摘要: 目的观察肉苁蓉苯乙醇苷类成分( CPhGs) 对牛血清白蛋白( BSA) 致大鼠肝纤维化的防治作用。方法将SD 大鼠随机分为6 组，每组12 只，即正常对照组、肝纤维化模型组( 模型组) 、复方鳖甲软肝片阳性对照组( 600 mg /kg) 及CPhGs 高剂量组( 500 mg /kg) 、中剂量组( 250 mg /kg) 、低剂量组( 125 mg /kg) ; 采用静脉注射BSA 诱导建立大鼠肝纤维化模型; 造模同时，灌胃给予大鼠CPhGs 提取物，连续12 w，末次给药后腹主动脉采血，取出肝脏和脾脏。计算肝脾指数，检测大鼠血清肝功能指标及肝脏病理组织学变化。结果与正常对照组比较，模型组大鼠肝脏指数明显增加，血清AST 含量明显增加。与模型组比较，复方鳖甲软肝片阳性对照组及CPhGs 不同剂量组大鼠肝脏指数均显著降低，CPhGs 不同剂量组大鼠脾脏指数明显下降，CPhGs 不同剂量组大鼠血清ALT、AST 含量显著下降。CPhGs 可使BSA 诱导的大鼠肝脏纤维增生明显减轻。病理结果显示，正常对照组大鼠肝组织未见异常，CPhGs 不同剂量组治疗效果显著，形态基本上接近于正常对照组。结论肉苁蓉苯乙醇苷类成分具有保护肝细胞和防治肝纤维化的作用。关键词: 肉苁蓉; 苯乙醇苷类成分; 肝纤维化; 牛血清白蛋白肉苁蓉( Cistanche) 属多年生根寄生草本植物，是名贵中药材，具有补肾、益精、润肠、抗衰老等功效，由于其生长于沙漠环境，又有“沙漠人参”之美誉。国内外学者对肉苁蓉的化学成分进行了大量研究，迄今为止已经分离出约70 种化合物，包括苯乙醇苷类、环烯醚萜类、木脂素类化合物以及生物碱和糖类等其他成分，其中最主要成分为苯乙醇苷类化合物［1］。苯乙醇苷类成分具有很强的抗菌、抗炎、抗病毒、抑制弹性蛋白酶、抗氧化、免疫调节、增强记忆及强心等多种药理活性［2］。本实验从肉苁蓉药材中分离得到苯乙醇苷类化合物，并研究其对牛血清白蛋白( BSA) 所致大鼠肝纤维化的防治作用，旨在为肉苁蓉中苯乙醇苷类化合物的抗肝纤维化作用机制及相关保健品或药品的开发提供依据。1 材料和方法1． 1 药材与仪器肉苁蓉苯乙醇苷类成分提取物( CPhGs) 由新疆药物研究所植物化学室提供。用时将药物配制成不同浓度，置4℃冰箱保存待用。复方鳖甲软肝片( 内蒙古福瑞科技股份有限公司产品，批号: 20131006) ，牛血清白蛋白( BSA) ( Sigma公司产品，CAS: 9048-46-8，原装进口) 。羊毛脂( 上海源叶生物科技公司) ，液体石蜡( 天津市富宇精细化工有限公司) ，磷酸盐缓冲液( 飞世尔生物化学制品( 北京) 有限公司，批号: NZD1132) 。电热恒温培养箱( 上海一恒科技有限公司) ，立式压力蒸汽灭菌器( 上海博讯实业有限公司医疗设备厂) ，L-530 多管架自动平衡离心机( 长沙湘仪离心机仪器有限公司) ，全自动生化分析仪( 迈瑞公司，系列号: A086A0182) 。1． 2 实验动物SD 大鼠72 只，雄性，体质量( 200± 20) g，SPF 级，由新疆医科大学实验动物中心提供，动物使用许可证号: SYXK( 新) 2003-0001。1． 3 实验方法1． 3． 1 弗氏不完全佐剂的制备称量羊毛脂50 g置于烧杯中，加入100 mL 液体石蜡，加热至70℃混匀，高压灭菌后备用。1． 3． 2 大鼠免疫性肝纤维化模型的建立造模分为致敏阶段和尾静脉攻击阶段: ( 1) 致敏阶段: 除正常对照组大鼠注射生理盐水( 每次每只0． 5 mL) 以外，其余各组动物均多点皮下注射含9 mg /mL BSA的弗氏不完全混合乳化液，每次每只0． 5 mL，共5次。前2 次注射间隔为14 d，后3 次注射间隔为7d。末次致敏注射后1 w，于眼内眦静脉丛采血，采用双向扩散法检测大鼠血清抗BSA 抗体; ( 2) 尾静脉攻击阶段: 抗体阳性大鼠继续进行尾静脉攻击，即模型组及给药组大鼠尾静脉注射BSA，每只首次2mL，每周2 次，其后浓度逐渐升至每次4 mL /只，连续5 w，共10 次。1． 3． 3 实验分组及药物干预SD 大鼠随机分为6 组，每组12 只，即正常对照组、肝纤维化模型组( 模型组) 、复方鳖甲软肝片阳性对照组( 600 mg /kg) 及CPhGs 高剂量组( 500 mg /kg) 、中剂量组( 250 mg /kg) 、低剂量组( 125 mg /kg) 。CPhGs 不同剂量组和阳性对照组在造模的同时按剂量灌胃给药，每天1 次，持续12 w。1． 4 指标检测各组末次给药后禁食( 不禁水) 12h，称重，经戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，腹主动脉采血，3 500 r /min 离心10min，取血清测定谷草转氨酶( ALT) 、谷丙转氨酶( AST) ; 采血后处死大鼠，剖取肝脏和脾脏，称量肝脏及脾脏湿重，计算肝脏指数和脾脏指数( 脏器指数= 脏器重量/体质量×100) 。取肝脏左叶同一部位，固定，切片，常规HE染色，进行病理组织学观察。肝纤维化分级参照文献［3］分为5 级: 0 级: 无纤维化; Ⅰ级: 纤维结缔组织仅限于汇管区或汇管区有扩大，有向小叶发展的倾向; Ⅱ级: 纤维结缔组织增生明显，超过小叶的2 /3 并伴有Ⅰ级改变; Ⅲ级: 纤维结缔组织进入肝小叶中央静脉周围; Ⅳ级: 纤维结缔组织在全小叶呈多处弥漫性增生，有假小叶形成，并有Ⅲ级改变。1． 5 统计学处理用SPSS17． 0 统计软件进行统计学分析，数据采用均数± 标准差( -x ± s) 表示; 多组间均数比较采用方差分析one-way ANOVA，多组样本均数两两比较采用LSD 方法进行统计学分析，检验水准α = 0． 05。2 结果2． 1 CPhGs 对BSA 致肝纤维化大鼠脏器系数的影响与正常对照组比较，模型组大鼠肝脏指数明显增加，差异有统计学意义( P ＜ 0． 05) 。与模型组比较，复方鳖甲软肝片组及CPhGs 不同剂量组大鼠肝脏指数明显下降，CPhGs 不同剂量组大鼠脾脏指数明显下降，差异均有统计学意义( P ＜0． 05) ，见表1。2． 2 CPhGs 对BSA 致肝纤维化大鼠肝功能酶指标的影响与正常对照组比较，模型组ALT 含量增加，但差异没有统计学意义; AST 含量增加，差异具有统计学意义( P ＜0． 05) ; 与模型组比较，CPhGs 高剂量组大鼠血清ALT 含量显著降低; 复方鳖甲软肝片组及CPhGs 高、中、低剂量组大鼠血清AST 含量显著降低，差异有统计学意义( P ＜0． 05) ，结果见表2。2． 3 CPhGs 对BSA 致肝纤维化大鼠病理组织学的影响正常对照组大鼠肝组织未见异常，肝小叶结构正常，肝细胞无变性坏死( 图1) 。模型组大鼠肝纤维化呈Ⅲ ～Ⅳ级纤维化，纤维结缔组织进入肝小叶中央静脉周围，纤维结缔组织在全小叶呈多处弥漫性增生，有假小叶形成( 图2) 。复方鳖甲软干片阳性对照组与模型组比较病理变化有所缓解，纤维结缔组织在小叶弥漫性增生减少( 图3) 。CPhGs高、中剂量组病理组织切片显示肝组织形态基本上接近于正常对照组，肝细胞无变性坏死，无肝纤维化( 图4、5) 。CPhGs 低剂量组纤维结缔组织仅限于汇管区或汇管区有扩大，有向假小叶发展的倾向( 图6) 。3 讨论肝纤维化是指肝细胞发生坏死及炎症刺激时肝组织内纤维、结缔组织异常增生的病理过程。肝纤维化是继发于各种形式慢性肝损伤之后组织修复过程中的代偿反应［4］，延缓肝纤维化的病程发展对慢性肝炎的治疗非常重要［5］。肝细胞损伤引起的炎症反应是促成肝纤维化形成的直接因素［6 － 7］。ALT 和AST 是国内外应用最为广泛的反映肝细胞损害的检测指标，转氨酶主要存在于肝细胞内。当肝细胞发生炎症、坏死等损伤及细胞膜损伤时，转氨酶从高梯度向血中释放，导致血清转氨酶升高。因此血清转氨酶水平是临床反映肝细胞损伤的敏感指标。本实验结果表明，与模型组比较，各给药组大鼠血清ALT、AST 含量明显下降，提示复方鳖甲软肝片及肉苁蓉苯乙醇苷类成分提取物具有保护肝细胞作用。在肝纤维化发生、发展过程中肝细胞的病理变化复杂，涉及肝细胞损伤( 变性、坏死) 、炎性、慢性持续的损伤修复反应、氧化应激反应及相关递质的调控，同时与肝窦内皮细胞、细胞外间质的功能紊乱和交互作用有关。如能有效保护肝细胞，防止肝细胞脂肪变性、坏死，即可阻止炎细胞浸润和纤维组织增生，从而切断向肝纤维化、肝硬化发展的病理过程［8］。本实验用尾静脉注射BSA 建立免疫性肝纤维化模型，其主要原理是异种血清进入机体引发免疫应答，在肝脏主要是在门静脉汇管区形成免疫复合物沉积，沉积的免疫复合物引起局部炎症反应，激发各种细胞因子的产生，肝星状细胞转变为肝纤维母细胞，分泌大量细胞外基质，发生纤维化［9 － 10］。本实验研究结果显示，肉苁蓉苯乙醇苷类成分提取物高、中、低剂量均能显著降低模型大鼠肝、脾脏指数，表明肉苁蓉苯乙醇苷类成分提取物能显著改善肝、脾充血、肿大，减轻肝、脾损伤。本研究病理组织学观察结果显示，肉苁蓉苯乙醇苷类成分高、中剂量组病理组织切片肝组织形态基本上接近于正常对照组，减轻肝细胞变性及炎性细胞浸润，抑制胶原纤维的合成与沉积，提示肉苁蓉苯乙醇苷类成分对BSA所致肝纤维化大鼠具有一定的防治作用，但其作用机制还需要进一步探讨。参考文献:［1］ 吴海虹，玄国东，刘春泉． 肉苁蓉苯乙醇苷乙醇回流提取影响因素研究［J］． 江苏农业科学，2009，( 1) : 250-252．［2］ 郑晓珂，李媛媛，冯卫生，等． 天然苯乙醇苷类化合物研究进展［J］． 中国新药杂志，2011， 20( 3) : 230-234．［3］ 程明亮，刘三都． 肝纤维化的基础与临床［M］． 北京: 人民卫生出版社，1996: 146-147．［4］ 吴静． 赤芍的药理研究及抗肝纤维化临床应用近况［J］． 中西医结合肝病杂志，2008，18( 3) : 189-191．［5］ 江字泳，王宪波，王融冰． 八味抗纤方治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的临床研究［J］． 北京中医药， 2010， 29( 7) : 487-489．［6］ Vinas O，Bataller Ｒ，Sancho BP， et al． Humanhepatic stellate cellsshow features of antigen-presenting cells and stimulate lymphocyteproliferat［J］． Hepatology，2003，38( 4) : 919-929．［7］ Maher JJ． Interactions between hepaticstellate cell sand the immunesystem［J］． Semin Liver Dis， 2001，21( 3) : 417-426．［8］ Iredale J． Defining therapeutic targets for liver fibrosis: exploitingthe biology of inflammation and repair［J］． Pharmacol Ｒes，2008，58( 2) : 129-136．［9］ 康文臻，谢玉梅，聂青，等． 苦参素对实验性大鼠肝纤维化防治作用的研究［J］． 世界华人消化杂志，2003，11( 2) : 195-198．［10］ 郑元义，戴立里，王文兵，等． 丹参素治疗肝纤维化及其作用机制研究［J］． 中华肝脏病杂志，2003， 11( 5) : 288-290．

【摘要】目的： 观察肉苁蓉苯乙醇苷类成分(CPhGs)对牛血清白蛋白(BSA)诱导的免疫性肝纤维化大鼠肝组织转化生长因子β1(TGF-β1)表达的影响，探讨其治疗肝纤维化的效果及机制。方法：将75只SD大鼠随机分为6组，即正常对照组，肝纤维化模型组，阳性对照组(复方鳖甲软肝片600 mg/kg)，以及CPhGs高(500 mg/kg)、中(250 mg/kg)、低(125 mg/kg)剂量组。CPhGs高、中、低剂量组每组各13只，其余每组各12只。采用皮下及尾静脉注射BSA诱导建立大鼠肝纤维化模型，造模同时灌服相应剂量的受试药物，正常对照组和模型组灌胃给予蒸馏水，其余各组均按设定剂量灌胃给药；给药结束后收集大鼠血清、肝组织，采用全自动生化仪检测大鼠肝功能酶指标，包括血清白蛋白(ALB)、血清总胆红素(TB)、血清直接胆红素(DB)水平；放射免疫法检测血清肝纤维化标志包括血清透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PC Ⅲ)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)含量；ELISA测定血清TGF-β1水平；Masson染色观察肝脏病理组织学变化；免疫组化法测定肝组织中TGF-β1的表达。结果：与模型组相比，CPhGs各剂量组肝纤维化大鼠血清中ALB含量增加，中、高剂量组TB、DB 含量降低，各剂量组大鼠肝纤维化指标含量均明显降低(P<0.05或P<0.01)，血清TGF-β1含量降低(P<0.01)，Masson染色结果显示CPhGs各剂量组肝纤维化程度减轻，均显著低于模型组(P<0.01)，各剂量组肝组织中TGF-β1蛋白的表达也明显受到抑制(P<0.05或P<0.01)。结论：CPhGs对BSA诱导的免疫性肝纤维化大鼠具有较好的保护作用，对TGF-β1表达的抑制作用可能是其作用机制之一。【关键词】肉苁蓉；苯乙醇苷类；肝纤维化；牛血清白蛋白；转化生长因子β1、肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)是肝脏遭受反复或慢性损伤后的一种损伤与修复过程，主要与慢性炎症[1-3] 和引起慢性肝脏损伤的化学因素相关，已成为一个发病率和死亡率都很高的世界医学难题，各种肝病多数经肝纤维化最后发展为晚期肝硬化，成为肝病死亡[4] 的主要原因。目前研究已经明确：肝纤维化是细胞外基质(extracellular matrix，ECM)合成与降解失衡的动[5] 态过程；肝纤维化及早期肝硬化是完全可逆转的。中医药治疗肝纤维化有悠久的历史和肯定的临床疗效，研究证实，中医药治疗肝纤维化具有多靶点、多环节、多途径复合作用的特点。肉苁蓉(cistanche)是著名的名贵补益类中药。因其疗效确切，药性温和，所以自古就被视为强壮、滋补的中药，有“沙漠人参”之美誉，化学及药理作用研究显示肉苁蓉苯乙醇苷类(cistanche phenylethanoid glycosides，CPhGs)成分是[6] 其发挥药效的主要物质基础之一。CPhGs具有抗氧化、抗抑郁、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗菌和免疫调[7-11] [12] 节等多种生物活性。Peter等于1989年首次发现苯乙醇苷类化合物松果菊苷具有显著的保肝护肝作用，随后引起人们对CPhGs进行抗肝炎研究的兴趣，本文通过建立牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)诱导的免疫肝纤维化大鼠模型，观察CPhGs对大鼠血清肝功能、肝纤维化指标、病理学变化及血清与肝组织中TGF-β1表达的影响，以期阐明CPhGs抗肝纤维化的可能作用机制，为进一步的新药开发提供基础数据。1 材●料1.1 主要试剂与仪器德赢vwin登录 新鲜肉质茎6.0 kg，经70%乙醇热回流提取3次，每次3 h，合并提取液。AB-8树脂纯化得到提取物即苯乙醇苷的乙醇提取物，后经新疆维吾尔自治区药物研究所赵军研究员鉴定为CPhGs，纯度为70%。用0.5%的羧甲基纤维素钠 (sodium carboxyl methylcellulose-Na，CMC-Na)将其配制成不同浓度，置4 ℃冰箱保存待用。复方鳖甲软肝片(内蒙古福瑞科技股份有限公司产品)，BSA(Sigma公司产品)。羊毛脂(上海源叶生物科技公司)，液体石蜡(天津市富宇精细化工有限公司)，磷酸盐缓冲液(飞世尔生物化学制品北京有限公司)。大鼠转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)夹心ELISA试剂盒(联科生物技术有限公司)，兔抗TGF-β1抗体0.2 m L(BIOSS公司)。电热恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)，立式压力蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)，L-530多管架自动平衡离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)，全自动生化分析仪(迈瑞公司)，化学发光分析仪(泰格科信)。1.2 方法1.2.1 动物●雄性健康SD大鼠75只，SPF级，体质量180～220 g，由新疆医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号为SCXK(新)2011-0004。SPF级实验动物使用许可证号为SYXK(新)2011-0004。1.2.2 分组及给药●将SD大鼠随机分为6组，即正常对照组，肝纤维化模型组，阳性对照组(复方鳖甲软肝片600 mg/kg)， 以及CPhGs高(500 mg/kg)、中(250mg/kg)、低(125 mg/kg)剂量组。CPhGs高、中、低剂量组每组各13只，其余每组各12只。除正常组外，大鼠[13] 采用朱启贵等的方法制备免疫性肝纤维化模型：造模分为致敏阶段和尾静脉攻击阶段。致敏阶段，除正常对照组注射生理盐水 (每只0.5 mL)以外，其余各组动物均多点皮下注射含弗氏不完全佐剂的9 mg/mL BSA，每次0.5 mL，共5次。前两次注射间隔为14 d，后3次注射间隔为7 d。末次致敏注射后1周，每只动物于眼球后静脉丛采血，采用双向扩散法检测大鼠血清抗BSA抗体。抗体阳性大鼠继续进行尾静脉攻击，即模型组和给药组大鼠尾静脉注射BSA，每周2次，连续5周，注射剂量由每只2 m g逐渐递增至4 m g；正 常对照组尾静脉注射生理盐水。造模同时给药，除空白对照组和模型组灌胃给予蒸馏水外，其余各组均按设定剂量灌胃给药；造模结束后继续给药4周，实验周期共计15周。1.2.3 血清各项指标含量的检测●各组大鼠于末次给受试物后禁食(不禁水)24 h，称体质量，经戊巴比妥钠腹腔注射麻醉、腹主动脉取血，3 000 r/min离心10min分离血清，全自动生化仪检测3项肝功能酶指标，包括血清白蛋白(serum albumin，ALB)、血清总胆红素(total bilirubin，TB)、血清直接胆红素(direct bilirubin，DB)含量；双抗体夹心酶联免疫法，测定血清TGF-β1水平；化学发光免疫分析仪检测肝纤维化4项即血清透明质酸(clolinesterase， HA)、层黏连蛋白(1aminin，LN)、Ⅲ型前胶原(prcocollagen type Ⅲ，PC Ⅲ)、Ⅳ型胶原(type Ⅳ collagen，Ⅳ-C)水平。1.2.4 肝脏组织病理学观察●所有大鼠均取同一部位肝组织，用40％的多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片并进行Masson染色，显微镜下观察组织学变化。肝纤维化分级参照文献[14]分为5级：0级，无纤维化；I级，纤维结缔组织仅限于汇管区或汇管区有扩大，有向小叶发展的倾向；II级，纤维结缔组织增生明显，超过小叶的2/3并伴有I级改变；Ⅲ级，纤维结缔组织进入肝小叶中央静脉周围；IV级，纤维结缔组织在全小叶呈多处弥漫性增生，有假小叶形成，并有Ⅲ级改变。1.2.5 肝脏组织TGF-β1表达的检测●组织切片用Nikon Digital Sightds-Fi2型生物显微镜进行观察，并用K12320型显微摄像系统在低倍镜(×100倍)下选取清晰视野拍照。采用Motic Med 6.0 CMIAS彩色图像分析软件，通过显微摄像系统放大200倍，每张切片随机选取3个视野，每个视野随机选取5个2 cm×3 cm大小的区域，TGF-β1免疫组化阳性反应产物为出现位于细胞浆的棕黄色细颗粒状染色，测定其平均光密度值(MOD)，值越大表明组织中该抗原含量越高。计算公式如下：MOD=胶原面积/肝组织面积×100%1.3 统计学方法用SPSS 16.0软件进行统计学分析，数据采用 x-±s表示；多组间均数比较采用方差分析One-way A NOVA，多组样本均数两两比较采用LSD方法分析，有序分类资料采用Ridit分析，检验水准α=0.05。2 结●果2.1 CPhGs对BSA致肝纤维化大鼠肝功能酶指标的影响与正常对照组比较，肝纤维化模型组ALB含量明显降低，TB、DB含量明显增加，差异均具有统计学意义(P均<0.01)。与肝纤维化模型组比较，阳性对照组和CPhGs高、中、低剂量组大鼠血清ALB含量显著增加，差异均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；阳性对照组和CPhGs高、中剂量组大鼠血清TB、DB含量均显著降低，差异均具有统计学意义(P均<0.05)；同时，CPhGs各剂量组对于TB、DB活性存在一定的剂量依赖关系(r=0.666，r=0.749，P均<0.05)，提示CPhGs能够降低肝纤维化大鼠肝细胞的损害程度，改善肝纤维化大鼠肝功能，对肝细胞损伤具有保护作用，见表1。2.2 CPhGs对BSA致肝纤维化大鼠血清肝纤维化标志HA、LN、PCIII、IV-C含量的影响与正常对照组比较，模型组大鼠血清肝纤维化标志HA、LN、PCIII、IV-C含量均显著增加，差异均具有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，CPhGs不同剂量组及阳性对照组血清中HA、LN、PCIII、IV-C含量均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，其中，CPhGs各剂量组LN、IV-C活性降低具有一定的剂量依赖关系(r=0.595，r=0.593，P均<0.05)，提示CPhGs能够降低大鼠纤维化程度，见表2。2.3 CPhGs对BSA致肝纤维化大鼠血清TGF-β1含量的影响与正常对照组比较，肝纤维化模型组大鼠血清TGF-β1含量明显增加， 差异具有统计学意义(P<0.01)。与肝纤维化模型组比较，阳性对照组及CPhGs高、中、低剂量组血清中TGF-β1含量均显著降低(P均<0.01)，且CPhGs各剂量组TGF-β1含量降低具有一定的剂量反应关系(r=0.490，P<0.01)。提示CPhGs可能通过降低肝纤维化大鼠血清中细胞因子TGF-β1的含量治疗肝纤维化，见表3。2.4 大鼠肝组织病理学观察Masson染色显示，正常对照组大鼠肝组织未见炎细胞浸润，肝小叶结构完整清晰，肝细胞呈索状分布，未见不规则血窦，汇管区无扩大(见图1A)。肝纤维化模型组大鼠呈Ⅲ～Ⅳ级纤维化，胶原纤维延伸连接，包绕整个肝小叶使正常肝小叶结构破坏，假小叶形成，但以大方型假小叶为主(见图1B)。阳性对照复方鳖甲软肝片组与CPhGs高、中、低剂量组治疗效果显著，病理组织切片示形态基本上与正常对照组接近(见图1C~1F)。根据肝纤维化评分标准，模型组肝纤维化程度与正常组比较，差异有统计学意义(P<0.01)；阳性对照复方鳖甲软肝片组与CPhGs不同剂量组肝纤维化程度减轻，均显著低于模型组(P<0.01)。见图1及表4。2.5 肝脏组织中TGF-β1表达的差异光镜下观察：TGF-β1在正常组大鼠肝脏细胞中几乎不表达，少量表达也仅限于间质细胞内(见图2A)；模型对照组TGF-β1表达广泛分布于汇管区、纤维间隔、肝窦壁及细胞胞浆内、肝星状细胞、炎症细胞及其周围。尤其汇管区内呈强阳性表达，染色呈棕黄色(见图2B)；阳性对照复方鳖甲软肝片组与CPhGs各剂量组TGF-β1的表达仅在汇管区和纤维间隔内可见少量阳性细胞，染色呈浅棕黄色(见图2C~2F)；各组大鼠肝组织中TGF-β1 表达的差异及平均光密度值见图2及表3。3 讨●论慢性肝炎向肝硬化发展的必经途径是肝纤维化，因此，积极探索肝纤维化的治疗在临床研究中具有十分重要的意义。国内外文献证实，慢性肝炎在早期肝纤维化阶段经过治疗大多数可以逆转或治愈，改变了[15] 传统的肝纤维化不可治愈的观念。抗肝纤维化多年来一直是医学界重点研究的医学难题，新世纪以来，[16] 中医药在抗肝纤维化治疗研究领域取得长足进步，发现气阴不足、瘀血阻络是肝纤维化的中医基本病机[17] 根源。脏器系数是毒理试验中常用的指标，此法简单易行，而且比较敏感。动物染毒以后，受损脏器质量可能发生变化，故脏器系数也会随之改变。脏器系数增大，则表示脏器充血、水肿或增生肥大等；脏器系数减小，则表明脏器萎缩以及其他退行性改变。本课题组前期研究显示CPhGs不同剂量组大鼠肝脾指数明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05)，提示CPhGs能够[18] 降低肝纤维化大鼠的肝、脾质量。血清白蛋白(ALB)、胆红素等生化指标是反映肝细胞损害的敏感指标，对估计肝硬化患者肝脏的储备功能，了解病情变[19] 化及预后判定具有重要的临床价值。肝脏是合成ALB的唯一器官，血清ALB水平下降提示蛋白合成能力减弱，常见于肝硬变合并腹水及其他肝功能严重损[20] 伤(如急性肝坏死、中毒性肝炎等) 。血清胆红素通常在正常水平，只有在肝脏严重受损或肝硬化时，胆红素水平才会升高。本实验结果表明，模型组血清中的TB和DB水平与正常对照组比显著升高，ALB水平显著降低，说明免疫性肝损伤模型构建成功；而CPhGs不同剂量组均能使血清ALB含量明显升高P< 0.05)，高、中剂量组TB及DB含量明显下降(P<0.05)， 表明CPhGs具有保护肝细胞作用。血清HA、LN、PCIII、IV-C是反映肝纤维化活动程度的重要指标。当肝细胞受损时，各种细胞因子及ECM本身的破坏可激活LN的合成，故LN和IV-C的升高程度与肝纤维化程度成正相关。HA是一种由间质细胞合成的大分子糖胺多糖，主要由肝星状细胞(hepaticstellate cell，HSC)产生，经淋巴细胞进入血液循环，分布在各种结缔组织中，除少量滞留于脾脏、淋巴结和骨髓外，大多数由肝窦内皮细胞摄取并降解为乙酸和乳酸。血清HA水平是反映肝损伤严重程度、判断有无活动性肝纤维化和肝硬化的定量指标。PCⅢ作为Ⅲ型胶原的前体主要在活化的HSC合成与释放，其含量可直接反映Ⅲ型胶原代谢及肝纤维化早期病变，其水平的高低可作为慢性肝组织炎症坏死、纤维化程度和[21] 肝纤维化、肝硬化诊断的重要指标。本研究结果显示， CPhGs能显著降低HA、LNPCIII、IV-C的含量，说明其具有明显的抗免疫性肝纤维化作用，与文[22] 献报道结果一致。血清TGF-β1水平对判断早期纤维化具有临床意义，TGF-β1能够作为肝纤维化独立因子用于临床早期[23] 肝纤维化的诊断。血清TGF-β1水平增高的机制可能是由于疾病在发生发展的过程中，肝脏肿瘤细胞过度表达TGF-β1。本实验结果表明，与正常对照组比较，肝纤维化模型组大鼠血清TGF-β1含量明显增加，差异具有统计学意义(P<0.01)；与肝纤维化模型组比较，阳性对照复方鳖甲软肝片组及CPhGs高、中、低剂量组血清中TGF-β1含量均显著降低(P<0.01)，进一步提示CPhGs可以通过TGF-β1途径减轻大鼠肝纤维化的发生和发展。TGF-β1是一个多功能的生长因子，目前被公认为是致纤维化最强有力的细胞因子之一，参与细胞的生[23] 长、分化及凋亡，刺激 ECM的合成和沉积，尤其TGF-β1在肝纤维化的发展中具有重要作用，可作为检[24] 测肝纤维化的重要标志物，其表达水平与肝纤维化[25] 的严重程度呈显著正相关。所以，通过检测TGF-β1的表达水平，可以明确肝纤维化病变产生的规律，并可进一步探究其逆转的机制。本研究以免疫组化图像分析检测TGF-β1的表达量后发现，CPhGs高剂量组的TGF-β1(免疫组化染色后阳性反应产物为出现位于细胞浆的棕黄色细颗粒)表达明显减弱，表达的面积缩小，颜色从棕黄色变为浅黄色；实验研究还发现，CPhGs高剂量组的TGF-β1表达量明显低于复方鳖甲软肝片组和模型组。我们分析结果后推测，可能由于CPhGs具有明显的降低TGF-β1表达量的作用，下调TGF-β1的表达，而抑制HSC活化、增殖，从而减少胶原合成，使ECM的合成减少，而达到抗肝纤维化的作用。参考文献[1] Cohen-Naftaly M，Friedman SL. 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摘要:目的观察肉苁蓉苯乙醇苷对大鼠精子膜结构和氧化损伤的干预作用, 探讨肉苁蓉苯乙醇苷治疗弱精子症男性不育的作用机制。方法取大鼠精子制备精子悬液, 并分为正常组, 药物空白组, 模型组, 阳性药对照组(维生素C组)和肉苁蓉苯乙醇苷提物小、中、大剂量组, 应用FeSO4 /H2O2体系产生活性氧(ROS), 在有氧环境下, 不同剂量(0.025, 0.25,0.5 g/ml生药量)的肉苁蓉苯乙醇苷与精子悬液共同孵育后, 检测精子膜脂质过氧化损伤程度, 通过精子低渗膨胀试验评估精子膜功能, 并与已知的抗氧化剂维生素C对照。结果肉苁蓉苯乙醇苷小、中、大剂量组(0.025, 0.25, 0.5 g·ml-1 )在相同的条件下均可提高精子悬液SOD活力, 降低MDA含量, 对精子膜功能具有一定的保护作用。其中0.25,0.5 g· ml- 1的肉苁蓉苯乙醇苷组明显优于维生素C组(P< 0.01或P< 0.001)。结论肉苁蓉苯乙醇苷对大鼠精子膜的脂质过氧化损伤具有明显的干预作用, 对精子膜结构和功能具有明显的保护作用。关键词:肉苁蓉;　苯乙醇苷;　精子;　脂质过氧化肉苁蓉作为一种名贵的中药材, 近年来对它的研究较多。肉苁蓉的活性成分主要包括苯乙醇苷类化合物(Phenylethanoidglycosides,PhGs)、肉苁蓉多糖、甜菜碱、黄酮等物质, 其中PhGs是肉苁蓉中最为重要的活性成分之一。PhGs是一类含有羟基、甲氧基取代苯乙基和羟基、甲氧基取代肉桂酰基的化合物, 通常以β -葡萄糖为母核的含有酯键及氧苷键的天然糖苷, 广泛存在于双子叶植物中。苯乙醇苷类化合物主要由咖啡酸、苯乙醇苷元和糖三部分组成, 包括海胆苷(Echinacoside)、麦角甾苷(Acteoside)、异麦角甾苷(Isoacteoside)、2-乙酰基麦角甾苷( 2′- acetylacteoside)等。许多研究结果表明, 苯乙醇苷类化合物具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、增强记忆及性机能等作用。由于PhGs分子含有多个酚羟基, 能够结合体内自由基, 避免其在体内的大量蓄积, 保护机体免受过量氧化损伤, 是抗氧化和抗衰老的主要成分[ 1] 。尽管肉苁蓉以复方形式多次出现在治疗男性少精、弱精疾病的中药配伍中[ 2] , 但就其所发挥作用的机理研究尚不全面。除去其可呈现出的雄性激素和促性腺激素样作用进而提高精子数量和活力的作用外[ 3] , 研究其抗氧化功效在治疗弱精、少精疾病中所做贡献还是新的尝试。本文以肉苁蓉提取物对大鼠精子体外膜功能氧化损伤的保护作用为题, 体外应用FeSO4 /H2O2 体系建立氧化应激损伤[ 4] , 探讨肉苁蓉抗氧化功效在治疗这类疾病中所发挥的作用。1　材料干燥德赢vwin登录 肉质茎(购自内蒙古中蒙医院)。电子天平PL2002, 自制色谱柱(1.5 cm×20 cm), 旋转蒸发仪(上海亚荣仪器厂), 大孔吸附树脂, 玻璃容器若干, 高速台式离心机, 水浴锅,二氧化碳细胞培养箱(SANYO), 酶标仪, 血球计数板。SOD试剂盒、MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所), 低渗膨胀液:柠檬酸钠0.735 g, 果糖1.351 g, 双蒸水100 ml。伊红Y溶液:伊红Y0.5 g, 溶于等渗生理盐水100 ml。雄性Wistar大鼠[ 购自内蒙古大学实验动物中心, 实验动物批号:SCXK(蒙)2002 0001] , 体质量(200 ±20)g。2　方法2.1　肉苁蓉苯乙醇苷的提取、分离[ 5] 取干燥的肉苁蓉30 g, 粉碎后过20目筛。加入8倍量70%乙醇, 以70℃提取, 提取两次,合并两次提取物。按图1操作后浓缩药液, 用聚乙烯微孔滤管过滤, 浓缩药液至相当于生药量0.5 g· ml-1, 冷藏保存。2.2　正常精子悬液制备[ 6] 取数只大鼠附睾, 置于温浴37℃PBS, 洗去毛发和血液, 转至有20 mlPBS的培养皿中, 剪开附睾头部, 待精子充分游离后, 将上清液用200目滤网过滤, 反复操作至上清液变清, 计数板计数, 用PBS调整细胞浓度为2 ×107个/ml。2.3　大鼠精子过氧化损伤模型的建立将精子悬液分为6 组:正常组为PBS缓冲液(pH 7.14);FeSO4 /H2O2组(FeSO4 终浓度0.02 mmol· L-1, H2O2终浓度1 mmol· L-1 );阳性药对照组为维生素C(终浓度为0.25 mg· ml-1 ) + FeSO4 /H2O2 (FeSO4终浓度0.02 mmol· L-1, H2O2 终浓度1 mmol· L-1);肉苁蓉小、中、大剂量组为肉苁蓉提取物(终浓度分别为0.025, 0.25, 0.5 g· ml-1 ) + FeSO4 /H2O2 (终浓度同模型组);各组样本置37 ℃,5%CO2 培养箱中孵育0.5h。2.4　总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力测定精子悬液孵育2 h,按试剂盒说明书操作, 用分光光度计测定。波长550 nm处比色,结果以每毫升酶单位表示。SOD活力单位为抑制反应50%的SOD量。SOD活力(U· ml-1) =(A对照- A样品) ÷ A对照÷ 50%×样品稀释倍数。2.5　丙二醛(MDA)含量测定精子悬液孵育2 h, 按试剂盒说明书操作, 用分光光度计测定。波长532 nm处比色。精子膜脂质过氧化损伤的程度以MDA的产量来表示(nmol/107 个精子)。MDA量(nmol/107 个精子) = (A样品- A空白) ÷(A标准- A空白)×对照品浓度(10 nmol· ml-1 )×样品稀释倍数。2.6　精子存活率测定精子悬液经温育30 min和90 min后分别取5 μl与等量的曙红-Y混匀, 室温下放置2 min, 加盖玻片,在明视野400 ×显微镜下15 min内观察, 死精子被染色呈粉红色, 活精子不被染色而胞质透明。每份标本计数200个精子计算存活率。2.7　精子低渗膨胀实验(HOS) 取低渗肿胀试剂1 ml, 37℃预温5 min, 分别加入处理过的精液100 μl混匀, 37℃水浴孵育30min, 取5 μl精子悬液于精子计数盘中, 计算200个精子中b-g型肿胀精子的百分率。3　结果3.1　肉苁蓉苯乙醇苷定性鉴定采用薄层层析法对肉苁蓉中PhGs定性分析, 正丁醇-乙酸-水(5∶ 4∶ 1)为展开剂, 展开晾干后, 喷以氯化铁-乙醇显色剂。PhGs含有酚羟基, 会与Fe3 +发生反应显紫色。测得Rf值0.24和0.78 较明显, 与文献松果菊柑和麦角甾苷0.23和0.73基本吻合。3.2　肉苁蓉PhGs对于大鼠精子氧化损伤后对精子存活率的影响精子悬液孵育30 min后各组的精子存活率由于实验条件的原因, 存活率均有降低。维生素C组和肉苁蓉提取物小、中、大剂量组的精子存活率显著高于模型组(P<0.001);30 min和90 min的精子活率, 0.025 g· ml-1肉苁蓉提取物组与维生素C组无明显差异, 0.25和0.5 g· ml-1肉苁蓉提取物组的精子存活率显著高于维生素C组(P<0.01或P<0.001);90 min后精子存活率进一步降低, 0.5 g· ml-1肉苁蓉提取物组的精子存活率保持在较高水平, 与正常组相比无显著差异(见表1)。3.3　对精子尾部低渗膨胀试验的影响低渗膨胀试验通过低渗溶液来检测精子尾部细胞膜的状况, 从而了解其运动机能的实验方法。g型精子尾部全部膨胀, 表示细胞膜无损, 机能良好。在精子低渗膨胀率试验中, 模型组显著低于正常组(P<0.001)。其中, 精子的总膨胀率(b-g型)[ 7, 8] :肉苁蓉提取物小剂量组与维生素C组相比无显著性差异, 中、大剂量组显著高于维生素C组(P<0.001), 甚至接近正常组;对于g型精子膨胀率影响, 0.025 g· ml-1肉苁蓉提取物组与维生素C组(0.25 mg·ml-1)相比无显著性差异, 但中、大剂量肉苁蓉提取物组显著优于维生素C组(P< 0.01)。见表2。3.4　肉苁蓉PhGs对于大鼠精子氧化损伤后T-SOD活力、MDA含量的影响精子悬液孵育0.5 h后, 模型组的T-SOD活力显著低于正常组(P<0.001), MDA量显著高于正常组(P<0.001);维生素C组和肉苁蓉提取物小、中、大剂量组的T-SOD活力明显高于正常组和模型组(P均<0.001), MDA量显著低于模型组(P<0.001)。对SOD活力和MDA量的影响, 0.025 g· ml-1的肉苁蓉提取物组与维生素C组(0.25 mg· ml-1 )之间无明显差异;0.25, 0.5 g· ml-1的肉苁蓉提取物组显著优于维生素C组(P< 0.05)。见表3。与维生素C组比较P< 0.001。而药物空白组中与正常组无显著性差异。4　讨论ROS包括氧离子, 自由基和超氧负离子, 是由精子和精子粒细胞产生并主要通过两种机制导致不育。第一, 它破坏精子细胞膜, 降低精子活力以及和卵子结合的能力;第二, ROS可以改变精子DNA, 导致缺陷的父系DNA作用于孕体。我们已知精子膜富含多聚不饱和脂肪酸, 在有氧条件下极不稳定, 易发生精子膜脂质过氧化(lipidperoxidation, LPO), 使膜的液态性、流动性及通透性发生改变, 造成精子膜的损伤, 甚至细胞死亡。MDA作为LPO反应的最终产物之一, 其含量可从一定程度上反映精子膜LPO损伤情况[ 9] 。SOD是精子所拥有的防御ROS的主要酶系。低渗膨胀试验:为WHO推荐的一种可供选择的检查精子存活力的补充试验方法。部分学者认为, 精子低渗膨胀实验可作为精子膜功能指标之一。本文应用FeSO4 /H2O2 体系产生ROS, 造成氧化应激损伤模型, 研究了肉苁蓉提取物对大鼠精子膜结构和功能氧化损伤的保护作用。结果表明, 在ROS的作用下大鼠精子膜结构和功能明显受到损伤, 精子悬液T-SOD活力显著降低, MDA含量显著增高, 精子膨胀率(总膨胀率、g型精子膨胀率)明显降低, 精子存活率显著下降, 与正常组相比差异极显著(P<0.001)。肉苁蓉提取物小、中、大剂量组(0.025, 0.25, 0.5 g· ml- 1)在相同的条件下均可提高精子悬液SOD活力, 降低MDA含量, 对ROS所致精子膜的氧化损伤均具有不同程度的干预作用, 对精子膜功能具有一定的保护作用。肉苁蓉提取物的作用呈剂量依赖性, 大剂量(0.5 g· ml- 1 )时对精子膜功能的保护作用最显著。肉苁蓉具有抗氧自由基活性, 对羟自由基及超氧阴离子自由基均有良好的清除作用。本实验结果显示, 适量肉苁蓉提取物能显著提高精子悬液SOD活力, 降低MDA含量, 抑制精子膜脂质过氧化反应, 发挥抗氧化作用, 对精子膜结构和功能具有明显的保护作用。这可能是在已有的可呈现出雄性激素和促性腺激素样作用外, 肉苁蓉在治疗弱精子症男性不育中所表现出的另一项新药理机制。参考文献:[ 1 ] 　MuteliefuGulinuer, LiuMingju, LuJingfen, etal.EffectofCistanosideCompoundsonOxidativeStressandImmunity[J] .JournalofChinesePharmaceuticalSciences,2001, 10 (3):157.[ 2 ] 　俞宜年.肉苁蓉治疗性功能障碍[ J] .中医药导报, 2008, 14(2):46.[ 3 ] 　何　伟, 舒小奋, 宗桂珍.肉苁蓉炮制前后补肾壮阳作用研究[ J] .中国中药杂志, 1996, 21(9):534.[ 4 ] 　谭迎春, 陈子江, 刘晓丹, 等.活性氧对精子功能的影响[ J] .山东医药, 2007, 47(29):63.[ 5 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摘要：目的　观察肉苁蓉苯乙醇苷预防给药对高原脑水肿模型大鼠的作用及可能的作用机制。方法　大鼠随机分为正常对照组，模型组，大花红景天口服液组[1.78 mL/（kg · d）]，肉苁蓉苯乙醇苷低、中、高剂量组[75、150、300 mg/（kg · d）]，每组12 只，灌胃预防给药10 d，第8 日起除正常对照组外其余各组置于模拟海拔5 000 m 高原环境72 h 建立高原脑水肿模型，观察各组大鼠脑组织病理改变，检测脑组织含水量、脑组织匀浆中白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）酶活力。结果　与正常对照组相比，模型组大鼠出现明显的脑水肿，脑组织含水量显著升高，脑匀浆液中IL-6、TNF-α、MDA 含量增高，SOD 和GSH-Px 酶活力显著降低。肉苁蓉苯乙醇苷能够改善高原脑水肿大鼠脑水肿病理改变，降低脑组织含水量，降低脑匀浆中IL-6 、TNF-α、MDA 含量，且能提高SOD 和GSH-Px 的酶活力。结论　肉苁蓉苯乙醇苷能够预防高原脑水肿的发生，可能与其抗炎、抗氧化应激有关。关键词：肉苁蓉；苯乙醇苷；高原脑水肿高原脑水肿（high-altitude cerebral edema，HACE）一般发生在初次进入海拔＞ 3 000 m 高原环境时，由于机体对高原低压低氧环境的不适应而导致的一种严重威胁生命的疾病，它与高原反应、高原肺水肿是急性高原病的3 种表现形式[1]。尽管关于HACE 的研究相比高原肺水肿较少，但相关研究表明氧化应激、炎症反应在HACE 发病中发挥了重要作用[2-3]。　　肉苁蓉苯乙醇苷（phenylethanoid glycosides from CistancheSalsa，PhGCs）是从新疆德赢vwin登录 中提取获得，相关研究成功分离得到了多种苯乙醇苷，主要包含松果菊苷和毛蕊花糖苷[4]。多年来对PhGCs 的药理作用研究表明其与抗高原病有效成分红景天苷具有相似的药理作用，具有抗缺氧、抗辐射、清除自由基等[5-7]。本实验利用西北地区特殊环境人工实验舱建立大鼠HACE模型[8-9]，PhGCs 预防给药，观察其对HACE 的预防作用及其可能的作用机制。1　材料1.1　动物　　实验动物Wistar 大鼠，SPF 级， 雌雄各半， 体重180 ～ 220 g [ 新疆医科大学实验动物中心，动物生产许可证号SCXK（新）2011-0004，动物使用许可证号为SYXK（新）2011-0004]。1.2　仪器　　西北特殊环境人工实验舱（贵州风雷航空军械有限责任公司，DY-2）；光学显微镜（日本Nikon 公司，E 200）；组织切片机（德国美康公司，HM 340 E）；电子天平（梅特勒- 托利多仪器有限公司，AL204，精度：0.1 mg）；酶标仪（美国Bio-RAD，XMark 7M）；紫外分光光度计（上海棱光技术有限公司，SpectrumLab22）；电热恒温干燥箱（湖北黄石市医疗器械有限公司，SKHG-01）。1.3　试药　　PhGCs（北京大学屠鹏飞教授提供，含量：90.70%，用蒸馏水配制成相应浓度的溶液）；大花红景天口服液（西藏藏药集团股份有限公司，批号：120503，规格：10 mL）； 肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α） 试剂盒（ 批号：ZJAGBZAB01）、白介素-6（interleukin-6，IL-6） 试剂盒（ 批号：ZIBIBZAB 02）（上海依科赛生物制品有限公司）；戊巴比妥钠（美国Amresco 公司， 批号：20110612）； 多聚甲醛（ 成都市科龙化工试剂厂，批号：20110901）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD） 试剂盒（ 批号：20130812）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒（批号：20130812）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathioneperoxidase，GSH-Px）试剂盒（批号：20130814）（南京建成生物工程研究所）；PBS 磷酸盐缓冲液粉剂（福州迈新生物技术开发有限公司，批号：13061716）。2　方法2.1　分组与用药　　Wistar 大鼠随机分为6 组：正常对照组、模型组、大花红景天口服液组（1.78 mL·kg － 1）、PhGCs 低剂量组（75 mg·kg － 1）、PhGCs 中剂量组（150 mg·kg － 1）、PhGCs 高剂量组（300 mg·kg － 1），每组12 只。各组均在SPF 环境饲养，正常对照组、模型组灌胃蒸馏水（1.0mL/100 g），其余各组按照相应剂量灌胃给药，连续给药10 d，第8 日除正常对照组外其余各组置于模拟海拔5 000 m 高原环境的人工实验舱中饲养72 h。舱内高度以10 m·s － 1 的速度匀速上升到海拨5 000 m 水平（大气压为54.1 kPa，氧分压为11.52 kPa），其间动物自由进水及进食，每24 h 开舱0.5 h 给药，添加饲料及饮水。2.2　动物处理　　各组大鼠出舱后立即腹腔注射戊巴比妥钠（2%，0.2mL/100 g）麻醉，腹主动脉取血，打开颅腔，取脑组织，取左脑上半部称重后锡箔纸包裹用于测定含水量，左脑下半部4% 多聚甲醛固定，用于HE 染色。右脑称重，加PBS 液制备10% 匀浆液，3 000 r·min － 1 离心10 min，分装上清液－ 80 ℃冰箱冻存，用于测定TNF-α、IL-6、SOD、MDA、GSH-Px。2.3　脑组织病理学观察　　脑组织放入4% 的多聚甲醛中充分固定后，脱水、包埋、切片、HE 染色，不同放大倍数下光学显微镜下观察病理改变，并拍摄图片。2.4　脑含水量测定及脑组织匀浆炎症及氧化应激相关指标的测定　　将锡箔纸包裹的脑组织，置烤箱（80 ℃，72 h）烤至恒重，称干重量，计算含水量：含水量＝（组织重量－组织干重量）/ 组织重量×100%。利用酶联免疫试剂盒测定TNF-α、IL-6 含量，紫外分光光度计测定MDA、SOD、GSH-Px，具体步骤按照说明书进行操作。2.5　统计学分析　　采用SPSS 16.0 软件进行分析，计量数据均采用x±s表示，数据先进行正态性检验，符合组间比较采用独立样本t 检验，不符合进行对数转换。检验水准为α ＝ 0.05。3　结果3.1　PhGCs 对HACE 大鼠脑组织病理改变的影响　　在光镜下观察各组大鼠脑组织病理切片可见，正常对照组脑组织分子层、外颗粒细胞层、椎体层细胞层、内颗粒细胞层、多行细胞层结构清楚，未发现病变。模型组大鼠脑组织毛细血管充血、水肿，分子层、椎体层细胞水肿明显。PhGCs 低剂量组大鼠脑组织分子层部分血管扩张充血水肿，细胞轻度水肿，水肿较模型组减轻；PhGCs 中剂量组大鼠脑组织部分脑膜下血管扩张充血，偶见细胞水肿，水肿较模型组明显减轻；PhGCs 高剂量组分子层无明显水肿，血管周围轻度水肿，水肿较模型组明显减轻。大花红景天组大鼠脑组织分子层散在水肿，散在血管极轻度水肿，水肿较模型组明显减轻。可知模型组大鼠脑组织明显水肿，模型成立。PhGCs、大花红景天可以降低HACE 模型大鼠脑水肿程度，结果见图1。3.2　PhGCs 对HACE 大鼠脑组织含水量的影响　　与正常对照组相比，模型组脑组织含水量升高，差异具有统计学意义（P ＜ 0.01），说明模型成立。PhGCs低、中、高剂量组和大花红景天组大鼠脑组织含水量与模型组相比均降低，差异具有统计学意义（P ＜ 0.01），PhGCs 各剂量组与大花红景天组脑组织含水量比较，差异无统计学意义，结果见表1。3.3　PhGCs 对HACE 大鼠脑组织TNF-α、IL-6 的影响　　与正常对照组比较，模型组大鼠脑组织匀浆液中TNF-α、IL-6 含量显著升高（P ＜ 0.01）。PhGCs 低、中、高剂量组和大花红景天组大鼠脑组织匀浆液中TNF-α、IL-6 含量低于模型组（P ＜ 0.05），差异有统计学意义。PhGCs 各剂量组与大花红景天组脑组织TNF-α、IL-6 含量比较差异无统计学意义，结果见表2。3.4　PhGCs 对HACE 大鼠脑组织氧化应激的影响　　与正常对照组比较，模型组大鼠脑组织SOD、GSHPx酶活力显著降低，MDA 含量显著升高（P ＜ 0.01）。PhGCs 低、中、高剂量组和大花红景天组大鼠脑组织SOD、GSH-Px 酶活力高于模型组，MDA含量低于模型组，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。PhGCs 各剂量组与大花红景天组大鼠脑组织SOD、GSH-Px 和MDA 含量比较差异无统计学意义，结果见表3。4　讨论　　近年来，国内关于中药防治高原病研究已取得了重大创新性成果，用于防治高原病具有自主知识产权的中药相继研发成功。如西藏军区研制的红景天胶囊，已获准军队特需药品批准文号，作为防治高原病的专用药品装备于高原边防部队。由青海、西藏地方药业公司推出的大花红景天口服液，获准国家中药品种正式批准文号，临床上适用于防治急、慢性高原病[10]。PhGCs 药理作用与红景天苷相似，所以我们选择了市场上在销售使用且有药准字号的大花红景天口服液作为了阳性对照药。　　大量研究[11-12] 证明在HACE 患者TNF-α、IL-6 水平升高，周其全等[13] 研究表明TNF-α 在改变血脑屏障通透性增高中起了重要作用，是高原环境下血脑屏障通透性增高的重要因素。TNF-α 在低氧血症时分泌增加，当TNF-α在血液中异常增多时，可损伤血管内皮细胞，造成血管内皮细胞形态改变、细胞膜及细胞器损害等，而且TNF-α还能作为一个细胞凋亡的胞内信号诱导血管内皮细胞凋亡，促使内皮素（endothelin，ET-1） 的产生而加重血管壁的损伤，并且有促进IL-6 分泌的作用[14]。　　低氧被认为是导致急性高原病发生的关键因素，低氧诱导的氧化应激反应在脑动脉高压和血管渗漏中发挥重要作用，局部的自由基参与引起血管损伤。脑血管损伤、液体漏出增多可引起脑水肿[15-16]。周其全等[17] 研究表明氧自由基在HACE 形成中起了重要作用，是高原环境下血脑屏障通透性增高的重要因素。低氧环境下，自由基和MDA 会显著升高，而抗氧化酶功能下调，因此抗氧化酶功能低下和脂质过氧化损伤增加可能在急性高原病发病中具有重要意义。MDA 由脂肪酸过氧化物分解产生，是生物系统中最常测量的脂质过氧化产物。体内抗氧化酶包括SOD、GSH-Px 等，它们或直接清除超氧自由基和过氧化氢，或转换为活跃较低的物质，从而发挥防御作用。所以我们检测了脑组织匀浆液中SOD、MDA、GSH-Px。　　在本次实验中，与正常对照组相比，HACE 模型组大鼠脑组织匀浆液中TNF-α、IL-6 量显著升高，SOD、GSH-Px 酶活力降低，而MDA 含量显著升高，说明低氧诱导大鼠氧化应激功能失调及炎症参与了HACE 的形成。PhGCs 预防给药后可以降低脑水肿模型大鼠脑组织的含水量，显著改善脑组织水肿病理改变，说明其具有预防HACE 发生的作用，PhGCs 可以提高低氧时大鼠脑组织SOD、GSH-Px 酶活力，降低脑组织中低氧引起的MDA 含量，PhGCs 预防给药组大鼠脑组织TNF-α、IL-6含量显著低于模型组，提示我们抗氧化应激和抗炎可能是PhGCs 防治高原病的作用机制之一。综合本实验结果来看，PhGCs 中剂量组效果略优于高剂量，但差异未见统计学意义。未见相关文献报道PhGCs 为肝药酶诱导剂，可排除药物诱导肝药酶活性增加而加速自身代谢的可能。推测可能的原因是随着药物浓度的增加，药物在体内的浓度超出了量效关系范围，在中剂量时体内受体已经全部占领，受体饱和，故未见高剂量效果继续增加，且药物为糖苷类，可能在胃内水解出糖，浓度过高黏度增加反而限制了药物的有效吸收。参考文献[1] John B. 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摘要：目的探讨肉苁蓉苯乙醇苷（Cistache deserticola phenylethanoid glycosides，CPhGs）对HepG2细胞增殖、凋亡的影响。方法实验以HepG2 细胞为研究对象，采用MTT 及平板克隆实验检测细胞增殖情况、Annexin V-FITC/PI、Hochest33258 和线粒体染色法分析细胞凋亡、流式细胞术分析细胞周期，免疫印迹法检测Bcl-2、Cleaved-Caspase3 及PARP 表达情况。结果CPhGs 可抑制HepG2 细胞增殖，IC50为187 μg/mL；平板克隆实验发现，CPhGs 中、高剂量组对HepG2 细胞有明显的抑制作用（P<0.01）。通过倒置显微镜、细胞核及线粒体染色发现，CPhGs 各组均可诱导HepG2 细胞发生凋亡。同时，Annexin V/PI 双染实验结果表明，CPhGs 各组均诱导HepG2 细胞发生早期凋亡（P<0.01），且呈现一定的剂量依赖性；CPhGs 各剂量组还可将HepG2 细胞周期阻滞在S 期（P<0.01）。Western-blot 结果显示，CPhGs 可诱到凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase3 及PARP 表达的增加，同时还可抑制抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达（P<0.01）。结论CPhGs 对HepG2 细胞具有一定的抑制增殖、诱导凋亡的作用，其机制可能与调控细胞周期、诱导细胞凋亡相关蛋白表达有关。关键词：肉苁蓉苯乙醇苷；HepG2 肝癌细胞；细胞增殖；细胞凋亡；细胞周期肝癌在全球都是严重的公共卫生问题。2018年，肝癌发病率在全球癌症发病率中排第6位，死亡率在全球癌症相关死亡率中排第2位，其中超过一半的新发病例和死亡病例在中国[1]。传统的肝癌治疗方法存在许多局限，与化疗药物相比，天然药物因具有温和、毒副作用小、无耐药性的特点，能有效改善患者症状，提高生活质量，延长肿瘤患者生存期等独特的优势而逐渐得到广泛研究与应用。肉苁蓉（Cistache deserticola）是我国传统的名贵补益类中药，自古就有“沙漠人参”的美誉。近年来，肉苁蓉以其显著的生物活性备受人们关注。其化学及药理作用研究显示，苯乙醇苷是肉苁蓉发挥药效的主要物质基础之一，它具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗菌和免疫调节等多种生物活性[2]。研究发现，其单体松果菊苷可通过降低氧化损伤、减轻肝脂肪病变来预防酒精引起的肝损伤[3]，而类叶升麻苷可有效预防肝细胞癌的发生[4]。已有研究发现类叶升麻苷可有效减缓酒精性肝损伤中的炎症反应[5]；此外，CPhGs、松果菊苷与毛蕊花糖苷均具有良好的抗纤维化作用[6-7]。因此，本实验旨在通过CPhGs调控HepG2肝癌细胞增殖、凋亡防治肝癌的实验研究进一步充实CPhGs在医药领域的应用。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 细胞株HepG2肝癌细胞株（货号：ZQ0022，上海中桥新舟生物科技有限公司）。1.1.2 药物与试剂肉苁蓉苯乙醇苷（CPhGs，含松果菊苷≥35%，毛蕊花糖苷≥16%；批号：20180502，win德赢官方 ）；MEM 不完全培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（批号：1928702）、谷氨酰胺（批号：1941832）、丙酮酸钠（批号：1916979）；双抗（青霉素与链霉素）、细胞凋亡试剂盒与细胞周期试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司）；四甲基偶氮唑盐MTT（批号：EZ5679C133）、二甲基亚砜（DMSO与Hoechst33258（美国Sigma公司）。1.1.3 仪器超净工作台与全管波长自动酶联免疫反应检验测试仪（美国Thermo Scientific公司）；CO2细胞培养箱（英国NEW BRUNSWICK Galaxy 系列）；CK-40 影型荧光倒置显微镜（日本Olympus 公司）；AEL-200型电子天平；TGL-16G 型台式低温高速离心机；低温离心机（美国Sigma公司）；数显恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）。1.2 方法1.2.1 细胞培养及分组HepG2肝癌细胞用MEM完全培养基（含10%FBS、1%双抗、1%谷氨酰胺、1%丙酮酸钠），在37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞长至对数生长期实验。实验分为4组：空白对照组（完全培养基）、CPhGs低、中、高剂量组（含不同浓度CPhGs的完全培养基），并使用相差倒置显微镜拍照，观察不同浓度CPhGs对HepG2细胞形态的影响。1.2.2 MTT 法检测HepG2 细胞增殖抑制的影响取对数生长期的HepG2细胞，调整细胞密度为3×104 个/孔，接种于96 孔细胞培养板中，待细胞贴壁后，分别加入含0、78、110、125、150、170、188、220、375、500μg/mL CPhGs的完全培养基培养24 h，加MTT溶液处理4 h，再加入DMSO避光孵育10 min，然后用酶标仪在490 nm处检测吸光度值（OD值）。计算细胞半数抑制率（IC50）并设置后续实验干预剂量。抑制率=（[ 空白对照组OD值－实验组OD值）/空白对照组OD值]×100%]。1.2.3 平板克隆实验观察CPhGs对HepG2肝癌细胞克隆率的影响取对数生长期的细胞，以2000 个/孔的细胞密度均匀的铺至六孔板中，细胞贴壁后，换含不同浓度的CPhGs完全培养基培养。7 d后，弃上清，PBS洗涤2次，加入1 mL 4%组织固定液固定30 min。30 min后，弃去组织固定液，加入1 mL结晶紫，染色30 min，然后再用PBS洗涤细胞2次，室温晾干拍照。1.2.4 倒置显微镜拍照观察CPhGs对HepG2细胞形态学的影响取对数生长期的HepG2细胞，以1×105个/mL的细胞密度接种于6 孔细胞培养板中，分别加入含0、32、64、128 μg/mL CPhGs 的完全培养基培养24 h 后，在倒置显微镜下拍照观察细胞形态变化情况。1.2.5 Hoechest33258检测CPhGs对HepG2细胞核的影响取对数生长期的HepG2 细胞，以1×105 个/mL的细胞密度接种至4分格玻底皿中，细胞分组处理同“1.2.4”实验。待细胞处理24 h 后，收集细胞用Hoechst33258稀释液染色15 min，然后在激光共聚焦显微镜下观察细胞核损伤情况。1.2.6 线粒体染色检测CPhGs对HepG2细胞线粒体的影响取对数生长期的HepG2细胞，以1×105 个/mL的细胞密度接种至4分格玻底皿中，细胞分组处理同“1.2.4”实验。待细胞处理24 h后，收集细胞用线粒体染剂染色15 min，然后在激光共聚焦显微镜下观察细胞线粒体损伤的发生情况。1.2.7 AnnexinV-FITC1PI 双染法观察CPhGs 对HepG2细胞凋亡率的影响取对数生长期的HepG2细胞，以1×105 个/mL的细胞密度接种于6 孔细胞培养板中，分别加入含0、32、64、128 μg/mL CPhGs的完全培养基培养24 h后，收集细胞根据凋亡试剂盒说明逐步处理细胞，然后用流式细胞仪检测细胞凋亡率。1.2.8 流式细胞术检测CPhGs对HepG2细胞周期的影响HepG2细胞按“1.2.4”步骤接种至6 孔板中，细胞分组处理同“1.2.4”实验。待细胞处理24 h后，收集细胞用预冷的75%乙醇中固定过夜，次日洗涤并收集细胞，按试剂盒说明书逐步处理细胞，然后采用流式细胞仪检测细胞周期。1.2.9 Western-blot检测不同浓度CPhGs对HepG2细胞凋亡蛋白Bcl-2、Cleaved⁃Caspase3及PARP表达的影响HepG2细胞按“1.2.4”步骤接种至6孔板中，细胞分组处理同“1.2.4”实验。待细胞处理24 h后，收集蛋白进行定量并使蛋白变性。根据目的蛋白分子量大小配置12%、10% 的分离胶及5% 的浓缩胶，每个样品按等质量上样，恒压电泳，恒流转膜，5%的脱脂牛奶室温封闭2 h，4 ℃孵育一抗过夜，室温孵育二抗1 h，曝光拍照，并用image J进行条带灰度值分析。1.3 统计学分析采用SPSS21.0统计软件进行统计分析，多样本均数比较采用方差分析，结果以均数±标准差（-x±s）表示，两两比较采用LSD 法，检验水准α =0.05。2 结果2.1 CPhGs 对HepG2 细胞的增殖抑制作用随着CPhGs药物浓度的增加，CPhGs对HepG2细胞的抑制逐渐增加，当CPhGs药物浓度为500 μg/mL时，抑制率为（82±2.3）%，经过probit分析，CPhGs对HepG2细胞的IC50 为187 μg/mL，见图1。在24、48、72 h 干预后，与空白对照组比较，CPhGs各剂量组OD值均显著降低，抑制率均显著增高，且差异均有统计学意义（P<0.01）；干预24 h后，CPhGs对HepG2细胞的增殖抑制具有一定的剂量依赖性（P<0.01）。同时，比较CPhGs各剂量组在3个时间段的抑制率发现，CPhGs中、高剂量组，3个时间段HepG2细胞抑制率差异均有统计学意义（P<0.01）。见表1。2.2 不同浓度CPhGs 对HepG2 肝癌细胞克隆率的影响随着CPhGs药物浓度的增加，细胞克隆形成能力逐渐降低，当CPhGs 为64 μg/m 与128 μg/mL 时，HepG2肝癌细胞的克隆形成能力降低为对照组的7%与1%（P<0.01），见图2。2.3 从形态学观察不同浓度CPhGs 对HepG2 细胞凋亡的影响在不同浓度CPhGs处理组中，HepG2细胞随着药物浓度增高，细胞形态发生改变，细胞出现空泡，细胞折光度下降，细胞密度降低，细胞间连接疏松，细胞轮廓发生改变。CPhGs各剂量组干预24 h后，细胞核出现染色质浓缩、核碎裂、核边集的细胞凋亡现象，并且细胞核发出的蓝色强光较空白对照组强。线粒体染色发现，CPhGs各剂量组细胞发生线粒体肿胀、碎片化、数量以及荧光强度都发生改变，且随着CPhGs剂量的增加，线粒体损伤特征也越来越明显。此外，还可以看出，CPhGs高剂量组的细胞数量下降明显，细胞皱缩。除了细胞核与线粒体发生明显改变外，细胞边界不清，处于即将崩裂、死亡的状态。2.4 不同浓度CPhGs 对HepG2 细胞凋亡率的影响CPhGs各剂量组（32、64、128 μg/mL）作用HepG2细胞24 h 后，各组细胞均发生了细胞凋亡，且随着CPhGs浓度增加而增加：空白组凋亡率（早期＋晚期）为（7＋1.18）%，CPhGs 低剂量组凋亡率为（11.2＋0.1）%，CPhGs 中剂量组凋亡率为（19.5＋2.94）%，CPhGs高剂量组凋亡率为（69.3＋3.35）%。与空白对照组比较，CPhGs中、高剂量组的早期凋亡率与总凋亡率均增高，差异有统计学意义（P<0.01），且呈现一定的剂量依赖性（P<0.01）。见图4。2.5 不同浓度CPhGs 对HepG2 细胞周期的影响G1期与G2/M期细胞比例，与空白对照组比较，CPhGs各剂量组均出现显著降低（P<0.01）；而S期细胞比例，与空白对照组比较，GPhGs各剂量组均出现明显增加（P<0.01）。此外，CPhGs 各剂量组之间比较，差异也具有统计学意义（P<0.01）。见表2，图5。2.6 不同浓度CPhGs 对HepG2 细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Cleaved - Caspase3 及PARP 表达的影响CPhGs各剂量组凋亡蛋白Cleaved⁃Caspase3表达均增加，与空白对照组比，差异有统计学意义（P<0.01），且各剂量组之间比较，差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。CPhGs 中、高剂量组凋亡蛋白PARP表达增加，抗凋亡蛋白Bcl-2 表达降低，与空白组比较，差异有统计学意义（P<0.01 或P<0.05）；且各剂量组之间比较，差异有统计学意义（P<0.01 或P<0.05）。见图6。3 讨论细胞凋亡作为一种潜在的抗癌机制，一直受到研究人员的密切关注。大量证据表明，细胞凋亡是肿瘤发展与治疗的重要机制[8-9]。本实验发现，CPhGs可抑制HepG2肝癌细胞增殖、诱导HepG2细胞发生凋亡，同时还能将细胞周期阻滞在S期。众所周知，真核生物通过无限的有丝分裂进行生长增殖，因此，就形成了有规律细胞周期，细胞周期分成G1 期、S期、G2期及M期4个阶段。研究表明，S期阻滞是诱导凋亡的潜在机制[10]，例如：抗坏血酸可诱导肠道细胞S期的DNA损伤，从而激活下游凋亡相关蛋白引发细胞凋亡[11]。槐定碱可通过阻滞S期激活JNK与ERK通路，诱导胰腺癌细胞凋亡[12]。尽管，真核生物有丝分裂及DNA复制取得很多进展，但在DNA损伤或细胞周期阻滞触发细胞死亡的事件还有待进一步研究。免疫印迹实验结果显示，CPhGs可通过下调Bcl-2，上调Cleaved⁃Caspase3 及PARP 凋亡蛋白来诱导HepG2细胞凋亡。B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）基因家族成员在调节细胞程序性死亡中起着核心作用，Bcl-2蛋白的增加可抑制细胞凋亡的发生，因此它的降低也可理解为促凋亡[13]。凋亡蛋白Cleaved⁃Caspase3是内在线粒体凋亡途径与外在死亡受体途径的交汇点，是凋亡的主要执行者[14]，在凋亡启动时剪切其底物聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）从而引发凋亡的发生，变构的PARP又可激发其他Caspase家族蛋白水解，以确保凋亡的顺利进行[15]。有研究表明，Cleaved⁃Caspase3 可作为癌症治疗的早期监测指标[16]，而在本实验中，CPhGs 各剂量组均能促进HepG2 细胞发生早期凋亡，Hochest33258 染色发现CPhGs低剂量组即可见轻微的细胞凋亡现象。细胞凋亡是一种依赖蛋白酶的级联反应，它主要存在两种相互交错的途径：外在死亡受体途径和内在线粒体途径[17]，此外，还包含一些非经典途径，这些细胞凋亡途径大都依赖Caspase 介导的级联反应。确定CPhGs诱导的细胞凋亡方式还需通过其他实验进行综合判断。目前，天然药物与肿瘤治疗的相关研究颇多，机制也复杂多样。因此，深入探讨CPhGs 抑制HepG2细胞增殖、诱导HepG2细胞凋亡的具体分子学机制尤为重要，这为探讨防治肝癌的分子机制及肉苁蓉药物抗肝癌的研发提供一定的实验依据，也为新疆德赢vwin登录 药物的开发提供研究基础。参考文献：[1] MATTIUZZI C, LIPPI G. 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　摘要　目的:探讨肉苁蓉苯乙醇苷对D-半乳糖致衰老模型小鼠的抗衰老作用。方法:以维生素E为阳性对照,用高、低剂量的肉苁蓉苯乙醇苷对D-半乳糖致衰老模型小鼠进行灌胃, 4 周后分别检测学习和记忆能力、SOD活性、MDA含量以及脏器系数。结果:与模型组比较, 苯乙醇苷组小鼠的学习和记忆的错误次数降低, 学习反应期缩短, 记忆潜伏期延长。苯乙醇苷显著提高小鼠血清、脑SOD活力(P<0.01), 降低肝脏、血清MDA活力。苯乙醇苷组小鼠的脾脏系数显著升高(P<0.05), 胸腺系数变化不明显。结论:肉苁蓉苯乙醇苷具有提高学习记忆能力、抗氧化和提高机体免疫力的作用。关键词　肉苁蓉;苯乙醇苷;SOD;衰老　肉苁蓉(CistanchedeserticolaY.CMa)属于寄生植物, 全世界约有二十种, 生长在我国的有盐生肉苁蓉、德赢vwin登录 、沙苁蓉、兰州肉苁蓉、迷肉苁蓉六个种及一变种白花盐苁[ 1] , 主要生长在我国沙漠地带, 被誉为“沙漠人参” , 是一种名贵中药, 为我国二级保护植物。肉苁蓉入药始载于《神农本草经》, 列为上品, 具有补肾壮阳、填精补髓、养血润燥、悦色延年等功效, 主治男子阳痿、女子不孕、带下、血崩、腰膝冷痛、血枯便秘等症。苯乙醇苷类化合物(Phenylethanoidglycosides,PEG)是肉苁蓉的主要活性成分之一, 是一类含有羟基、甲氧基取代苯乙基和羟基、甲氧基取代肉桂酰基的化合物, 通常以β-葡萄糖为母核的含有酯键及氧苷键的天然糖苷, 广泛存在于双子叶植物中[ 2] 。苯乙醇苷类化合物主要由咖啡酸、苯乙醇苷元和糖三部分组成, 包括海胆苷(Echinacoside)、麦角甾苷(Acteoside)、异麦角甾苷(Isoacteoside)、2-乙酰基麦角甾苷(2′-acetylacteoside)等[ 3] 。许多研究结果表明, 苯乙醇苷类化合物具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、增强记忆及性机能等作用。1　实验材料1.1 　实验动物　清洁级ICR种小鼠50只, 体重18～ 22 g, 雌雄各半。扬州大学比较医学中心提供, 合格证号:SCXK(苏)2007-0001。1.2　药物与试剂　苯乙醇苷为自制盐生肉苁蓉提取物, 浓度为36mg/ml;维生素E由上海源穹生物科技有限公司生产, 批号:050116;D-半乳糖(D-Galactose),含量:大于99.0%, 规格:100g/瓶, 批号:7H307HC0, 南京生兴生物技术有限公司提供(Sunshine),临用前生理盐水配制;考马斯亮兰(批号:20071015 )、丙二醛(MDA)试剂盒(批号:20071016)、超氧化物岐化酶(SOD)试剂盒(批号:20071012), 均由南京建成生物工程研究所提供。1.3　实验仪器　TECAN Safire2 微孔板测读仪(SafireII, 瑞士TECAN生产);电热恒温水浴(HH-4, 国华电器有限公司);电子分析天平(BS2105, 北京赛多利斯天平有限公司);涡旋仪(XW-80A, 上海医科大学仪器厂);台式离心机(TDL89-2B, 上海安亭科学仪器厂);高速台式冷冻离心机(TGL-16M,长沙湘仪离心机仪器有限公司);组织分散器(型号:T25, 德国IKA生产);跳台装置(STT-2, 医科院药物研究所)2　实验方法2.1　动物模型与分组　ICR小鼠随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组、苯乙醇苷高、低剂量组,每组10 只。苯乙醇苷高、低剂量组分别给予100、50 mg/kg苯乙醇苷, 阳性对照组给予100 mg/ml维生素E, 空白对照组和模型组给予等体积的空白溶媒;模型组、阳性对照组和各给药组皮下注射D-半乳糖250 mg/kg[ 4] ;空白对照组皮下注射等体积的生理盐水;连续4周, 最后1 d注射D-半乳糖2h后,进行学习记忆训练实验, 次日测定记忆成绩。最后处死, 测定各项衰老指标。2.2　D-半乳糖衰老模型小鼠学习、记忆能力的测定　将动物放入跳台箱内适应3 min后, 立即通36V交流电。动物受电击后的正常反应是跳回平台躲避伤害性刺激, 记录通电后其跳至安全台上的潜伏期, 并记录5 min内的触电次数(错误次数), 以此作为学习成绩;24 h后再进行测试, 以考察小鼠的记忆保持。2.3　测定对衰老模型小鼠体重及免疫器官重量的影响　每周称量实验动物体重2次, 经处死后称量胸腺、脾脏重量, 计算其脏器系数。2.4　实验动物肝、脑组织和血中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量测定　实验动物摘眼球取血(不少于0.5 ml)放入肝素抗凝的试管中, 以3000 r/min离心15 min, 分离血清, 置-20℃冻存待测。取血后立即将实验动物断头处死, 取出肝脏和全脑, 分别用预冷的4℃生理盐水冲净表面残血, 用滤纸吸干水分, 称重并用预冷的生理盐水制备成10%的肝匀浆和5%的脑匀浆, 3000 r/min离心15min, 取上清液-20℃冻存待测。采用考马斯亮兰法测定组织匀浆的蛋白含量, 用试剂盒检测血清、脑和肝脏中MDA和SOD的含量。2.5　统计学处理　实验数据以均数 x±s表示, 采用SAS软件进行方差分析。3　实验结果3.1　苯乙醇苷对衰老模型小鼠学习记忆能力的影响　实验结果如表1所示, 苯乙醇苷组的学习和记忆的错误次数减少, 学习反应期缩短, 记忆潜伏期延长, 但其改变无统计学意义。表明苯乙醇苷对模型小鼠的学习记忆能力有一定的改善作用, 但其作用并不明显。3.2　苯乙醇苷对衰老模型小鼠血清、脑组织中SOD活性的影响　结果如表2所示, 表明苯乙醇苷具有提高衰老模型小鼠血清、脑组织中SOD活性的作用(P<0.01)。3.3　苯乙醇苷对衰老模型小鼠血清、肝组织中的MDA含量的影响　结果如表2所示, 表明苯乙醇苷具有一定抑制衰老模型小鼠的MDA活力增加的作用, 但其作用并不明显。3.4　苯乙醇苷对衰老模型小鼠体重及胸腺、脾脏脏器系数的影响　结果如表3所示, 与模型组比较,苯乙醇苷高、低剂量组的胸腺脏器系数高于模型组,但其用不明显;脾脏系数均显著升高(P<0.05)。表明苯乙醇苷可能具有提高免疫能力的作用。4　讨论据统计, 肉苁蓉在历代增力配方中出现率居首位, 滋补配方中次位(仅次于人参)[ 1] 。随着国内外研究的逐渐深入, 其越来越多的药理作用被发现, 据文献报道, 肉苁蓉具有抗氧化、免疫调节、改善记忆、抗肝炎、抗辐射、抗肿瘤、通便及雄性激素样作用等重要的药理作用。本实验对肉苁蓉苯乙醇苷类的小鼠衰老模型的体内生物功效性进行了研究, 结果显示, 与模型组比较, 苯乙醇苷高、低剂量组的学习、记忆能力指标变化虽然并不具有统计学意义, 但从数据上可见苯乙醇苷组学习和记忆的错误次数降低, 学习反应期缩短, 记忆潜伏期延长, 说明苯乙醇苷对衰老模型小鼠学习记忆能力的有一定的改善作用, 统计学上不显著的原因可能是实验时间较短所致。近年的研究认为衰老与自由基引起的生物膜脂质过氧化有密切相关。SOD是一种能够清除超氧化物自由基的酶, 但随着年龄的增加, 机体SOD活性减弱, 抗氧化物质减少, 自由基损伤因素(OFRMDA)增加[ 5、6] , 将导致衰老。本研究发现, 苯乙醇苷能显著抑制血清、脑SOD活力的降低, 对降低肝脏、血清MDA含量亦有一定作用, 说明苯乙醇苷可通过增强机体抗氧化能力而抗衰老, 其机理可能与苯乙醇苷的自由基清除作用有关。另外, 对衰老模型小鼠体重及胸腺、脾脏脏器系数的研究结果表明,与模型组比较, 苯乙醇苷高剂量组的脾脏系数显著升高, 从另一侧面反映了苯乙醇苷可通过提高机体免疫功能延缓衰老。本研究发现苯乙醇苷具有提高机体抗氧化酶活力及学习记忆能力, 能在一定程度上延缓注射D-半乳糖引起的小鼠体内的拟衰老变化。但同时也观察到一些尚未明了的现象, 如学习记忆能力及MDA含量方面的研究数据虽然有一定趋势, 但还其差异尚不具备统计学意义等, 故苯乙醇苷的具体抗衰老作用机制尚需进一步深入研究。参考文献[ 1] 成喜雨, 郭斌, 倪文.肉苁蓉研究进展.天然产物研究与开发, 2005, 17(2):235-241.[ 2] 靖会, 佐建锋, 李教社.苯乙醇苷类化合物的药理研究进展.时珍国医国药, 2006, 17(3):440-441.[ 3] 宋志宏, 屠鹏飞, 赵玉英.德赢vwin登录 的苯乙醇苷成分.中草药, 2000, 31(11):808-810.[ 4] 王少康, 孙桂菊, 张建新, 等.亚急性衰老动物模型的建立及评价.东南大学学报(医学版), 2002, 21(3):217-220.[ 5] 朱汉民, 王赞舜.衰老机理研究中的超氧化物歧化酶.国外医学· 老年学分册, 1985, (2):49-52.[ 6] 吴伟康.增龄对小鼠心肌氧自由基浓度、超氧化物歧化酶活性及丙二醛含量的影响.中国老年医学杂志,1994, 14(4):221-224.

摘要: 为研究肉苁蓉苯乙醇苷对阿尔茨海默病模型小鼠海马β 淀粉样蛋白表达的影响。实验选用6 月龄APP/PS1双转基因AD 模型小鼠60 只，随机分为模型组、多奈哌齐组( 0． 65 mg /kg) 、肉苁蓉苯乙醇总苷剂量组( 250， 125， 62． 5mg /kg) 、肉苁蓉毛蕊花糖苷组( 125 mg /kg) ，正常组为同窝非转基因小鼠10 只，分别给予药物和蒸馏水灌胃3 个月，于9 月龄时通过Morris 水迷宫法检测行为学改变，采用HE 染色法观察小鼠脑部海马病变，采用免疫组化法和Western-blot 法考察海马Aβ1-42和Aβ1-40蛋白表达。实验结果发现肉苁蓉苯乙醇苷明显改善小鼠学习与记忆能力和脑部海马神经元的损伤，减少Aβ1-42、Aβ1-40阳性细胞数，并下调蛋白表达。肉苁蓉苯乙醇苷通过下调小鼠海马脑区Aβ1-42、Aβ1-40蛋白表达，从而影响Aβ 级联反应以保护神经元，发挥拮抗AD 作用。本研究明确了苯乙醇苷是肉苁蓉发挥抗AD 活性的主要药效物质基础，为后续将其开发为抗AD 新药提供了理论支撑。关键词: 肉苁蓉; 苯乙醇苷; 阿尔茨海默病; APP/PS1 双转基因小鼠; β 淀粉样蛋白阿尔茨海默病( Alzheimer disease，AD) 是一种以进行性记忆减退、认知功能障碍为主要临床特征的中枢神经系统退行性疾病［1-3］。目前较为公认的β 淀粉样蛋白( Aβ) 级联反应假说认为，生理状态下的正常代谢产物Aβ1-42和Aβ1-40单体本无神经毒性，但当其遇到APP 外源介质影响导致异常沉积后，积聚的Aβ1-42形成可溶性Aβ 寡聚体( ADDLs) ，阻止单体产生保护活性从而引起神经元变性、突触丢失和轴突损伤，最终引发脑内神经元凋亡致痴呆，因此考察其关键靶标Aβ1-42和Aβ1-40蛋白在脑内表达情况对于肉苁蓉苯乙醇苷防治的AD 研究具有重要的意义［4-7］。同时，研究AD 动物模型脑内特征性病变部位海马各分区的组织病理学检测可从宏观上真实反映药物对其脑内病变部位的改善情况［8-10］。我国传统中医药认为补肾益精类中药肉苁蓉具有抗老防衰、改善记忆的功效［11-14］。大量前期研究已证实，肉苁蓉苯乙醇总苷及苯乙醇苷代表性单体-毛蕊花糖苷在传统方法构建的AD 在体或离体模型中均表现出明显的拮抗AD 作用，具有一定的防治神经退行性疾病的潜能［15-20］。但未见肉苁蓉苯乙醇苷应用APP /PS1 双转基因模型从β 淀粉样蛋白角度开展防治AD 作用研究。综上所述，本研究基于AD 发病机制研究中经典假说—Aβ 级联反应假说，借助理想、可靠的AD动物模型APP /PS1 双转基因小鼠作为体内研究平台，采用Morris 水迷宫、HE 染色法、Western-blot、免疫组化等先进技术手段，从动物行为学、组织病理学角度、分子生物学层面考察肉苁蓉苯乙醇苷对APP /PS1 双转基因小鼠脑部海马区β 淀粉样蛋白表达的影响，以期寻找AD 防治新靶点，为肉苁蓉苯乙醇苷防治AD 具体作用机制的研究提供参考依据。1 试药与仪器1． 1 试药肉苁蓉苯乙醇总苷( 课题组自制，苯乙醇总苷含量达87． 6%) ; 毛蕊花糖苷( 批号111530-200505，中检所) ; 二氧化钛( 批号20161025，上海染料研究所有限公司) ; HE 染色试剂盒( 批号20160902，凯基生物公司) ; 中性树胶( 批号20161208，上海懿详公司) ; SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒( 批号1043721，北京索莱宝公司) ; BCA 蛋白定量试剂盒( 批号20150323，南京凯基生物公司) ; Aβ1-40( 批号20161012，美国CST 公司) ; Aβ1-42( 批号20161014，美国CST 公司) ; β-actin( 批号20161012，美国CST公司) ; 碱磷酶标记兔抗山羊IgG ( H + L) ( 批号20162308，北京中杉金桥公司) ; 4 × 蛋白上样缓冲液含β-巯基乙醇( 批号2010662，北京索莱宝公司) ; 10× TBST( 批号20160611，北京索莱宝公司; PVDF 膜( 批号03010040001，瑞士罗氏公司) ; SDS ( 批号20160930，北京索莱宝公司) ; Tris ( 批号WXBB4339V，美国VETEC 公司) ; 甘氨酸( 批号GB10466，北京索莱宝公司) ; 脱脂奶粉( 批号WB20361，美国BD 公司) ; BCIP /NBT Kit( 美国invitrogen公司) ; 二抗( 批号15922207，北京中杉金桥公司) ; 吐温20( 批号WXＲC6526N，美国VETEC 公司) 。1． 2 动物6 月龄APP /PS1 双转基因AD 模型小鼠60 只及同窝阴性小鼠10 只，雌雄对半，体质量20 ± 10 g，中国江苏南京模式动物研究所，许可证号［SCXK( 苏) 2015-0001］，实验过程中动物自由摄食和饮水。1． 3 仪器MT-100 Morris 水迷宫( 成都泰盟科技有限公司) ; 凝胶成像仪( 美国BIO-ＲAD 公司) ; ＲM2016 病理切片机( 德国Leica 公司) ; SIM-F124 型制冰机( 日本SANYO 公司) ; 凝胶电泳及转膜设备( 美国BIO-ＲAD 公司) ; 全波长酶标仪( 美国Thermo Scientific公司) ; CO2恒温培养箱( 美国Thermo 公司) ; 4°C 和-20°C 冰箱( 青岛海尔公司) ; 67120 超纯水仪( 美国Millipore 公司) ; TP-114 电子天平( 北京Sartorius公司) ; 低温冷冻高速离心机( 美国Thermo Scientific公司) ; DVKW-D-2 数显电热恒温水浴锅( 北京市永光明医疗仪器厂) ; 超声波细胞破碎仪( 宁波新芝公司) ; WD-9405A 型脱色摇床( 北京六一仪器厂) ; 可调式恒压恒流电源( 美国BIO-ＲAD 公司) ;DM4000 荧光倒置显微镜( 德国Leica 公司) 。2 方法2． 1 动物分组与给药依据SPSS18． 0 统计软件产生的随机数字，将AD 模型小鼠随机分为模型组、多奈哌齐组( 每日灌胃剂量为0． 65 mg /kg) 、肉苁蓉苯乙醇总苷( PhGs)高、中、低剂量组( 每日灌胃剂量分别为250、125、62． 5 mg /kg) 、肉苁蓉毛蕊花糖苷干预组( 125 mg /kg) ，每组10 只。于6 月龄时开始对小鼠按组别实施灌胃治疗，连续3 个月，每日灌胃1 次。正常组为同窝非转基因小鼠，模型组和正常组给予等体积蒸馏水灌胃。2． 2 Morris 水迷宫实验采用经典的Morris 水迷宫测试小鼠空间学习及记忆能力。第1、2 天训练小鼠熟悉平台位置，练习寻找平台，第3 ～ 5 天进行正式测试，观察各组小鼠训练后寻找平台的情况，第6 天撤去平台，观察小鼠的游泳轨迹。实验过程中，摄像头会同步记录小鼠寻找平台花费时间( 即逃避潜伏期) 及游泳轨迹的距离。若小鼠在设定的时间范围内未找到平台( 一般设定为60 s 或120 s，本实验采用60 s) ，则将该小鼠的逃避潜伏期记为设定值，且由工作人员将其置于平台上停留数秒( 本实验釆用10 s) ，助其加深平台记忆。实验结束后，记录小鼠从入水开始直至找到平台的游泳时间。在实验的最后一天，撤去平台，设定时间内需要记录的内容主要有小鼠穿越平台次数、目标象限的停留时间等，分析每个实验动物的搜索策略。2． 3 脑组织取材及石蜡包埋给药结束后称重小鼠，使用10% 水合氯醛麻醉小鼠。将麻醉后的小鼠仰放在操作台上固定四肢。4%多聚甲醛内灌注固定后处死动物，剔除小脑等多余的脑组织，沿大脑半球末尾，除去整个小脑和大脑中部冠状面前半部分。4%多聚甲醛中固定24 h，超纯水清洗10 分钟后依次放入30% 乙醇( 1 h) →40%乙醇( 1 h) →50% 乙醇( 1 h) →75% 乙醇( 1 h)→90%乙醇( 1 h) →95%乙醇( 1 h) →无水乙醇I( 1h) →无水乙醇II( 1 h) →二甲苯I( 15 min) →二甲苯II( 15 min) 。浸入石蜡2 h，组织包埋后在小鼠脑部海马CA1 区连续冠状切片。于60 ℃烘箱内干燥48h 后常温保存。2． 4 HE 染色将每组选取的切片于60 ° C 烘箱内烤片40min，然后依次将其放入二甲苯I( 5 min) →二甲苯II( 10 min) →无水乙醇( 5 s) →95% 乙醇I ( 5 s) →95%乙醇II( 5 s) →80%乙醇( 5 s) →蒸馏水冲洗多次，使用HE 染色试剂盒染色后中性树胶封片。2． 5 免疫组织化学染色将制备完成的切片按照脱蜡、抗原修复、阻断内源性过氧化氢酶、血清封闭、一抗孵育、二抗孵育、DAB 显色、脱水、封片的标准步骤进行免疫组化染色。每组选取适宜6 张切片，电镜下观察神经元细胞形态、着色，使用Image J 软件计数海马阳性细胞数值。2． 6 Western blot 分析蛋白表达情况吸取组织上清液按照BCA 蛋白定量法测定从脑组织海马中提取的蛋白含量。与4 × 蛋白上样缓冲液按照4: 1 的比例混匀， 95 °C 加热10 min，自然冷却后于-20 °C 冰箱内保存。制备SDS-PAGE 凝胶，加入电泳液后依次加入正常组、药物干预组等各组蛋白，两侧胶孔加入蛋白Marker。冰浴盒中电泳至分离胶底部终止电泳。转膜液平衡后依据胶大小剪取PVDF 膜、滤纸。在转膜夹中按照黑色纤维垫→3 层滤纸→凝胶→PVDF 膜→3 层滤纸→黑色纤维垫组装，清除气泡后80 V 恒压转膜。转膜完成后脱脂牛奶封闭2 h。稀释抗体加入对应膜中孵育过夜。二抗孵育2 h 后加入BCIP /NBT 显色液直至显色。BIO-ＲAD 凝胶成像仪采图。用Image J 软件定量分析目的蛋白条带，以IOD 表示蛋白条带的相对强弱。结果以目的蛋白与对照蛋白β-actin 的积分光密度值的比值表示。结果以( 目标蛋白ID/内参ID) × 100%表示。2． 7 数据统计学分析采用SPSS18． 0 进行数据的统计分析，数据以( 珋x ± s ) 表示，组间数据比较采用单因素方差分析( One-Way ANOVA) 检验分析，数据间的多重比较采用LSD-t 检验( least significant difference，LSD) ，以P＜ 0． 05 或P ＜ 0． 01 表示差异有统计学意义。3 实验结果3． 1 Morris 水迷宫检测结果随着训练时间的不断增加，各组小鼠到达平台的时间( 逃避潜伏期) 明显缩短。第1，2 天为训练时间，第3 天模型组与正常对照组小鼠相比逃避潜伏期显著延长( P ＜ 0． 01) ; 第4 天、第5 天模型组小鼠逃避潜伏期与正常对照组小鼠相比明显延长( P＜ 0． 05) ; 第3 天多奈哌齐组小鼠逃避潜伏期与模型组相比显著缩短( P ＜ 0． 05) ; 与模型组相比，肉苁蓉苯乙醇总苷各剂量组、毛蕊花糖苷组随着剂量的增加，小鼠逃避潜伏期明显缩短，具有显著差异( P ＜0． 05) ( 见表1) 。水迷宫实验第6 天撤去平台进行空间探索实验，记录60 s 内各组小鼠穿越平台位置的次数。由结果可得，模型组小鼠在设定时间内穿越平台次数与正常组小鼠相比显著减少( P ＜ 0． 01) ; 与模型组相比，肉苁蓉苯乙醇总苷各剂量组及毛蕊花糖苷组穿越平台次数明显增加( P ＜ 0． 05) ，具有显著性差异( 见表2) 。上述研究结果均暗示肉苁蓉苯乙醇苷可以显著改善APP /PS1 双转基因AD 小鼠的学习记忆能力，并且具有一定的剂量依赖性。3． 2 病理组织染色观察结果结果可知，正常组海马CA1 区神经元细胞排列整齐紧密，分布较为均匀，层次清晰，椎体细胞核较大且性状近似圆形。而模型组小鼠海马CA1 区由于受到损伤，导致神经元细胞和形态发生明显改变，排列疏松混乱，无明显层次，细胞之间的连接松散，部分细胞核出现固缩、凋亡，使染色偏深。肉苁蓉苯乙醇苷不同剂量干预组、多奈哌齐组和毛蕊花糖苷干预组海马CA1 区细胞均有不同程度的改善，固缩、深染的神经元细胞较模型组明显减少，但仍可看到较大的细胞间隙( 见图1) 。3． 3 免疫组化实验结果肉苁蓉苯乙醇苷治疗后，取9 月龄的APP /PS1双转基因小鼠脑部组织切片，对其海马CA1 区进行Aβ1-40免疫组化染色，结果显示: 视野内可见阳性细胞多呈圆形，大部分是胞膜着棕黄色，与正常组比较，模型组小鼠海马CA1 区Aβ1-40阳性细胞数明显增加( P ＜ 0． 01) ; 与模型组比较，肉苁蓉苯乙醇总苷高、中剂量组和毛蕊花糖苷组阳性细胞数显著减少( P ＜ 0． 01) ，多奈哌齐组和肉苁蓉苯乙醇总苷低剂量组Aβ1-40阳性细胞数明显减少( P ＜ 0． 05) ，具有显著性差异( 见表3，图2) 。经肉苁蓉苯乙醇苷干预后，取9 月龄的APP /PS1 双转基因小鼠脑组织切片，对其海马CA1 区进行Aβ1-42免疫组化染色，结果显示: 与模型组比较，肉苁蓉苯乙醇总苷各剂量组和毛蕊花糖苷组阳性细胞数显著减少，具有显著性差异( P ＜ 0． 01) ( 见表4，图3) 。3． 4 Western-blot 检测结果Western-blot 法检测小鼠海马Aβ1-40、Aβ1-42蛋白的表达，结果表明，模型组小鼠海马Aβ1-40、Aβ1-42的蛋白表达较正常组明显上调，有显著性差异( P ＜0. 05) 。肉苁蓉苯乙醇苷各剂量干预组和毛蕊花糖苷干预组小鼠海马Aβ1-40、Aβ1-42蛋白表达较模型组小鼠均显著下调( P ＜ 0． 01) ，具有显著性差异( P ＜0． 01) ，见图4。4 结论AD 主要发生在中枢神经系统，由多因素诱导产生，到目前为止其发病机制尚不明了，但研究核心仍然围绕Aβ 展开。作为脑内APP 分泌的主要多肽，Aβ1-42和Aβ1-40的异常沉积并不能直接引起神经元的变性，从病源的角度来讲，Aβ1-42产生的可溶性寡聚体ADDLs 才是导致脑内神经元变性的真正诱因。但对这两种蛋白表达的考察也可以实时反映AD 脑内病变程度，间接显示可溶性寡聚体ADDLs的表达情况，进而从源头动态监测脑内神经元损伤状况，为疾病防治提供参考。也鉴于此，Aβ1-42和Aβ1-40已成为AD 发病机制研究中的关键靶标。海马作为脑内评价学习记忆能力优劣的主要作用部位，其神经元的损伤是AD 产生认知功能障碍的主导诱因，而海马CA1 区是AD 病理损伤的主要部位之一，本部分实验采用HE 染色法，结果发现正常组海马CA1 区神经元细胞排列整齐紧密，分布较为均匀，层次清晰。而模型组小鼠海马CA1 区因损伤出现神经元细胞凋亡等退行性改变，经肉苁蓉苯乙醇苷不同剂量组干预后，其海马CA1 区细胞形态均有不同程度的改善，提示肉苁蓉苯乙醇苷可能具有保护神经元、抑制其凋亡的作用，但由于HE 染色对于细胞凋亡和神经元丢失并无特异性，后期仍需要针对凋亡特异分子标志物进行相关检测。HE 染色法是组织病理学考察的经典方法，对待测组织的前处理直接关系到染色结果。实验中作者发现，由于转基因小鼠海马位于端脑颞叶的内侧深部，体积较小，组织分离难度较大，稍有不慎就会对其造成机械损伤，从而无法有效观察其病理改变。同时，因转基因小鼠价格昂贵，且实验给药周期较长，样本一旦损失可能影响研究的整体进度。因此，当小鼠完成心脏灌注后，全脑取出使用多聚甲醛固定，手术刀片除去嗅球部分，其余脑组织全部进行脱水、包埋步骤，切片厚度控制在3 ～ 5 μm，在保证海马体完整的前提下优化了操作流程，提高了研究效率。在Western-blot 检测中作者发现，由于Aβ1-42和Aβ1-40蛋白分子量较小，使表达条带不易印迹，因而需要对其SDS-PAGE 凝胶浓度、电泳时间和转膜时间进行筛选。分离胶浓度过小会导致电泳泳道迁移，蛋白激活不完全; 电泳时间过长会导致条带偏移出凝胶层; 相应的转膜时间过久则会使蛋白印迹模糊，从而影响一抗孵育和二抗结合。鉴于此，本研究经预实验摸索，最终选择15%分离胶，电泳和转膜2 小时对Aβ1-42和Aβ1-40进行蛋白印迹，考察其表达情况。目前在对蛋白调控所采用的技术手段中，Western-blot 法主要进行定量，考察相关蛋白具体表达量。而免疫组化法则从定性角度出发，一方面更直观的展现蛋白与抗体特异性结合程度，另一方面佐证定量结果。因免疫组化法是通过抗体与组织病理切片上的抗原位点结合来检测蛋白表达情况，所以组织病理切片的制作显得尤为重要。切片不易过厚，切片完成后应注意保存，避免组织切面受到外界损伤; 处理前应进行充分的脱蜡，时间不宜少于2 小时; 选择条件温和、附带损伤较小的柠檬酸缓冲液对抗原进行修复，去除过氧化氢酶，充分暴露抗原位点，使一抗与位点完全契合。以上两种方法作为分子生物学常用检测手段，相辅相成，为蛋白的调控研究提供了技术保障。本研究借助HE 等方法对脑内海马病变情况、Aβ 相关蛋白表达进行了考察，结果显示，经肉苁蓉苯乙醇苷干预后，AD 模型小鼠脑内海马CA1 区细胞形态均有不同程度的改善，Aβ1-42和Aβ1-40的表达量明显下调，此外通过研究还发现毛蕊花糖苷干预组保护神经元作用优于苯乙醇总苷组，提示毛蕊花糖苷作为肉苁蓉苯乙醇苷代表性单体，相较于肉苁蓉苯乙醇总苷，其改善AD 模型鼠脑区病理改变进而发挥拮抗AD 作用潜能巨大，具体作用机制有待后续进一步研究。本研究完善肉苁蓉从Aβ 角度拮抗AD 作用机制的研究资料的同时，为后期进一步阐明肉苁蓉有效组分或活性单体抗AD 作用机制奠定研究基础。

表3 7种苯乙醇苷类物质的线性回归方程、相关系数、检测限和定量限对照品标准曲线R2(检测限定量限μg/mL)(μg/mL)麦角甾苷y=29.71x+42.746266600.42异麦角甾苷y=22.939x+22.5690.99980.54松果菊苷y=23.087x+26.1180.99990.54管花苷Ay=43.163x+9.4738 0.99960.542＊-乙酰毛y=17.656x-10.493 0.99960.54蕊花糖苷肉苁蓉苷Ay=19.948x+10.462 0.9997210肉苁蓉苷Fy=31.918x+7.8740.999516 由表3可知，7种苯乙醇苷类成分在各自线性范围内与色谱峰面积线性关系良好。7种苯乙醇苷类物质的检测限在0.4-2μg／ml．之间，定量限在2-10μg／mL．之间。（三）精密度实验吸取同一混合标准品溶液，上机验证精密度，分别重复测定6次，记录7种苯乙醇苷类成分的峰面积，并计算相对标准偏差，结果列于表4。结果表明7种苯乙醇苷类成分的峰面积对应的RSD值分别为1.52％、1.29％、1.79％、1.67％、1.80％、1.67％、1.71，表明该方法精密度良好。表4 精密度实验结果组分麦角甾苷异麦角甾苷松果菊苷管花苷A2＇-乙酰毛蕊花糖苷肉苁蓉苷A肉苁蓉苷F489.121359.569374.582336.554236.156156.71523250.587485.506354.319368.369342.756242.265151.71523258.156峰面积486.453356.328379.956334.852238.158149.71523254.161473.489347.745361.158344.248235.474151.1523245.165476,652351.259367.489349.756231.253152.7152253.584492.418348.842374.369337.258242.415154.71523252.641平均值483.939353.010370.987340.904237.620252.382152.673RSD/%1.521.291.791.671.81.671.71 （四）稳定性试验精密吸取同一混合标准品溶液10μL，分别于0.2、4、8.12、24h进样测定，分别重复测定3次，计录各特征峰的相对保留时间及相对峰面积，计算RSD值。结果表明7种苯乙醇苷的特征峰的相对保留时间的RSD＜0.5％，峰面积的RSD值分别为1.85％、0.92％、1.63％、0.87％、1.24％、1.65％、1.43％，峰面积的RSD＜2％，故7种苯乙醇苷类成分于24h内测定结果稳定。（五）回收率实验对7种苯乙醇苷类物质在1,5.20mg／kg3个水平下进行加标回收实验，平行测定6次，计算加标回收率，结果见表5。7种苯乙醇苷类物质的回收率在85.12％～97.21％之间，相对标准偏差RSD均低于5％，由此可以看出表明该方法精密度良好，结果稳定。表5    7种苯乙醇苷类物质方法平均回收率和相对标准偏差对照品1mg/kg回收率％ RSD/%5mg/kg回收率％ RSD/%20mg/kg回收率／％ RSD/%麦角甾苷异麦角甾苷松果菊苷管花苷A2＊-乙酰毛蕊花糖苷肉苁蓉苷A85.1287.2090.4589.5491.2487.642.23 92.53.62 95.62.89 97.211.24 92.153.67 94.282.56 87.260.892.124.082.243.254.2591.5095.1494.2586.273.111.642.411.253.652.741.4391.6487.56肉苁蓉苷F 92.361.48 89.25 1.95 93.25六）实际样品的测定分别按方法制备供试品样品，测定色谱峰面积，表6 含量测定结果及相对标准偏差样品麦角甾苷异麦角留苷

徐圣，柴莎莎（武汉职业技术学院生物工程学院，湖北武汉430074）摘要：建立HPLC-DAD同时检测肉苁蓉中主要活性物质7种苯乙醇苷类成分的快速分析方法。使用Agilent ZORBAXC18色谱柱（150mmx4.6mm，5μm），以乙腈-0.1％甲酸为流动相进行梯度洗脱，二极管阵列检测器，波长330nm，外标法定量。7种苯乙醇苷类成分在检测范围内有良好的线性，相关系数均在0.9995以上，检出限为0.5-2μg／mL，定量限为2-10μg／mL。在3个水平下加标回收率为85.12％-97.21％，相对标准偏差低于5％。该方法快速、准确、简便，适用于肉苁蓉苯乙醇苷类成分的检测需求，后续可以为控制肉苁蓉质量提供有力支持和有效保障。关键词：HPLC；肉苁蓉；活性物质；检测；质量控制一、材料与方法（一）材料与试剂麦角甾苷对照品（纯度98％）、异麦角甾苷对照品（纯度98％）、松果菊苷对照品（纯度98％）、管花苷A对照品（纯度98％）、2＇-乙酰毛蕊花糖苷对照品（纯度98％）、肉苁蓉苷A对照品（纯度98％）、肉苁蓉苷F对照品（纯度98％），成都曼思特生物科技技术有限公司：甲醇（色谱纯）。Fisher公司；乙腈（色谱纯），Fisher公司；甲酸（色谱纯），Fisher公司；水为屈臣氏纯净水。市购：试验采用的肉苁蓉原料采自主产区，经湖北省中医药研究院鉴定为肉苁蓉，共10批，见表1。表1 肉苁蓉原料产地信息编号批号来源批号批号来源1190315新61903122190701新疆7190611内蒙古31907218190722内蒙古4200311新疆9200112内蒙古5200311新疆10200923内蒙古（二）主要仪器与设备1260高效液相色谱仪：美国安捷伦公司，配有二极管阵列检测器：SB-800D数显普通型超声波清洗机：宁波新芝公司；XSR105电子天平：美国梅特勒公司。十万分之一天平：美国梅特勒公司；DJ-04B小型破碎机：上海鼎广机械设备有限公司。ZORBAXC18色谱柱（150mmx4.6mm，5μm）：美国安捷伦公司。（三）方法1．溶液配制（1）标准溶液分别精密称取麦角留苷对照品20mg、异麦角甾苷对照品20mg、松果菊苷对照品20mg、管花苷A对照品10mg、2＇-乙酰毛蕊花糖苷对照品10mg、肉苁蓉苷A对照品10mg，肉苁蓉苷F对照品10mg，于25mL容量瓶中，以甲醇-水（1：1）混合溶液定容至刻度，即得各标准溶液储备液。分别取各对标准溶液储备液适量于量瓶中，甲醇-水（1：1）混合溶液定容至刻度，即得标准混合溶液。（2）样品溶液取肉苁蓉粉末，过4号筛，精密称取1g，置100mL棕色量瓶中，加入甲醇-水（1：1）50mL，盖上瓶塞，摇匀，称定质量，然后浸泡30min，超声处理40min后放置室温，再称定质量，加甲醇-水（1：1）补足减失的质量．摇匀，静置，取上清液［1］．过0.45μm滤膜，备用。2．色谱条件以0.1％甲酸水溶液为流动相A．乙腈为流动相B．进样量10微升，柱温30℃，检测波长为330nm，梯度洗脱程序见表2。表2 梯度洗脱程序时间（min）流动相A（％）流动相B（％）流速（mL／min）090200.41080200.42260400.42560400.42830700.43030700.4二、结果与讨论（一）流动相条件的优化1．流动相的选择比较甲醇-水、甲醇-甲酸水、乙腈-水和乙腈-甲酸水系统溶液梯度洗脱对7种目标物的分离效果，结果表明，在相同色谱条件下，不加甲酸，各组分峰形较差，有明显的拖尾现象：使用甲醇-0.1％甲酸水溶液，各组分的峰出现较密集，面使用乙腩-0.1％甲酸水溶液作为流动相梯度洗脱时，7个苯乙醇苷类成分均可获得良好的分离度和峰形。因此采用乙腈-0.1％甲酸水溶液作为流动相对7种苯乙醇苷类物质进行色谱分离。2．波长的确定通过紫外吸收光谱对7种苯乙醇苷类成分进行全波长扫描，发现7个苯乙醇苷类成分在330nm处有最大吸收，故确定本实验的测定波长为330nm。3．柱温的选择比较了25℃，30℃、35℃柱温条件下，对7种苯乙醇苷类成分的分离效果，结果表明在相同色谱条件下，30℃时分离效果最好，确定本实验的柱温为30℃。（二）线性方程、线性范围和检出限按照2．色谱条件，依次对7种苯乙醇苷类成分的系列标准工作溶液进样分析，以保留时间定性，色谱峰面积定量。以质量浓度为横坐标，色谱峰的面积为纵坐标，进行线性回归，绘制标准曲线。将信噪比等于3时的7种苯乙醇苷类物质对应的浓度作为检测限，信噪比等于10时对应的7种苯乙醇苷类成分浓度作为定量限，得到各苯乙醇苷类成分的线性回归方程、相关系数、检测限和定量限，结果见表3。

徐荣＇，刘友刚2，陈君＂，陈士林”1中国医学科学院北京协和医学院 药用植物研究所，北京1000942天津中医药大学基础医学院，天津 300193摘要：肉苁蓉（Cistanche deserticola Y.C.Ma）为列当科肉苁蓉属多年生寄生性药用植物，具有抗衰老、增强人体免疫力、增强记忆和学习能力和抗炎、抗疲劳等作用。其化学成分主要包括苯乙醇苷类、多糖、环烯醚萜、木质素及半乳糖醇等，由于目前评价肉苁蓉药材质量的标准过于局限，为了更好地评价肉苁蓉的质量，保证药材及其产品的疗效，本文对肉苁蓉主要有效成分的分析方法进行了综述。关键词：肉苁蓉 有效成分 分析方法 进展列当科肉苁蓉属多年生寄生性药用植物肉苁蓉（Cistanche deserticola Y．C．Ma）为2005年前历版《药典》收录的肉苁蓉药材的唯一基源植物，具有滋肝养肾，益精血，润肠通便之功效＂。目前，评价肉苁蓉质量主要是对《药典》规定的指标成分毛蕊花糖苷和松果菊苷的含量进行测定，但中药材所含化学成分非常复杂，药效并不是由任何单一的活性成分决定，而是多种活性成分共同作用的结果。因此，这种单纯以两种成分含量的高低来评价肉苁蓉药材质量的优劣存在明显的不足。本文对有关肉苁蓉成分分析方法的文献进行了综述，为肉苁蓉质量控制和评价方法的完善和优化提供了基础。1 肉苁蓉主要化学成分的分析方法肉苁蓉的主要化学成分包括苯乙醇苷类、多糖、环烯醚帖、甜菜碱和半乳糖醇等。目前，苯乙醇苷类的种类最多，在防止脂质过氧化发挥肝保护作用和清除NO自由基体现抗炎活性方面发挥着作用。肉苁蓉多糖也是的一种重要的药理活性成分，具有抗氧化和抗衰老的作用，并在免疫和抗脂质过氧化方面有独特作用3。此外，肉苁蓉中含有一定量的甜菜碱和半乳糖醇，具有促进脂肪代谢、抗脂肪肝、保护肾脏、降压和润肠通便的功能7。1.1 苯乙醇苷类有效活性成分苯乙醇苷类是肉苁蓉中的主要有效活性成分，也是肉苁蓉质量控制的主要检测指标。早期的苷类物质的含量测定大多是对其苯乙醇总苷的含量进行测定，常采用比色法，如成杰等将肉苁蓉用乙醇回流提取，提取液经浓缩，乙酸乙酯脱脂和正丁醇萃取有效成分等步骤，再经大孔树脂、AB-8吸附，甲醇洗脱，用紫外分光光度法测定含量。结果表明测定的范围为3.20-32.0mg·L，平均回收率为100.6％，RSD＝3.5％。李俐等110）采用应用苯乙醇苷类中的酚性基团与重氮盐能生成有色物质为原理，在486nm处进行测定，回收率101.3％，RSD为3.70％。但比色法存在稳定性差、可重复性差、误差大等缺点，并且前处理复杂，不适合苯乙醇苷的定量测定。高效液相色谱（HPLC）法因其灵敏度高、线性范围广等优点，在肉苁蓉中苯乙醇苷类物质的含量测定中应用最广，张思巨等＂利用HPLC同时测定了肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量。测定条件：以流动相（乙腈-甲醇-0.1％醋酸溶液10：15：75）为溶剂，超声提取40分钟，制备得供试品溶液，色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-甲醇-0.1％醋酸溶液（10：15：75）为流动相，检测波长为334nm。结果表明此方法简便，精密度、重现性良好，结果准确可靠，该方法被2005版采纳并规定松果菊苷的含量不低于0.3％2。1.2 肉苁蓉多糖多糖提取分离和含量测定的方法大多以乙醇为溶剂，利用回流提取法提取多糖，苯酚硫酸法测定多糖含量。孙萍等2采用微波技术从肉苁蓉中提取多糖，并对其含量进行了测定，结果表明反应时间缩短，提取效率提高，说明微波技术在多糖提取方面有很大潜力。李艳等首次运用超声技术从肉苁蓉中提取出多糖，并对其含量进行了测定，提取时间大大缩短。玄国东等“选用提取时间、温度、固液比3个反应因素作为研究对象，以多糖提取率为考察指标，通过响应面分析方法优化肉苁蓉多糖的提取工艺条件。结果表明，提取时间193.0min、温度94.59℃、固液比10.89，多糖提取率的理论值为85.5％。1.3 8-表马钱子苷酸件8-表马钱子苷酸是肉苁蓉属植物中主要的一种环烯醚萜苷类成分，杨建华等（13）建立了HPLC法测定肉苁蓉中8-表马钱子苷酸的含量的方法：Hypersil ODS-2色谱柱（4.6mmx250mm，5μm），流动相为乙腈-0.4％磷酸（9：91），流速1.0mL-min＇，柱温25℃，检测波长235nm，本法操作简便快速，灵敏准确。1.4 甜菜碱甜菜碱是一种季铵型水溶性生物碱，常用含量测定方法有比色法、薄层色谱扫描法和重量法等，但随着HPLC技术的普及，HPLC法已逐渐成为其含量测定的首选方法。龚立冬等（16利用HPLC一蒸发光散射法成功的建立了测定肉苁蓉中甜菜碱的含量，方法采用Waters Spherisorb S5 NH2色谱柱（250mmx4.6mm，5 μm），柱温25℃，流动相为0.1％（体积分数）三氟乙酸水溶液一甲醇（体积比为15：85），流速0.6mL／min．蒸发光散射检测器参数为漂移管温度90℃，喷雾器温度45℃，载气（氮气）压力110kPa（16psi）。该法具有良好的线性关系，可以作为甜菜碱的含量测定方法。同时研究发现德赢vwin登录 不含甜菜碱，因此可以将甜菜碱作为标志物质来鉴别正品肉苁蓉和德赢vwin登录 。1.5 半乳糖醇鲍忠等7用HPLC 分离，蒸发光散射检测器（ELSD）检测苁蓉中通便有效成分半乳糖醇的含量，采用Prevail Carbohydrate ES聚合凝胶柱（250mmx4.6mm，5μm），流动相为乙腈一水（77：23），流速为0.7mL-min；柱温为25℃，检测器漂移管温度为40℃，气体压力为240kPa测定半乳糖醇的含量，最高含量可达10％。该方法简便、准确，可作为检测肉苁蓉中半乳糖醇的常用方法。2 问题与建议近年来，肉苁蓉的需求逐年增加，但野生资源已濒临枯竭，供需矛盾日趋尖锐。同时，肉苁蓉已被列为国家二级保护植物，并收入《国际野生植物保护名录》，同时被列入濒危动植物种国际贸易公约（CITES）附录二（18）。因此，肉苁蓉的人工栽培势在必行，而当前缺乏全面评价栽培与野生肉苁蓉质量的方法体系，利用现有的《药典》标准并不能完全保证肉苁蓉等中药复杂体系的药效和用药安全问题。通过对肉苁蓉主要化学成分分析方法的综述发现，肉苁蓉中主要成分的含量测定方法均比较成熟，但这些方法并未被多数研究人员采纳。因此，我们建议有关部门将肉苁蓉主要有效成分的分析方法进行验证并择优采纳，同时增加指标成分的种类，保证药材及其产品的疗效，同时为栽培生产过程中全面客观的评价肉苁蓉药材的质量提供依据。