乙醇苷类的指纹图谱研究［J］． 中国药学杂志，2009，44( 15) : 1128 － 1133．

［摘要］ 目的: 观察肉苁蓉苯乙醇总苷预防给药对高原脑水肿模型大鼠的作用。方法: 大鼠随机分为正常对照组、模型组、大花红景天口服液组( 1. 78 mL·kg － 1·d － 1 ) ，肉苁蓉苯乙醇总苷低、中、高剂量组( 75、150、300 mg·kg － 1·d － 1 ) ，每组12 只，灌胃预防给药10 d，第8 天起除正常对照组外其余各组置于模拟海拔5000 m 高原环境72 h 建立高原脑水肿模型，观察各组大鼠脑组织病理改变，检测脑组织干湿比、脑组织水通道蛋白4( aquaporin-4，AQP4) 的表达变化。结果: 与正常对照组( 脑组织干湿比为: 4. 65 ± 0. 10) 相比，模型组大鼠脑组织干湿比( 5. 14 ± 0. 16) 显著升高，脑组织AQP4 表达增加( 模型组表达为正常组的2. 21 ± 0. 46 倍) 。肉苁蓉苯乙醇苷能够降低脑组织含水量( 低中高剂量组依次为: 4. 68 ± 0. 08，4. 66 ± 0. 10，4. 66 ± 0. 18) ，且能降低高原脑水肿大鼠脑组织水通道4mＲNA( 低中高剂量组依次为正常组的: 1. 20 ± 0. 30，1. 03 ± 0. 17，1. 12 ± 0. 33 倍) 和蛋白的表达，改善高原脑水肿大鼠脑水肿病理改变。结论: 肉苁蓉苯乙醇苷能够预防高原脑水肿的发生，可能与其抑制水通道4 的表达有关。［关键词］ 德赢vwin登录 ; 苯乙醇总苷; 高原脑水肿; 水通道蛋白4高原脑水肿( high-altitude cerebral edema，HACE)一般发生在初次进入海拔超过3000 m 高原环境时，由于机体对高原低压低氧环境的不适应而导致的一种严重威胁生命的疾病，它与高原反应、高原肺水肿是急性高原病的3 种表现形式［1］。尽管关于高原脑水肿的研究相比高原肺水肿较少，但相关研究表明水通道4 蛋白表达的增多，从而增加血脑屏障通透性，参与脑水肿形成和发展，在高原脑水肿的发生中发挥着重要作用［2-3］。德赢vwin登录 Cistanche tubulosa( Schenk) Ｒ. Wight为中药肉苁蓉的基源植物之一，具有补肾阳、益精血、润肠通便之功效。化学成分研究表明，肉苁蓉主要含苯乙醇苷类( phenylethanoid glycosides) 、环烯醚萜及其苷类( iridoids and iridoid glycosides) 、木脂素及其苷类( lignans and lignan glycosides) 、寡糖酯类( oligosaccharide esters) 、多糖类( polysaccharides) 等成分，其中松果菊苷、毛蕊花糖苷等苯乙醇苷类为其主要药效成分［4］。多年来对肉苁蓉苯乙醇苷的药理研究表明其具有抗缺氧、抗辐射、清除自由基等作用［5-7］，与抗高原病有效成分红景天苷具有相似的药理作用。为vwin.com 苯乙醇苷类是否具有抗高原脑水肿作用，本研究利用西北地区特殊环境人工实验舱建立大鼠高原脑水肿模型［8-9］，对德赢vwin登录 苯乙醇总苷( phenylethanoid glycosides from Cistanchetubulosa，简称PhGs-Ct) 对高原脑水肿的预防作用及其可能的作用机制进行了研究，以期为肉苁蓉临床新用途的拓展提供科学依据。1 材料1. 1 动物实验动物Wistar 大鼠，SPF 级，雌雄各半，体重180 ～ 220 g，购自新疆医科大学实验动物中心，动物生产许可证号SCXK( 新) 2011-0004，动物使用许可证号为SYXK( 新) 2011-0004。实验设计通过了新疆医科大学第一附属医院伦理学审核，符合实验动物伦理学要求。1. 2 动物饲养条件前7 天，各组动物饲养在SPF 环境实验室。后3天，正常对照组仍饲养在SPF 环境，其余各组饲养在海拔5000 m 低氧环境( 大气压为54. 1 Kpa，氧分压为11. 52 Kpa) 。SPF 环境如下:温度: 22 ～ 26 ℃;相对湿度: 40% ～ 70%;光照条件: 12 h /12 h 明暗交替;通风情况: 全新风;动物房的一般清洁消毒: 0. 2% 新洁尔灭拖擦清洗。1. 3 仪器西北特殊环境人工实验舱( 兰州军区乌鲁木齐总医院， DY-2 ) ， 光学显微镜( 日本Nikon 公司，E200) ，组织切片机( 德国美康公司，HM340E) ，电子天平( 梅特勒-托利多仪器有限公司，AL204，精度0. 1 mg) ，化学发光成像系统( 上海勤翔科学仪器有限公司，Chemiscope 3000 ) ，凝胶成像系统( 美国UVP 公司，Bio Doc Imaging) 实时定量PCＲ 仪( 美国ABI 公司，7500 Fast) 。1. 4 药品与试剂德赢vwin登录 苯乙醇总苷( 北京大学屠鹏飞教授提供，含量90. 70%，用蒸馏水配制成相应浓度的溶液) ; 大花红景天口服液( 西藏藏药集团股份有限公司，120503，国药准字B20070002，10 mL* 12 支) ;免疫组化染色试剂盒( 北京中杉金桥生物技术有限公司，SP-9000) ，AQP4 抗体( Santa Cruz Biotechnology，L9057) 。2 方法2. 1 分组与用药Wistar 大鼠随机分为6 组: 正常对照组，模型组，大花红景天口服液组( 1. 78 mL·kg － 1·d － 1 ) ，PhGs-Ct 低剂量组( 75 mg·kg － 1·d － 1 ) 、PhGs-Ct 中剂量组( 150 mg·kg － 1·d － 1 ) 、PhGs-Ct 高剂量组( 300mg·kg － 1·d － 1 ) ，每组12 只。各组均在SPF 环境饲养，正常对照组、模型组灌胃蒸馏水，其余各组按照相应剂量灌胃给药，连续给药10 d，7 d 后除空白对照组外其余各组置于模拟海拔5000 m 高原环境的人工实验舱中饲养。舱内高度以10 m·s － 1 的速度匀速上升到海拔5000 m 水平( 大气压为54. 1 Kpa，氧分压为11. 52 Kpa) ，其间动物自由进水及进食，每24 h 开舱半小时给药，添加饲料及饮水［10］。2. 2 动物处理各组大鼠出仓后立即腹腔注射戊巴比妥钠( 2%，2. 0 mL·kg － 1 ) 麻醉，腹主动脉取血，打开颅腔，取脑组织，取左脑上半部称重后锡箔纸包裹测定组织湿干比，左脑下半部4%多聚甲醛固定，用于HE 染色及AQP4 免疫组化。右脑-80 ℃冰箱冻存，用于测定AQP4 mＲNA 的表达。2. 3 脑组织病理学观察脑组织放入4% 的多聚甲醛中充分固定后，脱水、包埋、切片、HE 染色，不同放大倍数光学显微镜下观察病理改变，并拍摄图片。2. 4 脑组织湿干比取左脑上半部称重后，锡箔纸包裹脑组织，置烘箱( 80 ℃，72 h) 干燥至恒重，称干重量，计算湿干比: 湿干比= 干燥前组织重量/干燥后组织重量。2. 5 免疫组化测定AQP4 的表达采用亲合素-生物素复合物( Avidin BiotinComplex，ABC) 染色，二氨基联苯胺显色法。免疫组化步骤如下: 切片，烤片、脱蜡、水化，组织抗原修复，淬灭内源性过氧化物酶活性，封闭，加入一抗，加入二抗，滴加试剂ABC，DAB 显色，复染、分化、透明，封片。2. 6 AQP4 mＲNA 表达的测定提取脑组织总ＲNA，DNase I 消化样品ＲNA 中的DNA，进行ＲNA 琼脂糖凝胶电泳，将ＲNA 反转录为cDNA，进行cDNA 检测。AQP4 荧光实时定量PCＲ 引物由上海生工有限公司合成，见下表。2. 7 统计学分析采用SPSS 16. 0 软件进行分析，计量数据均采用均数± 标准差表示，数据先进行正态性检验，符合组间比较采用独立样本t 检验，不符合进行对数转换。检验水准为α = 0. 05。3 结果3. 1 PhGs-Ct 对高原脑水肿大鼠脑组织病理改变的影响在光镜下观察各组大鼠脑组织病理切片可见，正常对照组脑组织分子层、外颗粒细胞层、椎体层细胞层、内颗粒细胞层、多行细胞层结构清楚，未发现病变。模型组大鼠脑组织毛细血管充血、水肿，分子层、椎体层细胞水肿明显。PhGs-Ct 低剂量组大鼠脑组织分子层部分血管扩张充血水肿，细胞轻度水肿，水肿较模型组减轻。PhGs-Ct 中剂量组大鼠脑组织部分脑膜下血管扩张充血，偶见细胞水肿，水肿较模型组明显减轻。PhGs-Ct 高剂量组分子层无明显水肿，血管周围轻度水肿，水肿较模型组明显减轻。大花红景天组大鼠脑组织分子层散在水肿，散在血管极轻度水肿，水肿较模型组明显减轻。可知模型组大鼠脑组织明显水肿，模型成立。德赢vwin登录 苯乙醇总苷、大花红景天可以降低高原脑水肿模型大鼠脑水肿程度。具体结果见图1。3. 2 PhGs-Ct 对高原脑水肿大鼠脑组织湿干比的影响与正常对照组相比，模型组脑组织湿干比显著升高，差异具有统计学意义( P ＜ 0. 01) ，说明模型成立。PhGs-Ct 低、中、高剂量组和大花红景天组大鼠脑组织湿干比与模型组相比均降低，差异具有统计学意义( P ＜ 0. 01) ，德赢vwin登录 苯乙醇总苷各剂量组与大花红景天组脑组织湿干比比较，差异无统计学意义。具体结果见表1。3. 3 PhGs-Ct 对高原脑水肿大鼠脑组织AQP4 表达的影响用免疫组织化学法检测脑组织AQP4 的表达发现，AQP4 主要在大鼠脑组织脉络丛表达。空白对照组大鼠脑组织AQP4 表达弱阳性，在急性高原病模型组大鼠脑组织强阳性表达，PhGs-Ct 低、中、高剂量组和大花红景天组大鼠脑组织AQP4 表达弱阳性，尤其是PhGs-Ct 低剂量组大鼠脑组织AQP4 表达接近正常组。可知模型组大鼠脑组织AQP4 蛋白在调控水-电解质平衡的部位表达增多，德赢vwin登录 苯乙醇总苷能降低高原脑水肿大鼠脑组织AQP4 蛋白的表达，从而抑制水肿的发生。具体结果见图2。3. 4 PhGs-Ct 对高原脑水肿大鼠脑组织AQP4 mＲNA表达的影响荧光定量PCＲ 检测脑组织AQP4 mＲNA 的表达发现，与正常对照组相比，模型组大鼠脑组织AQP4mＲNA 表达量显著升高，是其2. 21 倍( P ＜ 0. 01) 。与模型组相比，PhGs-Ct 低剂量组、PhGs-Ct 中剂量组、PhGs-Ct 高剂量组和大花红景天组大鼠脑组织AQP4mＲNA 表达量下降( 分别为正常对照组的1. 20、1. 03、1. 12 和1. 09 倍) ，差异有统计学意义( P ＜ 0. 01) 。PhGs-Ct 各剂量组与大花红景天组相比差异无统计学意义。PhGs-Ct 中剂量组、PhGs-Ct 高剂量组和大花红景天组可使大鼠脑组织AQP4 mＲNA 表达量恢复到正常水平( P ＞0. 05) 。具体结果见表2。3. 5 AQP4 mＲNA 表达量与脑组织含水量的相关性分析利用线性回归分析各组大鼠脑组织湿干比与AQP4 mＲNA 表达量的相关性，方差分析结果F =192. 112，P ＜ 0. 01，Ｒ2 = 0. 773，线性关系见图3。可见脑组织含水量与AQP4 mＲNA 表达量成正比，脑水肿程度与AQP4 mＲNA 表达量正相关。4 讨论水通道蛋白( aquaporins，AQPs) 是一组对水有高度选择性的膜转运蛋白，广泛分布于各种组织，在水的分泌和吸收，细胞内外水平衡过程中发挥着重要作用。迄今为止，在哺乳动物体内发现至少有13 种水通道蛋白，即AQP0 ～ AQP12，其主要功能是便于水和一些小分子溶质如甘油、尿素等的快速跨膜运动。中枢神经系统存在的水通道蛋白主要为AQP1 和AQP4，其中尤以AQP4 分布最为广泛［11］，AQP4 具有高度快速转运水的能力，比其它的水通道蛋白对水的通透性强3 ～ 4 倍，在脑内水电解质平衡的调节上发挥着重要作用［12-13］。研究表明AQP4 与脑水肿发生密切相关［14-15］。本研究结果表明，德赢vwin登录 苯乙醇总苷可以降低高原脑水肿模型大鼠脑组织的湿干比，能够预防高原脑水肿的发生发展。本研究采用免疫组化法检测了各组大鼠脑组织AQP4 的表达，并用荧光定量PCＲ 检测了AQP4 mＲNA 在大鼠脑组织中表达量的变化，发现高原脑水肿模型大鼠脑组织AQP4 蛋白和mＲNA 表达量显著增加，提示AQP4 参与了高原脑水肿的形成。德赢vwin登录 苯乙醇总苷可以抑制高原脑水肿模型大鼠脑组织AQP4 蛋白和mＲNA 的表达，可能通过抑制AQP4 的表达来预防高原脑水肿的发生。含水量的增加是组织水肿的重要标志，本研究通过计算组织湿干比表示组织含水量的多少，通过线性回归发现脑组织干湿比与AQP4 mＲNA 表达量正相关，肉苁蓉改善脑水肿与其抑制水通道蛋白AQP4 的表达有一定联系。随着西部大开发的深入进行和旅游业的长足发展，越来越多的平原居民将进入高原环境，所以由高原环境引起的高原病的防治极为重要。本研究表明，肉苁蓉具有预防高原脑水肿的潜在作用，为肉苁蓉新用途的拓展提供实验依据。目前高原脑水肿动物的相关研究中，很少研究动物整体行为的改变［15-16］。但急性高原病患者首先出现的一系列神经学症状，如头痛、恶心、呕吐、失眠、疲乏、头昏眼花、共济失调等，重者精神智力障碍以至昏迷。这些神经学症状是以大脑病变为基础的，即早期的血脑屏障病变到极端严重情况———高原脑水肿( HACE) ［17］。本研究结果提示肉苁蓉具有预防高原脑水肿的潜在作用，可能会有效预防上述症状的发生。参考文献［1］ West JB， English Translation of “ Nomenclature，Classification，and Diagnostic Criteria of High AltitudeDisease in China”［J］． High Altitude Med Biol，2010，11( 2) : 169-172．［2］ 杨晓文，可金星，陈代伦，等． 高原反应的脑病理与水通道蛋白-4( AQP4) 的相关性实验研究［J］． 第三军医大学学报，2005，( 27) 16: 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摘要：目的探讨肉苁蓉苯乙醇总苷(CPhGs)对腹主动脉缩窄术（AAC）后心肌肥厚大鼠的作用及其作用机制。方法将70 只实验大鼠分为7 组:正常对照组、模型组、假手术组、缬沙坦阳性药物组（8.3 mg/kg）、模型+CPhGs 低剂量组（125 mg/kg）、模型+CPhGs 中剂量组(250 mg/kg)、模型+CPhGs 高剂量组（500 mg/kg），各组10 只。对模型组大鼠行AAC 术，使大鼠腹主动脉管腔环形缩窄，构建心肌肥厚模型，术后每天灌胃给药1 次，持续6 周。各组以超声心动图检测大鼠心率（HR）、收缩期间隔厚度（IVSs）、左室收缩末期内径（LVESD）左室厚壁舒张期厚度（LVPWd）、射血分数（EF），碱水解法测量羟脯氨酸（HYP），苏木精-伊红（HE）染色观察心肌细胞的表型、数目、排列方式并进行比较。结果与正常对照组相比，模型组大鼠HR、IVSs、LVPWd、HYP 均有不同程度增加（P 均<0.05），LVESD 均有不同程度的降低（P 均<0.05）。与模型组相比，模型+CPhGs 低、中、高组大鼠HR、IVSs、LVPWd、HYP均有不同程度下降（P 均<0.05），LVESD、EF 均有不同程度的升高（P 均<0.05），模型+CPhGs 高剂量组与缬沙坦阳性药物组各项指标差异均无统计学意义。结论CPhGs 可以抑制AAC 术后心肌肥厚的发生，起到保护心肌的作用。关键词：肉苁蓉苯乙醇总苷；心肌肥厚；羟脯氨酸心肌肥厚是多种病理性刺激因素引起的适应性改变[1]，表现为心肌总量增加、心肌收缩力加强、心室壁厚度增厚等，作为高血压的严重并发症之一，如不对其进行及时干预，则会进一步发展为心率失常、心力衰竭甚至影响到生命。心肌肥厚已成为诱发脑卒中、冠心病等疾病的首要危险因素[2]。心肌肥厚的预防与治疗至关重要。肉苁蓉主要生长于新疆沙漠地区，因为药效切实被列为中国传统的中药材之中，且有“沙漠人参”之称[3]，其主要化学成分有肉苁蓉苯乙醇总苷(cistanche phenylethanoid glycosides,CPhGs)、木脂素类、生物碱、多糖等。肉苁蓉发挥药性作用的基础为CPhGs 的生物活性作用[4]，且CPhGs 具有抗衰老、免疫调剂、促进体液分泌和降低心肌细胞损伤的功能[5-6]。本课题组对大鼠行腹主动脉缩窄术(abdominalaortic constriction, AAC)构建心肌肥厚模型，研究CPhGs对AAC术后心肌肥厚大鼠射血分数(EF)、心率（HR）、收缩期间隔厚度（IVSs）、左室收缩末期内径（LVESD）、左室厚壁舒张期厚度（LVPWd）、羟脯氨酸（HYP）及心肌细胞的影响，旨在为心肌肥厚防治领域的发展提供新依据。1 材料与方法1.1 动物SPF 级SD 大鼠，健康状况良好，体重180～220 g，购于新疆医科大学动物实验室中心，动物生产许可证号:SYSK（新）2016-0003。1.2 主要仪器电子秤ACS-1.5A( 上海友声衡器有限公司)、电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；飞利浦HD 11 XE 超生诊断仪（德国Philips 公司）；酶联免疫反应检测仪（美国Therom Scientific公司）；电子显微镜（上海比目仪器有限公司）。1.3 实验试剂德赢vwin登录 提取物（购自win德赢官方 ），经高效液相色谱法（HPLC）法检测，CPhGs 含量高达92.0 %以上；缬沙坦（北京诺华制药有限公司）；戊巴比妥钠（德国Meck 公司）；HYP 试剂盒（南京建成生物工程研究所）；CMC-Na（西安正天药用辅料有限公司）；苏木素（Sigma 公司）。1.4 方法1.4.1 分组将大鼠分为7组:正常对照组、模型组、假手术组、缬沙坦阳性药物组（8.3 mg/kg）、模型+CPhGs低剂量组（125 mg/kg）、模型+CPhGs中剂量组(250 mg/kg)、模型+CPhGs 高剂量组（500 mg/kg），每组10 只。1.4.2 心肌肥厚模型的建立参照文献[7-9]对模型组大鼠行AAC 术构建模型，以2.5％戊巴比妥钠2mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，在无菌环境下于剑突下2~3 cm处，腹正中切口切开皮肤，暴露腹腔，将腹部脏器一并推向右侧，在右肾动脉上方1.5 cm处用两只弯镊剥离并充分暴露腹主动脉，取出置于生理盐水的7号针头，将针头与大鼠腹主动脉平行放置，再用4-0手术线一并结扎，随后抽出7号针头，剪去过长的手术缝线，手术后所有大鼠腹腔注射5 000 U青霉素防止感染，关闭腹腔。假手术组大鼠在手术时仅将腹主动脉分离，正常对照组不做任何处理。1.4.3 实验受试物干预手术次日后开始对大鼠进行药物干预，缬沙坦阳性药物组（8.3 mg/kg）、模型+CPhGs低剂量组（125 mg/kg）、模型+CPhGs中剂量组(250 mg/kg)、模型+CPhGs高剂量组（500 mg/kg），灌胃给药，每天给药1次，持续6周。1.4.4 超声心动图检查末次给药24 h后，麻醉大鼠后，于前胸及上腹部处备皮，打开超声诊断仪测定各组大鼠心功能指标：HR、IVSs、LVESD、LVPWd、EF。1.4.5 标本的采集与制备完成超声心动图检测后，处死大鼠，取出心脏，随机取样制成心肌匀浆测定羟脯氨酸（HYP）的含量；将采集好的心尖组织经固定、脱水、透析、HE染色后，把切片置于显微镜下观察。1.4.6 各组大鼠心肌匀浆中HYP的含量检测腹主动脉采血出处死大鼠后，打开胸腔，取出心脏，立刻使用清水冲洗心脏表面，直到冲洗干净后，擦干表面水分，取心尖组织部位，制成心肌匀浆测定HYP的含量，操作过程严格按照HYP试剂盒说明书操作。1.4.7 显微镜下观察心肌肥厚细胞的病理学变化从4％多聚甲醛中取出固定好的心尖组织，用生理盐水冲洗除去固定液，洗净后逐级脱水处理，脱水后对其进行逐级透明，接着浸入纯石蜡中，等切片平坦后，用擦拭干净的载玻片从水中捞取，矫正位置，擦干多余的水分，HE染色后进行观察，心肌肥厚参照文献[10]，分为3级：Ⅰ级，伴有部分心肌细胞数目减少、排列不规则不整齐；Ⅱ级，心肌细胞形以肥大为主，绝大部分心肌细胞受损且排列散乱；Ⅲ级，单位视野内可见心肌细胞明显增大，排列散乱无序，严重者可出现心肌纤维化。1.5 统计学方法SPSS21.0软件进行统计学分析，计量指标用均数±标准差以(-x ±s)表示；通过单因素方差分析两两比较各组数据，组间比较采用LSD 方法检验，检验水准α=0.05。2 结果2.1 CPhGs 对心肌肥厚大鼠HR 的影响模型组大鼠HR（[ 525.9±35.9）次/min]高于正常对照组（[ 394.1±22.1）次/min]、假手术组（[ 401.9±19.0）次/min]（P均<0.05）；模型+CPhGs 低、中、高剂量组 HR（[ 499.5±38.2）、（469.7±41.6）、（428.0±36.1）次/min]明显低于模型组（[ 525.9±35.9）次/min（] P均<0.05）。模型+CPhGs高剂量组HR 与缬沙坦阳性药物组HR[(424.5±29.6)次/min]比较差异无统计学意义。2.2 CPhGs 对各组大鼠的心脏彩超指标的影响与正常对照组和假手术组相比，模型组大鼠的IVSs、LVPWd升高，LVESD、EF降低（P<0.05），与模型组相比，模型+CPhGs各剂量组大鼠的IVSs、LVPWd降低，LVESD、EF升高，随着CPhGs剂量的增加各项指标越接近缬沙坦阳性药物组，其中模型+CPhGs高剂量组与缬沙坦阳性药物组各指标比较差异无统计学意义。见图1、表1。2.3 CPhGs 对心肌肥厚大鼠心肌匀浆HYP 含量的影响模型组大鼠的心肌匀浆中HYP的含量明显高于 正 常 对 照 组（[ 0.14±0.014）μg/mg]与 假 手 术 组[(0.15±0.013)μg/mg]（P 均<0.05）；阳性药物组大鼠心肌匀浆HYP的含量相对模型组明显下降（P<0.05）；模型+CPhGs 低、中、高组各组大鼠心肌匀浆中HYP水平（[ 0.22±0.013）、（0.19±0.020）、（0.18±0.016）μg/mg]与模型组(0.25±0.014)μg/mg相比均有不同程度下降，且随CPhGs剂量的增加心肌匀浆中HYP的含量下降越明显，其中模型+CPhGs中、高剂量组HYP的含量明显减少，与阳性药物组[(0.17±0.011) μg/mg]差异均无统计学意义。2.4 心肌组织病理学观察结果模型组心肌组织切片镜下表现：心肌细胞数量明显减少，细胞表型为肥大，且细胞的排列方式杂乱无序；与模型组相比模型+CPhGs低、中、高剂量组细胞数目有不同程度的增加，且细胞排列整齐，其中模型+CPhGs中、高剂量组与缬沙坦阳性药物组差异均无统计学意义。见图2。3 讨论心肌肥厚的早期是代偿性和适应性的，但长期进展会导致心肌及周围血管的纤维化，发生失代偿，使心率衰竭和猝死的发生率增加[11]。肉苁蓉中的CPhGs具有抗衰老、免疫调剂、促进体液分泌和降低心肌细胞损伤的功能。本实验以AAC术构建心肌肥厚大鼠模型，使用CPhGs对模型组大鼠进行干预，研究CPhGs逆转心肌肥厚的作用机制。HR是心脏功能的重要参数，是反映心脏基础功能的指标，具有测量方式简单且易行的优点。本研究结果显示，与模型组相比，模型+CPhGs各剂量组中大鼠HR有不同程度的下降，且本实验发现CPhGs高剂量组大鼠HR 变化最显著，这与既往研究结果相似[12]。这可能与在建模后期，大鼠发展为失代偿性心力衰竭有关。研究报道，建模4 周即可发生心肌肥厚[13]，本研究在建模后进行了时长6周的干预。AAC术，是一种压力超负荷模型构建方法，其通过缩窄腹主动脉，增加心脏后负荷，使心肌发生代偿性肥厚、心室容积增加和心脏扩大。模型后期出现失代偿，发生心力衰竭。CPhGs在一定程度上能起到改善心肌表面硬度和张力的作用，能够有效减缓心肌肥厚的发生。IVSs、LVESD、LVPWd、EF等是超声心动图指标，是反映心肌肥厚、心功能的敏感指标，对心肌肥厚大鼠心脏泵血能力、心腔容量、心肌厚度的判断具有重要的临床意义，相关文献表明IVSs、LVPWd的增加和LVESD、EF的降低，提示心室壁增厚，心腔内径缩小，常发生在心肌纤维化合并心功能严重损失等情况。本实验发现，与正常对照组相比，模型组大鼠的IVSs、LVPWd显著升高，LVESD、EF明显下降，则表明大鼠心腔容量缩小、心肌厚度增加。与模型组相比，模型+CPhGs 各剂量组中大鼠IVSs、LVPWd 明显降低，LVESD、EF明显升高，其中，CPhGs高剂量组大鼠IVSs、LVPWd下降和LVESD、EF上升最为显著，提示CPhGs 能起到改善心功能、心腔容量和心肌组织的功能。目前国内外广泛使用HYP含量表示胶原组织的代谢程度。本实验发现，与正常对照组相比，模型组大鼠HYP 的含量明显增多；与模型组相比，模型+CPhGs各剂量组中大鼠HYP含量均有不同程度的降低，CPhGs高剂量大鼠HYP含量减少的最为明显，提示CPhGS能有效降低大鼠心肌组织HYP的含量，起到减轻心脏负荷的作用。心肌细胞数目、表型、排列方式是病理学观察的主要指标。本实验显示，与模型组相比，模型+CPhGs各剂量组大鼠切片中细胞数目均有不同程度的增加，排列有序，且心肌纤维化的程度均有不同程度的降低，其中模型+CPhGs（500 mg/kg）剂量组基本看不到纤维化的心肌组织，提示CPhGs能起到保护心肌细胞、维持细胞正常形态、减轻心肌纤维化的功能。综上所述，CPhGs 能降低AAC 术后大鼠的HR、IVSs、LVPWd、HYP，增加LVESD、EF。随着CPhGs剂量的变化，逆转心肌肥厚的效果随之发生改变，呈现出剂量与效果正相关的关系，其中模型+CPhGs（500mg/kg）剂量组与阳性药组相比，各项指标接近。提示CPhGs可以抑制AAC术后心肌肥厚的发生，起到保护心肌的作用。参考文献:[1] BAI X J，HAO J T，WANG J，et al. 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【摘要】目的： 探讨肉苁蓉苯乙醇总苷(CPhGs)对转化生长因子β1(TGF-β1)介导的大鼠肝星状细胞(HSC-T6)增殖活化作用及对TGF-β1/Smad信号通路表达的影响。方法：试验分为正常对照组、5 ng/mL TGF-β1刺激的HSC-T6模型组、5 ng/mL TGF-β1+不同终浓度(25、50、75和100 μg/mL)CPhGs给药组，另设只加DMEM培养液的空白组。体外培养HSC-T6细胞，通过四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测细胞的增殖；LDH比色法测定CPhGs的细胞毒性；采用荧光定量PCR(qPCR)检测Smad2、Smad3和Smad7 mRNA的表达；采用Western blot法检测Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3和Smad7蛋白的表达。结果：与正常对照组比较，TGF-β1模型组显著促进了HSC-T6细胞的增殖，而50~100 μg/mL的CPhGs可以抑制TGF-β1诱导的HSC-T6细胞的增殖(P<0.05)，且25~100 μg/mL的CPhGs 对HSC-T6无明显细胞毒性作用；25~100 μg/mL CPhGs均可抑制Smad2和Smad3 mRNA和蛋白水平的表达，且明显抑制Smad2和Smad3蛋白的磷酸化水平，促进Smad7 mRNA和蛋白的表达，差异均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论：CPhGs的抗肝纤维化作用可能与其阻断TGF-β1/Smad通路进而阻断HSC-T6细胞的活化和增殖有关。【关键词】肉苁蓉苯乙醇总苷；转化生长因子β1；肝星状细胞；肝纤维化肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)的发生与慢性肝脏炎症及损伤等化学因素相关，它是肝脏在慢性或反复[1-3] 损伤后的一种损伤与修复过程，是目前发病率和死亡率都很高的世界医学难题。肝星状细胞(hepaticstellate cells，HSC-T6)的活化是肝纤维化发生发展的[4-6] 关键环节。转化生长因子β1(transforming growthfactor-β1，TGF-β1)被公认是致肝纤维化最强有力的细胞因子之一，它参与细胞的生长、分化及凋亡，激活HSC-T6，刺激细胞外基质(extracellular matrix，[7] ECM)的合成和沉积，TGF-β1/Smad信号通路是肝纤维化研究的热点。肉苁蓉(cistanche)是著名的名贵补益类中药，其发挥药效的主要物质基础之一是苯乙醇总苷(phenylethanoid glycosides from cistanchetubulosa，[8] CPhGs) ，研究显示CPhGs具有抗氧化、抗抑郁、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗菌和免疫调节等多种化学作[9-13] 用及药理作用。前期研究显示，CPhGs能够防治牛血清白蛋白(bovine serum albumin， BSA)所致的大鼠免[14] 疫性肝纤维化，并能显著降低肝纤维化大鼠血清TGF-β1的水平，抑制肝纤维化大鼠肝组织中TGF-[15] β1的表达，改善大鼠肝纤维化程度。而CPhGs治疗肝纤维化的作用是否与TGF-β1所介导的TGF-β1/Smads信号转导通路有关？为深入探讨CPhGs 治疗肝纤维化的作用机制，本研究以HSC-T6为靶细胞，采用体外给药从TGF-β1/Smad信号转导通路的角度来探讨CPhGs抗肝纤维化作用的分子生物学机制。1 材料与方法1.1 试剂与仪器德赢vwin登录 ，取自新疆吐鲁番地区，物种标本凭证存放于新疆中药研究所。CPhGs 由新疆维吾尔自治区药物研究所从德赢vwin登录 中提取纯化，纯度为70%；试验时用含10%胎牛血清的DMEM(高糖)培养液溶解，经0.22 μm滤器过滤后，配制成不同浓度。大鼠HSC-T6细胞系购自武汉Procell生物科技有限公司；TGF-β1购自Peprotech公司； 乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，LDH)试剂盒购自南京建成生物有限公司；Smad2、Smad3、Smad7、β-actin引物由上海生工生物技术有限公司设计、合成；cDNA反转录试剂盒购自Thermo Scientific公司；荧光定量PCR(qPCR)试剂盒购自QIAGEN GmbH公司；Smad2多克隆抗体和β-actin单克隆抗体购自武汉Protein Tech公司； Phospho-Smad2 (ser465/467)抗体、Smad3(C67H9)抗体和Phospho-Smad3 (ser423/425)抗体购自Cell Signaling Technology公司；Smad7抗体购自武汉Boster公司；碱性磷酸酶标记的二抗购自美国Invitrogen公司；RIPA裂解液购自美国Thermo Fisher Scientific公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自于美国Millipore公司。主要仪器有：倒置荧光显微镜(德国Leica公司)；CO 细胞培养箱(美国Thermo公司)；低温离心机(美国2Sigma公司)；凝胶成像仪、Western blot电泳装置、转移装置(美国Bio-Rad公司)；图像分析仪Alpha Imager2000、图像分析系统(Alpha I nnoteeh公司)。1.2 HSC-T6细胞的培养和传代HSC-T6细胞常规复苏后，用含10%胎牛血清的DMEM(高糖)完全培养液，在37℃、CO 体积分数为25%及饱和湿度下培养；当细胞呈单层致密状时，常规胰蛋白酶消化传代，24 h换液，72 h再传代；选用对数生长期细胞进行试验。1.3 MTT法检测CPhGs对TGF-β1刺激的HSC-T6细胞增殖的影响取对数生长期的HSC-T6细胞，消化、离心，以4 5×10 /mL接种于96孔板，每孔200 μL，24 h后细胞完全贴壁展开，吸去培养液，再用含10%小牛血清的DMEM培养液同步化细胞。试验分为正常对照组、5ng/mL TGF-β1刺激的HSC-T6模型组、5 ng/mL TGF-β1+不同终浓度(25、50、75和100 μg/mL)CPhGs给药组，另设不加细胞只加DMEM培养液的空白组，每孔总体积200 μL，每组设4个复孔，于37℃、CO 体积分数为25%的培养箱分别培养48 h，MTT法于酶标仪测定吸光度D(490)值。抑制率={[D(490) -D(490) ]-[D(490) -D(490) ]}/ 模型组空白组用药组空白组[D(490) -D(490) ]×100% 模型组空白组1.4 LDH比色法测定CPhGs的细胞毒性细胞分组处理同1.3，收集上清液。按乳酸脱氢酶LDH试剂盒说明书步骤进行测定。LDH(U/L)=[D(490) -D(490) ]/[D(490) -D(490) ]× 测定孔对照孔标准孔空白孔0.2 mmol/L×1 0 001.5 qPCR检测CPhGs对TGF-β1刺激的HSC-T6细胞中Smad2、Smad3和Smad7 mRNA表达的影响细胞分组处理同1.3。CPhGs作用48 h后，收集细胞，总RNA用Trizol提取 (按试剂盒说明书操作)，加0.2mL氯仿抽提纯化，电泳检测完整性，分光光度法测定其含量及纯度，测定D(260)/D(280)值。cDNA合成参照逆转录试剂盒说明书合成，加入待测定指标的引物，引物利用软件Batch Primer 3设计，由上海生工生物公司合成。序列见表1。反应条件：94 ℃变性3 min，94℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循环30次，终末72 ℃延伸10 min。并以β-actin基因作为内参，以待测基因/β-actin的比值作为待测基因mRNA的相对表达量(2-ΔΔCT)。结果的计算和分析采用IQ5 RealTime PCR检测系统。1.6 CPhGs对TGF-β1刺激的HSC-T6细胞中 S mad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3和Smad7蛋白表达的影响细胞分组处理同1.3。收集各组细胞，RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白含量。取等量的蛋白样品30 μg，SDS-PAGE凝胶电泳后100 V恒压转膜70~100 min，5% BSA封闭，分别加入基础抗体(Smad2兔多克隆抗体、p-Smad2兔单克隆抗体、Smad3抗体、p-Smad3兔单克隆抗体，均为1∶1 000稀释，Smad7抗体1∶200稀释，β-actin抗体1∶5 000稀释)，4 ℃孵育过夜，洗膜后加入二抗，室温孵育2 h，显色剂显影，GEL DOC XR凝胶成像仪扫描，GEL DOC软件分析结果。以β-actin表达水平作为内参照。试验重复3次。1.7 统计学方法应用SPSS 16.0统计软件分析。数据采用 x-±s 表示，多组间比较用单因素方差分析，多组样本的两两比较采用LSD法，剂量相关性采用Pearson相关系数分析；α=0.05为检验水准。2 结●果2.1 CPhGs对TGF-β1刺激HSC-T6细胞增殖的影响如表2所示，与正常对照组比较，TGF-β1模型组显著促进了HSC-T6细胞的增殖(P<0.01)，与TGF-β1模型组比较，TGF-β1+CPhGs 组50~100 μg/mL剂量时均不同程度地抑制TGF-β1诱导的HSC-T6细胞增殖(P<0.05)，其中TGF-β1+CPhGs 100 μg/mL抑制率最高，达41.60%，抑制作用呈一定的剂量效应(r=0.444，P<0.05)。同样，与正常对照组比较，CPhGs 25~100μg/mL组及TGF-β1组的上清液LDH 有逐渐增大的趋势，但各组间差异均无统计学意义(P>0.05)，这表明CPhGs作用的HSC-T6，大多数细胞膜完整，CPhGs抑制HSC-T6细胞的增殖作用不是由于药物的细胞毒性及TGF-β1的刺激所引起。2.2 CPhGs对TGF-β1刺激的HSC-T6细胞中Smad2、Smad3、Smad7 mRNA表达的影响如图1所示，实时荧光定量PCR分析表明，与正常组比较，在TGF-β1模型组Smad2和Smad3的mRNA表达水平显著增高(P<0.01)，Smad7表达水平显著降低(P<0.01)。与TGF-β1模型组比较，在TGF-β1+CPhGs各剂量组，Smad2和Smad3 mRNA水平均明显降低(P<0.05或P< 0.01)，接近正常组；同时，Smad7 mRNA表达水平在TGF-β1+CPhGs 50~100 μg/mL组较模型组显著增加(P<0.05)。2.3 Western blot检测CPhGs对TGF-β1刺激的HSCT6细胞中Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3 和Smad7蛋白表达的影响结果如图2所示，与正常对照组相比，TGF-β1模型组Smad2、Smad3、p-Smad2和p-Smad3的表达显著上升(P<0.01)，Smad7的表达显著下降(P<0.01)。与TGF-β1模型 组相比，TGF-β1+CPhGs各给药组对刺激升高的Smad2、 Smad3、p-Smad2和p-Smad3表达均有不同程度的抑制作用(P<0.05)，并随药物浓度的增大，抑制作用增强；而Smad7表达则相对上升，并随药物浓度的增大表达量增加(P<0.01)。3 讨●论肝纤维化是慢性肝损伤后修复反应的动态过程，HSC-T6的活化和增殖是肝纤维化发生的基础，现已证实肝纤维化发生的关键环节是HSC-T6的激活及其激活后过多的细胞外基质在肝脏沉积所致。HSC-T6的活化是静止的HSC-T6向肌成纤维细胞(myofibroblast， MFB)转化的过程，HSC-T6在肝损伤因子的作用下，由静止的富含VitA的正常形态向 MFB转化，表现为细胞增殖、趋化性、纤维产生、收缩性、VitA的丢失等，以细胞增殖及胶原合成明显增强为主要特征。而TGF-β1是目前公认最重要的致肝纤维化因素之一，以自分泌[16] 和旁分泌两种形式促进 HSC-T6活化。因此，本研究中，探索使用TGF-β1刺激HSC-T6，建立TGF-β1诱导HSC-T6活化的细胞模型。结果显示，TGF-β1+CPhGs50~100 μg/mL剂量组均不同程度地抑制TGF-β1诱导的HSC-T6的增殖，提示抑制HSC-T6增殖可能是CPhGs抗肝纤维化的作用机制之一。目前最常用的细胞毒性试验是基于细胞膜通透性的改变、细胞内成分释放入上清液的原理，通过检测上清液中某些成分的含量，辨别细胞膜通透性的变化。LDH是活细胞胞浆内酶，正常情况下不能透过细胞膜，当细胞受损时，细胞膜通透性增高，LDH释放[17] 至细胞外。本文中，通过测定上清液中LDH的水平可以反映细胞损伤程度。我们发现不同浓度的CPhGs作用HSC-T6细胞48 h后上清液中LDH水平与空白对照组比较差异不明显，提示，CPhGs在有效抑制HSC-T6增殖的同时，对HSC-T6基本上无毒性。TGF-β1介导的TGF-β1/Smad信号转导在HSC-T6细胞外基质表达调节中的作用是研究肝纤维化的热点课题。Smads是TGF-β胞内最重要的信号通路，不同类型的Smads分子作用各异，Smad2和Smad3可传递促肝纤维化信号， 而Smad7可传递抗肝纤维化信号。Smad2和Smad3过度表达及Smad7被抑制是TGF-β1/Smad通路持续激活，导致细胞外基质大量堆积的原因。因此，通过靶向性阻断Smad2和Smad3信号蛋白，加强Smad7信号蛋白表达有望成为肝纤维化治疗的新途径。结果显示，HSC-T6在TGF-β1刺激下大量活化增殖，Smad2、Smad3 mRNA表达增加，Smad7 mRNA 表达下降，这与CPhGs抑制BSA诱导的肝纤维化大鼠肝组织中TGF-β1的表达和胶原产生(免疫组化)结果一[18] 致。作为抑制型Smad，Smad7在结构上和Smad2 与Smad3有很大不同，因蛋白的序列只有DNA连接的MHl和MH2区，而缺失了C端的SSXS基序，SSXS基序是磷酸化的靶区，故监测不到磷酸化水平，但其作用和功能在各种疾病中也备受关注，Smad7蛋白与活化的I型受体相结合后，可以阻止Smads与Smad4 蛋白形成杂聚体并进行细胞核内转移，通过提高Smad7蛋白的表达来抑制TGF-β1/Smad信号在转导通路中的传递，可为[19] 防治相关的疾病提供一种全新的思路和治疗方法。实验结果显示，CPhGs作用于TGF-β1刺激的 HSC-T6细胞株后，Smad2、Smad3蛋白及其磷酸化水平的表达均降低，Smad7蛋白表达升高，提示CPhGs对TGF-β1/Smad信号通路的影响除了可以作用于转录水平，同时从蛋白水平同样可以抑制Smad2、Smad3蛋白的表达、磷酸化与核转位；升高抑制型Smad7蛋白的表达，也能干扰TGF-β1在细胞内的信号转导，从而减少细胞外基质的生成。提示， CPhGs可能通过阻断TGF-β1/Smad信号通路中Smad2、Smad3的表达及增加Smad7 的表达，或者通过与Smad2、Smad3、Smad7相互作用抑制TGF-β1的效应而起到治疗肝纤维化的作用。综上所述，CPhGs对肝纤维化的防治作用可能与下调Smad2和Smad3表达，上调Smad7表达，阻断肝纤维化关键性效应细胞HSC-T6中TGF-β1/Smad信号转导通路而实现。参考文献[1] Cohen-Naftaly M，Friedman SL. 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摘　要：肉苁蓉在我国药用历史悠久，具有滋肝养肾、益精血等多种功效。苯乙醇苷类成分是肉苁蓉的主要药效成分，具有补肾壮阳、肝保护、抗氧化等多种生物活性。对苁蓉苯乙醇苷类成分的药理作用进行了综述。关键词：肉苁蓉；苯乙醇苷；药理作用肉苁蓉始载于《神农本草经》，性温，味甘、咸，归肾、大肠经，有滋肝养肾，益精血，润肠通便的功效。肉苁蓉药用历史悠久，主要用于治疗肾阳不足，精血亏虚，阳萎不孕，腰膝酸软，肠燥便秘等症。其主要含有苯乙醇苷、环烯醚萜、木质素、多糖等化学成分，其中苯乙醇苷类成分是肉苁蓉的主要药效成分。现对肉苁蓉苯乙醇苷类成分的药理作用进行综述，旨在为肉苁蓉属植物或苯乙醇苷成分的开发利用提供参考。１　补肾壮阳作用荒漠肉苁蓉水煎液醇溶部分及其所含化合物毛蕊花糖苷具有雄性激素样作用，能显著增加去势大鼠精囊前列腺的重量，且无使胸腺萎缩的性激素副作用；毛蕊花糖苷能增加包皮腺和提肛肌的重量，为肉苁蓉雄性激素样作用的主要活性成分［１］。毛蕊花糖苷还可显著缩短“肾阳虚”模型小鼠阴茎勃起潜伏期，增加精子数量，提高性器官脏器系数，改善睾丸形态结构［２］。２　肝保护作用毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、２′－乙酰基毛蕊花糖苷和松果菊苷均能显著抑制ＮＡＤＰＨ－ＣＣｌ４诱导的肝细胞微粒体中脂质过氧化和细胞中天冬氨酸转氨酶的释放，并减轻ＣＣｌ４和Ｄ－ＧａｌＮ诱导的肝细胞毒性［１］。松果菊苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷等苯乙醇苷化合物也可降低Ｄ－ＧａｌＮ／ＬＰＳ诱导的肝损伤模型小鼠的ｓＡＳＴ和ｓＡＬＴ增长，体外实验结果表明：其保肝机制不是通过抑制ＴＮＦ－α的释放，而是依赖于降低肝细胞对ＴＮＦ－α的敏感度［３］。３　心肌保护作用盐生肉苁蓉苯乙醇总苷能提高小鼠缺血再灌注心肌ＳＯＤ和Ｓｅ－ＧＳＨ－Ｐｘ的活性，降低ＬＰＯ含量，减轻心肌超微粒结构损伤并改善心肌缺血大鼠的心电图，减小心肌梗死面积，提高心肌组织中磷酸肌酸激酶活力［１］。４　脑保护作用肉苁蓉总苷可降低脑缺血／再灌注过程中脑卒中指数、脑梗死范围百分比、脑组织ＭＤＡ 含量及一氧化氮合酶活性，升高ＳＯＤ活性，对脑缺血／再灌注损伤有保护作用。进一步研究发现，脑缺血及脑缺血／再灌注后脑梗死范围百分比明显增加，海马ＣＡ１区脑细胞密度降低，细胞皱缩明显，胞浆染色较深，核染色质凝聚，凋亡神经细胞明显增多，肉苁蓉总苷可促进上述各项指标的恢复［４］。５　神经保护作用盐生肉苁蓉苯乙醇苷成分对ＭＰＰ＋诱导小脑颗粒神经元凋亡有保护作用，其作用与抑制ｃａｓｐａｓｅ－３和ｃａｓｐａｓｅ－８活性有关［５］。盐生肉苁蓉苯乙醇苷成分对β淀粉样蛋白２５－３５诱导的大鼠嗜铬细胞瘤ＰＣ１２细胞凋亡有保护作用，可增高细胞存活率，降低乳酸脱氢酶活性和凋亡率［６］。盐生肉苁蓉苯乙醇苷可显著减弱由ＭＰＴＰ诱导的Ｃ５７小鼠ＤＡ神经毒性，对多巴胺能神经元损伤具有保护作用［７］。苯乙醇苷化合物ｃａｍｐｎｅｏｓｉｄｅ　ＩＩ［８］、毛蕊花糖苷［９］、管花苷Ｂ［１０，１１］、松果菊苷［１２］对ＭＰＰ＋、Ｈ２Ｏ２或ＴＨＦ－α诱发的大鼠小脑颗粒细胞凋亡、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞损伤、ＰＣ１２神经元凋亡具有保护作用。松果菊苷对６－ＯＨＤＡ急性损伤所致的大鼠纹状体细胞外液中的ＤＡ 及其代谢产物含量的减少具有较好的预防作用［１３］，可降低ＭＰＴＰ导致的小鼠行为损伤、提升条状ＤＡ和ＤＡ代谢物水平、减少细胞死亡、提高酪氨酸羟化酶表达［１２］。毛蕊花糖苷可改善ＭＰＴＰ诱导的Ｃ５７小鼠行为学表现，增加脑内ＤＡ递质含量、ＤＡ能神经元数量及黑质纹状体α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ蛋白水平［１４］。肉苁蓉苯乙醇苷化合物的神经保护作用与其能减少自由基生成，抑制氧化应激反应发生等有关，可治疗和预防帕金森病等神经退行性疾病。６　抗氧化作用肉苁蓉苯乙醇苷可抑制大鼠肾组织中氧自由基的产生，对糖尿病肾病的自由基损伤有阻止和修复的作用，并提高小鼠血中巨噬细胞的巨噬指数及小鼠免疫器官的重量［１５］。体外实验研究结果表明，苯乙醇苷有清除Ｏ２－·、ＯＨ·、Ｈ２Ｏ２、１　Ｏ２自由基和对ＯＨ·引起的ＤＮＡ 氧化损伤的保护作用，推测清除自由基作用可能是其抗衰老、抗辐射、心肌缺血保护等作用的机制之一［１６］。苯乙醇苷化合物２＇－乙酰基毛蕊花糖苷、肉苁蓉苷Ａ、管花苷Ａ、松果菊苷、毛蕊花糖苷、丁香苷３＇－α－Ｌ－吡喃鼠李糖苷、管花苷Ｂ、异毛蕊花糖苷和肉苁蓉苷Ｆ具有清除ＤＰＰＨ 和ＸＯＤ自由基及抗大鼠肝微粒体中ＬＰＯ的作用［１］。异毛蕊花糖苷、管花苷Ｂ、毛蕊花糖苷、２＇－乙酰基毛蕊花糖苷、松果菊苷、肉苁蓉苷Ａ、管花苷Ａ还通过清除ＮＯ自由基表现出抗炎作用［１７］。７　抗辐射作用肉苁蓉总苷可减缓６０Ｃｏ射线照射引发的小鼠胸腺、脾、睾丸超微结构的损伤，提高脾指数和脾Ｓｅ－ＧＳＨ－Ｐｘ活性，降低ＭＤＡ含量，提高存活率；抑制外周血白细胞、网织红细胞、骨髓有核细胞、脾集落数的减少，对受照小鼠敏感器官超微结构、脾和造血系统有保护作用。肉苁蓉总苷还能增强受照小鼠迟发型超敏反应，增加胸腺指数，增强Ｔ淋巴细胞增殖反应和ＩＬ－２的活性，对辐射损伤小鼠的Ｔ淋巴细胞功能具有较强的保护作用［４］。８　抗衰老作用肉苁蓉总苷能显著改善脑老化模型小鼠的学习、记忆功能，升高脑组织的ＳＯＤ活性，降低ＭＤＡ和脂褐素含量，并对海马ＣＡ１区组织结构形态学改变有保护作用［４］。肉苁蓉总苷抗衰老作用的免疫学机制研究结果显示，肉苁蓉总苷能提高模型小鼠淋巴细胞转化能力、外周血ＩＬ－２含量、腹腔巨噬细胞吞噬功能等，使其恢复或接近青年小鼠状态［４］。苯乙醇苷通过清除自由基、增强机体抗氧化能力、提高机体免疫功能等延缓Ｄ－半乳糖所致的小鼠衰老［１１］。毛蕊花糖苷通过拮抗自由基损伤，提高衰老小鼠心和脑组织端粒酶活性和机体免疫调节功能［１１］。松果菊苷可延缓人肺成纤维细胞ＭＲＣ－５细胞的衰老［１８］。９　改善记忆力作用肉苁蓉总苷可明显降低水迷宫实验正常小鼠到达终点的时间，延长跳台潜伏期［１９］。其能改善三氯化铝［１１］或双侧颈总动脉结扎［４］所致的学习记忆障碍，该功能与肉苁蓉总苷的抗氧化作用有关。肉苁蓉总苷还可提高血管性痴呆大鼠的学习记忆，为肉苁蓉预防、治疗学习记忆障碍和抗痴呆的有效成分［１１］。肉苁蓉总苷对氢化可的松导致的肾阳虚小鼠学习记忆障碍也有改善作用［１６］。毛蕊花糖苷有改善东莨菪碱所致小鼠学习记忆障碍的作用，效果与治疗老年痴呆症的石杉碱甲相似［２０］。松果菊苷可通过提高中枢胆碱能系统功能、提高总抗氧化能力、促进蛋白质和核酸合成、调节免疫状态而提高ＳＡＭ－Ｐ／８小鼠的学习记忆能力［２１］。１０　松弛血管作用从德赢vwin登录 中分离得到的苯乙醇苷类化合物松果菊苷、毛蕊花糖苷、ｋａｎｋａｎｏｓｅ、肉苁蓉苷Ｆ可以明显抑制去甲肾上腺素引起的大鼠胸主动脉血管收缩［２２］。松果菊苷还对苯肾上腺素和氯化钾引起的大鼠离体胸主动脉环收缩内皮有松弛作用，其扩张血管的机制是ＮＯ－ｃＧＭＰ路径［２３］。１１　抑制前列腺增生作用毛蕊花糖苷能促进良性前列腺增生模型大鼠的前列腺细胞凋亡，对超微结构有明显的改善作用，可抑制前列腺增生［２４］。１２　降低胆固醇作用肉苁蓉乙醇提取物可抑制高胆固醇饮食小鼠的血胆固醇升高，提高低密度脂蛋白受体和细胞色素Ｐ４５０侧链切割的ｍＲＮＡ表达，毛蕊花糖苷为降胆固醇作用的活性成分［２５］。１３　毒副作用肉苁蓉总苷的毒性研究表明其急性毒性试验为无毒，遗传毒性试验为阴性，体重、食物利用率、血常规、血生化、脏器比值及组织病理学检查等各项指标与对照组比较均无显著性差异［１１］。综上，肉苁蓉苯乙醇苷类成分药理作用广泛，且未见毒性报道，具有极大的市场开发潜力。参考文献：［１］　宋志宏，雷丽，屠鹏飞．肉苁蓉属植物的药理活性研究进展［Ｊ］．中草药，２００３，３４（９）：１６－１８．［２］　马晶晶，赵帆，孙云．类叶升麻苷对肾阳虚小鼠补肾壮阳作用的研究［Ｊ］．扬州大学学报：农业与生命科学版，２００９，３０（１）：２２－２５．［３］　ＭＯＲＩＫＡＷＡ　Ｔ，ＰＡＮ　Ｙ　Ｎ，ＮＩＮＯＭＩＹＡ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．Ａｃｙｌａｔｅｄｐｈｅｎｙｌｅｔｈａｎｏｉｄ　ｏｌｉｇｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ　ｗｉｔｈ　ｈｅｐａｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｄｅｓｅｒｔ　ｐｌａｎｔ　Ｃｉｓｔａｎｃｈｅ　ｔｕｂｕｌｏｓａ［Ｊ］．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ，２０１０，１８：１８８２－１８９０．［４］　赵新杰，夏华玲，王苏静．肉苁蓉的药理作用研究进展［Ｊ］．中国药业，２００９，１８（１７）：７７－７９．［５］　ＴＩＡＮ　ＸＦ，ＰＵ　Ｘ　Ｐ．Ｐｈｅｎｙｌｅｔｈａｎｏｉｄ　ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｉｓｔａｎｃｈｅｓｓａｌｓａ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　１－ｍｅｔｈｙｌ－４－ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍｉｏｎ　ｉｎ　ｎｅｕｒｏｎｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２００５，９７（１）：５９－６３．［６］　罗兰，阿尔孜古丽·吐尔逊，王晓雯．肉苁蓉总苷对淀粉样蛋白２５－３５诱导ＰＣ１２细胞凋亡的保护作用［Ｊ］．中国新药与临床杂志，２０１０，２４（２）：３１３－３１５．［７］　ＧＥＮＧ　Ｘ，ＳＯＮＧ　Ｌ，ＰＵ　Ｘ，ｅｔ　ａｌ．Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆｐｈｅｎｙｌｅｔｈａｎｏｉｄ　ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｉｓｔａｎｃｈｅｓ　ｓａｌｓａ　ａｇａｉｎｓｔ　１－ｍｅｔｈｙｌ－４－ｐｈｅｎｙｌ－１，２，３，６－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ 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