与对照组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；与模型组比较，P＜0.05，**P<0.01图6 各组小鼠肾上腺Hmgcr mRNA表达比较（n＝4，x±s）2.7 对皮质酮合成前期胆固醇储存过程相关分子表达的影响 与对照组相比，模型组小鼠肾上腺Lipe和Acatl的mRNA表达无显著变化（P＞0.05）；与模型组相比，各中药及其配伍干预后，Lipe和Acatl的mRNA表达均无显著变化（P＞0.05）。见图7A。与对照组相比，模型组小鼠肾上腺HSL蛋白表达显著降低（P＜0.01），但ACATI蛋白表达无显著变化（P＞0.05）。与模型组相比，淫羊藿组、补骨脂组、菟丝子组、肉苁蓉组及配伍组HSL蛋白表达明显降低（P＜0.05，P＜0.01）：各中药干预组的ACATI蛋白表达量呈增多趋势，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图7B、图7C。（A）PCR检测肾上腺Lipe 和Acal的mRNA相对表达量比较（n＝4．i）；（B）Wetem biot 检测 HSL和ACATI蛋白表达条带：（C）Wetemblot 检测HSL和ACATI的蛋白相对表达量比较（n＝3．±）。与对照组比较，＃P＜0.01；与模型组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01图7 各组小鼠腎上腺胆固醇储存相关分子表达比较2.8 对皮质酮合成前期胆固醇流出过程相关分子表达的影响 与对照组相比，模型组小鼠肾上腺三磷酸腺苷结合盒转运蛋白 A1（ATP-binding cassettetransporter A1，Abcal）mRNA 表达无明显变化，但三磷酸腺苷结合盒转运蛋白 G1（ATP-binding cassettetransporter G1．Abegl）mRNA 表达显著升高 （P＜0.01）。与模型组相比，各中药干预组及配伍组Abeal mRNA 表达均无明显变化：除肉苁蓉组外，其他各中药干预组及配伍组的Abegl mRNA表达均显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。见图8。Abcal与对照组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；与模型组比较，＊P＜0.05．**P<0.01与对照组比较，＃P＜0.01；与模型组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01图9 各组小鼠肾上腺胆圆醇稳态相关分子表达比较（n＝4，±x）3 讨论本研究采用0.66mg·kg＇·d氢化可的松连续给药14d的方法诱导药源性脾肾虚证模型，模型小鼠体质量和血清皮质酮含量降低，肾上腺皮质酮合成酶以及细胞内胆固醇代谢相关基因与蛋白表达异常，下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）轴功能受到显著抑制，这与课题组前期研究结果一致。临床常用的温补脾肾中药能够改善糖皮质激素诱发的虚证，但具体作用机制尚未明确，故本研究探讨常用温补肾阳中药对氢化可的松诱发的药源性虚证小鼠肾上腺皮质功能的影响，检测皮质酮合成前期胆固醇利用以及皮质酮合成生化过程有关分子的表达变化。肾上腺皮质是肾上腺外层的内分泌腺组织，受脑垂体前叶分泌的促肾上腺皮质激素调控，产生肾上腺皮质激素（糖皮质激素和盐皮质激素）。皮质酮是啮齿类动物分泌的有活性的糖皮质激素。本研究检测了皮质酮合成酶 Cypllal、Cyp2lal、Cypl1b1、Hsd3b1的mRNA表达，结果显示模型组小鼠肾上腺Cyp2lal mRNA表达显著降低，淫羊藿和仙茅作用后Cyp2lal mRNA表达明显上调：从蛋白表达层面分析，模型小鼠肾上腺CYP11A1蛋白表达显著降低，各中药及其配伍作用后，CYP11A1蛋白表达呈上调趋势。这些结果提示，小剂量氢化可的松连续给药14d可抑制肾上腺皮质细胞的皮质酮合成，淫羊藿、仙茅有助于提升肾上腺皮质细胞的皮质激素合成能力。动物体内皮质酮分泌受HPA轴调控，而温补肾阳中药干预后，模型小鼠血清皮质酮含量无明显变化，提示温补肾阳中药对氢化可的松诱导的药源性虚证的改善作用以调节肾上腺皮质激素合成的功能分子为主。类固醇激素的合成以胆固醇为原料，涉及多种酶，经过多个步骤的生物转化过程。本研究检测了胆固醇代谢过程中不同阶段的相关分子表达，在皮质酮合成起始阶段，模型小鼠肾上腺SIAR和NPC1的mRNA及蛋白表达均显著降低，NPC2蛋白表达显著升高，提示氢化可的松小剂量给药可影响细胞内胆固醇运输至线粒体的过程。与模型组相比，淫羊藿组、仙茅组、杜仲组、菟丝子组及配伍组SLAR蛋白表达明显升高；各中药干预组NPC1蛋白表达量增多，其中以补骨脂作用最为显著；除杜仲组外，其他中药干预组及配伍组 NPC2蛋白表达均明显下调，提示温补肾阳中药可以纠正氢化可的松诱导的胆固醇转运紊乱。血液中的胆固醇由肾上腺皮质束状带细胞膜上LDLR和SRBI两种受体摄取，并通过StAR蛋白转运至细胞线粒体内。检测皮质酮合成前期胆固醇摄取过程相关分子，模型小鼠肾上腺皮质细胞膜LDLR、SRBI的mRNA和蛋白表达均显著降低，仙茅组、补骨脂组、菟丝子组、肉苁蓉组及配伍组 LdlrmRNA表达较模型组明显下调，提示仙茅、补骨脂、菟丝子、肉苁蓉可能进一步抑制肾上腺皮质细胞对血液中胆固醇的利用。Hmger是胆固醇合成的限速酶。本研究结果显示，氢化可的松作用使Hmger mRNA表达显著下调.而仙茅、巴戟天、杜仲、补骨脂、肉苁蓉作用后该基因表达进一步下降，提示仙茅、巴戟天、杜仲、补骨脂、肉苁蓉单独干预或加重氢化可的松诱导的肾上腺皮质细胞胆固醇合成过程障碍。激素敏感性脂肪酶是脂肪动员阶段的关键限速酶之一ml，ACATI可催化细胞内游离胆固醇生成胆固醇酯。各中药及其配伍干预后，Lipe和Acatl的mRNA表达均无显著变化，提示温补肾阳类中药对胆固醇储存过程无明显影响。Abcgl和Abcal 负责胆固醇的流出，两者在外周组织细胞胆固醇的逆向转运过程中发挥协同作用，且Abcgl介导的胆固醇逆向转运是Abcal转运能力的有益补充。氢化可的松和温补肾阳中药对小鼠Abeal 基因表达无明显影响，但温补肾阳中药能够显著抑制氢化可的松诱导的Abcgl 基因高表达，提示温补肾阳中药可通过下调Abegl 表达抑制肾上腺皮质细胞内胆固醇的流出过程，有助于保障皮质激素合成所需的原料。Srebf2和Nrlh3参与细胞内胆固醇稳态的调节。小剂量氢化可的松作用导致Srebf2 mRNA表达显著下调，而补骨脂组、肉苁蓉组及配伍组Srebf2、Nrlh3的mRNA表达明显低于模型组，提示补骨脂、肉苁蓉单独用药或加剧细胞内胆固醇稳态失调。综上所述，0.66mg＊kg＇·d氢化可的松连续给药14d可引起小鼠肾上腺皮质功能抑制，表现为皮质酮合成酶（Cyp2lal、CYP11A1）表达下调以及皮质酮合成前期胆固醇转运（SIAR和NPCI表达下调、NPC2表达上调）、摄取（LDLR和SRBI下调）、合成（Hmger表达下调），流出（Abegl表达上调）、稳态（Srebf2表达下调）过程异常。温补肾阳中药可调节肾上腺皮质激素合成能力，上调Cyp2lal、CYPIIAI、SLAR、NPCI表达，下调NPC2和Abegl表 达，其中以淫羊藿、仙茅、杜仲、菟丝子的作用较为显著。

CYPI1AICYP21A2HSD11B1B-actin（A）PCR检测肾上腺Cypllal．Cypllb1．Cyp21al 和Hl3bl的mRNA相对表达量比较（a-4．zx）：（B）Westem blot 检测CYP11A1、CYP21A2和HSD11B1 蛋白表达条带：（C）Westem bot检测CYPIIA1、CYP21A2和HSDI1BI的蛋白相对表达量比较（n＝3．x＊）。与对照组比较，＃Pc0.05．＃P＜0.01；与模型组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01图3 各组小鼠肾上腺皮质酮合成酶表达比较（A）PCR检测肾上腺 Star，StarlD）3．Npel．Npe2的mRNA相对表达量比较（n＝4i±）：（B）Westem blot 检测 SAR．NPCI和NPC2蛋白表达条带：（C）Westem blot 检测SAR．NPCI和NPC2的蛋白相对表达量比较（n＝3，i±）：与对照组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；与模型组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01图4 各组小鼠肾上腺胆固醇转运相关分子表达比较

1.4 检测指标与方法1.4.1 体质量 末次给药后，记录每只小鼠的体质量，比较组间体质量的差异。1.4.2 ELISA检测血清皮质酮含量 取每只小鼠血液样本．4℃条件下4000r／min离心15min，分离血清。按照ELISA试剂盒说明书进行操作，检测血清皮质酮含量。1.4.3 PCR 检测相关基因表达 取小鼠肾上腺组织，加入TRIzol试剂抽提总RNA。应用PrimeScriptRT试剂盒进行逆转录反应，制备CDNA.逆转录反应体系为60μl，反应程序为：37℃．15 min；85℃，5s：4℃终止。以β-actin为内参进行荧光定量PCR扩增，以检测各组小鼠肾上腺组织中皮质酮合成相关基因的表达，扩增反应体系为20μl，反应程序为：95℃变性3min，95℃退火30s，60℃延伸30s，共40个循环。扩增引物由Primer3（v．0.4.0）在线软件设计、美国 Life Technologies 公司合成，引物序列见表1．各组均设4个复孔。采用2法表示各目的基因的相对表达量。表1 引物序列基因名称编号引物序列长度（bp）B-actinNM_007393上醇：5＇-TGTTACCAACTGGGACGACA-3165下游：5-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3上游：S-CTCCCGCTATGACATOCCTA-3Cyp2lal566600 NN下醇：5-ACAGCCAAAGGATGGTGTTC-3151CypllalNM_019779上醇：5-ACTTCCGGTACTTCGGCTTT3201下游：5-GCTTGAGAGGCTGGAAGTTG-3CypllblNM_001033229上游：5-GTATCGAGACCTGGCAGAGG-3140下游：5-CGGTTGATGTCGTGTCAGTG-3Hd3b1NM_008293上游：5-GGTGCAGGAGAAAGAACTGC3275下醇：5-CTTGAACACAGGCCTCCAAT-3NpelNM_008720上海：5-ACTCTTGTGTCCGACGGATG-3209下游：5-AGCAGTOCTGGCAGCTACAT-3Npx2NM_023409上游：5-CACTCAGTCCCAGAACAGCA3268下游：5-CCAAGGAGCCTAGCTTGTGA-3StarNM_011485上游：5TTCGCCATACTCAACAACCA-3103下游：5-GAAACACCTTCCCCACATCT3StarD3NM_021547上醇：5-TCCCCATTGTCTCTTTCGTC-3284下游：5-CACCOCAGTAGCTTCCTTTC3세P1NM_001252658上游：5-TCCTGGAGATGTGATGGACA-3158下游：5-GAGCCATCTAGGCAATCTCG3上游：5-AAGTGGTCAACCCAAACGAG-3ScarblNM_001205082下：5-ACCGTGTCGTTGTCATTGAA-3121HangerNM_008255上醇：5-TGGAGATCATGTGCTCCTTC-3248下醇：5-CCGACTATGAGCGTGAACAA3LipeNM_010719上游：5-AGACACCAGCCAACGGATAC-3239下游：5-ATCACCCTCGAAGAAGAGCA-3AcatlNM_144784上游：5-TATTTCCACTCCATGCACCA-3133下醇：5-ATTGGACATGCTCTCCATCC-3AbcalNM_013454上游：5-AACAGTTTGTGGCCCTTTG-3157下游：5-AGTTCCAGCCTGCGGTACTT-3AbeglNM_009593上游：5-GAAGTGGCATCAGGCGAGTA-3124下游：5-AAAGAAACCCGTTCACATCG-3Nrlh3NM001177730上海：5-GCAGGACCAGCICCAAGTAG-3125下游：5-GCCTCACCAGCTTCATTAGC-3Serbl2NM_033218上游：5-GGATCCTCOCAAAGAAGGAG-3147下游：5-TTCCTCAGAACGCCAGACTT-31.4.4 Westen blot 检测相关蛋白表达 取小鼠肾上腺组织，置于含有500 μl RIPA裂解液的EP管中，冰上超声研磨后，4℃条件下14000 r／min 离心15 min，收集上清液。BCA法测定总蛋白浓度。各孔取15μg蛋白上样，于10％SDS-PAGE 凝胶进行蛋白分离（浓缩胶电压80 V．30 min：分离胶电压120 V．90 min）。将分离后的蛋白电转移（恒流250 mA，150min），加入5％脱脂奶粉或5％牛血清白蛋白封闭1.5h．洗膜（即加入TBST溶液，置于摇床上振荡，清洗3次，每次10min，下同）后，分别加入一抗抗体（ACATI抗体的体积稀释比例为1：1000．β-nctin抗体的体积稀释比例为1：20 000，HSL抗体的体积稀释比例为1：50000．其他抗体的体积稀释比例均为1：2000），4℃孵育过夜。次日洗膜后，加入HRP标记的山羊抗兔／小鼠IgG（体积稀释比例为1：2000），室温孵育1.5h。洗膜后依据说明书滴加显色剂进行曝光，采用ImageJ图像分析管理系统对蛋白条带灰度值进行分析。1.5 统计学方法 实验数据采用GraphPad Prism7.0软件进行统计学分析和作图。计量资料以±表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两组间比较采用LSD-检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。2 结果2.1 对体质量的影响 与对照组相比，模型组小鼠体质量显著降低（P＜0.01），各中药干预组与配伍组小鼠的体质量亦明显降低（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组相比，各中药干预组与配伍组小鼠体质量无明显变化（P＞0.05）。见图1．图2 各组小鼠血清皮质酮含量比较（n＝12，x±s）2.3 对皮质酮合成酶表达的影响 与对照组相比，模型组小鼠肾上腺 Cyp2lal mRNA表达显著降低（P＜0.01）：与模型组相比，补骨脂组、菟丝子组、肉苁蓉组及配伍组的图2 各组小鼠血清皮质酮含量比较（n＝12，x±s）2.3 对皮质酮合成酶表达的影响 与对照组相比，模型组小鼠肾上腺 Cyp2lal mRNA表达显著降低（P＜0.01）：与模型组相比，补骨脂组、菟丝子组、肉苁蓉组及配伍组的Cypllb1 mRNA 表达明显下调（P＜0.01），面淫羊藿组和仙茅组 Cyp2lal mRNA表达明显上调（P＜0.05）。见图3A。与对照组相比，模型组小鼠肾上腺CYP11A1蛋白表达显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，各中药及其配伍作用后，CYP11A1蛋白表达呈上调趋势，CYP21A2和HSD11B1蛋白表达呈下调趋势，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图3B、图3C。2.4 对皮质酮合成起始过程胆固醇转运分子表达的影响 与对照组相比，模型组小鼠肾上腺Star和Npel的mRNA表达显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组相比，各中药干预组Star、StarD3、Npel、Npe2的mRNA表达均无显著变化，仅巴戟天组 Npc2mRNA表达明显降低（P＜0.05）。见图4A。与对照组相比，模型组小鼠肾上腺StAR和NPCI蛋白表达显著降

李亚，潘志强，谢海纳，方肇勤上海中医药大学基础医学院（上海 201203）【摘要】目的：研究温补肾阳中药及其配伍对虚证模型小鼠肾上腺皮质激素合成的影响，方法：120只维性ICR小鼠随机分成10组．即对照组、模型组、淫羊藿（5.3mg＊kg＇·d＇）组、仙茅（4.3mg＊kg＊·d＇）组、巴戟天（4.3mg＊kg·d）组、杜仲（5.3mg＊kg＊·d）组、补骨脂（5.3mg＊kg＇·d）组、菟丝子（6.0mg＊kg＇·d＇）组·肉苁蓉（5.3mg＊kg＇·d）组以及配伍（各单味中药等比例混合，4.7mg＊kg＊d＇）组，每组12只。除对照组外，其他各组小鼠灌胃给予0.66mg＊kg＊＊d氢化可的松溶液，连续14d，以复制药源性虚证模型，造模同时，各中药干预组及配伍组小鼠灌胃给予相应药液，连续14d．末次给药后，称量小鼠体质量：采集血清和双侧肾上腺组织。ELISA检测血清皮质酮含量：PCR检测肾上腺相关基因的表达，包括类固醇激素合成酶（Cypllal、Cyp2lal、Cypl1b1、Hsd3b1），胆固醇转运分子（Star、StarD3．Npe1、Npe2）、胆固醇摄取分子（Ldlr、Scarbl）、胆固醇合成限速酶（Hmger）、胆固醇储存分子（Lipe．Acatl）、胆固醇流出分子（Abcal、Abegl）、胆固醇稳态分子（Sreb2、Nrlh3）：Western blot 检测肾上腺 CYPIIAI．CYP21A2、HSD1IBI．SAR．NPCI．NPC2．LDLR、SRBI、HSL、ACATI的蛋白表 达，结果：①与模型组相比，各中药干预组及配伍组小鼠的体质量和血清皮质酮含量无明显变化（P＞0.05）。②与对照组相比，模型组小鼠肾上腺Cyp2lal mRNA表达和CYPIIAI蛋白表达显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，淫羊藿组和仙茅组Cyp2lal mRNA表达明显上调（P＜0.05），各中药组及配伍组CYP11A1蛋白表达呈上调趋势。③与对照组相比，模型组小鼠肾上腺Stur和Npel的mRNA表达及SAR和NPCI蛋白表达显著降低（P＜0.05．P＜0.01），NPC2蛋白表达显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，淫羊藿组、仙茅组、杜仲组、菟丝子组及配伍组SLAR 蛋白表达明显升高（P＜0.05，P＜0.01），各中药组NPCI蛋白表达量增多，以补骨脂作用最为显著（P＜0.05），除杜仲组外其他中药干预组及配伍组NPC2蛋白表达明显下调（P＜0.01）。④与对照组相比，模型组小鼠肾上腺Lllr、Scarbl的mRNA表达以及LDLR、SRBI的蛋白表达均显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组相比，仙茅组、补骨脂组、菟丝子组、肉苁蓉组及配伍组Ldlr mRNA表达明显下调（P＜0.01），杜仲组、菟丝子组及配伍组SRBI蛋白表达显著升高（P＜0.05，P＜0.01）。⑤模型组小鼠肾上腺Hmger mRNA表达及HSL蛋白表达较对照组显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，仙茅组，巴戟天组、杜仲组、补骨脂组、肉苁蓉组Hmger mRNA表达明显降低（P＜0.05，P＜0.01），淫羊藿组、补骨脂组、菟丝子组、肉苁蓉组及配伍组HSL蛋白表达明显降低（P＜0.05．P＜0.01）。⑥模型组小鼠肾上腺Abegl mRNA表达较对照组显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，除肉苁外其他各中药干预组及配伍组的Abegl mRNA表达均显著降低（P＜0.05．P＜0.01）。⑦模型组小鼠肾上腺Sebl2mRNA表达较对照组显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，补骨脂组·肉苁蓉组及配伍组Scebf2 mRNA表达显著降低（P＜0.05，P＜0.01），且补骨脂组、菟丝子组、肉苁蓉组及配伍组Nrlh3 mRNA表达显著降低（P＜0.05）。结论：温补肾阳中药可调节氢化可的松诱导的虚证模型小鼠肾上腺皮质激素的合成能力，其中以淫羊藿、仙茅、杜仲、菟丝子的作用较为显著。【关键词】 温补肾阳：肾上腺皮质：氢化可的松：虚证：小鼠证候是中医基础理论研究的主要领域。本课题组前期研究采用0.66mg＊kg·d氢化可的松连续给药14d的方法建立稳定的药源性脾肾虚证模型，模型小鼠肾上腺皮质功能受到显著抑制＂。温补肾阳中药对肾上腺皮质激素的合成与分泌具有明显的调节作用。临床中，在小剂量糖皮质激素维持治疗阶段，患者可出现肢倦神疲、少气懒言、腰膝酸软、头晕耳鸣、畏寒、肢冷、舌淡苔白、脉细等虚证征象，故常给予温补肾阳中药以改善证候，并通过血液激素的动态变化评价药效。但临床研究难以直接观察肾上腺皮质激素合成的多环节、多靶点的变化。为了进一步明确温补肾阳中药对肾上腺皮质功能的调节作用，本研究拟复制药源性脾肾虚证小鼠模型，并给予温补肾阳中药淫羊藿、仙茅、巴戟天、杜仲、补骨脂、菟丝子、肉苁蓉及其配伍组合进行干预，基于肾上腺皮质细胞合成与分泌皮质酮的生化过程，深入探讨温补肾阳中药对肾上腺皮质功能的影响。现将结果报道如下。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 动物 雄性ICR小鼠120只，SPF级，体质量20～22g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK（沪）2013-0016，动物合格证号：2008001685725。所有动物均饲养于上海中医药大学实验动物中心SPF级饲养室，饲养室温度22～25℃，湿度50％～60％，12h明暗交替，可自由饮水，予普通饲料喂养。1.1.2 药物与试剂 氢化可的松，国药集团化学试剂有限公司（批号：66003632）。淫羊藿（批号：180915）、仙茅（批号：180914）、巴戟天（批号：180425）、杜仲（批号：180915）、补骨脂（批号：180131）、菟丝子（批号：181008）、肉苁蓉（批号：180717），均购自上海康桥中药饮片有限公司。水煎法制备各单味中药及组合（等比例配伍）的药液，浓缩至1g／ml。TRIzol 试剂、PrimeScript®RT试剂盒、SYBR® Premix Ex Taqt（Tli RNaseH Plus）试剂盒，日本 TaKaRa公司；小鼠皮质酮ELISA检测试剂盒（货号：501320），美国Cayman公司；兔抗低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor，LDLR.货号： ab52818）抗体、兔抗B族I型清道夫受体（scavengerreceptor class B type I．Scarbl／SRBI，货号：ab52629）抗 体、兔抗类固醇合成急性调节蛋白（steroidogenesisacute regulatory protein，StAR，货号：ab96637）抗体、兔抗胆固醇侧链裂解酶（cholesterol side-chaincleavage enzyme P450scc，编码基因 Cypllal，货号： ab175408）抗体、兔抗胆固醇酰基转移酶1（acyl-CoA：cholesterol acyltransferase-1，ACATI，货号： ab168342）抗体、兔抗激素敏感性脂肪酶（hormone-sensitive triglayceride lipase，Lipe／HSL，货号： ab109400）抗体、兔抗胆固醇21-羟化酶（21-hydroxylase，编码基因 Cyp21a2，货号：ab232701）抗 体、兔抗11β-羟基类固醇脱氢酶1（11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1．HSD11B1，货号： ab39364）抗体、兔抗尼曼匹克CI前体蛋白（Niemann pick Cl protein precursor，NPCI，货号： ab134113）抗体、兔抗尼曼匹克C2前体蛋白（Niemann pick C2 protein precursor，NPC2，货号： ab218192）抗体，美国Abeam公司：小鼠 β-actin抗体，美国Sigma-Aldrich公司：RIPA裂解液、ECL化学发光试剂、辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）标记的山羊抗兔／小鼠IgG（H＋L），上海碧云天生物试剂有限公司。1.1.3 主要仪器 MP200B型电子天平，上海良平仪器仪表有限公司：Synergy2多功能酶标仪，美国Bio Tek 公司：Eco实时荧光定量PCR仪，美国IHlumina公司：电泳仪及转膜设备，美国 Bio-Rad公司：Alpha 化学发光凝胶成像系统，美国 ProteinSimple公司。1.2 分组与造模 小鼠适应性饲养后，待体质量达30g时，随机分为对照组、模型组、淫羊藿组、仙茅组、巴戟天组、杜仲组、补骨脂组、菟丝子组、肉苁蓉组、配伍组，每组12只。除对照组外，其他各组小鼠每日上午9：00灌胃给予0.66mg＊kg＇·d＇氢化可的松溶液，连续14d，以复制药源性脾肾虚证模型：对照组小鼠灌胃给予等体积0.9％NaCl溶液。1.3 药物干预 造模同时，各中药干预组每日下午3：00灌胃给予相应中药水煎液，给药剂量为：淫羊藿5.3mg·kg＇·d＇．仙茅4.3mg·kg＇·d＇，巴戟天4.3mg＊kg＇·d＇＇，杜仲5.3mg·kg＇·d＇，补骨脂5.3mg＊kg＇·d＇，菟丝子6.0mg·kg＇·d＇，肉苁蓉5.3mg＊kg＊d．配伍组4.7mg＊kg＇＊d，剂量设置依据《中华人民共和国药典》（2015版）各中药用量，取临床等效剂量的4倍；对照组和模型组灌胃给予等体积灭菌水；每日给药1次，连续14d。末次给药后，称量小鼠体质量：采集血液，分离血清；收集小鼠双侧肾上腺组织。

温阳法治疗血管性痴呆概况李晓琼＇，林荣清＇，杨壁璘＇，卢健锋＇，胡跃强（1．广西中医药大学，广西 南宁，530001；2．广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁，530023）［关键词］ 血管性痴呆；中医药疗法：温阳法：综述，学术性血管性痴呆（vacular dementia，VaD）是一种多发于中老年人的脑血管疾病，以学习和记忆功能障碍为主要临床表现，包括缺血性脑血管病、出血性脑血管病以及急性或慢性缺氧性脑血管病引起的痴呆。据有关资料显示，我国VaD患病率为1.1％～3.0％，严重影响患者的生活质量。随着全球老龄化时代的到来，VaD发病率呈不断上升的趋势，防治VaD一方面可以提高老年人的生活质量，减轻家庭和社会的负担，另一方面可以实现世界卫生组织提出的“健康老龄化”。VaD属中医学“痴呆”范畴，其发生主要与痰、察、浊、毒、虚等因素有关，临床治疗多以填精益智、补益气血、活血化瘀、化痰开窍为法。近年来，随着扶阳学术流派在中医学术界的崛起，运用温阳法治疗VaD取得了一定的成果，现综述如下。1 理论探源《素问·阴阳应象大论》日 阴阳者，天地之道也，万物之纲纪，变化之父母，生杀之本始，神明之府也，治病必求于本”，这体现了治病求本当属阴阳，辨病的本质应从阴阳的角度出发，故痴呆的论治亦离不开阴阳。《素问·四时刺逆从论》载“阳气竭绝，令人善忘”。《灵枢·大惑论》亦载“人之善忘者，何气使然？岐伯曰：上气不足，下气有余，肠胃实而心肺虚，虚则营卫留于下，久之不以时上，故善忘”。说明痴呆的发生与阳气不足密切相关。郑钦安于《医法圆通·卷二》中曰“健忘一症，固有阳虚阴虚之别，统以精神不足为主，人票二气以生（二气即阳精阴精），固曰精气神，二气贯于周身，精气足，则神自聪明，精气衰，则神昏，此病老年居多”。孙思道于《备急千金要方·养性》中指出痴呆之发病责之于“肾精竭乏，阳气日衰。《灵枢·天年》日：“六十岁，心气始衰，苦忧悲，血气懈情，故好卧······八十岁，肺气衰，魄离，故言善误”。王清任于《医林改错·脑髓脱》曰“小儿无记性者，脑髓未满：高年无记性者，脑髓渐空”，进一步阐明了年事渐高、机体虚衰、阳气亏虚、阴阳不和等是导致痴呆、健忘的病机所在。卢崇汉在《扶阳讲记》中有言“心无阳则血不行，脾无阳则水谷不化，肝无阳则疏泄不行，肺无阳则宣降失司，肾无阳则浊阴凝闭。““五脏阳气衰微，气血津液推动无力，可导致瘀血痰浊等阻滞机体，使气血难以上输脑络：而长期五脏阳气虚者，在产生察血、痰浊的同时，又影响着气机的条畅及气血津液的生化，从而导致阳气更虚《素问·生气通天论》曰 “阳气者，若天与日，失其所，则折寿而不彰”，说明了阳气的重要性，著名医家祝味菊有云“今人体质，纯阳者少，可温之证多，而可凉之证少······宜温者多，可清者少”国，其针对“阳常不足”的体质特点，重用桂附对于应用温阳法具有十分重要的现实意义。正如扶阳学派创始人清代医家郑钦安曰“阳行一寸，阴即行一寸，阳停一刻，阴即停一刻”，无不强调着阳气在人生命活动中的重要性，郑钦安一脉，由卢氏三代（卢铸之、卢永定、卢崇汉）及唐农教授薪火相传，发展并形成鲜明的扶阳思想，其理论核心“生命以火立极”-本着“阴平阳秘，精神乃治”的观点，在治疗上以“病在阳者，扶阳抑阴；病在阴者，用阳化阴”为思路，最终实现“阳密乃固”的治疗思想。加上后世扶阳学术派的维承与发展，郑氏的扶阳思想日渐成熟及完善。2 临床应用2.1 中医治疗 VaD病位在脑，根于五脏，病性本虚标实，多发于老年患者，其虚以阳气亏虚为主。故临床选方用药以温阳立法，根据辨证的不同佐以填精补髓、补益气活血化瘀、泻火逐痰等方法，可取得满意疗效。罗莎等认为，现代人因生活习惯等因素多属阳虚体质，故VaD多以阳虚为主，为VaD的辨证论治和治疗提供了新的思路与方法。张瑞杰认为，温阳与化痰均是治疗VaD的关键，其将60例VaD患者随机分为2组，对照组服用尼莫地平片，每次40mg，每天3次：治疗组服用温阳化痰汤（干姜、巴戟天、桂枝、制半夏、石菖蒲、茯苓各15g，炮附子（先煎）12g，陈皮、制胆南星、人参各12g·炙甘草6g），以2个月为1个疗程，治疗6个月后分别进行ADL积分、MMSE积分及2组的总有效率比较。结果显示，治疗组治疗后ALD积分较本组治疗前及对照组治疗后均明显下降（P＜0.05），而MMSE积分较本组治疗前及对照组治疗后升高（P＜0.01），总有效率治疗组明显优于对照组（P＜0.05），表明温阳化痰汤能有效提高患者的日常生活能力，改善患者认知功能，并提高其生活质量。王启芝等认为，VaD的形成主要与肺脏功能衰弱使人体清气吸入不足，导致机体气化无源、气虚无力充养脑髓、浊气积聚体内·浊气与血互结为瘀血、浊气随血上行于脑和瘀滞脑络有关，井运用温肺降浊汤［为扶阳派唐农教授自拟方，组成：制附子（先煎）30g，人参15g，炙甘草、干姜、酒大黄、田三七各10g］治疗VaD患者，扶助人体阳气、祛除痰湿寒邪。结果：显效16例，有效12例，无效2例，临床疗效为93.3％，说明温肺降浊汤治疗VaD可取得一定的疗效。唐农等认为，VaD的病因病机主要为气滞、痰浊、血瘀，而其形成皆本于五脏阳虚。基于此认识，其予以自拟五脏温阳化瘀汤（附子30g，淫羊藿、干姜、巴戟天、桂枝、半夏、田三七、石菖蒲、人参各15g，大黄6g）治疗动脉硬化性 VaD患者44例，总有效率为86.36％。该疗法可明显改善患者的日常生活行为能力和神经功能缺损情况。2.2 中西医结合治疗 以温阳方联合西药治疗VaD的中西医结合疗法常能发挥各自的优势而达到优势互补的作用，进而提高临床有效率。吕立峰等将老年VaD（阳虚型）患者分为2组，对照组予以基础治疗和口服丁苯酞胶囊，研究组在对照组基础上加服温脾通络开窍汤（黄芪30g益智仁、三七、石菖蒲、何首乌、纹股蓝、制附子、杜仲各10g，肉桂6g·肉苁蓉15g治疗，连续治疗3个疗程后，采用简易智力状态检查量表 MMSE.HDS.MoCA.BI评分评价患者认知功能和日常生活活动能力，对各项临床观察指标进行比较，并记录不良反应的发生情况，结果显示·研究组临床症状均较前明显改善，且优于对照组（P＜0.05），其不良反应发生率低于对照组。说明该方联合丁苯酞能够有效改善老年VaD（阳虚型）患者的认知功能及日常生活能力。庄贺等研究中西医结合疗法对VaD患者的认知功能及日常生活能力的改善程度，其将VaD患者分为2组，对照组单用六味地黄汤加减（牛脊髓30g，龟甲20g，茯苓、人参各12g·山药、黄精、石菖蒲各12g，泽泻6g，牡丹皮9g，天麻、益智仁、肉苁蓉各10g，附子5g，桂枝3g治疗，联合组在对照组的基础上加丁略地尔片口服，连续治疗2个月，分别于治疗第1、2个月采用MMSE、BI评分，结果显示治疗组2个时间节点的MMSE、BI评分均高于对照组（P＜0.05），说明六味汤加减联合丁咯地尔能显著改善患者认知功能及日常生活能力情况。黄循夫等通过中西医结合疗法治疗本病，对照组采用常规西药治疗，观察组在此基础上合用加减地黄饮子汤治疗，疗程为3个月，分别进行ADL、HDS评分比较。结果显示治疗后观察组的行为能力总有效率明显高于对照组（P＜0.05），观察组治疗后ADL评分均较治疗前及对照组升高（P＜0.05），且HDS评分较治疗前及对照组明显降低（P＜0.05），因此认为中西医结合治疗能显著提高VaD患者的认知能力和日常生活能力，值得临床推广。3 作用机制1）温阳方药。近年来基础研究发现，四逆汤、参附注射液、续断、淫羊藿、肉苁蓉等温阳方药具有显著的神经保护作用。四逆汤对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用已被证实，其保护机制与提高清除氧自由基能力，增强GSH-Px活性，减少NOS合成和增强抗氧化能力等密切相关。有研究证实，参附注射液对因脑缺血导致损伤的海马神经有保护作用，其作用机制与清除氧自由基、抗神经元凋亡、稳定细胞内钙离子等有密切关联。朱丹等通过进行Morris水迷宫行为学测试得出，腹腔注射4ml／（kg·d参附注射液可以增加VaD大鼠跨越平台的次数，可以改善VaD大鼠的学习记忆能力。2）温阳中药。如续断、淫羊蕾、肉苁蓉等温补肾阳中药及其提取物对神经元有一定的保护作用，有研究证实，VaD血管源性损伤的机制主要与大脑缺血缺氧后产生大量氧自由基从而损伤脑内的神经细胞有关，而Bel-2基因有抑制细胞调亡的作用。洪汝等在探讨续断提取物对VaD大鼠学习记忆能力及海马神经元的保护作用中发现，续断提取物能够提高Bcl-2基因的表达，增强清除氧自由基能力、提高机体抗氧化能力，抗细胞凋亡能力，对脑缺血缺氧大鼠的神经元起到一定的保护作用，从而可以改善VaD大鼠学习记忆能力，徐瑞霞等在对淫羊藿苷对大鼠学习记忆的保护作用的实验研究时证实，其神经保护作用与它能提高SOD活性，增加ChAT及AChE表达，降低MDA含量，抑制神经元内脂质过氧化物的生成有关。杨波等研究探讨应用肉苁蓉总营治疗轻、中度认知功能障碍的VaD患者的疗效，结果表明，肉苁蓉总营可以明显改善VaD患者的认知功能、降低痴呆程度和提高日常生活能力·这与肉苁蓉总苷能有效地清除各种活性氧自由基等因素有关。4小 结综上所述，中医药在防治VaD方面取得了一定的进展，扶阳学术流派以“阳虚”为辨证要点，运用温阳法治疗 VaD取得了一定的疗效，也丰富了对VaD的认识。温阳法将会给VaD的治疗带来新的思路和广阔的前景。今后应多开展规范、科学设计的临床研究，将研究成果应用于临床实践，使中医治疗在VaD患者的治疗中发挥更大的作用。

摘要: 目的: 研究德赢vwin登录 苯乙醇苷对巨噬细胞的激活作用，并筛选获得一个复方，研究其对正常小鼠的增强免疫力作用。方法: 通过巨噬细胞激活实验，考察德赢vwin登录 苯乙醇苷提取物对巨噬细胞ＲAW264.7 吞噬活性和TNF－α、IL－6 等分泌的影响; 研究当归、黄芪提取物的配伍对苯乙醇苷提取物的巨噬细胞激活作用的影响; 据此制备复方片剂，通过ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验、迟发型变态反应试验、抗体生成细胞检测、小鼠碳廓清试验和小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验，评价其对正常小鼠的免疫调节作用。结果: 75、100、125 g /L 苯乙醇苷提取物均能提高ＲAW264.7 细胞吞噬活性，以及NO、iNOS、TNF－α、IL－6 水平，其中以100 g /L 苯乙醇苷提取物效果最佳( P ＜ 0.01) ; 并且，当归、黄芪提取物对苯乙醇苷提取物的巨噬细胞激活功能具有极显著的促进作用( P ＜ 0.01) ; 以此为依据制备的复方片剂，0.4、1.2 g /kg·bw/d 组可显著促进淋巴细胞增殖( P ＜ 0.05) 、1.2 g /kg·bw/d 组可显著促进细胞免疫反应( P ＜ 0.05) ，0.4 g /kg·bw/d 组可显著促进抗体生成( P ＜ 0.05) ，1.2 g /kg·bw/d 组可显著提高小鼠碳廓清能力和巨噬细胞吞噬能力( P ＜ 0.05) 。结论: 苯乙醇苷提取物可通过诱导iNOS 表达，刺激巨噬细胞合成NO，同时刺激巨噬细胞释放TNF－α 和IL－6，激活巨噬细胞的免疫调节功能; 以其与当归、黄芪提取物制备的复方片剂，可通过调节细胞免疫、单核－巨噬细胞功能而发挥对正常小鼠的增强免疫力作用，并对体液免疫有积极影响。关键词: 德赢vwin登录 ，苯乙醇苷，当归，黄芪，巨噬细胞激活，增强免疫力列当科植物德赢vwin登录 ( Cistanche tubulosa( Schrenk) Wight) 是《中国药典》收载的肉苁蓉品种之一［1］，主产于新疆南疆地区，是著名的补益中药，“主五劳七伤，补中，除茎中寒热痛，养五脏，强阴，益精气，多子，妇人症瘕，久服轻身”。现代药理学研究表明，肉苁蓉具有抗疲劳［2－3］、抗衰老［4］、保护神经［5］、增强免疫力［6］、润肠通便［7］等多种生物活性，在保健食品开发方面具有独特的优势。苯乙醇苷和多糖被认为是肉苁蓉中的主要活性成分，其中，多糖的调节免疫活性已得到较多研究证实，它可通过免疫球蛋白受体Fcγ 依赖的吞噬作用、TNF－α NF－ κB 通路、糖酵解/糖原异生以及三羧酸循环和呼吸电子运输等实现对巨噬细胞ＲAW264.7的激活作用［8－10］，并可能通过促进细胞内钙释放促进小鼠胸腺淋巴细胞的增殖，通过促进IL－2 分泌提高正常小鼠的脾指数［10－11］。松果菊苷、毛蕊花糖苷等为代表的苯乙醇苷是肉苁蓉发挥药理活性的核心物质基础，但在调节免疫方面的研究则较少。文献报道，肉苁蓉苯乙醇苷能明显增加小鼠血中Mφ 的吞噬能力及免疫器官的重量［12］，松果菊苷为主要成分的肉苁蓉提取物可通过免疫调节等作用拮抗结肠炎，毛蕊花糖苷对免疫器官、免疫细胞和免疫因子均有明显的调节作用，对D－氨基半乳糖和脂多糖致肝功能衰竭小鼠的细胞凋亡和炎症反应也都有明显的抑制作用［6，13－14］，说明肉苁蓉中的苯乙醇苷类同样是很有潜力的免疫调节剂。本文首先研究了德赢vwin登录 苯乙醇苷对巨噬细胞的激活作用，其次，基于传统中医药理论将其与当归、黄芪配伍，通过细胞实验证明3 者对巨噬细胞激活的协同作用，并以此为依据制备复方片剂，通过动物实验考察复方片剂对正常小鼠的细胞免疫、体液免疫、单核－巨噬细胞功能的调节作用，以期为德赢vwin登录 苯乙醇苷在调节免疫产品方面的应用提供数据支持。1 材料与方法1.1 材料与仪器Hank’s 液、ＲPMI1640 培养液、DMEM 培养基、MTT、PBS 购自武汉普诺赛生命科技有限公司;DNFB 购自吴江市青云精细化工厂; SＲBC、豚鼠血清购自广州蕊特生物科技有限公司; ConA、大肠杆菌脂多糖( LPS) 购自美国Sigma 公司; NO 试剂盒、iNOS 试剂盒购自南京建成生物工程研究所;ELISA 试剂盒( Mouse TNF－α、Mouse IL－6) 购自武汉艾美捷科技有限公司; 巨噬细胞ＲAW264.7 购自中国医学科学院细胞中心; SPF 级CI /F1 代健康雌性小鼠( 生产许可证号SCXK( 沪) 2013－0016) 购自上海西普尔－ 必凯实验动物有限公司; 德赢vwin登录 购自和田秋永霞德赢vwin登录 有限责任公司; 当归、黄芪购自新疆九州通医药有限公司。JA2003 电子天平上海上天精密仪器有限公司; JJ－100 电子天平美国双杰公司; SG－603 生物安全柜美国Baker 公司; Varioskan LUX 多功能酶标仪Thermo Fisher Scientific 公司; QP80 二氧化碳培养箱山东博科科学仪器有限公司。1.2 实验方法1.2.1 各提取物及复方片剂的制备德赢vwin登录 苯乙醇苷提取物: 德赢vwin登录 以75% 乙醇溶液提取2次，浓缩干燥，即得( 松果菊苷+ 毛蕊花糖苷: 21.3%，总苷: 41%) ; 当归提取物: 当归以水提取2 次，浓缩后80%醇沉，浓缩干燥，即得( 阿魏酸: 0.3%) ; 黄芪提取物: 黄芪以水提取2 次，浓缩后70% 醇沉，干燥沉淀，即得( 多糖: 32.3%) 。复方片剂: 德赢vwin登录 苯乙醇苷提取物、当归提取物、黄芪提取物按15∶ 18∶ 12 的比例，辅以10% 微晶纤维素、9% 羧甲基淀粉钠、1% 硬脂酸镁混合均匀，湿法制粒、压片( 0.6 g /片) ，即得。1.2.2 苯乙醇苷提取物的巨噬细胞激活作用1.2.2.1 对ＲAW264.7 细胞吞噬活性的影响取对数生长期ＲAW264.7 细胞，胰酶消化后调整细胞数至5 × 106 个/mL，接种于48 孔板( 100 μL /孔) ，37 ℃，5% CO2条件下培养，待细胞贴壁后，PBS 清洗。分别加入DMEM 培养基( 空白对照组) 、LPS( 20 mg /L)和样品( 苯乙醇苷提取物25、50、75、100、125 g /L) 培养24 h，弃上清，加0.075%中性红溶液( 100 μL/孔) ，继续培养1 h，弃上清，PBS 清洗2～3 遍，加细胞裂解液( 100 μL /孔) ，4℃ 下放置2 h，酶标仪测定吸光度( 540 nm) ，计算相对细胞吞噬活性。相对细胞吞噬活性( %) = 处理组吸光度/空白对照组吸光度×100。1.2.2.2 对ＲAW264.7 细胞NO、iNOS、TNF－ α、IL－6的影响按上述方法培养ＲAW264.7 细胞，分别加入DMEM 培养基( 空白对照组) 、LPS( 20 mg /L) 和样品( 苯乙醇苷提取物25、50、75、100、125 g /L) 培养24 h，收集上清液，根据试剂盒说明测定NO、iNOS，Elisa 法测定TNF－α、IL－6 含量。1.2.3 苯乙醇苷提取物及其与当归和黄芪提取物的组合物对巨噬细胞激活的作用比较1.2.3.1 对ＲAW264.7 细胞吞噬活性的影响以苯乙醇苷提取物和当归提取物按15∶ 18 的比例混合得到组合物B，以苯乙醇苷提取物、当归提取物和黄芪提取物以15∶ 18∶ 12 的比例混合得到组合物C( 组合物配比依据《中国药典》中各药材的推荐服用量［1］和各提取物的得率折算) 。参照“1.2.2.1”方法，对比苯乙醇苷提取物( A) 、组合物B 和C( 50、75 g /L) 对ＲAW264.7 细胞吞噬活性的影响。1.2.3.2 对ＲAW264.7 细胞NO 释放量的影响参照“1.2.2.2”方法，对比苯乙醇苷提取物( A) 、组合物B和C( 50、75 g /L) 对ＲAW264.7 细胞产生NO 的影响。1.2.4 复方片剂对正常小鼠的免疫力的影响参考文献［15］的操作研究复方片剂对正常小鼠淋巴细胞等的影响。1.2.4.1 分组及处理SPF 级CI /F1 代健康雌性小鼠200 只，体重19.0～21.7 g，随机分五大组，每大组40 只，Ⅰ组进行ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验，Ⅱ组进行耳肿胀试验，Ⅲ组进行抗体生成细胞检测，Ⅳ组进行小鼠碳廓清试验，Ⅴ组进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验。每大组分别设复方片剂低、中、高剂量组0.2、0.4、1.2 g /kg·bw/d( 分别相当于受试样品人体推荐摄入量的5 倍、10 倍、30 倍; 折算人体推荐摄入量，各药材服用量均小于《中国药典》规定的用药量) 和空白对照组，灌胃体积0.1 mL/10 g·bw，空白对照组给予等体积蒸馏水，1次/d，连续灌胃30 d。1.2.4.2 ConA 诱导的小鼠淋巴细胞转化试验灌胃30 d 后，处死小鼠，无菌取脾，制细胞悬液，用ＲPMI1640 培养液调整细胞浓度为3 × 106 个/mL。将细胞悬液分两孔加入24 孔培养板，每孔1 mL，一孔加75 μL ConA 液( 100 μg /mL) ，另一孔作对照，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养72 h。培养结束后，用酶标仪按MTT 法在570 nm 测定OD 值。淋巴细胞增殖能力= 加ConA 孔的OD 值－不加ConA 孔的OD 值1.2.4.3 迟发型变态反应灌胃30 d 后，每鼠腹部剃毛( 3 cm × 3 cm) ，以10 mg /mL DNFB 溶液50 μL均匀涂抹致敏。5 d 后以10 mg /mL DNFB 溶液10 μL均匀涂抹于小鼠右耳( 两面) 攻击，攻击24 h后处死小鼠，分别以打孔器取左右耳片( d = 8 mm) ，称重。耳重差( mg) = 右耳重( mg) －左耳重( mg) 。1.2.4.4 抗体生成细胞检测灌胃30 d 后，每鼠腹腔注射0.2 mL 2%( v /v) SＲBC 悬液免疫，4d 后处死小鼠，取脾，制细胞悬液，按Jerne 改良玻片法检测溶血空斑数。溶血空斑数= 溶血空斑计数× 320。1.2.4.5 小鼠碳廓清试验灌胃30 d 后，每鼠尾静脉注入4 倍稀释的印度墨汁( 0.1 mL /10 g·bw) ，注入后2 min 及10 min 时分别从眼内眦静脉丛取血20 μL，加入2 mL 0.1% Na2CO3溶液中，用酶标仪在600 nm 处测OD 值，并取胸腺、肝、脾称重，计算胸腺/体比、脾/体比和吞噬指数a。K = ( lgOD1－ lgOD2) / ( t2－ t1) ，a = 体重/ ( 肝重+ 脾重) × K1 /3。1.2.4.6 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验试验前4 d 给每鼠腹腔注射2% 压积羊血红细胞0.2 mL。处死小鼠，腹腔注射加小牛血清的Hank’s液( 4 mL /只) ，轻轻按揉腹部20 次，然后将腹壁剪开一个小口，吸取腹腔洗液2 mL 于试管内。吸取0.5 mL腹腔洗液加入盛有0.5 mL 1% 鸡血红细胞悬液的试管内，混匀。取混合液加入玻片琼脂圈内，37 ℃孵育15～20 min。孵育后将未贴壁细胞洗掉，固定，Giemsa 染色，洗片，晾干，显微镜计数，计算吞噬率和吞噬指数。吞噬百分率( %) = 吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的吞噬细胞数× 100，吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数。1.3 数据分析数据均以珋x ± s 表示，用SPSS 软件对各实验原始数据进行方差分析。以P ＜ 0.01 作为非极显著性差异，P ＜ 0.05 作为显著性差异。2 结果与分析2.1 苯乙醇苷提取物的巨噬细胞激活作用2.1.1 苯乙醇苷提取物对ＲAW264.7 细胞吞噬活性的影响本实验首先研究了25、50、75、100、125 g /L苯乙醇苷提取物对ＲAW264.7 细胞吞噬活性的影响。结果表明，LPS 组细胞吞噬活性相比空白对照组具有极显著差异( P ＜ 0.01) ， 75、100 g /L 组样品可极显著提高细胞吞噬活性( P ＜ 0.01) ，125 g /L 组可显著增强细胞吞噬活性( P ＜ 0.05) ，提示苯乙醇苷提取物具有激活巨噬细胞的作用，见图1。2.1.2 苯乙醇苷提取物对ＲAW264.7 细胞NO、iNOS、TNF－α 和IL－6 释放的影响为了进一步明确苯乙醇苷提取物对巨噬细胞的激活作用，分别检测了巨噬细胞经不同浓度样品刺激后，细胞上清液中NO、iNOS、TNF－ α 和IL － 6 的含量。结果表明，LPS 组NO、iNOS、TNF－α 和IL－6 相比空白对照组均具有极显著差异( P ＜ 0.01) ， 75、100、125 g /L 苯乙醇苷提取物组均能改善ＲAW264.7 细胞NO 生成量、iNOS 活性和TNF－α 分泌水平，50、75、100、125 g /L 苯乙醇苷提取物组还能提高ＲAW264.7 细胞IL－6 分泌水平，其中，100、125 g /L 组样品的作用具有极显著差异( P ＜ 0.01) ，这也提示苯乙醇苷提取物可能通过促进巨噬细胞表达TNF－ α、IL－6 从而激活免疫吞噬功能，见图2～ 图5。2.2 苯乙醇苷提取物及其与当归和黄芪提取物的组合物对巨噬细胞激活作用的比较通过对比苯乙醇苷提取物A、苯乙醇苷提取物:当归提取物( 15∶ 18) 的组合物B、苯乙醇苷提取物:当归提取物: 当归提取物( 15∶ 18∶ 22) 的组合物C 对巨噬细胞吞噬活性和NO 释放的影响，考察3 者是否具有协同增效的作用，为下一步复方片剂的制备提供依据。结果表明，LPS 组细胞吞噬活性和NO 释放量相比空白对照组均具有极显著差异( P ＜ 0.01) ，A、B 仅有高剂量组能提高巨噬细胞吞噬活性和NO 释放量( P ＜ 0.05) ，而以3 种提取物共同制备的组合物C 低、高剂量组均能提高巨噬细胞吞噬活性和NO 释放量，并且，C 高剂量组对巨噬细胞吞噬活性和NO分泌的影响具有极显著差异( P ＜ 0.01) ，即苯乙醇苷提取物、当归提取物、黄芪提取物在激活巨噬细胞方面具有协同作用，故以组合物C 的配比为依据制备复方片剂继续考察其对正常小鼠的免疫调节活性，见图6～图7。2.3 复方片剂对正常小鼠的免疫调节活性为了进一步证明苯乙醇苷提取物、当归提取物和黄芪提取物配伍在增强免疫力方面的实际效果，通过动物实验，综合考察以3 者制备的复方片剂对正常小鼠细胞免疫、体液免疫、单核－ 巨噬细胞功能和NK 细胞活性的影响。2.3.1 ConA 诱导的小鼠淋巴细胞转化试验淋巴细胞的增殖和分化是机体免疫反应中的重要阶段，淋巴细胞受到抗原或者促有丝分裂原刺激时增殖能力的大小，可以反映机体的免疫功能状态［16］。0.4、1.2 g /kg·bw /d 组小鼠淋巴细胞中加ConA 孔与不加ConA 孔的OD 值差值显著高于空白对照组( P ＜ 0.05) ，说明样品可以增强ConA 诱导的淋巴细胞增殖能力，即其可以促进机体的免疫反应，见表1。2.3.2 迟发型变态反应1.2 g /kg·bw /d 组小鼠耳壳增重显著高于空白对照组( P ＜ 0.05) ，说明抗原攻击局部引起了炎症反应导致的肿胀［17－18］，并且样品可以增强这一作用，即样品能够增强DNFB 诱发的迟发型变态反应，综合“2.3.1”结果，可以判定样品能够促进小鼠的细胞免疫功能，见表2。2.3.3 抗体生成细胞检测抗原特异性抗体的产生可以裂解抗原致敏后的绵羊红细胞，从而在抗体形成细胞周围形成溶血空斑。0.4 g /kg·bw /d 组小鼠溶血空斑数显著高于空白对照组( P ＜ 0.05) ，说明样品可以促进抗体生成，即其对小鼠特异性体液免疫有积极影响，见表3。2.3.4 小鼠碳廓清试验单核巨噬细胞系统能够快速吞噬廓清异体颗粒和某些可溶性异物，并可迅速清除自体产生的某些有害物质，是机体最重要的防御系统［19］。1.2 g /kg·bw /d 组小鼠碳廓清吞噬指数a显著高于空白对照组( P ＜ 0.05) ，表明样品可以提高小鼠碳廓清能力，增强单核－ 巨噬细胞系统吞噬功能，并且，“2.2”结果也显示混合物在体外可以激活巨噬细胞，提高其吞噬活性，说明样品可以增强机体的非特异性免疫功能［20］，见表4。2.3.5 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验鸡红细胞对于小鼠是一种较强的抗原，其与小鼠腹腔巨噬细胞共孵育一定时间后，会被吞噬，吞噬百分率和吞噬指数可以反映小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力［21］。1.2 g /kg·bw /d 组吞噬百分率及吞噬指数均显著高于空白对照组( P ＜ 0.05) ，表明样品可以提高巨噬细胞的吞噬能力，综合“2.3.4”结果可以判定样品可以通过影响正常小鼠单核－ 巨噬细胞系统的吞噬功能发挥增强免疫力的作用，见表5。3 结论巨噬细胞在机体内不仅起呈递抗原的作用，还可通过非特异性吞噬病原微生物和肿瘤细胞等维持机体稳态，在宿主防御系统中占重要地位［22］。NO 是杀伤病原微生物和肿瘤细胞的主要物质，激活的巨噬细胞可以合成大量NO，从而杀伤微生物、寄生虫和肿瘤细胞［22］。iNOS 则是其合成的关键酶之一，当巨噬细胞被激活时会大量表达iNOS，进而诱发机体产生NO，可发挥防御作用［22］。TNF－α 和IL－6 则是巨噬细胞分泌的2 种主要炎性因子，不仅参与机体免疫应答反应，而且对机体的免疫反应有重要调节作用［23］。因此，本实验选择这些指标研究德赢vwin登录 苯乙醇苷的巨噬细胞激活作用，并考察其与当归和黄芪提取物的协同作用。结果表明，75、100、125 g /L的德赢vwin登录 苯乙醇苷提取物可显著提高细胞对中性红的吞噬能力，说明其可提高机体的非特异性免疫，并且可能是通过诱导iNOS 表达提高刺激巨噬细胞合成NO，同时刺激巨噬细胞释放TNF－ α和IL－6，激活细胞免疫吞噬功能。此外，当归提取物、黄芪提取物可明显提升苯乙醇苷提取物对巨噬细胞的激活作用，即三者在巨噬细胞激活方面具有协同增效作用。肉苁蓉补肾气、益精血［24］，当归补血活血［25］，黄芪补诸虚不足、益元气、壮脾胃［26］，三者合用，平补阴阳，调养五脏，温而不燥，补而不腻，性味平和，无阴阳偏盛之弊，全方共奏补肾填精养血活血之功效，因而能够发挥增强机体免疫力的功效。动物实验也证明，以3 者作为原料制备的复方片剂，可以提高正常小鼠淋巴细胞增殖能力、促进抗原攻击下的迟发型变态反应、提高小鼠体内碳颗粒被清除的速率、巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力和脾细胞抗体生成能力，但是，对溶血素水平、NK 细胞活性没有积极影响( 数据未列出) 。根据《保健食品检验与评价技术规范》之标准［15］，受试样品在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核－巨噬细胞功能、NK 细胞活性4 个方面任2个方面结果为阳性，即具有增强免疫力功能。因此，可以判定本复方片剂具有增强免疫力功能，且主要是通过调节正常小鼠细胞免疫、单核－巨噬细胞功能发挥增强免疫力作用的。参考文献［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典( 2015 年版一部)［M］.2015 年版一部.北京: 化学工业出版社，2015: 135.［2］ＲunLan Cai Ｒ，MeiHua Yan，Yue Shi，et al.Antifatigueactivity of phenylethanoid－rich extract from Cistanche deserticola［J］.Phytotherapy Ｒesearch，2010，24( 2) : 313－315.［3］ZweLing Kong，Athira Johnson，FanChi Ko，et al.Effect ofCistanche tubulosa extracts on male reproductive function instreptozotocin－nicotinamide－ induced diabetic rats［J］.Nutrients，2018，10( 10) : 1562－1584.［4 ］ Xiaoming Wang， Jinfang Wang，Huanyu Guan， etal. 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摘要：目的 通过对甘肃省3 种肉苁蓉药材的生态适宜性进行评价，为选取种植区域及合理利用优质肉苁蓉药材资源提供依据。方法 通过查阅网络资料和实地采集，收集甘肃省肉苁蓉药材共197 个样点信息，其中肉苁蓉87 个样点，沙苁蓉50 个样点，盐生肉苁蓉60 个样点，综合55 个生态因子，采用地理信息系统和最大熵模型分析肉苁蓉药材在甘肃省的生态适宜性分布。结果 影响甘肃省3 种肉苁蓉药材生态适宜性的主要生态因子是海拔、植被类型、土壤亚类、降雨和温度；甘肃省肉苁蓉最适宜生境主要集中在河西地区和白银市，但物种不同，各地区分布面积及空间格局存在差异，因此不同种肉苁蓉进行人工种植时应加以区分。结论 本研究结果与目前甘肃省肉苁蓉药材的产区一致，可为合理选择优质肉苁蓉种植区提供依据。关键词：肉苁蓉；沙苁蓉；盐生肉苁蓉；生态适宜性肉苁蓉为列当科Orobanchaceae 肉苁蓉属植物肉苁蓉Cistanche deserticola Y.C.Ma.和德赢vwin登录 C.tubulosa（Schenk）Wight 的干燥带鳞叶肉质茎，别名疆芸、寸芸、苁蓉、查干告亚（蒙语），具有补肾阳、益精血、润肠道功效[1]，素有“沙漠人参”之美誉，是传统名贵中药材。近年随着乱采滥挖日趋严重，甘肃省肉苁蓉资源濒临枯竭；另外，甘肃省许多地区大面积种植肉苁蓉，但因不同品种混用，以及缺乏相应的系统性适宜生境研究，导致肉苁蓉药材良莠不齐。因此，研究不同种肉苁蓉药材的生境适宜性，明确其范围，已成为亟需解决的问题。笔者通过收集甘肃省3 种肉苁蓉样点信息，结合生态因子数据，采用最大熵（MaxEnt）模型预测其生态适宜分布区，并利用地理信息系统（GIS）技术将其表现出来，以期为优质肉苁蓉的人工栽培选地提供依据。1 资料与方法1.1 药材分布信息通过自采和查阅中国数字植物标本馆（http://www.cvh.ac.cn），共收集197 个样点信息，其中肉苁蓉87 个样点，沙苁蓉50 个样点，盐生肉苁蓉60 个样点。将物种名、分布地区的物种名存储为MaxEnt 模型要求的.csv 格式。样点分布详见图1，样点信息见表1。1.2 生态因子数据本研究使用来源于“中药资源空间信息网络数据库”（http://www.tcm-resources.com/）的生态因子数据（降水、温度、植被类型和土壤），选取适应肉苁蓉药材生长的所有生态因子数据。1.3 最大熵模型参数设置将转换为.csv 格式的肉苁蓉药材样点信息导入MaxEnt3.4.0软件，设置建模参数，随机测试比例15%，设置响应曲线、ROC 曲线和刀切法。用响应曲线评价生态因子适宜度范围，用ROC 曲线及曲线下面积（即AUC 值）评价模型精度，用刀切法检验生态因子的权重。1.4 模型预测评价采用AUC 值评价预测结果精度，取值范围0～1，值越大表示模型判断力越强。1.5 生态因子筛选导入3 种肉苁蓉药材的采集信息和55 个生态因子，进行迭代运算，舍弃贡献因子为0 的生态因子，得到对肉苁蓉药材生长影响贡献率较高的主要生态因子，依据响应曲线得到适宜范围。1.6 生态适宜区划分将MaxEnt 导出的结果导入GIS，参照生态适宜度最小值及正态分布曲线的均值（μ）和均方差（δ），以[0，μ－δ]为不适宜区，[μ－δ，μ]为次适宜区，[μ，1]为最适宜区，绘制3 种肉苁蓉药材生态适宜性区划分布图。2 结果与分析2.1 刀切图结果肉苁蓉、沙苁蓉、盐生肉苁蓉的ROC 曲线训练数据集AUC 分别为0.996、0.998、0.998，测试数据集AUC 分别为0.992、0.997、0.998，均为0.9～1，表明MaxEnt 模型预测肉苁蓉药材在甘肃省的潜在分布准确度和可信度都很高。肉苁蓉、沙苁蓉、盐生肉苁蓉刀切法检验结果见图2～图4，肉苁蓉、沙苁蓉、盐生肉苁蓉训练集的ROC 曲线见图5～图7。2.2 主要生态因子筛选55 个生态因子，其中20 个对肉苁蓉生态适宜性有贡献，10 个为影响肉苁蓉适宜性的主要生态因子，贡献率总和为95.400 5%；20 个对沙苁蓉生态适宜性有贡献，8 个为影响沙苁蓉适宜性的主要生态因子，贡献率总和为96.871 7%；22 个对盐生肉苁蓉生态适宜性有贡献，10 个为影响盐生肉苁蓉适宜性的主要生态因子，贡献率总和为95.671 1%。海拔、植被类型、土壤亚类、降雨、温度均为影响3 种肉苁蓉药材生长的主要生态因子。3 种肉苁蓉主要生态因子适宜值详见表2～表4。2.3 生态适宜性区划肉苁蓉药材的生态适宜区分布县见表5。肉苁蓉最适宜区包括酒泉南部边缘地区、张掖西部、金昌东部、武威南部、白银市，次适宜区为酒泉市中北部、张掖市中北部、金昌西部、武威北部、兰州市、定西市北部、临夏回族自治州北部。见图8。沙苁蓉最适宜区包括酒泉东部边缘、武威东部、白银市、兰州市，次适宜区为酒泉中东部边缘地区、定西市北部、临夏市部分地区。见图9。盐生肉苁蓉最适宜区包括张掖市北部、白银市为肉苁蓉适宜区，次适宜区为酒泉市东部部分地区、张掖市中部、金昌市、武威市中部、兰州部分地区、临夏部分地区。见图10。

摘要德赢vwin登录 和淫羊藿是我国几千年来一直用于强身健体的两种中药。牛磺酸和锌是现代医学中人体的重要组成部分。根据中药配伍的原理，由德赢vwin登录 、淫羊藿、牛磺酸和葡萄糖酸锌组成了复方德赢vwin登录 片。本研究旨在评价新型保健品复方德赢vwin登录 片对小鼠的抗疲劳作用，并探索其抗疲劳作用的机制。选用雄性小鼠，设低、中、高剂量和阴性对照组，分别给予复方德赢vwin登录 片产品和等量纯水，连续灌胃30 天后，测定各组小鼠负重游泳时间、血清尿素氮含量、肝糖原含量和血乳酸水平。与阴性对照组比较，复方德赢vwin登录 片能显著增加小鼠负重游泳时间，加速血乳酸清除，提高肝糖原水平。这些结果表明，复方德赢vwin登录 片能延缓疲劳的产生，这可能与复方德赢vwin登录 片的抗氧化应激效应有关。关键词复方德赢vwin登录 片抗疲劳雄性小鼠抗氧化应激疲劳是体力劳动或脑力劳动后的一个生理过程， 涉及工作能力和活力的显著下降［1］。这可能是由于能量资源消耗、身体内部环境紊乱等原因造成的［2］。当今社会的快速发展，给人们的生活和工作带来了巨大的压力，疲劳已成为一种严重的现象［3］。因此，有必要找到有效的缓解疲劳的方法。肉苁蓉作为补肾、补阳、补血的滋补药，在我国已有2000 多年的历史［4］。药理研究表明，它们具有抗氧化、清除一氧化氮自由基［5］、增强机体免疫力、抗衰老［6］、改善性功能、抗炎、神经保护等多种生物学活性［7-10］。此外，先前的一项研究发现，肉苁蓉的甲醇提取物可提高心肌ATP 生成能力［11］。淫羊藿是“补肾”、“补骨”的著名中药［12］。现代医学研究表明，淫羊藿提取物的主要活性成分是多糖、黄酮苷类、木脂素、萜类和厚朴生物碱［13］，可用于治疗骨质疏松症、心血管疾病、类风湿性关节炎［14］、性功能障碍和炎症等［15， 16］。此外，淫羊藿经常与肉苁蓉一起使用，以提高其疗效［17］。牛磺酸是人体内最丰富的游离氨基酸之一。它可以在几乎所有的组织中发现，特别是心脏、大脑、视网膜、骨骼肌和血小板等［18］。牛磺酸的生理功能有结合胆汁酸、抗氧化、解毒、渗透调节、膜稳定、神经调节等［19， 20］。锌是人体不可缺少的微量元素之一，几乎存在于人体所有的活性酶中［21］。它可以通过维持金属硫蛋白［22］来保护生物结构免受自由基诱导的损伤。在免疫反应调节、伤口愈合等方面也发挥着重要作用［23］。葡萄糖酸锌具有生物利用度高、易于吸收等优点，被广泛应用。根据中药配伍的原则，我们研究的复方德赢vwin登录 片是肉苁蓉、淫羊藿、牛磺酸和葡萄糖酸锌的全新组合，它综合这四种组成成分的功效，能增强抗疲劳效果。本试验通过强迫游泳试验，为复方德赢vwin登录 片的抗疲劳性能评价提供依据。1 材料和方法1． 1 材料复方德赢vwin登录 片由德赢vwin登录 提取物( 折合生药材4． 0 g /d) 、淫羊藿提取物( 折合生药材4． 0 g /d) 、牛磺酸( 0． 4 g /d) 、葡萄糖酸锌( 折合锌10 mg /d) 组成。片剂折合剂量为0． 066 g /kg． Bw。1． 2 主要仪器和试剂BS － 420 全自动生化分析仪( 深圳迈瑞) 、UV 紫外可见分光光度计、JD500 － 2 电子天平。试剂盒( 南京建成赛浩科技有限公司) 、生化分析试剂( 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司) 等。1． 3 试验动物分组及剂量确定SPF 级雄性昆明种小鼠，体重18 ～ 22 g［东南大学医学院实验动物中心生产许可证号: SCXK( 陕)2012 － 003，SCXK( 京) 2012 － 0001］。选取预游泳姿势正确的小鼠160 只，随机分为4 个试验组，每组40只。各试验组均设三个剂量组和阴性对照组，每剂量组小鼠各10 只。试验一组负重游泳试验，试验二组血清尿素氮试验，试验三组肝糖原试验，试验四组血乳酸试验。因人体每日推荐量为4． 0 g /60 kg． Bw ( 0． 066g /kg． Bw) ，故称取1． 98 g、1． 32 g、0． 66 g 样品，分别加蒸馏水至20 mL，混合均匀，定为高、中、低剂量组，另设阴性( 蒸馏水) 对照组。试验组经口给予相应剂量药品( 1 次/天) ，灌胃体积为20 mL /kg． Bw。阴性对照组给予等体积蒸馏水，连续灌胃30 天。然后，分别进行各项指标的测定。1． 4 方法1． 4． 1 小鼠负重游泳试验末次给药30 min 后，在小鼠尾根部负荷5%体重的铅皮，置于游泳箱中游泳( 水深35 cm，水温25℃) 。记录各组小鼠自游泳开始至死亡的时间( 沉至游泳箱底并停止张口呼吸) ，以及小鼠试验前后体重变化。1． 4． 2 小鼠血清尿素氮测定末次给药30 min 后，不负重的情况下置于游泳箱中游泳90 min( 水温30℃) ，休息60 min 后眼球采血0． 5 mL，离心15 min，血清用全自动生化分析仪进行血清尿素氮测定。1． 4． 3 小鼠肝糖原测定末次给药30 min 后处死，解剖取出肝脏，用生理盐水清洗干净，滤纸吸干后按试剂盒要求进行肝糖原测定。1． 4． 4 小鼠血乳酸测定末次给药30 min 后，不负重的情况下置于游泳箱中游泳10 min( 水温30℃) ，于游泳前、游泳后及休息20min 后，各采血三次( 内眦采血， 20μL) ，测定血乳酸含量。血乳酸曲线下的面积( AUC) ［24］根据以下公式计算:Cs =1/2 !( C0 + C1) !10 +1/2 !( C1 + C2) !20Cs 是血乳酸曲线下的面积。C0、C1 和C2 分别是游泳前、游泳后和休息20 min 后小鼠的血乳酸浓度。1． 4． 5 数据统计处理所有统计数据均采用SPSS 17． 0 版Windows 软件进行。通过单因素方差分析估计各组间的差异。数据表示为平均值± 标准差( X ± S) 。概率值( P) 小于0． 05 被认为具有统计学意义。2 结果2． 1 对体重的作用试验过程中及时记录小鼠体重，如表1。与对照组相比，各剂量组体重变化无显著性差异( P ＞0． 05) 。2． 2 对小鼠耐力的作用由图1 可见，饲喂复方德赢vwin登录 片高、中、低剂量组的小鼠游泳力竭时间均得到不同程度的延长，其中高剂量组小鼠游泳力竭时间与阴性对照组相比，呈极显著差异( P ＜ 0． 01) ，说明高剂量组可以显著提高游泳力竭时间，小鼠的运动耐力显著增强。2． 3 对小鼠血清尿素氮的作用由图2 可见，相较于阴性对照组，饲喂复方德赢vwin登录 片低剂量组小鼠的血清尿素氮有所下降，但下降无显著性差异( P ＞ 0． 05) 。而高、中剂量组比阴性对照组的血清尿素氮稍有升高，仍无显著性差异。这说明复方德赢vwin登录 片对运动小鼠的血清尿素氮含量的影响不显著。2． 4 对小鼠肝糖原水平的作用由图3 可见，饲喂复方德赢vwin登录 片的高、中、低剂量组小鼠的肝糖原含量比阴性对照组均有不同程度的增加。其中高剂量组肝糖原含量的增加相较于对照组有显著性差异( P ＜ 0． 05) 。2． 5 对小鼠血乳酸含量的作用由表2 可见，饲喂复方德赢vwin登录 片的高、中、低剂量组小鼠的三个时间点血乳酸曲线下面积均小于阴性对照组，且高剂量组与阴性对照组相比有显著性差异( P ＜ 0． 05) 。3 讨论疲劳是运动后机体产生的一种复杂的应激性反应。运动耐力宏观反应了机体抗疲劳的能力，而负重游泳时间的长短直接体现了运动耐力的情况，对评价抗疲劳和运动耐力有重要意义［25］。试验结果显示，复方德赢vwin登录 片高、中、低剂量组都不同程度地增长了力竭时间，特别是高剂量组更是显著性的延长了小鼠的力竭时间，提示复方德赢vwin登录 片可以显著提高机体的运动耐力，延缓疲劳的产生。为了进一步研究复方德赢vwin登录 片的抗疲劳性能，测定了几种与疲劳相关的生化指标—肝糖原、血乳酸和血清尿素氮。文献报道［26］，运动衰竭是伴随糖原的耗竭产生的。当剧烈运动时，血糖和肌糖原的消耗急剧上升，这时肝糖原就会转化为血糖以维持机体的血糖平衡，因此，肝糖原的含量是反映机体疲劳程度的敏感指标之一。试验中，饲喂复方德赢vwin登录 片的各剂量组肝糖原的含量明显比对照组高，特别是高剂量组相较于阴性对照组有显著性差异，提示复方德赢vwin登录 片可以维持运动后肝糖原的含量，使机体有较好的能量储备，减缓疲劳的产生。剧烈运动时，机体代谢加快，产生的代谢产物乳酸进入血液使肌肉酸痛，因此血乳酸水平可以直接反应机体的疲劳程度。试验结果显示饲喂复方德赢vwin登录 片的剂量组运动后血乳酸水平比阴性对照组低，且高剂量组相较于对照组有显著性差异，提示复方德赢vwin登录 片可以显著降低机体运动后血乳酸水平，从而延缓疲劳的产生。蛋白质和氨基酸代谢分解为尿素，来不及排泄时，堆积在体内，影响机体内环境的相对稳定，从而使机体感到疲劳［27］。因此血清尿素氮含量的高低也是评价机体疲劳的重要指标［28］。但是，一般程度的运动蛋白质参与很少，只有当糖和脂肪代谢不足以为机体提供足够的能量时，蛋白质与氨基酸的分解代谢才会加强，以补充机体对能量的需求。试验结果显示，相较于阴性对照组，饲喂复方德赢vwin登录 片的各剂量组的血清尿素氮含量没有显著性差异。可能复方德赢vwin登录 片对机体运动后血清尿素氮的清除没有太大影响或者是因为肝糖原储备量的增加导致参与代谢的蛋白质和氨基酸变化不大，这需要更多的试验来验证。过度运动会破坏氧化和抗氧化系统之间的平衡［29］。氧化应激已被证明与疲劳有关。药理研究表明，复方德赢vwin登录 片的组分具有不同程度的抗氧化和自由基清除作用，因此，能有效缓解氧化应激，使其具有抗疲劳作用。参考文献［1 ］Xi，X． ; Guo，S． ; Guo，H． et al． Anti － exercise － fatigueand promotion of sexual interest activity of total flavonoidsfrom wasps drone － pupae in male mice ［J］． Biomed．Pharmacother． 2018，107: 254 -261．［2 ］Li，Z． ; Wu，F． ; Shao，H． et al． Does the Fragrance ofEssential Oils Alleviate the Fatigue Induced by Exercise? 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【摘要】　该文总结中药特色技术传承项目轮转游学培训中的道地药材产区变化。举例说明了由于道地药材野生资源匮乏、大量栽培及新栽培技术的应用和栽培区域地理气候的优势等原因，道地药材的产区在发生着变化，指出道地药材产区变化是随着时代的发展产生适应性变化，有助于解决优质中药供应问题。提出应当充分了解道地药材的生长习性和质量评判标准，在栽培上选择合适区域进行指导性栽培，不能盲目栽培，才能保持中药质量的优质性、稳定性及可控性，同时提出生态种植是未来道地中药材栽培种植的方向。【关键词】　道地药材；产区；栽培；肉花蓉；黄芪；红花国家中医药管理局自２０１３年启动中药特色技术传承培训项目，笔者是２０１８级第３批全国中药传承学员，从２０１８年下半年开始参加全国各地的基地轮转游学培训，在中药资源方面收获颇多。以往笔者一直认为道地药材质量好，采购中药饮片一定要选择传统道地产区的药材，而在实际工作中有时采购不到传统道地产区的中药。通过游学基地的老师授课和实地了解发现，中药饮片道地产区发生了变化，如红花，原来河南属于道地产区，但目前产量减少，市场货源很少，很难采购，目前市场主流的红花产区是新疆，质量优良。由此表明道地药材的产区在发生着变化，有的已经和本草书上的记载不同。黑龙江中医药大学王振月教授认为，道地药材不是一成不变，只要是好的遗传基因加上产地因素和人文因素，符合高质高产高效，就可以称为道地药材。如黑龙江的西洋参，虽然道地药材是加拿大，但黑龙江最早引种，产量大，质量优，口碑好，已成为国内认可的道地药材。王振月教授关于道地药材的上述看法，笔者认为很有道理。本文探讨分析道地药材产区变化的主要原因。１　道地药材产区变化的主要原因　１．１　大量人工栽培　由于中药野生资源的匮乏及急剧减少，中药人工栽培量越来越大，且中药的栽培已经突破传统道地产区，进而使道地药材的产区发生了变化。如防风，原来的道地产区是东北地区，俗称关防风。但中国中医药报报道显示，目前东北地区的野生资源濒临枯竭，可供货源不多。市场主要以家种防风为主，其主产地是河北、内蒙古，这两处产的防风含量达标，质量最好［１］。用途上，河北省以防风饮片供应为主，主产于石家庄行唐、保定安国。内蒙古产地家种防风为籽播１年生品种，单产量相对较低，但其更受药厂采购方的青睐，价格也高于秧播的河北防风。诸如此类的还有很多，如天麻、茯苓、猪苓等野生资源大幅度减少，人工栽种大幅增加，使原有道地产区的产量发生明显变化，在市场供应中的份额也有明显改变。１．２　新栽培技术应用　新栽培技术的产生，改变了道地药材各产区的产量。如肉苁蓉，《中华人民共和国药典》（以下简称“药典”）收载的是荒漠肉苁蓉，主产于内蒙古，新疆产量少。由于新疆野生资源急剧减少，寄主梭梭被大量砍伐、挖掘，固沙植被破坏，土地荒漠化加重。但其有着适合梭梭和柽柳生长的广大沙漠区域，广泛种植梭梭和柽柳有助于固沙防沙。新疆基地李永和老师称，随着肉苁蓉在梭梭上接种、德赢vwin登录 在柽柳上接种研究的成功，在改善植被的情况下大面积接种肉苁蓉和德赢vwin登录 ，极大地提高了肉苁蓉和德赢vwin登录 的产量。德赢vwin登录 被列入２０１５年版药典，并开发出多种产品。新疆基地贾晓光老师称，全国肉苁蓉产量中，新疆的德赢vwin登录 占１００％；新疆荒漠肉苁蓉占６０％，有力保障了全国肉苁蓉的市场需求。１．３　地理环境及气候条件　地理环境及气候条件的优势，改变了道地药材各产区的产量。如红花，是活血化瘀的常用药，原产于欧洲及中亚地区，先引种到河南、山东、四川和云南等地区，河南种植的红花称“怀红花”，为道地药材。但由于时代变迁、土地紧张等因素，除云南外，其他产区逐渐减少。最早新疆也有分布，产量不大，但新疆具有地理气候的优势，地广人稀，土地资源丰富，机械化操作方便，同时日照时间充足，气温温差大，降雨量少，极适合红花等喜光耐旱中药种植。近年来，新疆红花种植面积逐步扩大，２０１０年最高峰时种植面积可达７０万亩以上，年产红花高达7000～8000吨，占全国产量的８０％，后经调减，到２０１６年时产能占比仍达到７５％以上，产量在4500吨以上，成为名副其实的红花主产区，且质量也优，形成了红花新的道地产区［２］。２　分析　道地药材的产区变化是随着时代前进的适应性变化，有助于解决优质中药供应问题。但也应当看到，在经济利益驱动下，也存在着中药引种的随意性、不科学性，南药北种、北药南栽的现象，导致中药质量下降。笔者认为应当充分了解道地药材的生长习性和质量评定标准，在栽培上选择合适区域进行指导性栽培，不能盲目栽培，保持中药质量的优质性和稳定性、可控性。内蒙古基地的张春红老师授课时讲到，其团队利用ＡｒｃＧＩＳ技术和最大信息熵Ｍａｘｅｎｔ模型进行内蒙古地区肉苁蓉、蒙古黄芪、赤芍等的适宜性区划研究，找出影响内蒙古黄芪等药材适宜性分布的主要生态因子，总结出其适宜性区划分布区域生态特征，指出在内蒙古自治区的适宜性分布区域，为今后内蒙古黄芪等药材的适宜性区域种植及道地性研究提供基础和借鉴。笔者认为这种研究及模式完全可以推广到全国范围及所有道地药材，用于道地药材栽培种植的指导和规范，这样栽培的道地药材才能在保障中药产量和满足使用的基础上保持高品质。同时内蒙古有着生态种植中药材的经验，与经济作物的套种，十分成功。如内蒙古黄芪和马铃薯的套种及结合牧业，形成良好的生态种植养殖业，既提高了产量，又提高了品质。因为大部分中药材种植不能连续耕作，笔者认为生态种植是未来道地中药材种植的方向，值得在全国推广借鉴。３　小结　笔者认为中药材既要讲究传统道地，又要与时代同行，适应道地药材的产区变化。同时在中药材栽培种植上要科学规划，提倡生态种植，确保道地，保证质量，保障应用。参考文献［１］中药材天地网．防风成交量大，市场平稳［Ｎ］．中国中医药报，２０１９－１－１８（６）．［２］中药材天地网．红花产量大减，市场紧俏［Ｎ］．中国中医药报，２０１７－８－１０（６） ．

摘要：【目的】采用“中医传承辅助平台（V2.5）”探讨崔学教教授治疗阳痿的用药规律。【方法】收集2017年5月至2019年5月崔学教教授于广州中医药大学第一附属医院外科（男科）门诊诊治阳痿的有效病例的病案，对收集到的数据分别进行用药频次、四气五味及功效分类的统计，并对治疗阳痿的组方规律、候选新方进行数据挖掘。【结果】筛选出138例患者的处方，使用的中药为116味，共计5 593次。用药频次居前3位的为淫羊藿、巴戟天、肉苁蓉；药物的四气主要以温、平为主，药物的五味以甘、辛、咸为主；药物的功效分类中居前3位的分别为补虚药、收涩药、活血化瘀药。经关联规则分析和聚类分析后，提取出15组药物核心组合和5首新处方。【结论】崔学教教授认为肝肾亏虚、气滞血瘀是阳痿主要病机，治疗阳痿主要采用温肾补肝的药物，并辅以活血化瘀通经之药。关键词：阳痿；温肾补肝；活血化瘀通经；用药规律；崔学教阳痿是指阴茎痿软不起或勃而不坚或坚而不久，以致不能维持正常性生活的一种病症。随着现代生活节奏加快、生活环境变化、饮食结构改变及精神压力增大等，阳痿的发病率不断增高，且发病人群趋向年轻化，给男性同胞的交际、生活及精神带来了不良的影响。中医治疗阳痿，明清以前医家多认为阳痿与肾虚有关，多以补肾为主；从明代开始，诸医家从不同角度认识阳痿，认为郁火、湿热、情志皆为阳痿发病的重要因素，治疗上多采用补泻结合的思路；到清代，各医家提出阳痿辨证应先辨虚实，不宜一味补益，通过疏肝调畅情志诊治阳痿。崔学教教授为国家第三批名老中医药专家学术经验继承工作指导老师、广州中医药大学教授、博士研究生导师。崔学教教授师古不泥古，对阳痿的治疗有独到之处。本研究采用数据挖掘方法对崔学教教授治疗阳痿的用药特点进行分析，以期为临床治疗阳痿提供依据。1 资料与方法1. 1 病案数据来源收集2017年5月至2019年5月崔学教教授于广州中医药大学第一附属医院外科（男科）门诊诊治阳痿的有效病例的病案数据。1. 2 病案患者的诊断标准1. 2. 1 西医诊断标准参照《男科病诊治学》[1]、《中国男科疾病诊断治疗指南与专家共识》（2016年版）阳痿诊断标准及勃起功能国际问卷-5（IIEF-5）评分[2]：阴茎持续无法达到或维持足够的勃起以获取满意的性生活，且病程在3个月以上；IIEF-5评分小于22分者。1. 2. 2 中医辨证分型参照《中药新药临床研究指导原则·阳痿》[3]及普通高等教育“十五”国家规划教材《中医内科学》（2011年版）[4]，并根据崔学教教授多年的临床经验，拟定肾气虚衰证、肾阳亏虚证、肾阴亏虚证、肝气郁结证4个基本证型。1. 3 病案的纳入标准（1）符合阳痿中医及西医诊断标准并于2017年5月至2019年5月期间在崔学教教授门诊就诊的有效病例；（2）均服用中药治疗；（3）依从性良好，且配偶性欲正常，能配合治疗；（4）为了保证处方的有效性，采集复诊次数不少于两次的患者，且毎名患者采集处方不超过5张。1. 4 病案的排除标准（1）不符合纳入标准者；（2）资料不全者；（3）依从性差，配偶性欲异常，不能配合治疗者。1. 5 中药名称的规范中药名、中药功效归类的规范参考2015年版《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》），如“酒萸肉”以“山茱萸”录入，“酒苁蓉”以“肉苁蓉”录入，“盐巴戟天”以“巴戟天”录入等。1. 6 数据分析本研究主要采用“中医传承辅助系统（V2.5）”对收集到的数据分别进行用药频次、四气五味及功效分类的统计，以及分析组方规律、挖掘新方等。2 结果2. 1 用药频次分析经筛选后，收集得到138例患者的处方，累计使用中药116 味，共计5 593次。频次高于120次的有15味药，其中前3味药为淫羊藿、巴戟天、肉苁蓉，结果见表1。2. 2 药物四气五味归经频次分析运用“中医传承辅助平台（V2.5）”中“统计报表”模块中的“性味归经统计”功能统计138例患者处方中所用中药的“四气”“五味”及“归经”。结果显示四气主要以温、平为主，温、平药的用药频次分别为2 584（53.8%）、1 361（28.3%）次；寒、热、凉的用药频次明显较少， 分别为799（16.6%）、47（1.0%）、10（0.2%）次。五味以甘味药最多，共计3 514 次，占总药物频率的45.3%；辛味药次之，用药频次为1 404次，占18.1%；咸味药1 111次，占14.3%。苦味药、酸味药、涩味药使用频次较少， 分别为722、598、403 次， 各占9.3% 、7.7%、5.2%。2. 3 药物功效分类参照全国高等中医药院校教材《中药学》（2011年版）[5]、《中国药典》及《全国中草药汇编》[6]的分类，将138例患者处方中所使用的116味中药进行功效分类，共分为10类，按用药频次从高到低排序，居前3位的分别为补虚药、收涩药、活血化瘀药。具体结果见表2。2. 4 基于关联规则分析的组方规律分析运用“中医传承辅助平台（V2.5）”中“数据分析”模块中的“方剂分析”功能分析处方规律，将支持度个数设置为250，置信度≥ 0.9，获得15条药物组合模式，涉及6味药，结果见表3。2. 5 新方分析将上述核心组合采用无监督熵层次聚类算法进行进一步分析，得到5首治疗阳痿的新处方，结果见表4。3 讨论肾藏精，寓元阴元阳，主生殖，开窍于阴器，为作强之官，技巧出焉；肝藏血，主疏泄，调畅气机，司宗筋。宗筋者，一指一身之筋，二特指男子前阴。肾精、肝血是性器官生理活动的物质基础，肾气为其动力，肝气疏泄则使其气机通畅，血液充盈，当举则举。崔学教教授认为肝肾亏虚及气滞血瘀是阳痿的主要病机，阳痿的治疗需从调肝肾出发。3. 1 从药性统计结果探讨遣方特色本研究结果显示，崔学教教授治疗阳痿所选用的药物的四气以温、平为主。温性药主要具有温里散寒、暖肝散结、补火助阳、温阳利水、温经通络、引火归元、回阳救逆等作用。平性药虽然寒热界限不明显，但其药性平和、作用缓和，可调和气血阴阳，在补益的过程中不易出现寒热的偏性，适合寒热不明显及慢性疾病的患者使用，且可通过不同的配伍，可发挥不同的药效。崔学教教授治疗阳痿所选用的药物的五味以甘、辛、咸为主，甘味药“能散，能和，能缓”，具有补益、和中、调和药性和缓急止痛的作用；辛味药“能行，能散”，具有发散、行气行血的作用。多用于表证及气血阻滞之证；咸味药“能下，能软”，具有泻下通便、软坚散结的作用。崔学教教授治疗阳痿多采用温阳补肾、活血化瘀为法，温性药、甘味药偏补，过于补肾，则易影响气机运行，加入辛味药后可以加强行气行血的作用，调畅气机。肾属水，咸入肾。咸味药，引药至病所，可更好地发挥药效。3. 2 从用药频次分布及药物功效分类探讨治疗原则用药频次统计结果提示，用药频次居前3位的是淫羊藿、巴戟天、肉苁蓉。淫羊藿，其味辛、甘，性温，归肾、肝经，补肾壮阳，祛风除湿。《日华子本草》认为淫羊藿“治一切冷风劳气，补腰膝，强心力，丈夫绝阳不起”。巴戟天，味辛、甘，性微温，归肾、肝经，具有补肾壮阳及祛风除湿的功效。《本草备要》提出巴戟天可“补肾益精，治五劳七伤，辛温散风湿”。肉苁蓉，味甘、酸、咸，性温，归肾、大肠经，补肾助阳，润肠通便。《日华子本草》谓肉苁蓉“治男绝阳不兴……暖腰膝，男子泄精，尿血，遗沥。”这些药均具有补肾助阳的作用，体现崔学教教授温补肾阳的治疗原则。具体临证中，还需结合患者的体征、症状，随证加减。药物功效频次统计结果显示，崔学教教授治疗阳痿多采用补虚药、收涩药、活血化瘀药。除此之外，收涩药及活血化瘀药的使用频次也较高。现代社会，因生活、精神压力过大及饮食的不规律，易损耗肝阴、肾阴；久病耗气，气虚无以推动正常的生理活动；久病必瘀，瘀血阻滞气血的正常运行。因此崔学教教授治疗阳痿加入收涩药以补肾纳气；同时常加入蜈蚣、地龙等虫类药，因虫类药属于“血肉有情”之品，与人体气血相应，取其破血逐瘀、搜邪通络之效。正如叶天士所谓，疾病“久则邪正混处其间，草木不能见效，当以虫蚁疏逐”，以“搜剔络中混处之邪”[7]。3. 3 新方分析崔学教教授根据多年的临床经验，治疗阳痿常从肾气虚衰、肾阳亏虚、肾阴亏虚、肝气郁结证4个证型辨治。但在临床实际中，患者所诉症状往往并不似上诉证型那样简单，往往夹杂着或多或少其他不同的症状，这些症状影响着病情的发展。对于这些兼夹症状，需配伍其他药物，以协同治疗阳痿。故在得到的治疗阳痿的5首新处方中，药物构成并不仅仅针对以上4个基本证型，而是针对4个基本证型与其他证素兼夹的复合证型。如新方1（牡蛎、淫羊藿、知母、牡丹皮、龙骨）中，牡蛎、龙骨可滋阴潜阳，收敛固精；知母、牡丹皮功擅滋阴清热，凉血活血，在补肾助阳的同时可清热滋阴，治疗阴虚火旺型阳痿。新方3（覆盆子、菟丝子、白芍、锁阳、蜈蚣、桑椹）取五子衍宗丸组成之覆盆子、菟丝子以补肾固精，白芍、桑椹补血滋阴；蜈蚣通络止痛，在补肾的同时，疏肝养肝，可治疗肾虚肝郁型阳痿兼不育者。新方4（肉苁蓉、五味子、芡实、煅龙骨、莲须、巴戟天、桑螵蛸）中的五味子收敛固涩，补肾宁心；芡实、莲须益肾固精；龙骨收敛固涩，煅制后则收敛固涩之力更专；桑螵蛸固精缩尿，补肾助阳，全方在补肾固精的同时，功专收敛固涩，可用于治疗肾虚精亏之阳痿兼早泄者。4 病案举例患者李某，男，40岁，2018年12月20日因勃起不坚1年就诊。患者可勃起并进行性生活，但举而不坚，勃起时感会阴部疼痛。自诉偶感精神压力大，喜太息，胸胁胀满，纳眠欠佳，大便每日1次，小便正常。查体见阴茎外观正常；舌质暗淡，苔薄白，脉弦。中医诊断：阳痿，证属肝气郁结型。治以疏肝解郁，补肾活血。处方：淫羊藿20 g，巴戟天20 g，柴胡15 g，郁金15 g，白芍20 g，甘草泡地龙10 g，蜈蚣3 条，毛冬青30 g，槐花15 g，生地黄15 g。处方14剂，每日1剂，水煎至200 mL，温服。2019年1月10日二诊：述勃起状况同前，胸胁胀满感较前好转，纳眠可，仍感会阴部疼痛，仍以上方去槐花，加黄柏15 g、刺蒺藜15 g、烫水蛭10 g。处方14 剂，每日1 剂，水煎至200 mL，温服。2019年1月25日三诊，自诉自觉症状较前好转，续服二诊方10剂。后经电话随访，诉症状好转，生活正常。按：生活方式的改变及睡眠不规律易耗损肝肾之阴，出现肝肾亏虚；精神压力大，所愿不遂，肝郁气滞，血行不畅，宗筋不用则致阳痿。崔学教教授采用柴胡、郁金、槐花疏肝清热，加入虫类药如地龙、蜈蚣通经活络；二诊时根据患者突出症状，加重虫类药活血通经功效，临证多见效验[8-10]。综上，本研究通过数据挖掘方法研究崔学教教授临床治疗阳痿的用药规律，初步揭示了崔教授对阳痿临证的一般用药特点。因阳痿患者的病程相对较长，肝肾亏虚后易致气滞血瘀，故治疗时在补肾助阳的同时，不忘疏肝行气，活血祛瘀，使肝经调达，脉络得通，气机通畅，血液充盈，当举则举[8]。参考文献：［1］ 邓春华， 辛钟成，李宏军. 男科病诊治学［M］. 广州：羊城晚报出版社，2004.［2］ 中华医学会男科学分会.中国男科疾病诊断治疗指南与专家共识［S］. 北京：人民卫生出版社，2016.［3］ 郑筱萸. 中药新药临床研究指导原则［M］. 北京：中国医药科技出版社，2002.［4］ 周仲瑛.中医内科学（普通高等教育“十五”国家级规划教材）［M］. 2版.北京：中国中医药出版社，2011.［5］ 高学敏. 中药学［M］. 北京：中国中医药出版社，2007.［6］《全国中草药汇编》编写组. 全国中草药汇编［M］. 北京：人民卫生出版社，1975.［7］ 王晓仙，刘金伟，李恩宽，等.李恩宽教授运用逐瘀通络虫类药临证经验［J］. 中国民族民间医药，2019，28（6）：57-58，64.［8］ 蒙浩，陈铭，崔学教.崔学教温肾化瘀通经治疗阳痿经验［J］.广州中医药大学学报，2018，35（6）：1104-1106.［9］ 张仁荣. 基于数据挖掘分析崔学教教授治疗男性不育症的用药经验［D］.广州：广州中医药大学，2018.［10］ 黎土轩，黄岸豪，谢建兴，等.崔学教教授治疗阳痿经验总结［J］.中医药导报，2018，24（3）：52-53.