摘要：目的　观察类叶升麻苷对大鼠原代肝细胞免疫性肝损伤的保护作用。方法　采用卡介苗（ＢＣＧ）联合脂多糖（ＬＰＳ）建立大鼠原代肝细胞免疫性损伤模型，测定并比较各组肝细胞培养上清液中谷丙转氨酶（ＡＬＴ）、谷草转氨酶（ＡＳＴ）的活性和一氧化氮（ＮＯ）在不同培养时间点（３，６，１２和２４ｈ）的含量。结果　与模型组相比较，类叶升麻苷在不同时间点均能明显降低ＡＬＴ、ＡＳＴ和ＮＯ水平（Ｐ＜０．０１），且呈剂量依赖关系。结论　类叶升麻苷对卡介苗联合脂多糖诱导的大鼠原代肝细胞免疫性肝损伤具有保护作用。关键词：类叶升麻苷；肝细胞；免疫性肝损伤；肝保护作用苯乙醇苷类（ｐｈｅｎｙｌｅｔｈａｎｏｉｄ　ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ）含有羟基、甲氧基取代苯乙基及羟基、甲氧基取代肉桂酰基，通常是以β－葡萄糖为母核的含有酯键及氧苷键的天然糖苷类化合物，具有抗氧化、抗菌抗炎和免疫调节等多种药理作用［１］。近年来还发现，该类化合物具有较强的肝保护作用。类叶升麻苷（ａｃｔｅｏｓｉｄｅ）是此类成分中最有代表性的化合物，是多种复方及单方中药民族药所含的主要标志性成分，广泛分布于肉苁蓉和列当等生长于干旱、半干旱地区的植物中［２－３］。为了进一步开发类叶升麻苷，拓展其应用，笔者以临床常用的保肝降酶药联苯双酯（ＤＤＢ）作为阳性对照，采用卡介苗（ＢＣＧ）联合脂多糖（ＬＰＳ）诱导的原代肝细胞损伤模型，在体外研究类叶升麻苷的肝保护作用。１　仪器与材料１．１　仪器　Ｂｅｃｋｍａｎ　７００全自动生化分析仪（Ｂｅｃｋｍａｎ公司）；ＣＯ２恒温培养箱（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｏｒｍａ公司）；ＨＬ－２型恒流泵（上海精科实业有限公司）；ＴＤＬ８０－２Ｂ台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；ＢＯＸＵＮ洁净工作台（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；ＺＰＸ－３５ＢＩ座式自动电热压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）。１．２　试药　类叶升麻苷（自制，质量分数＞９５％）；联苯双酯滴丸（ＤＤＢ，德州德药制药有限公司，批号０６０４１０）；Ⅳ型胶原酶、脂多糖ＬＰＳ（Ｅ　ｃｏｌｉ　０５５５：Ｂ５，Ｓｉｇｍａ公司）；高糖ＤＭＥＭ培养基（ＧＩＢＣＯ公司）；无噬菌体低内毒素胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批号０６１２０５）；卡介苗（ＢＣＧ，上海生物制品检定所，５０ｍｇ／支）；谷草转氨酶（ＡＳＴ）和谷丙转氨酶（ＡＬＴ）试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司）；Ｎ－萘基－乙烯二胺和对氨基苯磺酰胺（Ｆｌｕｋａ公司）。１．３　实验动物　雄性Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ大鼠（１８０～２２０ｇ）购自新疆医科大学实验动物中心，动物使用许可证号ＳＹＸＫ［新］２００３－０００１。２　方法２．１　大鼠原代培养肝细胞免疫性损伤模型的制备　雄性Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ大鼠１０只，随机分为正常对照组和模型组，模型鼠经尾静脉注射ＢＣＧ　８ｍｇ／只（约５×１０７个活菌数）致敏，正常对照组经尾静脉注射同体积生理盐水。实验第１２ｄ后分别取正常和ＢＣＧ致敏的大鼠，按文献报道方法［４］采用两步灌流法分离获取大鼠原代肝细胞：用３ｇ·Ｌ－１的戊巴比妥钠０．５ｍＬ麻醉后，手术分离肝门静脉并行门静脉插管，以３７℃恒温氧饱和的无钙灌流液５００ｍＬ灌流肝脏（流速２０ｍＬ·ｍｉｎ－１），并迅速剪断下腔静脉，作在位灌流５ｍｉｎ，边灌流边切断肝与周围组织的联系，３７℃恒温氧饱和的０．２５ｇ·Ｌ－１Ⅳ型胶原酶灌流液循环灌流１０ｍｉｎ，然后经门静脉插管推注４ ℃高糖ＤＭＥＭ培养液２０ｍＬ封闭消化。取出肝脏放入盛有３０ｍＬ含４℃高糖ＤＭＥＭ培养液的平皿中，用高糖ＤＭＥＭ培养液清洗２次，散落肝细胞，用１００目筛网过滤，收集细胞悬液，５００ｒ·ｍｉｎ－１离心３ｍｉｎ，弃上清液，向沉淀中加入高糖ＤＭＥＭ培养液轻轻吹打均匀，同条件重复离心２次。用４ｇ·Ｌ－１等张台盼蓝溶液染色，光镜下计数细胞产量与活率，细胞活率在９５％以上的肝细胞用于进一步实验。２．２　细胞活性实验　设正常对照组、模型组（ＢＣＧ＋ＬＰＳ）、溶剂对照组（ＢＣＧ＋ＬＰＳ＋ＤＭＳＯ）、类叶升麻苷（５，２０和８０μｇ·ｍＬ－１）组和ＤＤＢ（５，１０和２０μｇ·ｍＬ－１）组。取正常和ＢＣＧ致敏的大鼠肝细胞悬液用高糖ＤＭＥＭ培养液稀释成２．５×１０５细胞·ｍＬ－１，接种于２４孔培养板中，每孔１．０ｍＬ。继续培养１６ｈ后，ＢＣＧ致敏大鼠的肝细胞用１０μｇ·ｍＬ－１的ＬＰＳ攻击，造成肝损伤细胞模型，同时分别加入以不含血清的高糖ＤＭＥＭ培养液配制的各质量浓度样品溶液１．０ｍＬ，继续培养。分别于３，６，１２和２４ｈ收集细胞上清液，置－７０ ℃冰箱保存，待测。细胞上清液ＡＳＴ和ＡＬＴ活性测定按照试剂盒说明书测定，ＮＯ含量采用Ｇｒｉｅｓｓ法测定。２．３　数据处理与统计分析　实验结果用珚ｘ±ｓ表示，使用ＳＰＳＳ１２．０软件包进行方差分析。３　结果　　类叶升麻苷对大鼠原代培养肝细胞损伤后细胞上清液ＡＳＴ、ＡＬＴ活性及ＮＯ含量的影响见图１～３。３．１　对ＡＳＴ和ＡＬＴ活性的影响　ＢＣＧ联合ＬＰＳ造成大鼠原代肝细胞损伤后，其肝细胞培养上清液中的ＡＳＴ和ＡＬＴ水平明显高于正常组，且随时间的延长逐步升高。类叶升麻苷各剂量组在３ｈ均能显著降低ＡＬＴ，高剂量组在３ｈ可显著降低ＡＳＴ，并与低剂量组间存在显著差异（Ｐ＜０．０１），在６，１２和２４ｈ均可使升高的ＡＳＴ和ＡＬＴ明显下降，且呈剂量依赖关系。此外从图１和图２中还可看出，中、低剂量类叶升麻苷的活性与等剂量ＤＤＢ的活性相似。３．２　对ＮＯ含量的影响　与正常组相比较，模型组大鼠肝细胞上清液ＮＯ的含量随时间的延长而逐步升高，在１２ｈ达到最高水平（Ｐ＜０．０１）。阳性对照药物ＤＤＢ，除３ｈ低剂量组外，在各时间点均可显著降低ＮＯ含量，且６，１２和２４ｈ各剂量组间存在显著的剂量反应关系（Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．０５）。类叶升麻苷各剂量组在６，１２和２４ｈ均可不同程度地使升高的ＮＯ含量下降（Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．０５）。此外，在药物干预３ｈ时，类叶升麻苷的高剂量组可显著降低ＮＯ含量，并与低剂量组间存在统计学意义（Ｐ＜０．０１）。图１　类叶升麻苷对大鼠原代培养肝细胞损伤后细胞上清液ＡＳＴ水平的影响注：与空白对照组相比较ａ）Ｐ＜０．０１；与模型组相比较ｂ）Ｐ＜０．０１；与同组低剂量组相比较ｃ）Ｐ＜０．０１，ｄ）Ｐ＜０．０５图２　类叶升麻苷对大鼠原代培养肝细胞损伤后细胞上清液ＡＬＴ水平的影响注：与空白对照组相比较ａ）Ｐ＜０．０１；与模型组相比较ｂ）Ｐ＜０．０１，ｃ）Ｐ＜０．０５；与同组低剂量组相比较ｄ）Ｐ＜０．０１，ｅ）Ｐ＜０．０５图３　类叶升麻苷对大鼠原代培养肝细胞损伤后细胞上清液ＮＯ水平的影响注：与空白对照组相比较ａ）Ｐ＜０．０１；与模型组相比较ｂ）Ｐ＜０．０１，ｃ）Ｐ＜０．０５；与低剂量组相比较ｄ）Ｐ＜０．０１，ｅ）Ｐ＜０．０５４　讨论　　近年来，采用ＢＣＧ联合ＬＰＳ诱导大鼠原代肝细胞产生免疫性肝损伤模型已成为筛选和研究抗肝炎药物的常用方法之一。该模型的损伤机制为ＢＣＧ首先激活致敏Ｔ淋巴细胞，尤其是致敏肝内枯否氏细胞和巨噬细胞，并大量聚集于肝脏。当用ＬＰＳ进一步刺激激活处于致敏状态的巨噬细胞后，大量细胞毒性因子被释放出来，如一氧化氮（ＮＯ）、肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）和白细胞介素等，造成肝细胞损害［５］。肝脏是富含酶的脏器，在肝内ＡＬＴ和ＡＳＴ主要分布于细胞浆和线粒体中。在肝脏组织受损时，酶从细胞内逸出进入血液，致使血清中ＡＬＴ和ＡＳＴ增高。因此，肝组织ＡＳＴ、ＡＬＴ活性下降及血清ＡＳＴ、ＡＬＴ活性升高为肝功能受损的特异性指标。本实验结果显示，类叶升麻苷在６，１２和２４ｈ均可不同程度地使升高的ＡＳＴ和ＡＬＴ活性降低，说明该成分对免疫性肝损伤具有较好的降酶作用，且与阳性对照药物ＤＤＢ的作用类似。作为一种自由基，ＮＯ的过度产生也可直接导致机体正常组织的损伤。肝巨噬细胞可通过释放ＮＯ对肝细胞产生毒性，且肝细胞在体外也可经特异性细胞因子及ＬＰＳ协同诱导，持续产生大量的ＮＯ，介导多种病理生理效应，包括肝细胞毒性效应［６］。类叶升麻苷在不同的时间点均可使升高的ＮＯ水平降低，且这种作用呈一定的浓度依赖关系。此结果提示类叶升麻苷可能通过抑制肝细胞释放ＮＯ的通路，降低肝细胞受损伤程度，进而抑制ＡＳＴ和ＡＬＴ的活性，显示出较好的保肝降酶作用。参考文献：［１］　靖会，佐建锋，李教社．苯乙醇苷类化合物的药理研究进展［Ｊ］．时珍国医国药，２００６，１７（３）：４４０－４４１．［２］　宋志宏，莫少红，陈燕，等．德赢vwin登录 化学成分的研究［Ｊ］．中国中药杂志，２０００，２５（１２）：７２８－７３０．［３］　赵军，闫明，黄毅，等．紫花列当水溶性成分的研究［Ｊ］．天然产物研究与开发，２００９，２１：６１９－６２１．［４］　郑芹珠，王立明，楼宜嘉．卡介苗联合脂多糖诱发大鼠原代培养肝细胞免疫性损伤模型的构建［Ｊ］．浙江大学学报：医学版，２００２，３１（６），４１９－４２５．［５］　Ｚｈａｎｇ　ＧＬ，Ｗａｎｇ　ＹＨ，Ｎｉ　Ｗ，ｅｔ　ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｒｏｌｅｏｆ　ｇａｎｏｄｅｒｍａ　ｌｕｃｉｄｕｍ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ａｇａｉｎｓｔ　ＢＣＧ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｉｍｍｕｎｅ　ｌｉｖｅｒ　ｉｎｊｕｒｙ　ｉｎ　ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｗｏｒｌｄ　Ｊ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，２００２，８（４），７２８－７３３．［６］　章国良，林志彬．细胞因子对内毒素刺激的原代培养大鼠细胞一氧化氮生成的影响［Ｊ］．北京医科大学学报，１９９８，３０（８）：１８０－１８３

摘要:目的　研究类叶升麻苷在M PTP诱导的C57小鼠的帕金森病(PD)模型中的神经保护作用及机制。方法　通过自主活动实验和滚筒实验研究动物的行为表现, 通过高效液相电化学检测方法观察脑纹状体多巴胺的变化, 通过脑黑质酪氨酸羟化酶( ty roxine hydroxy lase, TH)免疫组化染色观察多巴胺能神经元的损伤程度。并对黑质纹状体进行α-突触核蛋白(α-synuclein)的免疫印迹分析以探讨药物作用机制。结果　①经MPTP诱导的C57 小鼠, 其自主活动次数、滚筒运动潜伏期均低于对照组(P <0.01);纹状体多巴胺含量明显降低(P <0. 01);多巴胺能神经元数量明显减少;黑质纹状体α-synuc le in蛋白水平下降。②经类叶升麻苷(10、30 m gkg- 1 )预处理后能明显改善M PTP诱导的C57小鼠的行为学表现, 增加脑内多巴胺递质的含量, 增加多巴胺能神经元的数量, 增加黑质纹状体α-synuclein蛋白水平。结论　类叶升麻苷具有神经保护作用, 能对抗MPTP诱导的C57小鼠PD模型中的神经损伤。其机制可能与上调α-synucle in蛋白水平有关。关键词:类叶升麻苷;MPTP;PD模型;酪氨酸羟化酶;α-突触核蛋白;神经保护　帕金森病(Park insons d isease, PD)是一种常见的神经退行性疾病, 其主要病理改变为黑质致密部多巴胺能神经元的变性和坏死, 导致神经递质多巴胺的不足, 最终造成PD 特有的运动功能障碍。由于PD的病因复杂, 社会危害大, 随着高龄化社会的到来, 寻找具有抗PD功效的天然药物尤为重要。肉苁蓉(Herba Cistanches)为常用的传统补益中药, 具有补肾阳、益精血、润肠通便的功效。其有效成分为苯乙醇苷类化合物(pheny le thanoid glycosides,PhG s)。本实验室前期研究工作发现苯乙醇总苷具有对抗MPTP损伤C57小鼠多巴胺能神经元保护作用[ 1] 。其总苷成分之一类叶升麻苷(ac teoside)在其中的含量达10%, 在细胞水平上抗PD细胞凋亡的作用亦得到证实[ 2, 3] , 而其在整体动物水平的抗PD作用及对家族性PD 致病相关蛋白α-synuclein的调节作用尚未见报道。α-synuc lein 也叫α-突触核蛋白, 是近年来在PD 发病研究机制中得到广泛关注的蛋白, 它与遗传性PD和散发性PD 都有密切关系, 已有的研究表明:α-synucle in 可能是PD发病的中心环节[ 4] 。观察在MPTP损伤和药物干预的情况下该蛋白的变化情况, 将有助于揭示PD的发病机制和具有保护作用的药物的作用机制。因此本实验进一步研究类叶升麻苷的神经保护作用及其可能的机制。为开发具有抗PD作用的天然药物提供初步实验依据。1　材料与方法1. 1　动物　C57BL /6小鼠, ♂, 体重20 ～ 25 g , 由北京大学医学部实验动物中心提供, 动物合格证号:SCXK11 - 00 - 0004。1. 2　药品　类叶升麻苷由北京大学药学院天然药物学系屠鹏飞教授提供, 相对分子量624, 易溶于水, 纯度达到98%以上。1. 3 　试剂　1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氢吡啶(MPTP), 为S igma公司产品。α-synucle in蛋白单克隆抗体由北京宣武医院于顺教授提供, 酪氨酸羟化酶( ty rox ine hydroxy lase, TH )多克隆抗体为美国Chem icon In te rnational公司产品, H istostainTM -SP K its为北京中山生物技术有限公司产品, ECL试剂为北京普利莱生物技术公司产品。1. 4　仪器　XZ-4型小鼠自主活动仪, 由中国医学科学院药物研究所研制。SD-2型小鼠滚筒仪, 北京大学医学部实验仪器厂生产。ESA 库仑电化学检测器5600A, 美国Princeton Applied Research C orporation生产, C18柱, 迪马公司产品。1. 5　动物模型的建立及分组给药　60只小鼠随机分5组, 每组12只, 分别为对照组、模型组、阳性药金刚烷胺组(40 mg kg -1 )、以及类叶升麻苷给药组(10, 30mg kg -1 )。连续灌胃给药14 d, 于第11天开始灌胃给药前1 h腹腔注射MPTP 30mg kg -1(对照组给予等体积的生理盐水), 连续4 d, 最后1次给药后1 d, 进行行为学指标测试, 4 d后脱颈处死, 分别取小鼠脑纹状体和黑质, 于- 80℃保存, 用于分别测定多巴胺含量以及免疫组化和W esternblot分析。1. 6　指标测定及方法1. 6. 1　一般行为学观察　观察小鼠在腹腔给予MPTP造模后的一般行为表现, 有无异常反应[ 5] , 比较分析各组之间的差异。1. 6. 2　自主活动实验　使用XZ-4型小鼠自主活动仪测定小鼠自发活动并记数, 将小鼠放入自主活动箱中(高:13 cm, 直径:25 cm, 每次同时测定4 只小鼠, 每个活动箱中1 只)由记录仪自动记录小鼠活动, 测定每只小鼠5 m in内的活动次数[ 6] , 进行统计学处理。1. 6. 3　滚筒实验　使用SD-2型小鼠滚筒仪测试小鼠的滚筒行为表现[ 7] 。测试前连续训练3 d, 每天2次, 转速为12 r m in-1 , 训练时间120 s。将小鼠置于滚筒仪的滚筒上, 设置转速35 r m in-1 , 测试小鼠从滚筒开始旋转到离开滚筒的时间作为小鼠运动潜伏期, 测试时间为120 s。每只小鼠测3次取平均值。1. 6. 4　高效液相-电化学法(HPLC-EC)分析　采用HPLC-EC 测定纹状体内DA 的含量。样品预处理:将小鼠脱颈处死, 取小鼠双侧纹状体置于冰浴上, 加入100 μl溶液A (0.4 mo l L-1 HC lO4 )冰浴超声匀浆处理, 4℃静置1 h, 注意避光保存。然后离心15m in(15 000 ×g, 4℃), 取上清加入40 μl溶液B(20mmol L- 1柠檬酸钠, 300 mmo l L-1K2HPO4和2mmol L- 1 Na2EDTA ), 充分混匀后4℃静置1h, 条件同上。再离心15m in(15 000 ×g, 4℃), 得到样品上清, -80℃存放备用。样品测定条件:施加电势:0 ～ 500 mV, 以100mV 递增。流动相:柠檬酸缓冲液100mmol L- 1 ,Na2EDTA 100mmol L- 1 , 八烷基硫酸钠20 mmo lL-1 , 20% 甲醇。样品预处理液:0.4 mo l L- 1HC lO4 , 200 mmo l L- 1柠檬酸甲缓冲液。C18柱流速:1 m l m in-1 , 温度24℃ ±1℃。进样量:10 ～ 20μl。多巴胺含量用μg g -1湿组织重表示。1. 6. 5　免疫组化分析　将小鼠用戊巴比妥钠(50mg kg- 1 , ip)麻醉后, 先用生理盐水灌注, 再用4%的多聚甲醛缓冲液灌注, 取出脑组织置于4%多聚甲醛缓冲液内, 室温存放。对黑质进行石蜡切片(厚10 μm), 做TH 的免疫组化染色。使用TH多克隆抗体以及H istostainTM -SP K its试剂盒。DAB 显色观察细胞的阳性反应。显微照相的放大倍数为33倍。1. 6. 6　W estern blo t实验　样品预处理:将小鼠断头处死, 在冰浴的培养皿上迅速分离黑质和纹状体,置于Eppendo rf管内迅速称重, 于- 80℃冰箱存放。加入匀浆缓冲液(1 g:5 m l)冰浴制备匀浆, 匀浆缓冲液为80 mmo l L-1 Tris-HC l缓冲液(pH 7.4),0.1 mmo l L-1 PMSF, 0.4 mmo l L-1 DTT, 0.1%SDS(W /V), 2mmo l L- 1 Na2EDTA。将匀浆液离心15m in(15 000 ×g , 4℃), 收集上清, 并使用BCA 试剂盒测定蛋白浓度, 以保证各电泳各上样总蛋白浓度一致。得到的蛋白提取液经12.5%SDS-PAGE 变性凝胶电泳后, 以250 mA 恒流1 h进行电转移, 用5%脱脂奶粉封闭1 h。加入α-synuclein 的单克隆抗体(1 ∶1000 稀释), 4℃孵育过夜。之后, 加入辣根酶标记二抗37℃孵育1 h。ECL发光液曝光, X光片显影、定影。1. 6. 7　统计学处理　所有数据均以–x ±s表示。除滚筒实验采用Mann-Whitney U 检验外, 其余实验的各组间比较采用单因素ANOVA 检验。2　结果2. 1　一般行为学　腹腔给予MPTP(30 mg kg -1 )后5 m in开始, 与对照组相比MPTP模型组小鼠的一般行为表现异常, 大多数出现下列变化:举尾、竖毛、唾液分泌增多、呼吸加快、肌张力减退、对外环境刺激敏感以及牙颤等, 其持续时间一般为2 ～ 3 h。而类叶升麻苷(10、30 mg kg- 1 )和金刚烷胺(40mg kg- 1 )组, 其症状表现较轻, 持续时间较短。2. 2　自主活动实验　实验结果表明MPTP模型组与对照组相比活动次数明显减少(P <0.01), 用10、30 mg kg -1类叶升麻苷预处理后, 和MPTP模型组相比能明显增加其活动次数(均为P <0.01, F ig1)。2. 3　滚筒实验　实验结果表明MPTP 模型组与对照组相比, 运动潜伏期明显缩短(P <0.01), 用10、30 mg kg -1类叶升麻苷预处理后, 和MPTP模型组相比能明显的增加滚筒运动潜伏期(均为P <0.01,Fig 2)。2. 4　HPLC实验　实验结果表明MPTP模型组与对照组相比, DA含量明显降低。给予30 mg kg -1类叶升麻苷预处理后, 能够增加纹状体内DA 的含量(P <0.01, Fig 3)。2. 5　免疫组化实验　TH 的免疫组化染色结果如Fig 4所示, 对照组可见大量免疫染色阳性细胞, 胞质丰富, 细胞轴突清晰。模型组免疫染色阳性细胞数明显减少, 轴突断裂, 用30 mg kg-1类叶升麻苷预处理后有改善作用, TH 阳性细胞数增加(Fig 4和Tab 1)。2. 6　Western b lot实验　给予MPTP 后可看到黑质和纹状体的α-synucle in水平明显降低, 而给予类叶升麻苷后则可以增加α-synuc le in 水平, 从而说明类叶升麻苷能够对抗MPTP诱导的多巴胺能神经元α-synuc lein的降低(Fig 5)。3　讨论肉苁蓉为补益中药研究的热点之一, 除作为传统的补肾壮阳中药外, 更兼具有抗衰老、增强记忆、提高免疫力等多种功能, 近20年来受到国内外的普遍关注。类叶升麻苷是肉苁蓉提取物苯乙醇苷中的单体成分, 已有研究对类叶升麻苷在PD动物模型上抗细胞凋亡, 抗氧化损伤等方面的作用进行了探讨[ 2, 3] , 本实验从整体动物水平进一步验证其神经保护作用。MPTP 对小鼠、灵长类动物和人类多巴胺能神经元具有选择性毒性[ 8] , 是模拟环境因素导致PD 模型的经典造模剂, 因此本实验采用小鼠MPTP损伤模型研究类叶升麻苷的神经保护作用。实验结果表明, MPTP 诱发小鼠出现帕金森病症状的表现非常明显, 在行为学方面, 其肌肉震颤, 随意运动减少, 运动协调能力下降可分别从一般行为学表现、自主活动实验、滚筒实验中得到观察。免疫组化实验通过TH阳性神经元的变化从形态学反映出多巴胺能神经元的破坏。TH 是多巴胺合成代谢中的限速酶, 通过TH 抗体染色, 可以明显观察到多巴胺能神经元的变化。HPLC-EC 实验则从多巴胺神经递质的含量变化(直接反映多巴胺能神经元功能的物质基础)表明动物黑质-纹状体多巴胺能神经元功能的减弱, 上述结果表明PD 小鼠模型的建立是成功的。在此基础上, 预先给予类叶升麻苷, 并在MPTP损伤过程中继续给药处理后的动物组, 与模型组比, 其一般行为学表现显示中毒症状减轻, 自主活动能力增强, 运动协调能力改善, 多巴胺能神经元数量增多, 脑纹状体中多巴胺含量明显增加, 表现出对抗MPTP损伤的作用。本研究参照细胞水平的实验设计(用类叶升麻苷预处理细胞, 对PD 细胞模型具有保护作用)[ 3] , 以预防性给药方式, 在造模前和造模中连续给药, 实验结果反映了类叶升麻苷在整体动物水平具有预防PD的作用。已有研究表明, 将小鼠α-synuclein基因敲除后可抵制MPTP引起的神经毒性作用[ 4] 。α-synucle in在脑内的基因突变和异常代谢参与了PD 等神经系统退行性疾病的发生, 其在PD 等神经系统退行性疾病发生过程中的作用机制已成为目前研究的焦点[ 9 -12] 。因此, 本实验观察在MPTP损伤的小鼠, 其黑质纹状体通路多巴胺能神经元α-synuclein蛋白水平如何变化, 而类叶升麻苷对这种改变又会产生什么影响, 这既有利于探讨药物作用机制, 又为PD 病因的研究提供参考。本文采用亚急性给予MPTP 造模, Weste rn blo t结果显示黑质纹状体α-synuclein蛋白水平降低, 免疫组化实验表明黑质α-synuclein蛋白和TH 蛋白免疫反应阳性细胞数减少(α-synucle in的免疫组化结果未提供), 显示这二者在蛋白质水平均呈下降趋势, 与Xu等[ 13] 的结果相似。而预先给予类叶升麻苷后则可对抗这种改变。提示一种可能的机制是类叶升麻苷具有对抗MPTP的细胞保护作用, 从而减轻了MPTP对细胞的氧自由基损伤, 本室已有研究发现类叶升麻苷可明显抑制鱼藤酮诱导的自由基生成[ 3] 。另外, 类叶升麻苷的神经保护作用还可能与上调α-synuclein蛋白水平有关, 其详细的作用机制有待进一步探讨。参考文献:[ 1] 　Geng X C, Song LW, Pu X P, et a.l Neuroprotective effects ofphenylethanoid g lycos ides from cis tan ches salsa against 1-m ethy l-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahyd ropyrid ine(M PTP)-indu ced dopam inergictoxicity in C 57m ice[ J]. 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我晚上睡觉起两三次夜是常事，很少一觉睡到天明。现在天气已经转凉，每次起夜都很痛苦。之前听朋友提过一个方子，取肉苁蓉、锁阳、菟丝子、王不留行各15克，党参、黄芪、浙贝母各20克，枳实、炮山甲各10克，益母草30克，用水煎服，每日1剂，6～7个星期为1个疗程。山西 赵先生解答：中医认为，肾主水，膀胱贮藏尿液，故夜间尿多尿频多与肾和膀胱有关，实为阳气虚衰所致。此方对肾阳不足、小便不利，有前列腺增生的病人有一定效果。肾阳虚的人常表现为畏寒肢冷、面色苍白、腰膝冷痛、夜尿频等。肾阳不足导致的夜尿频，治疗上应以健脾温肾、利水通淋为主要原则。肉苁蓉、锁阳被列为草药上部，主要功效为补肾益精、养肝明目、滋养脾胃，对肝肾不足引起的腰膝筋骨酸痛、小便频数、尿多余沥等症状有改善作用。一般情况下，肉苁蓉、锁阳既可用于中药汤剂煎服，也可泡药酒饮用。此外，还可以煲汤、熬粥等。菟丝子、王不留行的主要功效为清利补肾活血，党参、黄芪可补肾健脾益气、扶正气。浙贝母对于素体阳盛的小儿及青年人有很好的清火散结作用。枳实、炮山甲能活血消癥、搜风通络。加入益母草，对夜尿频的人能起到化淤、利水的功效。中医讲究辨证治疗，该方服用前需在医生的指导下，辨清体质，进行合理的配伍和药量加减。夜尿频的患者，平时应该多锻炼身体，多吃补益肾阳、温脾胃的食物，如羊肉、鸡肉、猪肚、洋葱、韭菜、山药等。中南大学湘雅医院中西医结合科副主任医师 唐涛

方药：当归、白芍、淫羊藿各15 g，白术、肉苁蓉、火麻仁各25 g，桃仁12 g，炙甘草10 g，陈皮6 g。加减：腹胀甚者加枳壳、厚朴各12 g；纳呆食少者加砂仁、鸡内金各10 g；气虚自汗者加黄芪、党参各15 g，五爪龙30 g；肛裂出血者加生地黄、玄参各20 g，地榆12 g。用法：每天1剂，水煎至300 ml，口服，疗程为7天。疗效：共治疗47例，痊愈22例，好转23例，无效2例，总有效率为95．74％。来源：李晓容（茂名卫生学校525000 广东茂名）．养血温阳法治疗老年习惯性便秘92例．新中医，2009，41（7）：88－89．

老年性痴呆( 又称为阿尔茨海默病, AD) 是大脑原发性退变性疾病。它以进行性痴呆为主要症状, 是大脑变性中最常见的疾病, 是由于以大脑皮质和大脑边缘系统为中心的各种神经递质系统功能降低所致, 其中显著的变化是胆碱能神经系统变化, 大脑皮质及海马的胆碱乙酰化酶活性的显著降低。据专家估计, 我国AD 患者已超过500 万, 占全世界所有患病人数的1/4, 而且, 随着我国人口老龄化进程的加快, 这个数字将更为庞大。AD 将成为21 世纪威胁人类的最严重疾病之一。因此,寻求一种有效的AD 治疗药物, 减轻老年患者痛苦, 提高其生活质量, 已成为当今医药工作者的一项重任。近年来, 国内外学者在应用天然药物有效成分治疗AD 方面做了大量的基础研究和应用研究工作, 有望从中开发出治疗AD 的新药。本文结合近年来的报道从结构方面分类进行综述, 为在天然药物中寻找抗AD 的药物提供参考。1 皂苷类1.1 醉茄内酯类化合物:南非醉茄根中的甾体衍生物可增强大鼠的学习和记忆能力。南非醉茄根提取物也可逆转东莨菪碱所致大鼠的注意力涣散和电休克后遗忘, 还可显著地减少应激大鼠海马区神经元变性的数量, 这些作用表明南非醉茄根提取物可能有促智作用, 对神经变性疾病可能有潜在的保护作用。南非醉茄根及其组分( 如醉茄内酯) 也有抗氧化及抗炎作用, 这可能与治疗AD 有关。南非醉茄的许多药理活性提示这种药对于治疗AD 患者有多重益处, 同时也表明提取物比单纯的化合物更有优势[1] 。1.2 三七皂苷:钟振国等[2] 通过药理实验研究表明, 三七总皂苷( PNS) 对大鼠动物模型大脑胆碱能神经元具有较强的保护作用, 通过改善和修复受损神经元而提高细胞存活的数量和质量, 提高乙酰胆碱转移酶( ChAT) 的含量和活性, 从而保护和改善中枢胆碱能系统的功能, 发挥抗老化、抗痴呆的作用。对神经元的保护和修复作用可发生在不同水平, 诸如对基因的表达调控、蛋白质的翻译修饰、递质代谢酶的活性以及突触可塑性改变等。陈洁文[3]观察三七皂苷( Rg1) 对大鼠海马CA1 区锥体细胞缺血损伤所致电生理变化的影响, 结果显示Rg1 对海马锥体细胞的缺血性损伤具有明显的保护作用。1.3 人参皂苷:王爱民等[4]报道, 腹腔注射人参根皂苷和人参茎叶皂苷( 50mg ·kg-1 ·d -1) 能够提高和改善正常大鼠及休克大鼠的学习、记忆功能, 它们均可使大脑不同脑区5 -羟色胺( 5 -HT) 含量增多, 这与某些学者报道的服用5 -HT 前体药物有助于改善记忆障碍相一致。1.4 红景天素:谢桂琴等[5]研究表明, 红景天素作为抗氧化剂可改善痴呆鼠学习记忆能力, 清除自由基, 促进细胞代谢, 增强细胞活力, 从而延缓细胞老化, 阻抑其退化、变性、凋亡, 进而改善机体的结构和功能, 提高机体生命力。提示可能是由于红景天素具健脑、益智、增强记忆功能和抗衰老的作用而对实验性痴呆鼠有一定的防治作用。关于其分子学水平的机制, 有待进一步研究。此外, 绞股蓝皂苷能增强记忆, 拮抗利血平能减少单胺类神经递质的耗竭, 使小鼠脑干、海马、纹状体中去甲肾上腺素( NE) 、5 -HT 、多巴胺( DA) 含量不同程度的增加[6 ] 。大蒜中含有的多种呋甾和螺甾皂苷能显著抑制血小板聚集和提高纤溶酶活性, 改善脑部微循环和供养[7] 。2 生物碱类2.1 石杉碱甲(Hupe rzine A) :为我国上海药物研究所首创的可逆性强效低毒乙酰胆碱酯酶( AChE) 抑制剂。是从石杉属植物千层塔Huperziase rr ata( Thunb1) Tre v1 中分离提取的一种新生物碱, 具有明显的抗胆碱酯酶作用, 动物实验证实能增强大鼠记忆功能。该药对乙酰胆碱酯酶高选择性抑制, 作用时间较长, 口服吸收完全, 外周胆碱能副反应极少, 可改善老年人的记忆。石杉碱甲是一种很有发展前途的治疗AD 的药物。2.2 加兰他敏( Galanthamine) :是从石蒜属植物中分离得到的一种生物碱, 亦系可逆性的胆碱酯酶抑制剂, 抑制强度稍弱于毒扁豆碱, 但它易为患者耐受且不良反应少, 用于治疗轻、中度AD 。加兰他敏有希望成为一种供临床使用的治疗AD 的安全有效的药物。2.3 黄皮酰胺( Clausenamide) :是从芸香科植物黄皮的叶中提取的有效成分。已有多种行为学实验证明, ( -) 黄皮酰胺有明显的促智作用, ( -) 黄皮酰胺体内给药后能明显增加受体的密度, 促进突触体谷氨酸释放, 加强海马脑片上的幅度、脑皮质厚度及海马区突触数, 对学习记忆过程有促进作用, 其促智作用强于已在临床广泛应用的吡拉西坦[8] 。2.4 酒石酸庚基毒扁豆碱( Eptastigmine) :该药是毒扁豆碱亲脂性衍生物。毒扁豆碱是较早应用的AChE, 在短时期内可显著改善AD 病人的认知能力, 但对胆碱系统的副作用大, 给药次数多且血药浓度变化大。它的毒性仅为毒扁豆碱的1/60,口服后能迅速分布到体内各组织, 半衰期长, 对血浆及细胞内AChE 的活性有持久、适度的抑制作用, 可使患者认知能力和行为能力达到最大程度的改善。此外, 一叶秋碱( Se cur inine) 是从一叶秋叶中分离得到的一种生物碱, 通过兴奋中枢和拮抗中枢r -氨基丁酸( GABA)受体而促进记忆。一叶秋碱可提高小鼠的记忆再现力, 对记忆再现不良有显著改善作用[ 9] 。党参总碱[ 10]能对抗东莨菪碱所致小鼠脑内乙酰胆碱( Ach) 减少及ChAT 活性降低, 从而改善记忆障碍。生物碱中的川芎嗪也具有显著的提高超氧化物歧化酶( SOD) 活性和降低细胞中丙二醛(MDA) 含量的作用。3 多糖类近年来的研究表明, 具有生物活性的天然产物如多糖类物质, 具有清除氧自由基的作用, 有着很好的抗衰老作用。氧自由基( 又称活性氧) 与机体细胞的许多功能和疾病密切相关。当它们在体内积累过多时, 将对人体造成毒害, 导致癌变、衰老、炎症、免疫功能紊乱等疾病。多糖是由单糖聚合成的天然高分子化合物, 是维持生命机器正常运转的基本物质之一, 在生物体中, 糖类不仅作为能源物质, 更重要的是参与了生命现象中细胞的各种活动。免疫学的抗衰老措施, 着重于增强机体细胞免疫功能。补益类中药多糖能从整体上增强机体的免疫力, 在一定程度上延缓衰老, 防治老年病。肉苁蓉多糖:吴波等[11]的实验研究结果显示, 肉苁蓉多糖( 100mg ·kg-1) 可显著提高亚急性衰老小鼠SOD 的活性, 并明显降低亚急性衰老小鼠的血液和肝中的脂质过氧化物的含量。这说明肉苁蓉多糖具有调节衰老小鼠机体氧化、抗氧化平衡的功能, 可消除D -半乳糖引起自由基产生的增多。提示肉苁蓉多糖具有抗氧化及延缓衰老的作用。目前, 中药多糖的抗衰老和防治AD 的药效研究主要集中在其免疫调节作用、抗氧化作用和延长生物寿命等方面。4 酚酮类4.1 显齿蛇葡萄:( Ampelopsis Gro ssedenta (Hand -M azz.)W.T.Wa, 又名藤茶) [ 12], 为葡萄科蛇葡萄属植物, 显齿蛇葡萄总黄酮为其主要化学成分, 含量高达45.52 %[13] 。显齿蛇葡萄总黄酮0.5 、1.0g ·kg -1 灌胃给药45d, 可使D -半乳糖所致衰老小鼠血清和肝脏中SOD 活性明显升高, 显著抑制M DA 的生成[14] 。4.2 蛇床子素( Ostho l) :是从伞形科植物蛇床成熟果实蛇床子中提取的香豆素类化合物, 化学名为7 —甲氧基—8 —异戊烯基香豆素。研究发现, 蛇床子素可显著改善小鼠的记忆、巩固及方向辨别障碍, 并能显著延长小鼠断头耐缺氧时间, 抑制大鼠肝脑组织中脂质过氧化物的生成, 降低小鼠全血、脑内胆碱酯酶活性, 证明蛇床子素有促进小鼠学习记忆的作用, 其机制可能与抑制脑内胆碱酯酶活性及延缓细胞老化等因素有关。4.3 银杏叶提取物( EGb) :EGb 在德国已被批准用于痴呆的治疗。EGb 的作用机制可能与多种药理作用有关。其所含的黄酮类成分具有协同抗氧化、清除自由基、增强中枢胆碱能功能、增加脑血流量以及改善脑正常功能代谢等作用。4.4 葛根提取物:邹丽波[15] 报道, 葛根醇提物及总黄酮能拮抗东莨菪碱所致小鼠大脑皮质和海马区Ach 及ChAT 的活性降低。此外, 从中药红花、五味子及丹参提取的有效成分五味子酚、丹酚酸和红花黄素( SY -L) 能抵抗氧化应激产生的过氧化氢(H2O2) 的损伤作用, 使大鼠脑突触体内谷胱甘肽( GSH) 的含量基本恢复正常, 同时抑制H2O2 和N —甲基—D —天门冬氨酸( NM DA) 诱导的神经元凋亡[16] 。大豆异黄酮能明显改善AD小鼠学习记忆功能、信号方位辨别能力和记忆保持能力[17] 。5 环烯醚萜类化合物( Iridoids)[ 18]5.1 白花蛇舌草:从白花蛇舌草Hedoy tis diffusa 的全草中分离得到的4 个乙酰化环烯醚萜苷均对L -谷氨酸损伤的小鼠皮质培养细胞有显著的神经保护作用。5.2 胡黄连:胡黄连Picr orhizae scrophu lariiflo ra Penne Ⅱ的干燥地上部分中含有的Picr oside Ⅰ 和Ⅱ能促进从PC12D细胞出发由神经生长因子NGF 介导的轴突分枝生长, 药理数据表明它们可能是通过扩大NGF 受体介导的细胞内信息传播途径中的某一步而获得此效果的。此外, 从蔓荆子Viticis trifo liate Fruc tus 中得到的Agnuside和V R -Ⅰ ( 10 -Ovanilloy laucubin) 对1, 1 —二苯基—2 —间三硝苯基偕腙肼有很强的清除作用, 抗氧化活性比3 -叔丁基—4 —羟基苯甲醚还强。海巴戟(M or inda citrifo lia) 的叶中含有的Citrifolinin B 有抗氧化作用, 30μmol ·L-1 的浓度即能清除二苯基苦基苯肼( DPPH) 自由基。6 苷类6.1 二苯乙烯苷:楚晋等[19]通过观察何首乌提取物中二苯乙烯苷( TSG) 对D -半乳糖致痴呆模型小鼠学习记忆及脑内神经营养因子表达的影响, 发现TSG 可促进海马神经因子及其受体的表达, 并在宏观上表现出明显提高小鼠学习记忆能力的作用, 提示其在抗脑老化及在以脑老化为基础的AD 等疾病的防治方面具有较好的应用前景。6.2 金丝桃苷(Hyperin , Hyp) :毒性较低, 有多种生物学活性。在小鼠脑缺血再灌模型上, Hyp 可显著地抑制脑组织乳酸胶氢酶( LDH) 活性的下降;Hyp 在跳台试验中对脑缺血再灌注所致小鼠学习记忆功能障碍有明显的改善作用。上述结果提示Hyp 对脑缺血再灌损伤有显著的保护作用, 其机制可能与其抗自由基、抑制一氧化氮( NO) 的生成有关。此外, 何首乌活性单体化合物大黄素—8 —O —β —D —吡喃葡萄糖苷能提高小鼠学习、记忆功能, 对东莨菪碱所致记忆障碍有防护作用, 可逆性抑制AChE [15 ] 。7 卵磷脂类卵磷脂经人体代谢的产物能迅速转化成Ach, 它是神经传递的重要物质, Ach 对改善记忆力、提高反应能力都有直接作用。目前, 美国多以摄取卵磷脂以增加体内的胆碱, 对脑力退化的老年患者, 从体外供给卵磷脂, 以补充制造Ach 所需的胆碱。近年来研究表明, 酸枣仁、桑寄生、灵芝、黄精、枸杞、何首乌等具有降胆固醇、血糖和血压作用的中药中均含有丰富的卵磷脂成分, 提示此类中药在治疗AD 方面有良好的发展前景。此外, 传统延缓衰老的中药如淫羊藿、益智仁、锁阳、白术、女贞子、菟丝子、黄芪和茯苓对神经生长因子( NGF) 受体有明显的增强作用, 提示它们可能通过激活NGF 受体而达到抗痴益智作用, 有望应用于抗AD 药物的开发[20] 。韩恩吉[21]应用细胞培养和逆转录-聚合酶链反应( RT -PCR) 观察到海风藤可选择性抑制β -淀粉样蛋白( β -APP) 的基因表达, 为从基因角度防治AD 的发生提供了一定的依据。钱亦华等[22]研究中药续断对AD 模型大鼠顶叶皮质内淀粉样蛋白沉积的影响, 结果提示续断对β -APP 沉积的形成具有一定的抑制和清除作用,同时其具有抗细胞过氧化作用。中药复方制剂主要有益智胶囊、益智灵口服液, 后者可显著提高痴呆模型小鼠大脑皮质及海马Ach 含量及Ach 活性, 抑制脑组织脂质过氧化, 提高学习记忆能力[23] 。8 小结与展望AD 的形成过程相当复杂, 涉及到多系统、多靶点的异常。根据AD 的发病机制, 天然药物中的中药无论是单味药及提取物还是复方, 其作用大多为多靶点、多途径和多系统, 与单纯的化合物相比中药在AD 的防治方面具有更大的潜力。目前, 中药在AD 的研究中已经取得了一定的进展, 已经研制成功的制剂有苁蓉总苷胶囊等。但笔者认为, 今后中药抗AD 的研究应着重在以下几个方面:( 1) 加强对AD 的发病机制的研究, 探明其发病机制, 为开发出对症药物打好基础;( 2) 要选择更接近于AD 发病机制的病理模型, 使动物实验与临床疗效相关性更强;( 3) 加强研究的深度和广度, 依据AD 的发病机制,运用现代制剂的新技术、新方法, 系统广泛地研究与开发出更有效的抗AD 的中药制剂。参考文献[ 1] 匡海学, 杨炳友, 唐玲.醉茄内酯类化合物的研究与开发[ R] .哈尔滨:2006 中国国际制药前沿技术与产业化发展论坛, 2006.[ 2] 钟振国, 屈泽强, 王乃平, 等.三七总皂苷对Alzheimer ' s病大鼠模型大脑胆碱能神经病理损害的保护作用[ J] .中药材, 2005, 28( 2) :119.[ 3] 陈洁文, 陈朝凤, 汤湘江, 等.三七皂苷对心脑细胞缺氧损伤保护的实验研究[ J] .深圳中西医结合杂志, 1997, 7( 4) :39.[ 4] 王爱民, 曹颖林.中国人参根、茎叶皂苷对大鼠的学习记忆及脑内单胺类递质含量的影响[ J] .中国中药杂志, 1995,20( 8) :493.[ 5] 谢桂琴, 孙秀兰, 田苏平, 等.红景天素对实验性老年性痴呆大鼠防治作用的研究[ J] .中国行为医学科学, 2003,12( 1) :18.[ 6] 杨炯炯, 岳文浩, 韩丹春.绞股蓝对脑梗死后病人脑功能障碍的改善作用[ J] .中国临床心理学杂志, 1997, ( 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关键词:抗骨增生片; 质量标准; TLC; HPLC; 淫羊藿苷摘要:目的:建立抗骨增生片的质量标准。方法:采用TLC 法对处方中骨碎补、鸡血藤、熟地黄和肉苁蓉进行定性鉴别;并用HPLC 法对处方中淫羊藿苷进行含量测定，采用Phenomenex Gemini C18(4. 6 mm × 250 mm，5 μm)色谱柱，乙腈-水(30∶ 70)为流动相，检测波长为270 nm。结果:薄层色谱斑点清晰，易于识别，专属性强;淫羊藿苷在1. 734 μg /mL ～ 173. 4μg /mL 的范围内呈良好线性关系(r = 0. 999 9);平均回收率为100. 98%，RSD = 0. 6% ( n = 9)。结论:该方法准确灵敏、简便、重复性好，提高后的质量标准更有效的控制该制剂的质量。抗骨增生片质量标准收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第七册［1］，是由熟地黄、鹿衔草、骨碎补、鸡血藤、淫羊藿、肉苁蓉、莱菔子组成的中药复方制剂，具有补肾，活血，止痛的功效，用于肥大性脊椎炎，颈椎病，跟骨刺，增生性关节炎，大骨节病。原标准仅有一项显微鉴别，为了更好地控制该制剂的质量，本研究按《中国药典》要求增订了骨碎补、莱菔子、熟地黄、肉苁蓉的薄层色谱鉴别，并增加了淫羊藿苷高效液相色谱含量测定方法，提高后的质量标准方法结果准确、操作简便，可作为抗骨增生片的质量标准。1 材料、仪器和试药1. 1 材料抗骨增生片为广州美晨药业公司及广东A、B药厂提供;柚皮苷对照品( 批号722-8601)、芒柄花素对照品( 批号200501 )、5-羟甲基糠醛对照品( 批号111626-200503)、甜菜碱对照品( 批号894-20001)、淫羊藿苷对照品(110737-200312);均购于中国药品生物制品检定所;阴性对照样品:由广州美晨药业公司提供。1. 2 仪器安捷伦高效液相色谱仪:1100 系列; 瑞士卡马薄层色谱成像系统:CAMAGPEPROSTAR 3;日本岛津紫外可见分光光度计:UV-2501PC。1. 3 试药与试剂烟台市化学工业研究所硅胶预制板;乙腈为色谱纯，水为双蒸水，其他试药及试剂均为分析纯。2 方法与结果2. 1 薄层色谱鉴别2. 1. 1 骨碎补的薄层色谱鉴别取本品，除去包衣，研细，称取6 g，加石油醚(30 ～ 60 ℃)30 mL，水浴回流30 min，滤过，弃去滤液，药渣再加甲醇70 mL，加热回流40 min，过滤，蒸干滤液，加水20 mL 溶解残渣，乙酸乙酯每次20 mL，分3次提取，，合并提取液，蒸干，用水10 mL 溶解残渣，通过大孔吸附树脂柱(D101型，内径1. 5 cm，柱高15 cm)，加50 mL 水洗脱，弃去，再用40%乙醇90 mL 洗脱，弃去，最后加70% 乙醇100 mL 洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇2 mL 使残渣溶解，作为供试液。另取柚皮苷对照品适量，加甲醇制成每1mL 含0. 5 mg 的对照液。照中国药典2005 年版一部附录VIB 薄层色谱法项下试验，吸取供试液及对照液各2 μL，点于同一硅胶G 薄层板上，展开剂为甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(2∶ 17 ∶ 3 ∶ 3)的上层溶液，展开后取出，晾干，喷5% 三氯化铝的乙醇液，105 ℃加热5 min 后置紫外光灯(365 nm) 下观察。供试品色谱中，在与柚皮苷对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，缺骨碎补阴性对照液对上述方法无干扰。见图1。2. 1. 2 鸡血藤的薄层色谱鉴别取本品10 片，除包衣，研细，加乙醇30 mL，水浴回流1 h，滤过，滤液浓缩至约2 mL，加入3 倍量硅胶，搅匀，烘干，装柱( 内径1. 0 cm，干法装柱)，加三氯甲烷50 mL 洗脱，蒸干洗脱液，加甲醇1 mL 溶解残渣，作为供试液。另取芒柄花素对照品适量，加甲醇制成每1 mL 含0. 25 mg 的对照液。照中国药典2005 年版一部附录VI B 薄层色谱法试验，分别吸取供试液5 μL 与对照液1 μL 点于同一硅胶G 薄层板上，展开剂为氯仿-甲醇(10 ∶0. 65)，展开后取出，晾干，置紫外光灯(365 nm) 下观察。供试品色谱中，在与芒柄花素对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，缺鸡血藤阴性对照液对上述方法无干扰。见图2。2. 1. 3 熟地黄的薄层色谱鉴别取本品，除包衣后研细，称取3 g，加30 mL 甲醇，超声30 min 后过滤，滤液蒸干后加2mL 甲醇溶解残渣，作为供试液。取5-羟甲基糠醛对照品适量，加乙醇制成每1 mL 含0. 5 mg 的对照液。照中国药典2005 年版一部附录VI B 薄层色谱法试验，分别吸取供试液及对照液各1 μL，点于同一硅胶GF254薄层板上，展开剂为甲苯-乙酸乙酯(1 ∶ 1)，展开后取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下观察。供试品色谱中，在与5-羟甲基糠醛对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，缺熟地黄阴性对照液对上述方法无干扰。见图3。2. 1. 4 肉苁蓉的薄层色谱鉴别取本品，除包衣后研细，称取1 g，加甲醇20 mL，超声30 min 后过滤，滤液蒸干后加2mL 甲醇溶解残渣，作为供试液。取甜菜碱对照品适量，加甲醇制成每1 mL 含4 mg 的对照液。照中国药典2005 年版一部附录VI B 薄层色谱法试验，吸取供试液及对照液各1 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，展开剂为丙酮-无水乙醇-盐酸(10 ∶ 6 ∶ 1)，展开后取出，晾干，喷改良碘化铋钾试液后置碘蒸气中熏至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与甜菜碱对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。缺肉苁蓉阴性对照液对上述方法无干扰。见图4。2. 2 含量测定［2-4］2. 2. 1 色谱条件填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶;流动相为乙腈-水(30 ∶ 70);流速为1. 1 mL/min;检测波长:270nm。在上述条件下供试品中淫羊藿苷与其他组分分离度大于1. 5。理论板数按淫羊藿苷峰计算为14 347。2. 2. 2 对照品溶液的制备取淫羊藿苷对照品适量，精密称取，制成每1 mL 含淫羊藿苷35 μg 的甲醇溶液。2. 2. 3 供试品溶液的制备取本品10 片，除包衣后研细，精密称取0. 4 g 置三角瓶中，精密加入50 mL 70% 乙醇溶液，密塞，称重，超声(功率250 W，频率40 kHz)10 min，放冷后再称定重量，以70% 乙醇补足减失的重量，摇匀后滤过，弃去初滤液，取续滤液，即得。2. 2. 4 阴性对照溶液制备取淫羊藿阴性对照样品，按2. 2. 3项下制备方法制成阴性对照液。2. 2. 5 准确度试验2. 2. 5. 1 对照品溶液制备精密称取淫羊藿苷对照品0. 014 78 g，置100 mL 量瓶，加70%乙醇适量溶解后稀释至刻度，摇匀，作为准确度用淫羊藿苷对照品溶液( 每1 mL 含淫羊藿苷147. 8 μg)。2. 2. 5. 2 供试品溶液的制备精密称取抗骨增生片样品(批号MC00106，含淫羊藿苷1. 21 mg /片) 共9 份，置具塞三角瓶中，精密加入上述准确度用对照品溶液适量( 见表1)，再按2. 2. 3 项下精密加70%乙醇溶液50 mL 起操作，结果平均回收率为100. 98%，RSD = 0. 6%(n = 9)。见表1。2. 2. 6 精密度2. 2. 6. 1 重复性试验取相同批号的抗骨增生片6 份，按2. 2. 3 项下操作，结果6 份样品RSD 为0. 6%，表明重复性良好。2. 2. 6. 2 中间精密度试验由甲、乙、丙三人用同一台设备，在不同的时间，按拟定方法测定相同批号的抗骨增生片，结果三者RSD 为0. 7%，表明精密度良好。2. 2. 7 专属性分别取供试液、淫羊藿苷对照液及淫羊藿苷阴性对照溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，结果表明阴性对照液对本方法无干扰。见图5。2. 2. 8 线性对照品贮备液的制备称取淫羊藿苷对照品0. 017 34 mg，精密称定，置50 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(浓度:0. 346 8 mg /mL)。精密吸取对照品贮备液0. 1、0. 2、0. 5、1. 0、2. 0、3. 0、5. 0、10. 0 mL，分别置20 mL 量瓶中，加甲醇并稀释至刻度，摇匀，吸取10 μL，注入高效液相色谱仪，平行两次进样，以淫羊藿苷浓度(μg /mL)为横坐标，峰面积平均值为纵坐标，得回归方程为: Y =19. 783X + 5. 378 1，r = 0. 999 9，表明在淫羊藿苷在1. 734 ～173. 4 μg /mL 范围内线性良好。2. 2. 9 被测溶液的稳定性取相同批号的抗骨增生片，按拟定方法试验，分别间隔0、1、2、4、6、10 h 进样，结果RSD 为0. 5%，表明被测溶液在10 h 内稳定性良好。2. 2. 10 耐用性2. 2. 10. 1 流速的考察取相同批号的抗骨增生片，按拟定方法试验，分别在0. 8、1. 1、1. 5 mL/min 的不同流速情况下进行测定，淫羊藿苷含量测定结果RSD 为1. 8%，表明淫羊藿苷含量测定结果不受流速的影响。2. 2. 10. 2 色谱柱的考察取相同批号的抗骨增生片，按拟定方法试验，使用3 种不同色谱柱( 迪马Diamonsil C18;4. 6mm × 250 mm，5 μm;Phenomenex Gemini 5 μm C18 110A 250mm × 4. 6 mm; 依利特Kromasil C18 5 μm，4. 6 mm × 200mm)，结果3 支柱子RSD 为1. 5%，表明色谱柱对不影响该方法的结果。2. 2. 10. 3 流动相比例的考察取相同批号的抗骨增生片，按拟定方法试验，在流动相配比分别为(28 ∶ 72)、(30 ∶ 70)、(32 ∶ 68) 时进行测定，淫羊藿苷的含量测定结果RSD 为0. 9%，表明在流动相配比发生微小变化时，该试验测定结果影响不大。2. 2. 10. 4 柱温的考察取相同批号的抗骨增生片，按拟定方法试验，在20 ℃、30 ℃、40 ℃ 柱温下测得结果RSD 为1. 5%，表明柱温对该试验影响不大。2. 2. 11 10 批样品含量测定取不同批号不同厂家的抗骨增生片10 批，按拟定方法试验，结果见表2。3 讨论3. 1 小结本研究对建立的薄层色谱方法进行了耐用性的考察，对不同温湿度及不同的板材( 手铺板、市售预制板) 下的展开效果进行对比，结果良好;含量测定方法按中药质量标准分析方法验证指导原则［5］进行方法学验证，准确度好，方法可行。3. 2 含量测定项下波长的确立在200 ～ 320 nm 波长范围内扫描淫羊藿苷对照品的甲醇溶液，结果在270. 9 nm 波长处有最大吸收，与文献所用的最大波长(270 nm) 基本一致，故选择270 nm 为本品的测定波长。3. 3 流动相的选择流动相曾试用:(Ⅰ) 乙腈-水(30 ∶70);(Ⅱ)甲醇－ 1%冰醋酸溶液(55 ∶ 45);(Ⅲ)甲醇-水(60∶ 40)，结果表明流动相Ⅰ板数高，分离度好，故选择其为本试验流动相。3. 4 提取溶剂的选择为寻找合适的提取溶剂，取同一供试品，分别用70%乙醇、甲醇、流动相进行提取，三者结果差异不大，但甲醇与流动相中的乙腈毒性较大，故提取溶剂选择70%乙醇。3. 5 提取方法及超声时间的选择考察了分别超声处理10、20、40、90 min 与浸渍6 h 的提取效果，表明不同超声处理时间与浸渍较长时间测得结果大致相同，RSD 为0. 94%，故选择提取方式为超声10 min 列入正文。参考文献:［1］ 中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂( 第六册)［S］. 1993.［2］ 杨增明. 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中医认为，便秘因病因、病机不同，分为不同类型，热结便秘是其中的一种。其症状表现为大便排出困难，腹部胀满，粪便呈球状或如羊屎，面红身热，心烦口干或口舌生疮，小便短赤，舌红、苔黄或燥。短期形成的热性便秘用大黄等攻下药物即可，但老年人或习惯性便秘者要慎用，否则伤害正气，反复使用形成恶性循环。患者可以尝试以下方子：决明子、肉苁蓉各10 克，蜂蜜适量，将决明子炒熟、研细，两味药同加沸水冲泡，滤液，加入蜂蜜，代茶饮。方中，决明子性微寒，归肝、大肠经，具有清热明目、润肠通便的功效，常用来治疗目赤肿痛、视物模糊、头痛眩晕、肠燥便秘。决明子有升清降浊的特点，升清表现为清解风热，以利头目，治疗目昏不清、眩晕等；降浊表现为对肠道有濡润作用，有利于粪便的排出。肉苁蓉是一种寄生植物，有“沙漠人参”的美誉。其性温，归肾、大肠经，能够补肾阳、益精血、润肠道，它能养血润燥，缓解肠道的燥结，同时性温不寒，和决明子寒热互济，避免消耗人体阳气。本方最后还要加入蜂蜜，能润肠通便。蜂蜜用在这里对上面两味药物有辅助作用，也改善了药液的口味。

细胞培养至对数生长期时分别加入上述各组药物，每日1次。培养96h时，模型组、银杏叶片组和GCs各剂量组分别加入终浓度为20 μmol-L-的Aβss，正常对照组以等体积培养基替代。MTT比色法测定细胞存活率取96孔板，细胞培养井分组，Aβs．m诱导24h和48h后，常规MTT法测定，计算PC12细胞存活率。吸收光波长为570nm。每组设8个复孔，实验重复3次。分光光度法检测细胞中LDH活性 另取96孔板，细胞培养并分组，Aβxm诱导24h和48h后，分别收集细胞上清液，精密吸取上清液0.02ml。按LDH试剂盒说明书操作，计算各组细胞上清液中LDH 活性。吸收光波长为440mm。每组设12个复孔，实验重复3次。流式细胞术 Annexin V／PI法检测细胞凋亡 取25ml培养瓶，按上述方法培养细胞并分组，收集细胞悬液，将细胞悬浮于1xAnnexin V混合缓冲液中。取细胞悬液100μL，按调亡检测试剂盒说明书操作，流式细胞仪测定细胞凋亡率。统计学处理 数据以王±：表示，使用PEMS3.1统计软件处理。采用方差分析，两两比较，P＜0.05为有显著差异。结果细胞的形态及生长情况 光镜下观察可见，模型组PC12细胞数目显著减少，细胞接触松散，部分细胞皱缩，变圆、脱落的细胞数目较多，诱导48h比24h产生变圆、脱落的细胞数日更多。见图1。与模型组相比，银杏叶片组和GCs各剂量组细胞数目显著增多，细胞接触紧密，贴壁生长旺盛，少量细胞皱缩，变圆、脱落的细胞数目明显较少，受损程度明显较轻。GCs低、中、高剂量组中存活的细胞，随GCs剂量的增高，皱缩、变圆、脱落的细胞数目呈明显减少。细胞存活率 Aβzsa诱导PC12细胞24h及48h后，与正常对照组比较，模型组PC12细胞的存活率显著降低（P＜0.01），诱导48h后的存活率低于24h。与模型组比较，作用24h后，银杏叶片组和GCs各剂量组的细胞存活率均显著增加（P＜0.01）．GCs中剂量组细胞的存活率与低剂量组无显著差异（P＞0.05），GCs高剂量组细胞的存活率高于中剂量组（P＜0.05）。但作用48h后，GCs高剂量组细胞的存活率与中剂量组相比无显著差异（P＞0.05）。作用48h后CCs各剂量组细胞的存活率均显著低于作用24h（P＜0.01）。见表1。表1各组PC12细胞的存活率及乳酸脱氢酶（LDH）活性检测结果细胞存结率／号（＊＊8） (21**)1·/이24% 48%正業日期0'0010'001592:27718:16备물22.0-1.216.4=2.0852.261126:15银查对片86.013 67518:4653446GC值M641948.9598.35692.12CG中制量71:655.7-568.30656*32CC高到量+4*6464:12%540:34577:17单国素方差分析，两两比较；与模型组比较，P＜001：与CC低剂量组比较。甲＞0.05．P＜0.05，甲＜0.01：与GC中制量相比，中＞0.05．P＜0.05，P＜001：与两导24h后检测比数，P＜0.01图1 光镜观察不同处理后PC12细胞的形态变化（x160）（24％），D：正常对照期（48％），E：模型组（48％），F：CG真量型（48％）细胞中LDH活性情况 Aβsm诱导PC12细胞24h和48h后，与正常对照组比较，模型组PC12细胞的LDH活性显著增加（P＜0.01），诱导48h后LDH的活性高于24h。与模型组比较，GCs各剂量组和银杏叶片组细胞的LDH活性显著降低（P＜0.01）。作用24h和48h后，GCs中剂量组细胞的IDH活性低于低剂量组（P＜0.05或P＜0.01），GCs高剂量组细胞的LDH活性低于中剂量组（P＜0.05或P＜0.01）。作用48h后GCs各剂量组细胞的LDH活性显著高于作用24h（P＜0.01）。见表1。细胞的凋亡率 与正常对照组细胞的凋亡率（24h：1.8％，48h：10.1％）比较，模型组细胞的凋亡率显著增加（24h：26.7％，48h：51.0％）。与模型组比较，GCs低剂量组细胞的凋亡率（24h：20.1％，48h：32.4％）、中剂量组细胞的调亡率（24h：14.9％，48h：26.9％）、高剂量组细胞的调亡率（24h：10.3％，48h：18.3％）均显著下降，与银杏叶片组细胞的调亡率（24h：11.8％，48h：15.6％）相似。讨 论本研究利用体外培养的PC12细胞经Aβs．s诱导成功建立AD细胞模型，检测不同剂量CCs对细胞存活率、LDH释放量和细胞调亡率的影响。结果显示，Aβsis（20μmol-L-）可诱导PC12细胞膜损伤，使细胞存活率下降，细胞LDH活性增高、细胞凋亡率增加，与文献［6］报道一致。与模型组相比，GCs各剂量组细胞数目显著增多，生长状态明显改善。随GCs剂量的增高，PC12细胞的存活率增高，LDH活性下降，细胞凋亡率降低。提示，GCs对Aβsm诱导PC12凋亡细胞具有抑制作用，且对损伤的神经细胞有保护作用。其中，高剂量GCs作用48h效果最明显。研究表明，Aβ聚合成不溶性纤维时，会促使细胞外自由基生成，导致细胞器、细胞膜和细胞骨架受到损伤，引起细胞凋亡”。而自由基的生成是AD发生的重要因素网。已有报道称，Aβsss可使PC12细胞中调亡抑制基因bax的表达增强＂。研究证实，GCs具有体外清除自由基的作用，能提高Aβ所致AD模型小鼠的学习记忆力，防止脂质过氧化作用，使bax表达减弱、bcl-2表达增强m。因此，GCs对Aβxs诱导PC12凋亡细胞具有保护作用，其机制可能是通过促使bax表达减弱、bcl-2表达增强，从而抑制细胞凋亡。关于GCs对Aβsn诱导PC12凋亡细胞与bcx／bel-2的关系将进一步研究证实。［参考文献］刘江红，许贤豪，黎健，等，β-淀粉释蛋白25-35致神经细胞损伤的机制及信号转导通路初步研究，中国神经免疫学和神经病学杂志，2006,3（3）：129-132．[2] 王晓雯，李琳琳，木胡牙提，等，肉菜蓉总试对小鼠组织的抗氧化作用1 中国中药杂志，1998,23（9）：554-556．[] 王晓雯，蒋晓燕，邹利娅·伊明，等，肉其蓉总普体外清除自由基及对OH-引发的DNA损伤的保护作用1中国药学杂志，2001.36(1):29-32.[4] 王新源，王晓雯。王雪飞，等，肉苁春总管对D-半乳糖脑老化模型小鼠的保护作用月中国行为医学科学，2004,13（6）：613-615[5] 刘风霞，王晓雯。罗兰，等，肉苁春总苷对β-淀粉释肽所致阿尔采末病小鼠模型学习记忆的影响及其机制月中国药理学通报，2006,22（5）：595-599．[6] 聂培纬、李颖，王瑞涛，B淀粉样蛋白致PC12细胞损伤的研究哈尔滨医科大学学报，2007,41（3）：234-236．[7] RETTER RU. Ocilative danage in the entral nervous sytem peotection bymelamin Pog Neumbiol,1998,56(3):359-384[s] MARTINA.YOLDIM K, SZPRENGIEL A, et o. Rales of vanins Eand Con neulegenerative dieaes and cognitive pedomao Nate Rev,2002,60(101):308-326.[9] 王振福，魏泽兰，李新民，等，奥氯平对淀粉祥β蛋白25-35请导的PC12细胞调亡的保护作用月 解放军医学杂志，2006,31(5):388-390.［10］李珠琳，王晓雯，王雪飞，等，肉苁종总试的抗脂质过氧化作用及抗辐射作用（J）中国中药杂志，1997,22（6）：364-367．［11］罗兰，王晓雯，杨梅，等，肉苁蓉总音对双侧颈总动脉结孔大鼠学习记忆功能影响及其机制探讨，中国新药与临杂志，2007.26（6）：401-405．

罗兰”，阿尔孜古丽·吐尔逊b，王晓雯。（新疆医科大学a.第一附属医院 药剂科；b.第一附属医院医学研究中心；c.药学院药理教研室，新疆乌鲁木齐 830054）［关键词］ 肉苁蓉；PC12细胞；淀粉样β蛋白；细胞凋亡；阿尔茨海默病［摘要］ 目的 研究肉苁蓉总苷（GCs）对β淀粉样蛋白25-35（Aβzsss）诱导大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞凋亡的保护作用。方法 体外培养的大鼠PC12细胞分6组：正常对照组、模型组、银杏叶片组（40mg·L-）、GCs低剂量组（25mg·L-1）、GCs中剂量组（50mg·L-）和GCs高剂量组（100mg·L-1）。细胞培养至对数生长期时分别加入上述各组药物，每日1次。培养h96时，模型组、银杏叶片组和GCs各剂量组分别加入终浓度20μmol-L-的Aβzs3s，正常对照组以等体积培养基替代。继续培养24h和48h时，光镜观察各组细胞的形态及生长情况，MIT比色法检测各组细胞的存活率，分光光度法检测细胞中乳酸脱氢酶（LDH）活性，流式细胞术 Annexin V／PI法检测细胞凋亡率。结果 与正常对照组比较，模型组细胞数目显著减少，部分细胞皱缩，变圆、脱落的细胞数目较多，其存活率显著降低、LDH活性明显提高、凋亡率显著增加（P＜0.01）。与模型组相比，GCs各剂量组细胞数目显著增多，细胞形态学变化明显改善，细胞的存活率增高、LDH活性下降、凋亡率降低，有非常显著差异（P＜0.01）。其中，GCs高剂量作用48h效果最显著。结论 GCs对Aβxs引起的PC12凋亡细胞损伤具有明显的保护作用。β淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）是正常情况下存在于细胞膜上的β淀粉样前体蛋白（APP）在β和y蛋白水解酶作用下，生成的由39～43个氨基酸残基构成的肽。其第25-35位氨基酸所组成的多肽片段是一个疏水性氨基酸的肽，体外水溶液中可形成稳定的聚集态，呈β片层状二级结构，具有神经毒作用。因此，Aβss常用于体外神经毒实验。阿尔采末病（Alzheimer disease，AD，又名阿尔茨海默病）为慢性进行性神经性疾病，以认知功能和记忆损害、日常生活能力进行性下降及神经心理症状和神经行为异常为主要特征。大量实验研究证明，Aβ异常沉积是AD的重要病因，也是构成老年斑的主要成分。Aβ具有神经毒性，可引起动物学习记忆减退和认知功能障碍，还可出现神经退化和死亡。因此，由Aβ诱导的模型常用于AD发病机制的研究和药物筛选。肉苁蓉总苷（glycosides of cistanche，GCs）是从新疆盐生肉苁蓉（herba cistanches）中提取的，主要成分是苯乙醇总苷。本课题组多年来已对GCs的抗氧化口、清除自由基、抗衰老、抗调亡等药理作用进行了深入研究。本研究在观察Aβ2sm诱导PC12细胞调亡的同时，探讨GCs对凋亡细胞的神经保护作用，为防治AD提供理论基础。材料与方法药品、试剂与仪器 DMEM／F1粉剂培养基为美国Gibco公司产品，胎牛血清购自杭州四季青工程材料研究所，甲基噻唑基四唑（MTT）为美国AMRESCO公司产品。乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒（南京建成生物研究所），Vybrant凋亡检测试剂盒（美国Invitrogen 公司）。Aβxa（美国Sigma公司，批号：115K4778），银杏叶片（扬子江药业集团有限公司，批号：08092001）。GCs 由新疆医科大学药学院天然药物生药教研室按日本文献［公开特许公报（A）昭63-198627］方法，从新疆盐生肉苁蓉植物中提得，主要成分是苯乙醇苷类（批号：20070606）。垂直流超净化台ZHJH-1214C（上海智城分析仪器有限公司），无菌二氧化碳培养箱（美国Thermo公司），全自动酶标仪（美国Bio-Rad公司），流式细胞仪（美国 Beckman Coulter公司），低温离心机（美国Thermo公司），PM-30倒置显微镜-计算机图像分析系统（日本Olympus公司）。溶液与药物配制 Aβsm溶液的配制：取Aβsas1mg充分溶解于灭菌生理盐水中，使其浓度为1.0mmol-L，密闭后置37℃培养箱中1wk，-20℃冻存。实验前解冻，临时配制成所需浓度。药物配制：银杏叶片和GCs均用含血清的培养基配制至所需浓度，0.22μm滤膜过滤除菌，分装到无菌瓶中，-20℃冰箱避光保存。细胞培养与分组 大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞购中国科学院上海细胞生物研究所。细胞常规培养，培养基含10％灭活胎牛血清和DMEM／Fn。细胞接种至96孔板，每孔加细胞培养液100μL，分为6组：正常对照组、模型组、银杏叶片组（40mg·L-）、GCs低剂量组（25mg·L-）、GCs中剂量组（50mg·L）和GCs高剂量组（100mg-L）。

罗兰＇，王晓雯，时扣荣＇，顾伟鹰（1．上海中医药大学附属第七人民医院药学部，上海 200137；2．新疆医科大学药学院，新疆乌鲁木齐 830000）【摘要】目的：探讨肉苁蓉总苷（GCa）对β-淀粉样蛋白致 Alzheimer病（AD）大鼠海马CA1区神经元病理形态学的影响。方法：将60只SD雄性大鼠随机分为6组，分别为假手术组、β淀粉样蛋白组（模型组）、维生素E阳性药组（VitE组）、GC40mg／kg组（小剂量组）、GCa80mg／kg组（中剂量组）、GCs160mg／kg组（高剂量组）。灌胃给药，1次／d，连续14d。给药结束后，处死大鼠，制备其脑组织切片备用。经苏木精-伊红染色（HE）和Bielachowskis银染色法观察海马CAI区神经元的病理结构改变，且通过电子显微镜观察神经元超微结构变化。结果：（1）GCs给药组的大鼠海马CAI区细胞排列整齐，形态正常，未见调亡坏死细胞，结构与假手术组类似。（2）GCs各给药组的大鼠神经元细胞核圆，核膜完整，核仁明显，线粒体结构完整，神经原纤维排列较整齐，结构几乎接近于假手术组和维生素E阳性药对照组。（3）GC给药组的大鼠海马CAI区神经原纤维排列较规则，神经元结构较完整，无明显肿胀、增粗，损伤明显减轻，组织结构基本接近于假手术和维生素E阳性药对照组。结论：GCs能减轻AD模型大鼠受损神经细胞的病理性改变及超微结构的损伤。【关键词】阿尔茨海默病；肉苁蓉总苷；β-淀粉样蛋白；海马；神经元；大鼠阿尔茨海默病（alzheimersdisease，AD）亦称老年性痴呆症，是一种老年神经系统退行性疾病，随人口老龄化，其患病率也明显增高，给国家、社会和家庭带来沉重负担。AD患者主要临床表现为记忆力减退、认知功能障碍以及人格改变等。对于AD发病机理和防治的研究已经成为近年来国内外关注的热点之一。较为公认的β-淀粉样蛋白（Aβ）级联反应假说认为：脑内在遗传及内外环境因素发生变化刺激下生成AB.Aβ在脑内的聚集，生成斑块、神经纤维缠结和tau蛋白磷酸化，进而产生神经毒性，造成神经突触损伤、神经元调亡，最终引发认知障碍。另外，中医认为老年痴呆的病因主要在于年老腑脏疲惫，心血渐耗。脑为髓海，“肾”与脑功能存在密切的联系，通过“补肾填髓”可以防治衰老引起的记忆力降低，起到“益脑髓”作用。与此同时，“补肾填髓”治疗方法已应用于临床多年，无论是在提高智能方面，还是在改善临床症状与体征方面，均获得了可靠的疗效。肉苁蓉俗名大芸，为列当科植物，是味著名的药食两用的补肾益气类中药”，在民间已用于治疗老年性痴呆多年，效果颜住。日前市面上已有复方肉苁蓉益智胶囊问世，很有研究价值和应用前途。肉苁蓉总苷（glycusides of cistanche herba.CC.）是从 肉苁蓉中提取的一类多酚羟基类化合物，主要成分为松果菊苷和毛蕊花糖苷两类苯乙醇总苷（化学结构式见图1），其有抗氧化“、清除白山基”、保护心肌缺血、抗辐射”、增加人体免疫功能、延缓衰老等功效。我国传统中医也认为补肾益精类中药肉苁蓉具有抗衰老、改善记忆的功效。另有研究发现，肉苁蓉总苷可改善实验性AD大鼠的记忆学习障碍，对脑组织损伤具有保护作用，这可归因于其抗脂质过氧化和抑制细胞测亡功效。这种抗脂质过氧化和抑制细胞凋亡作用与中医治疗AD的主要治疗原则“补肾填髓”相吻合。GC、不仅可以提高AD样大、小鼠脑组织中超氧化物歧化酶（superoxide dis-mutase，SOD）及谷胱甘肽过氧化物酶（glutathioneperusidase，GSII-Px）的活性，还降低了丙二醛（ma-londialdehyde，MDA）的含量，说明GC，可增强自由基清除酶活性，减少自由基对机体的损伤，防止脂质的过氧化作用，抑制细胞损伤＊-，但对于GC是如何作用于AD模型大鼠海马CA1区的病理形态改变，尚未见相关报道。本研究报将Aβss注入大鼠脑室海马致 Alzheimer病，建立实验性AD动物模型，观察GCs对该实验性AD大鼠海马CAI区的病理形态变化和超微结构的影响，观察GCs对大鼠脑内病变部位的改善情况，为中药治疗AD提供实验依据。 1 材料与方法1.1 仪器脑立体定位仪（中国人民解放军第二军医大学），Leica RM 2135切片机（德国菜卡公司），Ni-konYS100型显微镜（日本尼康公司），Leica HI1210展片机（德国莱卡公司），Motie Med 6.0 数码医学图像分析系统（Motie Med公司）JEDL-1230透射电子显微镜（日本）。1.2 试剂ABsss、DAB免疫组化显色试剂盒（Sigma化学公司）、药用维生素E（vitamin E，ViE）（上海建安制药厂）、硫代硫酸钠（西安化学试剂厂）、过碘酸（北京化工厂）、六次甲基四胺（天津市百世化学有限公司）、双色酸（上海试剂三厂）、磷钨酸（天津市化学试剂公司分公司）、灿烂绿（天津市汇英学试剂有限公司）、硝酸银（天津市大茂化学试剂厂）。所有化学试剂均为分析纯级别（analytically pure，AR）。1.3 药材肉苁蓉总苷由新疆医科大学药学院天然药物教研室从新疆肉苁蓉中提取。1.4 动物SPF级SD大鼠雄性大鼠60只，体重（250±20）g，动物及饲料购白新疆医科大学实验动物，实验动物生产证号：医动字第16-003号。1.5 实验方法1.5.1 AB的解有 将ABsss1mg溶解于200μL灭菌生理盐水中，制成5mmol／L的溶液，溶液密封后置于37℃细胞培养箱中，经7d后形成凝聚态，备用。1.5.2 大鼠的给药方式 将60只试验大鼠随机分为6组，分别为阴性对照组（假手术组）、Aβ组（模型组）、VitERI性药组（VitE组），GCs40mg／kg组（小剂量组）、GCs80mg／kg组（中剂量组）、GCs160mg／kg组（高剂量纸）。灌胃给药，1次／d，连续14 d。1.5.3 AD模型的建立 先用水合氯醛（400mg／kg）腹腔注射，以麻醉大鼠，并进行常规备皮消毒。然后，切开大鼠的颅顶部正中的皮肤，用脑立体定位仪固定大鼠。定位方式为：取平颅头位，确定右侧3.8mm、中线旁2.5mm，颅骨表面下达到3.0mm处为右海马背侧部。最后，回抽脑脊液，并用10μL微量注射器于5min内缓慢注入1μLAβsss，留针10min。建模方法参照文献报道（。1.5.4 标本采集 电迷宫实验结束后，每组随机选取3只动物，用水合氯醛（400mg／kg）麻醉，依次剪开皮肤、胸腔，充分暴露心脏，剪开心尖部，以灌注针朝主动脉方向插入，止血钳夹闭，灌注生理盐水，于右心耳处，生理盐水灌注15-20min，至流出液变清，换用4％甲醛溶液继续灌注15-20min，直至动物全身僵硬，肝脏发白为止，然后断头取脑，用刀片切除前部脑端和后部小脑，将脑组织放入10％福尔马林溶液继续固定24h，石蜡包埋，制作大鼠海马CA1区4μm厚的横断面脑切片。切片分别用于苏木精-伊红（HE）染色和Bielschowskis银染色。1.5.5 HE染色观寨实验性AD大风海马CAI 区超微结构 石蜡切片脱蜡、乙醇梯度脱水。二甲苯5 min，10 min（共两次），无水乙醇（1次）．95％酒精（两次）．80％酒精（1次）各5s，水洗。苏木素染液5-10mn。自来水洗，洗去多余染液。盐酸乙醇分化（将切片在盐酸乙醇内快速沾一下，立即人自来水使切片返蓝1min）。伊红染液3-5min。自来水洗，洗去多余染液。脱水（系列酒精：80％酒精、95％酒精、95％酒精、无水乙醇各5s）。透化（二甲苯两次各5s）取出封片。在光学显微镜下观察：假手术组大鼠海马CA1区，细胞排列整齐，神经元细胞的中央有一个细胞核，形状圆面大，核内异染色质少，色浅，核仁内胞质丰富（图2A）。模型组可见散在大量的凋亡细胞，表现为细胞质为淡红色，浓缩样样；个别可见核碎裂，甚至核仁消失现象；局部神经元数目减少，并且神经纤维肿胀成宽带状或条索状，增粗（图2B）。与模型组比较，GCs给药组和VitE阳性药组，大鼠海马CAI区神经元结构基本正常，没有发现凋亡坏死细胞出现（图2C-2F）。图2 大城海马CAI区病理结构的影响（HEx100）ECC中制量丝（80mgkg）：FCC高剂量组（160mg／kg）。2.2 GCs对实验性AD大鼠海马CAI 区超微结构的影响