结 果小鼠状况 NS组小鼠状况良好，进食良好。被毛浓密而有光泽，眼睛有神，反应灵敏，动作灵活，肌肉有弹性；模型组多数表现为动作不灵活，并见竖毛，身体蜷缩，维生素E和CCs组在活动方面较模型组小鼠为好，被毛有光泽，蜷缩者较少。GCs对AICI，所致拟AD模型小鼠被动回避反应能力的影响 在跳台实验中，与NS组相比，模型组出现的错误反应次数增多（P＜0.05），潜伏期缩短（P＜0.05），表明AICI，破坏拟AD模型小鼠的被动回避反应能力；与模型组相比，GCs组和维生素E组，错误次数减少（P＜0.01），潜伏期延长（P＜0.01），提高了拟AD模型小鼠的被动回避反应能力。见表1。表1 GCS对AIC，（sc）所致报AD模型小鼠被动回避反应能力的影响填别结药剂量／项物3mim内出现错误的进伏期和错误次数mg*kg数／只借伏期／健误次数／次NS9160:510.6x0.3模型966:222.2.0.8VIE508159.530.54=0.18GC.162.58168:251.2:0.4GC.I125%176*41.00±0.24GC.2508178:120.84=0.13     GC：肉苁蓉总开：AC：三氯化语：AD：阿尔采末病：NS：生理盐水：VaE：维生素E，下表同，经方差分析和，检验：VaE组和GCs组与模型组比较，P＜0.01；模型组与NS组比较。P＜0.05迷宫试验 在迷宫实验中，与NS组相比，模型组出现的错误反应次数明显增多（P＜0.01），表明AICl，小鼠体内明显破坏拟AD模型小鼠的空间学习记忆能力；与模型组相比，GCs组和维生素E组，错误次数显著减少（P＜0.01），提高拟AD模型小鼠的空间学习记忆能力。见表2。   GCs对AICI，所致拟AD模型小鼠脑组织SOD活性和MDA含量的影响 与NS组相比，模型组拟AD小鼠脑组织中SOD活性降低（P＜0.01），MDA含量增高（P＜0.01）；与模型组相比，CCs组和维生素E组小鼠脑组织中SOD活性增高（P＜0.01），MDA含量降低（P＜0.01）。见表3。脑重系数的测定 与NS组相比，模型组拟AD小鼠脑重系数降低（P＜0.01）。结果提示，模型小鼠脑萎缩，脑体积减小。与模型组相比，GCs组和表2 迷宫试验结果表2 迷宫试验结果X土车细别验药制量／sg·kg动物数／只情误次数／次SN97.3±1.4模型99.3±1.3VIIE5086.0±2.51*3962.587.0±2.2GC.E125율7.1+1.61*3925086.1=1.4经方委分析和,检验:ViE组和CCs量与模型组比较,P<0.01:模型组与NS组比较,P0.01表3 GCs对AIC,(sc)所致报AD模型小鼠脑组织 SOD和MD含量的影响X土5组别给药制量／ 动物数／SOD/MDA/日gkD·mgpromol·mgproNS61661915±1.8模型9113:1630±73HA50 8140÷2012+6GC.L62.5 월150.2822.10GC.I123 %158+328+61GC.B250 8174+1314主量经方委分析和，检验：ViE组和CCs量与模型组比较，P＜0.01：模型组与NS组比较，P＜0.01表3 GCs对AIC，（sc）所致报AD模型小鼠脑组织 SOD和MDA含量的影响SOD：超氧化物歧化酶：MDA：丙二脏。经方差分析和q检验：VE组和CC推与信型组比较，P＜0.01；模型姐与NS组比较．P＜0.01维生素E组可提高拟AD模型小鼠脑重系数（P＜0.01）。见表4。表4 GC对

罗兰＇，王晓雯2＂，刘凤霞，杨珊2，王涛（1．新疆医科大学第一附属医院药剂科，新疆乌鲁木齐 830054；2．新疆医科大学药学院药理教研室，新疆乌鲁木齐 830054；3．新疆医科大学解剖教研室，新疆乌鲁木齐 830054）［关键词］阿尔采末病；铝；自由苯；脑重系数；三氧化铝；肉苁蓉总苷［摘要］目的：探讨肉苁蓉总普（GCs）对三氧化铝（AICI，）皮下注射（sc）致小鼠拟阿尔采末病（AD）模型小鼠学习记忆障碍的保护作用及其机制。方法：以AICl3（60mg＊kg＇，sc，7d）致小鼠学习记忆障碍模型，维生素E为阳性对照，采用小鼠跳台试验和迷宫试验观察GCs（62.5,125,250mg＇kg＇，ig，20d）对小鼠学习记忆障碍的保护作用，并测定GCs对小鼠脑组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量和脑重系数的影响。结果：GCs各个剂量组均能改善AICl，所致学习记忆障碍，增加脑组织中SOD活性，降低MDA含量，并使脑重系数增加。结论：内苁蓉总普对AICl，致小鼠学习记忆障碍具有保护作用，其作用机制可能与其抗氧化作用有关。［文献标识码］A［中图分类号］ R285;R965   铝是一种慢性神经毒物，是致阿尔采末病（Alzheimer＇s disease，AD）的一个重要的危险因素＂，可引起AD的一系列特征性表现，故在进行防治AD的药物研究中常以三氯化铝（aluminumtrichloride，AICl3）模拟AD动物模型。许多研究表明，铝可增强脑组织中的脂质过氧化水平，脂质过氧化产物丙二醛（MDA）的含量间接反映了脂质过氧化的程度，从面反映神经元受损程度，超氧化物歧化酶（SOD）活力的高低间接地反映了机体清除自由基的能力。肉苁蓉（herba cistanches）俗名大芸，为列当科植物，是一味著名的补益中药，具有补肾阳、益精血、抗衰老、抗氧化等方面功效”。肉苁蓉总苷（glycosides of cistanche.GCs）是从新疆德赢vwin登录 中提得，主要成分是苯乙醇总苷。本课题组多年来已对GCs的抗氧化，清除自由基，抗衰老”等药理作用进行了深人的研究。本实验采用皮下注射（sc）AICl，致拟AD小鼠的急性模型，观察GCs对AICl，所致的拟AD模型小鼠学习记忆障碍的保护作用，并探讨其抗AD作用与其抗氧化作用的关系。材料与方法      药品与试剂 GCs（紫外方法测定纯度＞50％）由新疆医科大学药学院植物化学室按日本文献［公开特许公报（A）昭63-198627］方法，从新疆德赢vwin登录 植物中提得，主要成分是苯乙醇苷类；维生素E（上海建安制药厂，规格每粒100mg）；考马司亮兰CBBG试剂盒、MDA含量测定试剂盒、SOD活性测定试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；AICl，-6H2O，分析纯，由天津市化学试剂三厂出品。仪器 LSY型电热恒温水浴锅，北京医疗设备厂生产；电子秤，北京塞多利斯天平有限公司生产：LYJ-皿型离心沉淀机，江苏响水医疗器械厂；721分光光度计，上海第三分析仪器厂；WH-851旋涡混合器，上海环球物化仪器厂；TN型托盘式扭力天平，上海第二天平仪器厂；XZC-5A小白鼠刺激型跳台，张家港市三兴教学机械厂：MG-B型迷宫刺激器，张家港市三兴教学机械厂。动物分组及模型制备 雄性昆明种小鼠60只，体重（22.0±s2.0）g，由新疆医科大学实验动物中心提供随机分为6组。于d1至d7进行造模，生理盐水（NS）组小鼠se NS，其余各组小鼠scAICl，60mg·kg。成模后：（1）NS组9只（对照组）；（2）模型组9只；（3）维生素E组8只（阳性对照组，维生素E50mg·kg）；（4）GCs组（设低、中、高剂量组每组8只，GCs剂量分别为62.5，125,250mg-kg＇）。于造模前7d开始ig给药，NS组和模型组小鼠ig NS，维生素E组和GCs组小鼠分别ig维生素E和GCs，每组ig给药体积一致，每日1次，连续给药，共20d。观察指标及检测方法  小鼠被动回避性跳台实验 装置为80cmx16cmx40cm的茶色有机玻璃箱，箱底铺有铜栅作为刺激电极，内设高4.5cm，直径6.5cm的橡皮垫作为回避电击的安全平台。先放入小鼠适应5min，随后通以36V交流电，小鼠遭到电击后跳上安全平台，如从台上跳下，双足接触铜栅为错误反应。记录3min内出现的错误反应次数。以小鼠学习过程中出现反应的潜伏期和错误反应次数来评价学习记忆能力。 迷宫实验 将小鼠放入三等臂Y型迷宫箱测试小鼠学习记忆能力，反应箱设三条通道，其顶端有一盏15W的信号灯，箱底可施以电击，训练小鼠按信号灯跑向安全通道。电压35V，同时记录小鼠能找到安全区的次数，每次时间为30s，共10次，以小鼠的错误次数作为学习记忆成绩。 生化指标 于造模后20d断头取脑，制成10％脑匀浆，按试剂盒说明书测定SOD活性、MDA含量。考马斯亮兰CBB-SDS法进行脑组织蛋白质含量测定。  脑重系数的测定 小鼠断头处死，速取脑桥基底部上缘水平以上全脑，立即用冷NS冲洗，用滤纸拭去多余的水分，按以下公式计算系数：脑重系数＝脑湿重（g）／体重（g）x100％。统计学方法 采用PEMS3.0统计软件包，数据用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用方差分析q检验。

罗兰＇，王晓雯”，杨梅2，杨珊2，杨永新？（1．新疆医科大学第一附属医院药剂科，新疆乌鲁木齐 830054；    2．新疆医科大学药学院药理教研室，新疆乌鲁木齐 830054；    3．新疆医科大学实验机能中心，新疆乌鲁木齐 830054）［关键词］ 大鼠；学习；记忆；自由基；细胞凋亡：肉苁蓉总苷【摘要】目的：探讨肉苁蓉总苷（GCs）对双侧颈总动脉结扎大鼠学习记忆功能的影响及其机制。方法：雄性SD大鼠，行双侧颈总动脉结扎术，以银杏叶片为阳性对照，术后2wk，进行大鼠跳台试验和Y-型迷官试验，观察GCs对大鼠学习记忆障碍的保护作用；并测定GCs对大风脑组织中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽-过氧化酶（GSH-Px）活性、丙二醛（MDA）含量和乙酰胆碱酯酶（AchE）活性的影响；采用NBT染色法测定24h后脏梗死范围；行为指标采用11分制进行评分；TUNEL法检测脑细胞调亡。结果：GCs能提高双侧颈总动脉结扎所致的脑缺血大鼠学习记忆水平；提高脑组织SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量及AchE活性；改善神经症状；降低脑细胞凋亡率；缩小脑梗死范围；结论；GCs对双侧颈总动脉结扎大鼠认知功能障碍有防治作用，其作用机制可能与增强自由基清除酶活性，防止脂质过氧化反应，抑制细胞凋亡有关。还可能与通过抑制AchE活性，维持脑内乙酰胆碱（Ach）的正常水平有关。［中图分类号］ R285；R965 ［文献标识码］A血管性痴呆是老年性痴呆的一种主要类型。其中缺血性痴呆约占血管性痴呆的半数以上。缺血导致结构不可逆的损伤而出现痴呆症状”。肉苁蓉（herbacistanches）俗名大芸，为列当科植物，是一味著名的补益中药，具有补肾阳、益精血、抗衰老等功效 肉苁蓉总苷（glycosides of cistanche.GCs）是从新疆德赢vwin登录 中提得，主要成分是苯乙醇总苷。本课题组多年来已对GC的抗氧化，清除自由其，抗脑缺血＊等药理作用进行了深入的研究 本实验采用永久性结扎双侧颈总动脉所致的脑缺血动物模型，观察GCs对脑缺血引起血管性痴呆模型大鼠学习记忆功能的保护作用，并探讨其抗血管性痴呆的作用机制。材料与方法药品与试剂 肉从蓉总苷（紫外方法测定纯度＞50％），由新疆医科大学药学院植物化学室按日本文献｜公开特许公报（A）昭63-198627］方法，从新疆德赢vwin登录 植物中提得，主要成分是苯乙醇苷类：银杏叶片（商品名：银可络，深圳海王药业有限公司，规格每粒含总黄酮苷19.2mg、萜类内酯4.8mg，批号：20040501）；氯化硝基四氨唑蓝（NBT）（季兰科技发展有限公司，批号：040819）；考马司亮兰CBBG％试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定试剂盒、丙二醛（MDA）含量测定试剂盒，谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒，乙酰胆碱酯酶（AchE）试剂盒，购自南京建成生物工程研究所，细胞凋亡原位检测试剂盒为德国宝君曼公司产品。仪器 LSY型电热恒温水浴锅，北京医疗设备厂生产；电子天平，北京塞多利斯天平有限公司生产：LYJ-I型离心沉淀机，江苏响水医疗器械厂：721分光光度计，上海第三分析仪器厂：WH-851涡旋混合器，上海环球物化仪器厂；TN型托盘式扭力天平，上海第二天平仪器厂；MC-B型迷宫刺激器，张家港市三兴教学机械厂；跳台（新疆医科大学机能实验中心自制）动物分组及模型制备SD大鼠［许可证书编号：SCXK（新）2003-0011．雄性，体重（290±x30）g，由新疆医科大学实验动物中心提供，按照文献，稍加改进，大鼠经10％水合氯醛溶液300mg·kg＊腹腔注射麻醉，仰卧固定，颈正中切口分离双侧颈总动脉，分别结扎双侧经颈总动脉的远，近端。缝合后伤口，每鼠肌内注射青霉素10万U（连续注射4d），放回笼饲养。假手术组大鼠仅行颈部切开，不结扎双侧颈总动脉，余处理组同双侧颈总动脉永久结扎术大鼠。大鼠随机分6组：（1）假手术组（对照组）；（2）模型组：（3）银杏叶片组（阳性对照组，剂量为6mg＊kg＇）；（4）GCs组（设低、中、高剂量组，剂量分别为40,80,160mgkg＇）。于造模前5d开始ig给药，假手术组和模型组g生理盐水，银杏叶片组和GCs组大鼠分别ig银杏叶片和CCs，每日1次，连续给药，共2wk观察指标及检测方法1 大鼠术后存活情况 观察大鼠双侧颈总动脉永久结扎术2wk后存活情况：2 行为指标评分于术后24h进行行为评分标准如下：提尾离开地面约30cm，左前肢表现为腕弯曲、肘屈曲、肩内旋或兼而有之者，计1-4分；将动物置于光滑平面上，轻推肩部使其向对侧移动，检查阻力情况，降低者根据程度不同计1～3分；根据左前肢肌张力下降程度差异，计1～3分；动物有向一侧不停转圈现象计1分 满分为11分，分数越高，动物的行为障碍越严重3 脑梗死范围百分比测定 术后2wk，大鼠断头处死取脑，去掉嗅球、小脑及低位脑干，浸人37℃、0.25％NBT溶液中温孵15min（即NBT染色）。正常脑组织呈现暗紫色，脑梗死区为白色。取出后置于10％甲醛溶液中固定，取出清洗浮色，称全脑重量及梗死区重量，计算后者占前者的百分比即为脑梗死范围百分比。4 脑组织细胞凋亡的测定 采用TUNEL法，术后2wk，断头取脑，用10％甲醛溶液固定，石蜡切片，常规脱蜡脱水处理，滴加TUNEL反应混合物。37℃孵育60min，滴加转化剂-POD，37℃孵育60 min，滴加DAB底物溶液，室温孵育5～20min，光镜40x10倍下观察结果，每视野下计数100个细胞，计算凋亡细胞所占的比例。5 跳台实验 术后2wk，将大鼠放在跳台仪内的橡皮台上适应3min，然后将大鼠放在铜栅上，接通电源（90V交流电），动物受到电击后逃避反应为跳上橡皮台。记录反应时间及5min内出现的错误反应次数，以大鼠学习过程中的反应时间和错误反应次数来评价学习记忆能力。6 Y型迷宫试验 术后2wk，在暗室中进行，将大鼠放入三等臂Y型迷宫箱测试大鼠学习记忆能力，反应箱设3条通道，其顶端有1盏15W的信号灯，箱底可施以电击，训练小鼠按信号灯跑向安全通道。电压90V，10次·s的电刺激，同时记录大鼠是否能找到安全区的次数，每次时间为30s，共10次以大鼠的正确次数作为学习记忆成绩。7生化指标 术后2wk断头取脑，制成10％脑匀浆，按试剂盒说明书测定SOD活性、MDA含量、GSH-Px活性和AchE酶活性。考马斯亮兰CBB-SDS法进行脑组织蛋白质含量。8 统计学方法 采用PEMS 3.0统计软件包，数据用均数±标准差（x±x）表示，组间比较采用秩和检验，方差分析q检验。结果大鼠术后存活情况 大鼠行双侧颈总动脉结扎2wk后，大部分动物自发活动减少，且随着缺血时间延长，死亡率增高，死亡率为36％，假手术组（对照组）大鼠术后无异常表现，死亡率为0％。对双侧颈总动脉结扎致脑缺血损伤型大鼠的神经保护作用 所有动物均出现了神经症状，主要表现为提尾悬空时，左肩内旋，左前肢内收，肌力下降，行走时向左侧环转。大鼠脑出现明显的梗死灶。银杏叶片和GCs能改善大鼠的神经功能，缩小脑梗死面积，GCs具有神经保护作用。见图1和表1。图2 GCs对双側颈总动脉结扎致脑缺血损伤型大鼠脑组织皮质和海马部细胞调亡的影响（x400） A：假手术组：B：模型组；C：服杏叶片组：D：CC组（160mg-kg＊组）跳台实验 在跳台实验中，与假手术组相比，模型组反应时间延长（P＜0.01），出现的错误反应 图1 GCs对双側颈总动脉结扎致脑缺血损伤型大鼠脑梗死面积的影响 1：餐手术组：2：模型组：3：银杏叶片组：4：GC组（160mg·kg组） 表1 GCs对双侧颈总动脉结扎政脑缺血损伤型大服行为指标和脑梗死范围及脑细胞凋亡的影响 ¥01组别检药制量mg·kg**行为指标评分脑梗死范胰细胞调亡国／％%/*餐手术0.40=0.103.241.44.0+1.9模型9.8±1.419.316.3银查片65.3.1.74.60.56.3x1.8100407.6+1.66.0:0.38.0+2.6CC.1807.2:1.25.910.64.9x2.0GC.1606.2.0.84.6+0.05.8±1.8经秩和检验，方差分析和，检验：模型组与假手术组比较，P＜001：银查叶片组和CC，组与模型组比较，P＜0.01GCs对所致大鼠模型脑组织细胞凋亡的影响 细胞测亡时，TUNEL法检测，光镜下可看到凋亡细胞呈现棕黄色，而正常脑细胞呈蓝染。实验结果显示GCs组和银杏叶片组凋亡细胞明显少于模型组（P＜0.01）。见表1和图2。图2 GCs对双側颈总动脉结扎致脑缺血损伤型大鼠脑组织皮质和海马部细胞调亡的影响（x400） A：假手术组：B：模型组；C：服杏叶片组：D：CC组（160mg-kg＊组）跳台实验 在跳台实验中，与假手术组相比，模型组反应时间延长（P＜0.01），出现的错误反应次数增多（P＜0.01），表明双侧颈总动脉结扎致脑缺血损伤型大鼠的被动回避反应能力降低；与模型组相比，GCs组和银杏叶片组，反应时间缩短（P＜0.01），错误次数减少（P＜0.01），提高了模型大鼠的被动回避反应能力。Y型迷宫试验 在迷宫实验中，与假手术组相比，模型组出现的错误反应次数增多（P＜0.01），表明双侧颈总动脉结扎致脑缺血损伤型大鼠的的空间学习记忆能力受损；与模型组相比，GCs组和银杏叶片组，提高正确次数（P＜0.05），提高双侧颈总动脉结扎致脑缺血损伤型大鼠的空间学习记忆能力。见表2。表2 GCs对双侧颈总动脉结扎致脑缺血损伤型大鼠学习记忆（跳台法，2wk）及速宫实验的影响组别维药数量mg·kg· 5min内反应时间A学习记忆请误次数/次进官实验正确次数/1O次假手术2.00.51.3:0.57.7=1.7模型62.355.7+2.93.6+1.3银查叶片 610:51.7±0.85.3x1.51004013.72.8+1.414.6:1.1<p style="text-indent: 0px; text-align: left; li

摘要本文对德赢vwin登录 中松果菊苷的提取和纯化工艺进行了初步研究。确定了德赢vwin登录 中松果菊苷的最佳提取工艺条件：10 倍量75％乙醇回流提取2 次，每次1h，此条件下德赢vwin登录 提取物中松果菊苷的含量为11.2％。通过HPD- 100 大孔吸附树脂纯化后松果菊苷的含量达到32.8％，回收率为91.5％。关键词德赢vwin登录 ；松果菊苷；提取；纯化；树脂德赢vwin登录 [Cistanche tubulosa（Schenk）R.Wight]又称红柳大芸、管花大芸，为列当科肉苁蓉属多年生寄生植物，与药典收载的荒漠肉苁蓉功效相同，具有补肾阳、益精血、润肠燥、通便之功效[1-2]，临床上用于阳痿、不孕、腰膝酸软、筋骨无力、肠燥便秘等症。德赢vwin登录 化学成份主要为苯乙醇苷类、环烯醚萜类[3-4]、木质素类、D-甘露醇、甜菜碱及糖类等成份[5]。本实验对德赢vwin登录 中松果菊苷的提取和纯化进行了初步研究。1 材料与仪器1.1 材料与试剂德赢vwin登录 （新疆和田高辰生物医药科技有限公司），松果菊苷对照品（中国药品生物制品检定所），试剂均为分析纯。1.2 主要仪器RE-52AA 旋转蒸发仪；冷冻干燥仪（德国制造）；针筒式微孔滤膜过滤器；SHB-III 循环水式多用真空泵；玻璃层析柱；高效液相色谱仪LC-6AD PUMP，岛津RID-10A，YMC ODS-A Columns（250mm×4.6mm250mm×20mm id）。2 方法与结果2.1 松果菊苷标准曲线的绘制精密吸取对照品溶液适量，注入液相色谱仪，以松果菊苷的峰面积为横坐标，相应的进样量为纵坐标，结合松果菊苷标准品色谱图（图略）绘制标准曲线，得回归方程：y=8.31466×10-7x-0.0246336，r=0.9999245，线性范围：0.904~9.04μg。2.2 松果菊苷的乙醇正交提取法按L9 （ 34）正交试验设计表的条件进行试验，因素水平设计见表1，结果见表2。直观分析表明，在所选因素水平范围内，提取次数为主要影响因素，乙醇浓度影响较小，料液比影响最小，试验表明提取时间无统计学意义，可作为空白对照。故确定最优方案为A2B3C2，且75％的乙醇提取2 次，每次1h，料液比1∶10，松果菊苷含量为11.2％。2.3 松果菊苷的纯化2.3.1 大孔吸附树脂的筛选静态吸附和解吸实验：将已处理好的3 种湿树脂置于锥形瓶中，将配制好的松果菊苷提取液加入至接近饱和，用水洗至流出液为无色，再用乙醇进行解析，定时取样进行分析，上HPLC 测定并计算树脂的吸附和解析率，结果见表3 表4。选择树脂时应从两方面来考虑：吸附性能和解析性能，从表3 表4 中数据可以看出，吸附率：HPD-100>D-101>AB-8，解吸率：HPD-100>D-101>AB-8，综合考虑吸附率和解吸率，选择HPD-100树脂。2.3.2 HPD-100 树脂对松果菊苷纯化性能的考察（1）洗脱剂浓度的选择：取适量肉苁蓉提取物配制成6.1051mg/mL 的上样液20mL，加入处理好的HPD-100 型树脂的层析柱中，依次用3BV （柱体积） 的水和10％、20%、30%、40％、50%、60%的乙醇梯度洗脱，每隔0.5BV（柱体积）收集一次洗脱液，共收集19 份。用HPLC测定。梯度洗脱各管松果菊苷的含量（图略）。水洗液中松果菊苷含量较少，10％、20％乙醇洗脱液中松果菊苷含量明显增加，当浓度为30％时，洗脱液中松果菊苷含量达到最高值，因此，确定30％的乙醇为最佳解吸溶剂，水洗液可忽略不计，故可用水洗除去杂质。（2）泄露曲线的确定：将10g 已处理好HPD-100型树脂装柱（1.5cm），用浓度为24.1mg／mL 的100mL松果菊苷提取液上样进行动态吸附，控制流速1.5BV/h，用试管收集流出液，每隔0.5BV（柱体积）为1 管，共收集19 管，上液相测定松果菊苷含量，计算最大上样量。结果，10gHPD-100 树脂吸附此浓度的肉苁蓉提取液从6.5BV（柱体积）起有泄漏，9.5BV（柱体积）时HPD-100 树脂可达饱和吸附（8.5×11×24.1=2254mg），即1gHPD-100 树脂可吸附0.23g 肉苁蓉提取物。（3）吸附流速的确定：取适量肉苁蓉提取物配制成11.64mg/mL 样品液，分别取5mL 加入处理好的4 个HPD-100 型树脂的层析柱中，3 份树脂分别以0.5、1.0、1.5、2.0mL/min 的流速进行动态吸附，计算松果菊苷的得率。结果见表5。由表5 可知，流速过快会降低松果菊苷精制收率，流速过慢会增加循环周期，综合考虑控制流速1.5mL／min 较理想。（4）HPD-100 型大孔吸附树脂纯化松果菊苷的工艺验证：采用HPD-100 型大孔吸附树脂，在样品浓度5.5mg/mL，吸附流速1.5mL/min，上样量20mL，依次以3BV（柱体积）水洗、6BV（柱体积）30％的乙醇为洗脱剂的条件下纯化松果菊苷。纯化后德赢vwin登录 提取物中松果菊苷含量由10.6％提高到32.8％，收率为29.4％，纯度为91.5％。3 结论德赢vwin登录 中松果菊苷的最佳提取工艺条件为：10 倍量75％乙醇回流提取2 次， 每次1h，1gHPD-100 树脂可吸附0.23g 肉苁蓉提取物，此条件下德赢vwin登录 提取物中松果菊苷的含量为11.2％。通过HPD-100 大孔吸附树脂纯化后松果菊苷的含量能达到32.8％，回收率为91.5％，可用于指导工业化生产。参考文献[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典.2005 年版一部.北京：化学工业出版社，2005：90.[2] 孙永强，郑兴国，陆中元，等.新疆肉苁蓉资源人工种植研究初探.干旱区资源与环境，2003，5（17）：3.[3] Hai Hui -xie，Toshio Morikawa.Monoterpen constituents fromcistanche tubulosa-chemical structures of kankanosides A-E andkankanol. Chem pharm Bull，2006，54（5）：669-675.[4] 贾晓光，谢海辉，李勇，等.德赢vwin登录 化学成份研究.新疆大学学报（自然科学版），2007，24：214-216.[5] 刘国钧.肉苁蓉及其人工种植.中国劳动社会保障出版社，2003：119-135.

摘要：目的　考察从德赢vwin登录 中提取、纯化苯乙醇总苷类物质的最佳工艺和条件。方法　通过正交试验优化德赢vwin登录 中苯乙醇总苷的提取工艺，并通过筛选大孔吸附树脂、洗脱液，选择最适树脂和最佳纯化条件。结果　苯乙醇总苷的最佳提取工艺为：１２倍６０％乙醇，超声提取３次，每次３０ｍｉｎ，提取率９５％以上，从８种大孔吸附树脂中选出纯化效果最佳的ＤＭ１３０树脂，最大静态吸附量为３４４．４９ｍｇ／ｇ，用６０％乙醇洗脱，解析率达９６％，纯度达９７％。结论　该方法简单易行，周期短，成本低，所得苯乙醇总苷纯度高，对工业生产具有指导意义。关键词：德赢vwin登录 ；苯乙醇总苷；松果菊苷；大孔吸附树脂德赢vwin登录 为列当科植物德赢vwin登录 Ｃｉｓｔａｎｃｈｅ　ｔｕｂｕｌｏｓａ（Ｓｅｈｒｅｎｋ）Ｒ．Ｗｉｇｈｔ的干燥带鳞叶的肉质茎，俗称红柳大芸，具有益精血、补肾助阳、润肠通便、延缓衰老等功能［１］，是我国稀有的名贵中药材，在《神农本草经》中被列为上品［２］，为中医常用的补肾壮阳药物，被人们誉为“沙漠人参”。其主要活性成分为苯乙醇总苷类物质［３］，其中的代表成分为松果菊苷和毛蕊花糖苷，《中国药典》（２００５年版）正式收录。国内外的许多专家和学者在德赢vwin登录 的人工种植［４］、化学成分研究［５］、药理作用［２］、加工工艺和产品开发［６－８］等方面进行了大量的研究。本研究考察从德赢vwin登录 中提取、纯化活性成分苯乙醇苷类物质的最佳提取条件，为德赢vwin登录 的大规模生产加工提供科学依据。１　仪器和材料ＵＶ１１０２紫外分光光度计（上海天美科学仪器有限公司），ＨＵ１０２５０Ｂ／３３超声清洗仪（天津市恒奥科技发展有限公司），ＡＬ１０４电子天平（德国梅特勒公司）。德赢vwin登录 （新疆博远欣绿生物科技有限公司提供，由新疆中药民族药研究所王果平助理研究员鉴定）。树脂ＤＭ１３０、ＡＢ－８（山东鲁杭立科药物化学有限公司），树脂Ｄ１０１、ＨＰＤ１００、ＨＰＤ６００（沧州宝恩化工有限公司），树脂ＬＳＡ２１、ＬＳＡ１０、ＬＸ３８（西安蓝晓科技有限公司）。色谱纯甲醇购自美国ＴＡＤＩＡ 公司，其它试剂均为分析纯，松果菊苷（批号１１１６７０）对照品购自中国药品生物制品鉴定所。２　方法与结果２．１　标准曲线的制定２．１．１　对照品溶液制备　精密称取松果菊苷１０ｍｇ，置５０ｍＬ容量瓶中，加甲醇至刻度，充分振荡溶解，配制成０．２ｍｇ／ｍＬ的对照品溶液。２．１．２　供试品溶液制备　按文献［３］的方法制备供试品溶液。２．１．３　标准曲线的制备［３］　准确吸取松果菊苷对照品溶液０．５、１．０、１．５、２．０、２．５ｍＬ，分别置于２５ｍＬ容量瓶中，加甲醇至刻度，以甲醇为空白对照，照分光光度法（《中国药典》（２００５年版）附录ＶＢ），３３３ｎｍ处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，对照品质量浓度为横坐标，绘制标准曲线得回归方程：Ｙ ＝０．０２２　２　Ｘ ＋０．０１４　６，γ＝０．９９９　９。２．２　德赢vwin登录 中苯乙醇总苷的提取　选用乙醇溶液为提取溶媒超声提取，对乙醇浓度、溶媒倍数、提取时间、提取次数４个因素进行考察，每个因素各取３个水平（表１）。采用Ｌ９（３４）正交法进行试验。以苯乙醇总苷提取率为考察指标，结果各因素对提取效果的影响程度依次为Ｃ＞Ａ＞Ｂ＞Ｄ，影响最大的是提取次数（Ｃ）和固液比（Ａ），乙醇浓度（Ｂ）和提取时间（Ｄ）的影响较小，综合考虑成本和生产周期，得各因素的最佳水平组合为Ａ３Ｂ２Ｃ３Ｄ２。经３次验证试验，用该工艺条件从德赢vwin登录 中提取苯乙醇总苷，提取率为９５％以上（表２）。２．３　德赢vwin登录 提取物中苯乙醇总苷的纯化２．３．１　树脂的预处理　分别用９５％乙醇浸泡树脂ＤＭ１３０、ＡＢ－８、Ｄ１０１、ＨＰＤ１００、ＨＰＤ６００、ＬＳＡ２１、ＬＳＡ１０、ＬＸ３８　２４ｈ，使树脂充分溶胀，然后用９５％乙醇洗涤至流出液中加适量水不变混浊；改用纯化水冲洗至无醇味。然后对树脂进行酸碱处理，再用去离子水洗至滤液ｐＨ 值为中性。２．３．２　供试液的制备　按“２．２”项条件提取德赢vwin登录 ，合并提取液，浓缩回收乙醇至无醇味，加入适量水后混匀，静置水沉，离心，去除水沉物，收集上清液备用。２．３．３　大孔吸附树脂的选择试验　将精密称取处理好的树脂ＤＭ１３０、ＡＢ－８、Ｄ１０１、ＨＰＤ１００、ＨＰＤ６００、ＬＳＡ２１、ＬＳＡ１０、ＬＸ３８各１ｇ置带塞三角瓶中，分别加入２０ｍＬ（过量的）德赢vwin登录 提取物溶液，静置过夜。充分吸附后过滤，测定滤液中苯乙醇总苷的浓度，按下列公式计算吸附量：吸附量＝（吸附前浓度－吸附后浓度）×２０／树脂量（ｇ）。过滤后的树脂用足量纯化水洗干净，再用１００ｍＬ　８０％乙醇洗脱，收集洗脱液，测定苯乙醇总苷的浓度。然后将洗脱液浓缩、干燥，测定干燥物中苯乙醇总苷含量，计算解析率。在所有树脂中，ＤＭ１３０对苯乙醇总苷的吸附最好，ＡＢ－８次之。ＤＭ１３０的解析率最高，ＤＭ１３０ 洗脱液干燥物中苯乙醇总苷含量为９８．３２％（表３）。综合以上吸附和解析效果，本研究选择ＤＭ１３０为纯化苯乙醇总苷的树脂。２．３．４　最大吸附量试验与动态吸附曲线　用德赢vwin登录 提取液配成约４０ ｍｇ／ｍＬ 的溶液，以１．５ＢＶ／ｈ的流速通过１０ｍＬ树脂吸附，收集流出液，测定每１ＢＶ 中的苯乙醇总苷浓度。以流出液体积为横坐标，流出液中苯乙醇总苷浓度为纵坐标，绘制动态吸附曲线，至流出液中苯乙醇总苷浓度与上样液相等为止。用水冲洗至流出液不浑浊，再用６０％乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩干燥，测定干燥物中苯乙醇总苷含量。如图１所示，苯乙醇总苷物质从６ＢＶ 开始有少量泄漏，至１０ＢＶ 时吸附达饱和。乙醇洗脱液浓缩干燥后，得动态吸附苯乙醇总苷的最大吸附量为３２３ｍｇ／ｇ。的增高而增大，２０％、４０％、６０％和８０％乙醇的解析率分别为３２．１％、８９．６％、９５．１％、９５．３％，６０％乙醇与８０％乙醇无明显差异。结合“２．３．４”的结果，选择６０％乙醇为洗脱剂。２．３．６　动态解析曲线的制备　将德赢vwin登录 提取物配成约４０ｍｇ／ｍＬ的溶液，过树脂吸附，用蠕动泵控制上样速度为１．０ｍＬ／ｍｉｎ（１．５ＢＶ／ｈ），上完样后静置吸附１ｈ。用水冲洗至流出液不浑浊，用６０％乙醇洗脱，每洗脱１．０ＢＶ 测定其中苯乙醇总苷浓度，以洗脱液体积为横坐标，苯乙醇总苷浓度为纵坐标作图。流出液在１．０ＢＶ 时迅速达到最大值，２．５ＢＶ 洗脱液即可将苯乙醇总苷基本洗脱干净，无拖尾，解析率为９５％（图２）。２．４　重复验证试验　量取德赢vwin登录 提取浓缩液，用蠕动泵控制上样速度为１．０ｍＬ／ｍｉｎ（１．５ＢＶ／ｈ），上完样后静置吸附１ｈ，用足量的水洗脱未被吸附的杂质，再用２．５ＢＶ８０％乙醇洗脱，控制流速为１．０ｍＬ／ｍｉｎ。收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥，测定干燥物中苯乙醇总苷的含量，计算回收率。重复３次，得苯乙醇总苷的平均含量为９７％，平均解析率可达９６％。３　结论本研究从德赢vwin登录 中提取苯乙醇总苷，用乙醇溶液为提取溶媒，无毒安全，价格便宜，容易回收再利用；采用超声提取，可以大大缩短生产周期。纯化树脂选用ＤＭ１３０大孔树脂可反复使用，再生简单，吸附量大，所得产品纯度高，回收率高。参考文献：［１］　国家药典委员会．中华人民共和国药典：一部［Ｓ］．２０１０年版．北京：中国医药科技出版社，２０１０：１２６．［２］　陈绍淑，何生虎，曹晓真，等．肉苁蓉药理及化学成分的研究进展［Ｊ］．甘肃畜牧兽医，２００５，３５（３）：４１－４４．［３］　王丽楠，陈君，杨美华，等．肉苁蓉中苯乙醇苷的含量测定［Ｊ］．西北药学杂志，２００８，２３（２）：６７－６９．［４］　贾晓光．新疆常用中药栽培技术［Ｍ］．乌鲁木齐：新疆科学技术出版社，２００４：８４－８８．［５］　贾晓光，谢海辉，李勇，等．德赢vwin登录 化学成分研究［Ｊ］．新疆大学学报，２００７，２４（７）：２１４－２１６．［６］　卿德刚，张娟，吴涛，等．大孔树脂对德赢vwin登录 中松果菊苷的纯化工艺研究［Ｊ］．中国中医药科技，２０１１，（１８）：４１－４２．［７］　吴波，付王梅．肉苁蓉提取工艺的正交设计研究［Ｊ］．广东药学，２００４，１４（６）：２９－３１．［８］　郭雄飞，吴亚东，倪慧，等．德赢vwin登录 不同部位有效成分含量的考察比较［Ｊ］．新疆医科大学学报，２０１２，３５（１）：４８－５０．

摘要：在查阅、收集国内德赢vwin登录 中苯乙醇苷的提取纯化文献基础上，综述近几年德赢vwin登录 中苯乙醇苷的提取、纯化研究进展，旨在为德赢vwin登录 制剂工业化生产研究提供参考。关键词：肉苁蓉；苯乙醇苷；提取；纯化德赢vwin登录 为列当科肉苁蓉属多年生寄生植物，为新疆特有资源，是传统补肾阳的中药材，具有补肾、益精、润燥、通便的功效。现代研究表明，苯乙醇苷类是德赢vwin登录 的主要活性成分和含量最高的化合物，是《中国药典》含量测定的指标成分，具有抗氧化、促进物质代谢、改善学习记忆、增强性功能等作用。苯乙醇苷类化合物包括松果菊苷、毛蕊花糖苷、松果菊苷和麦角甾苷等。1 肉苁蓉中的苯乙醇苷的提取1.1 乙醇回流提取肉苁蓉中苯乙醇苷类化合物李蒙等利用响应面法对瓜州肉苁蓉苯乙醇苷的提取工艺进行优化。方法是，以肉苁蓉苯乙醇苷提取率为评价指标，探究乙醇体积分数、提取温度、提取时间、料液比和提取次数对肉苁蓉苯乙醇苷提取率的影响。结果表明，肉苁蓉苯乙醇苷的实际最佳提取工艺条件为乙醇体积分数60%、提取温度80℃、液料比12∶1，提取时间2 h，提取2次，此条件下的提取率为76.588 0 mg/g。本研究为瓜州肉苁蓉苯乙醇苷资源开发及工业化生产提供理论依据。1.2 乙醇浸出提取肉苁蓉中苯乙醇苷类化合物戴海蓉等优化肉苁蓉提取工艺，为肉苁蓉制剂生产研究提供科学依据。方法是，采用L9 （34）正交试验，以提取溶剂、料液比、提取次数为考察因素，出膏率、松果菊苷和毛蕊花糖苷含量为指标，优选肉苁蓉提取工艺。结果显示，肉苁蓉最佳提取工艺为肉苁蓉饮片以8 倍量30%乙醇提取2 次，每次1 h。孔征等优化德赢vwin登录 中毛蕊花糖苷的提取工艺，为该药材的深入开发和综合利用提供参考。方法是，采用高效液相色谱法对德赢vwin登录 中的毛蕊花糖苷进行含量测定；色谱柱为Inertsil-ODS-3V，流动相为甲醇-0.2%甲酸水溶液(40∶60，V/V），流速为1 mL/min，柱温为30℃，检测波长为330 nm，进样量为10 μL；以毛蕊花糖苷的提取率为考察指标，分别对浸泡时间、乙醇浓度、液料比、提取时间、提取次数进行单因素试验，根据上述试验结果，采用Box-Behnken 响应面法对乙醇浓度、液料比、提取时间等条件进行优化，并对优化后的提取工艺进行验证试验。结果显示，毛蕊花糖苷检测质量浓度的线性范围为18.65～932.4 μg/mL。最优提取工艺为乙醇浓度63%、液料比8∶1（mL/g）、浸泡2h、提取时间1.5 h、提取2次。3次平行验证试验所得毛蕊花糖苷的提取率分别为78.21%、76.95%、79.34%，与预测值76.76%的相对误差分别为1.89%、0.25%、3.36%。优化所得德赢vwin登录 中毛蕊花糖苷的提取工艺稳定、可行，适用于该化合物的提取。1.3 甲醇提取肉苁蓉中苯乙醇苷类化合物黄翔等选择肉苁蓉最佳提取工艺参数。方法是，采用单因素筛选结合Box-Behnken 响应面法优化提取工艺。结果表明，最佳提取工艺是甲醇体积分数55.14%，液料比46.39∶1，提取时间38.50 min。使用该工艺提取肉苁蓉，其5 种苯乙醇苷类成分提取完全、充分。1.4 水溶媒提取肉苁蓉中苯乙醇苷类化合物刘丽莎等以德赢vwin登录 为原料，探究原料粒径、料液比、浸提温度、时间等因素对苯乙醇苷浸提效果，开发苯乙醇苷水溶媒提取技术。经单因素优化及正交试验优化，德赢vwin登录 苯乙醇苷水溶媒提取最佳工艺为原料粒径大于40 目，料液比1∶15，浸提温度80℃，浸提时间2 h，提取率为(175.9±1.1）mg/g，松果菊苷及毛蕊花糖苷分别占总苯乙醇苷的38.85%、8.78%。研究结果为德赢vwin登录 苯乙醇苷提取降低成本及安全生产提供了参考依据。1.5 微波辅助提取肉苁蓉中苯乙醇苷类化合物刘洋为优选德赢vwin登录 苯乙醇苷提取最佳工艺并对经分离纯化的苯乙醇苷进行抗氧化活性评价研究，以德赢vwin登录 中的苯乙醇苷得率为检测指标，采用响应面分析法，分别优化乙醇浸提法、超声提取法、微波提取法3 种方法的提取效果，选出最优条件，并进行比较；采用DPPH 法体外测定苯乙醇苷的抗氧化能力。结果表明，微波辅助提取法在最短时间内具有最高的苯乙醇苷得率，超声波辅助提取法次之，而乙醇浸提法时间最长，得率最低。蒋媛等筛选德赢vwin登录 中苯乙醇苷的最佳提取工艺。方法是，采用苯乙醇苷得率评分指标，正交设计法筛选。结果表明，德赢vwin登录 中的苯乙醇苷的最佳提取工艺为采用微波辅助提取法，75%的乙醇浓度，提取2 次，每次1.5 min，微波功率200W，料液比1∶20。本试验为德赢vwin登录 中苯乙醇苷的提取提供了参考数据，为德赢vwin登录 的苯乙醇苷类成分提取提供参考书数据，为苯乙醇苷进一步分离及活性研究提供依据。1.6 超声-微波回流提取肉苁蓉中苯乙醇苷类化合物丁慧玲等为了使其充分利用，在单因素研究基础上，通过响应面法优化超声- 微波回流提取德赢vwin登录 中苯乙醇苷工艺。结果表明，在超声频率40kHz，超声功率为50 W，提取时间15 min 时由二次回归模型获得最优工艺条件为提取丙酮体积分数50%，液料比14∶1 （mL/g），微波功率100 W，理论得率为49.87%，验证实验得49.2%，与理论值接近。通过红外光谱分析可知，超声- 微波提取的是德赢vwin登录 苯乙醇苷类物质。1.7 酶解法提取肉苁蓉中苯乙醇苷类化合物高建德等研究复合酶提取肉苁蓉的工艺，比较传统水提、醇提与酶解后水提、醇提，正丁醇萃取物抗氧化活性。方法是，以肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷作为评价指标，选择酶用量、酶解温度、酶解时间为主要因素，通过正交试验确定复合酶提取肉苁蓉的最佳工艺条件，并在此基础上比较不同提取方法下提取物抗氧化活性。结果表明，复合酶强化提取肉苁蓉最佳工艺参数为复合酶0.2%、酶解温度60℃，酶解时间2.5 h；等量药材同体积肉苁蓉提取液，抗氧化活性依次为酶解后醇提＞酶解后水提＞传统醇提＞传统水提。在所得的复合酶提取肉苁蓉工艺条件下，肉苁蓉抗氧化活性可以显著提高。1.8 超声辅助提取肉苁蓉中苯乙醇苷类化合物郭雄飞等考察从德赢vwin登录 中提取，纯化苯乙醇总苷类物质的最佳工艺和条件。方法是，通过正交试验优化德赢vwin登录 中苯乙醇总苷的提取工艺，并通过筛选大孔吸附树脂，洗脱液，选择最适树脂和最佳纯化条件。结果表明，苯乙醇总苷的最佳提取工艺为12 倍60%乙醇，超声提取3 次，每次30min，提取率95%以上，从8 种大孔吸附树脂中选出纯化效果最佳的DM130 树脂、最大静态吸附量为344.49 mg/g，用60%乙醇洗脱，解析率达96%，纯度达97%。该方法简单易行，周期短，成本低，所得苯乙醇总苷纯度高，对工业生产具有指导意义.2 纯化工艺2.1 中压柱层析技术纯化苯乙醇苷类朱玉婷等建立一种快速可靠的肉苁蓉中苯乙醇苷类分离纯化方法。方法是，采用中压柱层析技术进行分离纯化，考察上样浓度、上样体积、洗脱剂体积分数、洗脱流速和收集洗脱液位置等因素，筛选出比较理想的分离纯化工艺。结果表明，确定的最佳工艺为上样浓度100 mg/mL ，上样体积100mL，30%甲醇洗脱，洗脱流速为80 mL/min，从目标成分出峰后上升段的1/4 处开始收集洗脱液。最终分离得到的松果菊苷、毛蕊花苷含量分别为93.08%、90.20% （ =6）。本试验方法简便、准确，能快速制得高质量分数的单体化合物，为其他苯乙醇苷单体化合物的纯化、富集提供技术参考。2.2 大孔树脂技术纯化苯乙醇苷类刘朋龙等应用AB-8 型大孔树脂分离纯化德赢vwin登录 ，得到最佳纯化工艺为上样液质量浓度1.2mg/mL，上样流速1.5 BV/h，吸附时间1.5 h，解析时间4 h，洗脱的乙醇体积分数为40%，洗脱流速为1.5 BV/h；收集洗脱液，减压浓缩后冷冻干燥，得到德赢vwin登录 中苯乙醇苷的初步纯化物，其纯度达到80%，纯化前纯度为42.5%，比纯化前增加了37.5%。王毓杰等优选德赢vwin登录 中苯乙醇苷的纯化工艺。方法考察7 种大孔树脂对2 种苯乙醇苷的吸附和解吸附性能，确定最佳纯化工艺条件。结果最佳提取纯化工艺为德赢vwin登录 药材加12 倍量50%乙醇，70 ℃温浸2 次，温浸时间1 h，过滤，合并滤液，回收溶剂，加水调整为含生药0.2 g/mL 的上样溶液，上样量为0.8 倍柱体积（BV），大孔树脂柱的径高比为1∶9，先用3 BV 的水除杂，再用4 BV的30%乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩至干，即得肉苁蓉苯乙醇苷纯化物，该纯化物中2 种苯乙醇苷质量分数75%。优选得到的提取纯化工艺稳定可行，适合工业化生产。2.3 膜分离技术纯化苯乙醇苷类蒋华彬等研究了膜分离技术在德赢vwin登录 苯乙醇苷及多糖同步分离纯化的应用。以新疆特色资源德赢vwin登录 为原料，采用膜分离技术，将德赢vwin登录 水提液先后经过30 ku 超滤膜、400 u 纳滤膜。得到2 种目标产物，一是多糖粗品，多糖得率为57.40%，纯度为51.82%；二是苯乙醇苷粗品，苯乙醇苷得率为66.86%，其中松果菊苷、毛蕊花糖苷、总苯乙醇苷纯度分别为26.54%、3.36%、31.11%。形成了一套采用膜分离技术加工德赢vwin登录 水提液的新工艺体系，此工艺操作简单安全、能耗及成本较低，可实现德赢vwin登录 苯乙醇苷及多糖的低碳、高效同步分离纯化。3 结束语综上所述，苯乙醇类化合物具有水溶性和吸湿性，易溶于甲醇，可溶于丙酮，性质较为稳定。其提取工艺有加热回流提取、乙醇浸出提取、水溶媒提取、甲醇提取、微波辅助提取、超声辅助提取、微波-超声辅助提取、酶解提取等。纯化方法有中压柱层析技术、大孔树脂技术和膜分离技术等。参考文献[1] 孔征,毛乐静,霍仕霞,等.Box-Behnken 响应面法优化德赢vwin登录 中毛蕊花糖苷的提取工艺研究[J].中国药房,2019,30(14):1970-1974.[2] 黄翔,郭晔红,贾存勤,等.肉苁蓉提取工艺及干燥方式研究[J].中草药,2019,50(15):3622-3630.[3] 朱玉婷,李茂星,王建,等.中压柱层析快速分离纯化肉苁蓉提取物中的松果菊苷和毛蕊花苷[J].解放军药学学报,2018,34(06):491-493.[4] 刘朋龙,王亮.应用大孔树脂分离纯化德赢vwin登录 中苯乙醇苷研究[J].农产品加工,2018(23):11-14.[5] 蒋华彬,刘丽莎,张清,等.膜分离技术同步分离纯化德赢vwin登录 苯乙醇苷及多糖[J].食品科技,2019,44(07):229-234.

摘要：目的 优选德赢vwin登录 Cistanche tubulosa 中苯乙醇苷的提取纯化工艺。方法以松果菊苷和麦角甾苷质量分数为考察指标，采用L9(34) 正交试验设计，对提取工艺进行优化；考察7 种大孔树脂对2 种苯乙醇苷的吸附和解吸附性能，确定最佳纯化工艺条件。结果最佳提取纯化工艺为德赢vwin登录 药材加 12 倍量50%乙醇，70 ℃温浸2 次，温浸时间1 h，滤过，合并滤液，回收溶剂，加水调整为含生药0.2 g/mL 的上样溶液，上样量为0.8 倍柱体积（BV），大孔树脂柱的径高比为1∶9，先用3 BV 的水除杂，再用4 BV 的30%乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩至干，即得肉苁蓉苯乙醇苷纯化物，该纯化物中2 种苯乙醇苷质量分数＞75%。结论优选得到的提取纯化工艺稳定可行，适合工业化生产。关键词：德赢vwin登录 ；大孔树脂；苯乙醇苷；松果菊苷；麦角甾苷肉苁蓉为列当科肉苁蓉属多年生草本寄生植物，药用其根，始载于《神农本草经》，列为上品。性温，味甘、咸，归肾、大肠经，有滋肝养肾、益精血、润肠通便的功效，用于治疗肾阳不足、精血亏虚、腰膝酸软、筋骨无力、肠燥便秘等症[1]。《中国药典》2010 年版收载的法定品种为荒漠肉苁蓉Cistanche deserticola Y. C. Ma 和德赢vwin登录 C. tubulosa (Schenk) Wight[2]。两者化学成分相似，但寄生于红柳根上的德赢vwin登录 更容易进行人工栽培，已在新疆民丰县、于田县等地大面积种植，是目前市场流通量最大的肉苁蓉药材[3]。肉苁蓉中的苯乙醇苷类成分是其发挥补益作用的主要成分[4]，这类成分由苯乙醇基和糖构成，结构中的多个糖链决定了这类成分具有较高的水溶性。除了补益作用，肉苁蓉苯乙醇苷类成分还具有肝脏保护、神经保护等多种活性[5-7]。因此，肉苁蓉苯乙醇苷类成分的提取纯化工艺研究，对于其药效物质基础及新产品开发研究都具有重要意义。本研究以德赢vwin登录 中的主要苯乙醇苷类成分松果菊苷和麦角甾苷为考察指标，采用L9(34) 正交试验设计，对提取工艺进行优化；并考察7 种大孔树脂对上述苯乙醇苷的吸附和解吸附性能，确定纯化肉苁蓉苯乙醇苷的最佳工艺。1 仪器与材料Agilent 1100 型高效液相色谱仪，含G1311A 四元泵、G1315A 二极管矩阵检测器。松果菊苷（批号A0282）、麦角甾苷对照品（批号A0280），质量分数均＞98%，成都普思生物科技有限公司；肉苁蓉药材购于新疆维吾尔自治区于田县，经成都中医药大学张艺研究员鉴定为列当科肉苁蓉属多年生草本寄生植物德赢vwin登录 Cistanche tubulosa (Schenk)Wight 的干燥根；大孔吸附树脂HPD400、HPD450、HPD600、HPD750、HPD826、DM130、ADS-17，沧州宝恩吸附材料科技有限公司；乙腈，色谱纯，Honeywell 公司；甲酸、乙醇，分析纯，成都科龙化工试剂厂。2 方法与结果2.1 松果菊苷和麦角甾苷测定方法的建立2.1.1 色谱条件[8] Waters Symmetry Shield RP18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Symmetry Shield RP18（20 mm×3.9 mm，5 μm）Guard 2Pk 保护柱；流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱：0～10 min，17%乙腈；10～30 min，17%～50%乙腈；检测波长330 nm。在此色谱条件下待测组分可达到基线分离，理论塔板数以松果菊苷、麦角甾苷计算均大于5 000。2.1.2 对照品溶液的制备取松果菊苷、麦角甾苷对照品适量，精密称定，加30%乙醇制成含松果菊苷1.995 mg/mL、麦角甾苷1.299 mg/mL 的对照品储备液，精密量取该储备液稀释10 倍，作为对照品溶液。2.1.3 线性关系考察精密量取松果菊苷、麦角甾苷对照品储备液，稀释5、10、50、100、500、1 000倍制得不同质量浓度的对照品溶液，精密吸取上述对照品溶液10 μL 注入高效液相色谱仪，测定峰面积，并以峰面积积分值为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X），进行回归分析。松果菊苷的回归方程：Y＝18 182 X－69.895，r＝0.999 6，表明松果菊苷在1.995～399 μg 线性关系良好；麦角甾苷的回归方程：Y＝18 035 X－9.949 3，r＝1.000 0，表明麦角甾苷在1.299～259.8 μg 线性关系良好。2.2 肉苁蓉药材定量测定按《中国药典》2010 年版肉苁蓉项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项方法测定。结果按干燥品计算，本研究所用肉苁蓉药材中松果菊苷和麦角甾苷的质量分数分别为14.01%、3.18%。2.3 苯乙醇苷的提取工艺研究2.3.1 提取溶剂考察分别取肉苁蓉药材粗粉50g，加10 倍量的水及30%、50%、70%乙醇，70 ℃温浸2 次，每次1 h，滤过，回收溶剂后，加水定容至250 mL。取1 mL，加30%乙醇定容至100 mL，滤过，测定松果菊苷和麦角甾苷；另取200 mL（相当于40 g 药材），置蒸发皿中挥干溶剂后，计算出膏量。上述提取溶剂所得粗提物中松果菊苷的质量分数分别为19.96%、23.28%、31.98%、28.78%；麦角甾苷分别为2.89%、4.57%、6.64%、5.93%。结果表明50%乙醇对松果菊苷和麦角甾苷的提取率最高。2.3.2 正交试验以溶剂用量（A，8、10、12 倍量），提取次数（B，1、2、3 次），提取时间（C，1.0、1.5、2.0 h）为因素，以松果菊苷、麦角甾苷质量分数为指标，进行L9(34) 正交试验。实验结果见表1，方差分析见表2、3。由直观分析（松果菊苷 Ks、Rs，麦角甾苷Km、Rm）和方差分析结果可知，各因素对提取效率的影响顺序为A＞B＞C，且A 因素有显著性影响，因此最佳提取方案为A3B2C1，即肉苁蓉药材加12 倍量50%乙醇，70 ℃温浸2 次，温浸时间1 h。2.4 验证试验按正交试验优选的提取工艺，平行试验 3 次。肉苁蓉粗提物中松果菊苷、麦角甾苷的平均质量分数分别为33.21%、7.55%，见表4。2.5 苯乙醇苷的大孔树脂纯化工艺研究2.5.1 静态吸附与解吸附（1）静态吸附考察：取肉苁蓉药材50 g，加12倍量50%乙醇，70 ℃温浸2 次，每次1 h，滤过，回收溶剂后，加水定容至250 mL（相当于0.2 g 生药/mL），作为供试原液。分别称取不同型号经过预处理的大孔树脂HPD-400、HPD-450、HPD-600、HPD-750、HPD-826、DM-130、ADS-17 各5 g，置50 mL 锥形瓶中，加30 mL 供试原液，振荡吸附24h，静置后取1 mL 上清液，加30%乙醇定容至100mL，测定。计算静态饱和吸附量［饱和吸附量＝(初始质量浓度－吸附后质量浓度)×吸附液体积/干树脂质量］，结果见表5。（2）静态解吸考察：取已吸附好的树脂，经100mL 水洗后，加入50%乙醇溶液250 mL，置恒温振荡器上振荡解吸，取上清液1 mL，加30%乙醇定容至10 mL，测定。计算解吸率（解吸率＝解吸液质量浓度×解吸液体积/饱和吸附量），结果见表5。由表 5 可以看出，HPD-750 和ADS-17 2 种树脂对松果菊苷、麦角甾苷的吸附量高于其他型号树脂，并且HPD-750 的解吸率高于ADS-17，因此选择HPD-750 进行下一步考察。2.5.2 上柱液质量浓度考察将提取后的药液分别浓缩成含生药0.1、0.2、0.4 g/mL 的上柱液。分别取3 份处理好的HPD-750 树脂装柱，每份15 g，将上述不同质量浓度的药液上大孔树脂柱（上柱生药量相同），上样后依次用3 BV 的水、以2 BV/h 的体积流量洗脱除去杂质，再用50%乙醇洗脱6 BV，体积流量为2 BV/h。洗脱液浓缩至干，测定，计算质量分数。松果菊苷分别为59.11%、63.16%、61.79%，麦角甾苷分别为10.21%、12.73%、11.26%。因此，上柱液的浓度确定为生药0.2 g/mL。2.5.3 泄露曲线的绘制取 50 g（体积为100 mL）处理好的HPD-750 树脂装柱，取肉苁蓉上柱液，以2 BV/h 的体积流量通过树脂柱，进行动态吸附，每10 毫升接1 流分，每1 流分中取1 mL，加30%乙醇定容至100 mL，测定，绘制泄露曲线，见图1。由图1 可知，当上样体积在9 号流分（即上样量为90 mL）时出现明显地泄露。因此，上样量确定为80 mL，即0.8 BV。2.5.4 洗脱溶剂的考察取肉苁蓉上柱液80 mL，加入到装有50 g HPD-750 树脂柱中，依次用3 BV的水及10%、30%、50%乙醇以2 BV/h 的体积流量洗脱，洗脱液按每0.5 BV 收集1 份，每份中取1 mL，加30%乙醇定容至100 mL，测定结果见图2。苯乙醇苷主要集中在30%乙醇洗脱液中，并且水洗脱液不会将苯乙醇苷洗脱下来。2.5.5 洗脱溶剂用量的考察取肉苁蓉上柱液80mL，加入到装有50 g HPD-750 树脂柱中，依次用3BV 的水以2 BV/h 的体积流量洗脱除去杂质，再用30%乙醇洗脱，洗脱液按每1 BV 收集1 份，每份中取1 mL，加30%乙醇定容至100 mL，测定结果见图3。在洗至4 BV 时，洗脱率达到90%以上。同时，考虑到生产成本等因素，洗脱溶剂的量确定为4 BV。2.5.6 树脂柱径高比的考察取肉苁蓉上柱液80mL，加入到装有50 g HPD-750 树脂柱中，树脂柱的径高比分别为1∶3、1∶6、1∶9、1∶12，分别用3 BV 的水以2 BV/h 的体积流量洗脱除去杂质，再用4 BV 的30%乙醇洗脱，洗脱液减压蒸干后，测定质量分数。结果显示，不同径高比的大孔树脂纯化样品中松果菊苷分别为60.15%、62.46%、63.91%、63.96%；麦角甾苷分别为11.65%、12.06%、13.21%、13.25%。从提高纯化效率和节约成本的角度出发，将径高比确定为1∶9。2.5.7 水洗量的考察取肉苁蓉上柱液 80 mL，加入到装有50 g HPD-750 树脂柱中，树脂柱的径高比为1∶9，分别用1、2、3、4 BV 的水以2 BV/h 的体积流量洗脱除去杂质，再用4 BV 的30%乙醇洗脱，洗脱液减压蒸干后，测定质量分数。结果显示，4 种样品质量分数相差不大，但用3、4 BV 水洗脱后，30%乙醇洗脱液颜色较澄清，HPLC 色谱图中杂质峰较少，从提高纯化效率的角度出发，选择用3 BV 的水洗脱。2.5.8 大孔树脂纯化工艺的确定肉苁蓉提取液浓度调整为0.2 g 生药/mL，上样量为0.8 BV，大孔树脂柱的径高比为1∶9，先用3 BV 的水除杂，再用4 BV 的30%乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩至干，即得肉苁蓉苯乙醇苷纯化物。2.5.9 大孔树脂纯化工艺验证试验按上述确定的纯化工艺制备3 批样品，分别测定纯化前（粗提物）、后（大孔树脂纯化物）松果菊苷和麦角甾苷的量，并计算出膏率和转移率。结果表明，经大孔树脂纯化后，松果菊苷和麦角甾苷的质量分数分别由粗提物中的33.21%、7.55%提高到66.14%、13.43%，纯化物中2 种苯乙醇苷的质量分数＞75%，见表6。3 讨论本研究采用正交设计试验优化德赢vwin登录 苯乙醇苷的提取工艺。考虑到苯乙醇苷类成分结构中既有亲脂性基团，又有多个亲水性的葡萄糖取代基。因此，在考察提取溶剂时比较了水以及低浓度乙醇的提取效果，实验结果也证实50%乙醇的提取效率最高。同样的，笔者在预试验时也发现中等极性的大孔树脂对苯乙醇苷的吸附和解吸附效果较好。因此，通过比较多种型号中等极性大孔树脂的吸附、解吸附效果，最终筛选出HPD-750 型树脂。在分析正交试验结果以及大孔树脂工艺参数时，本研究综合考虑了提取效率、提取成本、药材成本等多种因素，筛选出最合理、稳定可行的提取纯化工艺。本工艺能够使德赢vwin登录 提取物中的主要苯乙醇苷类成分松果菊苷和麦角甾苷的量明显增加，可用于指导工业化生产。参考文献[1] 国家中医药管理局《中华本草》编委会. 中华本草 [M].上海: 上海科学技术出版社, 1999.[2] 中国药典 [S]. 一部. 2010.[3] 屠鹏飞, 何燕萍, 楼之岑. 肉苁蓉类药源调查与资源保护 [J]. 中草药, 1994, 25(4): 205-208.[4] 龚梦鹃, 刘新民, 王立为. 肉苁蓉对阳虚小鼠抗疲劳作用的研究 [J]. 中医药导报, 2007, 13(11): 8-10.[5] Wu Y, Li L, Wen T, et al. 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摘要：目的：制备德赢vwin登录 提取物，分析主要成分，研究其通便作用。方法：测定德赢vwin登录 提取物中水分、灰分、总蛋白、多糖、总黄酮及总苷的含量；采用斑马鱼肠道染色荧光模型，观察德赢vwin登录 对斑马鱼肠蠕动的促进作用。结果：德赢vwin登录 提取物中的多糖是主要成分，含量为40.27%，总苷和总黄酮总含量近25%，另外含有少量的蛋白成分（7.61%），水分和灰分总含量不高于8%；德赢vwin登录 提取物在浓度为200μg/mL、667μg/mL 和2000μg/mL 时对斑马鱼肠蠕动均有促进作用，呈现浓度依赖性，最高促进率可达23.26%，且在所有浓度下没有对斑马鱼造成死亡。结论：此提取物安全无毒，并且保证药效，可开发成预防或治疗便秘的保健食品或者药品。关键词：德赢vwin登录 主要成分润肠通便斑马鱼尼罗红随着饮食结构的改变及精神心理和社会因素的影响，便秘发病率有增加趋势，困扰越来越多的人[1， 2]。据统计，便秘在人群中的患病率高达27%，且有增加趋势[3]。便秘患者除会感到身体不适外，还有可能伴有失眠、虑、抑郁等心理障碍，严重者会出现腹痛、贫血和消瘦等症状[4]。便秘是临床上常见的慢性消化道疾病，通常以排便间隔延长、大便干结、艰涩不畅为主要症状，严重者可导致电解质和酸碱平衡紊乱，引起痔疮、下肢静脉曲张等疾病[5]。长期便秘则可导致肠道细菌发酵产生致癌物质，刺激肠黏膜上皮细胞，产生异形增生，易诱发癌变[6]。因便秘发病率高、病因复杂，患者常有许多苦恼，便秘严重时会影响生活质量[7]。因此，预防和治疗便秘是保证人类健康并提高生活质量的一个重要方面。德赢vwin登录 为列当科植物德赢vwin登录 Cistanche tubulosa（Sehrenk）R. Wight 的干燥带鳞叶的肉质茎，俗称红柳大芸，寄生于怪柳属植物红柳的根上，主要分布于我国新疆北部的和田、奇台、吉木萨尔县以及新疆南部的塔克拉玛干沙漠周围地区，以和田地区的民丰县和于田县产量最大[8， 9]。德赢vwin登录 具有益精血、补肾助阳、延缓衰老等功能，是我国稀有的名贵中药材，在《神农本草经》中被列为上品，为中医常用的补肾壮阳药物，被人们誉为“沙漠人参”[10]。其主要活性成分为苯乙醇总苷类物质，代表成分为松果菊苷和毛蕊花糖苷，《中国药典》（2005 年版）正式收录[11]。近年来，国内外学者对于德赢vwin登录 的研究非常活跃，主要集中于德赢vwin登录 的免疫调节、神经保护、抗衰老、清除自由基、保肝等功效方面[12]。目前，对于德赢vwin登录 润肠通便药效的研究也有报道，但研究较少。屠鹏飞等对市场上常见的三种肉苁蓉类生药进行了润肠通便的药效比较，结果表明德赢vwin登录 药材的水煎剂可以促进肠蠕动、抑制大肠水分吸收和缩短排便时间[13]。张勇等通过肉苁蓉类药材及其炮制品通便作用比较研究认为，德赢vwin登录 药材的酒制品能增加小鼠小肠的推进度，缩短通便时间[14]。可见，目前对于德赢vwin登录 润肠通便的研究主要停留在对其原药材的方面，而对于德赢vwin登录 提取物用于预防和治疗便秘等疾病的研究尚未见报道。本文将德赢vwin登录 药材煎煮浓缩后，再经醇沉、干燥等工序制备提取物，并经斑马鱼体内实验验证其润肠通便生物活性，为德赢vwin登录 药材开发利用提供理论基础。1 仪器与材料1.1 仪器与试剂：R-210 型旋转蒸发仪和V-700 型真空隔膜泵（美国步琪公司），Milli-Q Reference 纯水机（美国Millipore 公司），XS-205 型1/10 万电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司），FreeZone 型冷冻干燥机（美国Labconco 公司），SMZ645 型解剖显微镜（日本Nikon 公司），AZ100 型电动聚焦连续变倍荧光显微镜（日本Nikon 公司）。乙醇为食品级，水为超纯水，其余试剂为分析纯。1.2 药材：德赢vwin登录 药材购自新疆和田天力沙生药物开发有限责任公司，经台湾“国防”医学院林汉钦教授鉴定为列当科肉苁蓉属植物德赢vwin登录 Cistanche tubulosa（Sehrenk）R. Wight 干燥的肉质茎，符合2015 版《中国药典》一部下规定，样品编号为20151106，储存于杏辉天力（杭州）药业有限公司研究所。1.3 实验动物：斑马鱼胚胎的繁殖以自然成对交配的方式进行，每次交配准备4～5 对成年斑马鱼。在受精6h 和24h 后对胚胎进行清理（移除已死亡胚胎），并根据胚胎的发育阶段挑选合适的胚胎。在温度为28℃条件下，用养鱼用水孵育胚胎（养鱼用水水质：每1L 反渗透水中加入200mg 速溶海盐，电导率为480～510μS/cm；pH 值为6.9～7.2；硬度为53.7～71.6mg/L CaCO3）。因为胚胎可以从卵黄囊中获取营养物质，所以在受精后9d 内不需要喂食。实验完成后，用三卡因甲磺酸对各个发育阶段的斑马鱼进行过度暴露处理，从而将斑马鱼麻醉处死。麻醉处死的操作步骤符合美国兽医协会（AVMA）对动物麻醉处死的规范要求。2 实验方法2.1 德赢vwin登录 提取物的制备：称取100kg 德赢vwin登录 药材，经清洗、浸润60min 后，切片（厚度5~8mm），再加入1000mL 纯化水回流提取3h，提取3 次，合并以上提取液，离心、过滤。滤液用旋转蒸发仪浓缩至密度为1.10g/mL 时停止浓缩，冷却至温度40℃，边搅拌边加入体积浓度为95%的乙醇，以调至醇的体积浓度约为65%。静置过夜，离心、去除上清液，沉淀物经真空干燥得到11.2kg 德赢vwin登录 提取物。2.2 德赢vwin登录 提取物成分测定方法：水分含量测定按照GB/T5009.3-2016[15]；灰分测定按照GB/T 5009.4-2016[16]；蛋白含量测定按照GB 5009.5-2016 中的凯氏定氮法[17]；多糖含量测定采用苯酚-硫酸法[18]；总黄酮含量测定采用硝酸铝比色法[19]；总苷含量测定采用苯乙苷类测定法[20]。2.3 最大非致死浓度（MNLC）的确定：将德赢vwin登录 提取物用养鱼水配制5 个浓度，分别为100μg/mL、211μg/mL、447μg/mL、946μg/mL 和2000μg/mL，同时设空白对照组。每个浓度均处理30 尾斑马鱼，处理期间，记录并统计每组斑马鱼死亡数量并及时移除。处理6h 后，统计各实验组斑马鱼死亡数量，绘制最佳的浓度效应曲线，并使用Origin 统计学软件计算MNLC 值。2.4 对斑马鱼肠蠕动影响的评价：根据“2.3”项下确定的MNLC值，以浓度为MNLC/10、MNLC/3 和MNLC 的3 种浓度的德赢vwin登录 提取物处理经尼罗红喂养的斑马鱼，并设模型组和阳性对照组（多潘立酮），每组浓度（包括模型组和阳性对照组）均处理30 尾斑马鱼。处理6h 后，在荧光显微镜下拍照，每组随机拍摄数量为15 尾，利用NIS-Elements D 3.10 高级图像处理软件分析斑马鱼肠道总荧光信号（S，Total fluorescent signal），肠蠕动促进率=（1-S 药物/ S 模型）×100%。统计学分析采用方差分析和Dunnett s t–检验，P<0.05 表示差异显著。3 结果与分析3.1 德赢vwin登录 提取物的化学成分分析：德赢vwin登录 提取物的化学成分见表1。由表1 可知，多糖是德赢vwin登录 提取物的主要成分，含量为40.27%，总苷和总黄酮总含量近25%，另外含有少量的蛋白成分。3.2 通便实验：斑马鱼是源自印度、巴基斯坦淡水河的一种小型热带淡水鱼，属于鲤科，与人类基因同源性高达85%，其信号传导通路与人类基本近似，生物结构和生理功能与哺乳动物高度相似，现已被美国国立卫生研究院列为继人和小鼠之后的第三大模式生物，近年来广泛被用于疾病模型建立和药物开发[21]。斑马鱼的个体小、易于饲养、胚胎透明易于观察和操作、样品用量少、试验周期短和可实现高通量筛选等优点，且肠道组成与人类非常相似，均由内皮细胞、结缔组织、环状肌和外纵肌组成，可用斑马鱼研究胃肠道生理功能[22]。尼罗红（9-二乙基氨基-5H-苯并[α]吩恶嗪-5-酮）是一种荧光染料，可以标记活体细胞培养中的巨噬细胞、平滑肌细胞中的脂滴，因其无毒性，尼罗红染料在脂肪代谢疾病模型中广泛应用于活体染料[23]。当斑马鱼卵暴露于尼罗红溶液中，富含脂肪的组织卵黄囊能被结合，在荧光显微镜下清晰显示。当斑马鱼5～6d 时，大部分卵黄囊被吸收，斑马鱼开始自发肠蠕动摄食，可以观察到肠道中尼罗红的充盈情况，而不被其他组织吸收[24]。当斑马鱼摄入有助于促进肠蠕动的药物或者食物时，肠道荧光强度会减弱，可根据斑马鱼肠道蠕动情况来评价促进肠动力药物的药效。3.2.1 斑马鱼肠蠕动实验测定浓度的确定：德赢vwin登录 提取物用养鱼水配制的100μg/mL、211μg/mL、447μg/mL、946μg/mL 和2000μg/mL 这五个浓度，处理斑马鱼6 h 后，统计斑马鱼死亡数量，如表2 所示。从表2 的实验数据可以看出，斑马鱼在德赢vwin登录 提取物五个浓度下，均没有诱发斑马鱼死亡，可见德赢vwin登录 安全无毒，MNLC 浓度即为2000μg/mL。基于此实验结果，确定斑马鱼肠蠕动实验的三个测定浓度，分别为200μg/mL、667μg/mL 和2000μg/mL。3.2.2 斑马鱼肠蠕动实验结果的分析：将发育至第5 天的斑马鱼幼鱼置于浓度为200μg/mL、667μg/mL 和2000μg/mL 的德赢vwin登录 提取物溶液中，并设置模型组和阳性对照组（多潘立酮：2000μg/mL）。处理6 h 后，观察并在荧光显微镜下拍照，实验结果如图1 所示。从图1 可以看出，未经任何药物处理的模型组中的斑马鱼肠道呈现强度较高的荧光，说明肠道染色成功。而经浓度为2000μg/mL 多潘立酮处理后的斑马鱼肠道呈现很弱的荧光强度，初步证实造模成功。再经浓度200μg/mL、667μg/mL 和2000μg/mL 的德赢vwin登录 提取物作用后的斑马鱼肠道的荧光强度信号值也呈现一定的变化，肠道荧光强度信号值如图2A 所示。由图2A 可知，经多潘立酮作用后，荧光强度信号值较低，也验证了阳性对照多潘立酮具有促进肠道蠕动作用。经三种浓度的德赢vwin登录 提取物作用后，荧光强度信号值随着浓度的提高而降低。根据荧光强度信号值，计算德赢vwin登录 提取物对斑马鱼肠道蠕动的促进作用，结果如图2B 所示。从图2B 可以看出，德赢vwin登录 提取物对斑马鱼肠道蠕动具有明显的促进作用，随着浓度的提高，促进作用明显增强，呈现浓度依赖性，在浓度为2000μg/mL 时，促进作用达到了23.26%。由此可见，德赢vwin登录 提取物可以通过促进肠道蠕动，达到润肠通便的目的，也恰好印证了民间对于德赢vwin登录 的功效评价。综上所述，德赢vwin登录 提取物具有较好的润肠通便作用，可以作为较好的润肠通便保健食品或者药品进行开发。对于促进肠道蠕动的机制尚不清楚，因此对其作用机制有待实验研究。此外，人类每天有不同程度的体力和脑力消耗且需要应对各种压力，这种情况下德赢vwin登录 提取物能否表现出润肠通便效果还需探讨。4 结论本文对德赢vwin登录 提取物进行了化学成分分析，结果表明多糖类化合物是德赢vwin登录 提取物的主要成分，含量在40%左右，总黄酮和总苷总含量近25%，还有少量蛋白类成分（7.61%）。斑马鱼体内实验结果显示德赢vwin登录 提取物在浓度为200～2000μg/mL 时均没有诱发斑马鱼死亡，说明德赢vwin登录 安全无毒。此外，斑马鱼肠蠕动实验表明德赢vwin登录 提取物可明显促进肠蠕动，并呈现浓度依赖性，在浓度为2000μg/mL 时，促进率可达23.26%。由此可以证实德赢vwin登录 提取物具有增强肠蠕动和促进排便的作用，但对于德赢vwin登录 提取物的作用机制尚不清楚，有待实验研究。德赢vwin登录 与荒漠肉苁蓉虽是不同种植物，但这两种植物均为列当科肉苁蓉属植物，同科同属植物具有类似的药理活性。据文献报道，荒漠肉苁蓉多糖具有清除自由基、免疫调节、抗衰老、改善脾虚、抗病毒、抗肿瘤、促进造血等多方面的药理活性，也有报道指出荒漠肉苁蓉的胶质多糖可以显著提高小肠推进度，缩短通便时间，有效地对抗阿托品的抑制排便作用，抑制大肠中水分的吸收[25-26]。而多糖也是德赢vwin登录 提取物的主要成分，可以推测多糖是德赢vwin登录 提取物的主要活性成分。对于德赢vwin登录 多糖进一步的成分研究和药理活性探讨正在进行。参考文献[1]刘佃温，刘翔.中西医结合治疗混合型便秘的疗效观察[J].中国中西医结合杂志，2016，36（2）：244-245.[2]邝宁子.功能性便秘中医证型的研究进展[J].新中医，2009，41（6）：121-122.[3]李迪夫.结肠次全切除术与结肠全切除术治疗慢传输型便秘的疗效比较[D].长春：吉林大学硕士学位论文，2016.[4]白玉强，马雁平，高广春，等.失眠症患者的焦虑抑郁状态研究[J].中国现代医药杂志，2001，3（6）：24-25.[5]赵金凤，曲佳乐，皮子凤，等.植物酵素润肠通便保健功能研究[J].食品与发酵科技，2012，48（3）：54-56.[6]叶国英，孙秀琴.大肠水疗治疗便秘的护理[J].当代护士（中旬刊），2002，6：29-30.[7]晓牧.看食物中的防便秘“高手”[J].糖尿病新世界，2013，12：60-61.[8]蔡鸿，鲍忠，姜勇，等.鲜德赢vwin登录 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鲜品化学成分及生物活性的研究[D].沈阳：沈阳药科大学博士学位论文，2011.[12]于连云.肉苁蓉的药理作用及临床应用[J].内蒙古中医药，2016，35（4）：87-88.[13]屠鹏飞，李顺戊，李志新，等.肉苁蓉类润肠通便药效比较[J].天然产物研究与开发，1997，11（1）：48-51.[14]张勇，吴焕，王顺年，等.肉苁蓉类药材及其炮制品通便作用的比较研究[J].中成药，1993，15（5）：20-21.[15]中华人民共和国卫生部、中国国家标准化管理委员会.食品中水分的测定，GB/T5009[S].3-2016.[16]中华人民共和国卫生部、中国国家标准化管理委员会.食品中灰分的测定，GB/T5009[S].4-2016.[17]中华人民共和国卫生部、中国国家标准化管理委员会.食品中蛋白质的测定，GB/T5009[S].5-2016.[18]杨勇杰，姜瑞芝，陈英红，等.苯酚硫酸法测定杂多糖含量的研究[J].中成药，2005，27（6）：706-708.[19]尉芹，王冬梅，马希汉，等.杜仲叶总黄酮含量测定方法研究[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2001，29（5）：119-123.[20]张雷红，堵年生，王青.紫外分光光度法测定肉苁蓉总苷胶囊中苯乙醇苷类的含量[J].新疆医科大学学报，2002，25（4）：407-408.[21]刘敬弢，佟侃，崔景荣.斑马鱼在肿瘤药理学研究中的应用[J].中国药学杂志，2010，45（23）：1800-1804.[22]侯海荣，张姗姗，孙晨，等.低聚果糖和低聚异麦芽糖促进斑马鱼肠道蠕动作用的研究[J].山东科学，2016，29（6）：56-61.[23]石玉新，穆迪，武洪庆，等.微藻油脂含量的几种快速测定方法[J].安徽农业科学，2012，40（21）：11067-11069.[24]周娟，郭胜亚，李春启.建立斑马鱼肠蠕动模型及筛选促胃肠动力药物的方法：中国专利，CN103301480A[P].2013-05-15.[25]高晓霞，陈君，彭艳丽.肉苁蓉多糖药理作用研究概况[J].食品与药品，2015，17（2）：136-139.[26]任璐.栽培德赢vwin登录 中苯乙醇苷的提取与纯化研究[D].无锡：江南大学硕士学位论文，2006.

2.5 肉苁蓉总苷对酒精损伤原代培养肝细胞凋亡的影响 由图3-B可以看出，肝细胞经酒精损伤后，凋亡率明显增加（34.7％），肉苁蓉总苷可以明显增加肝细胞存活率，且作用呈剂量依赖性，该结果与荧光显微镜下观察所得结果一致。经免疫细胞化学方法比较发现，肝细胞经酒精损伤后，凋亡抑制因子bc-2表达减弱（4-B），c-fos表达增强（5-B）。肉苁蓉总苷可明显增强bcl-2表达（4-C、D．E），抑制e-fos表达（5-C、D、E）．结果见图4-5．图4 肉苁蓉总苷对酒精损伤原代培养肝细胞tF2表达的影响（400图5 肉苁蓉总苷对酒精损伤原代培养肝细胞e-fos 表达的影响（400）A：空台红：马核型组：C．0.2gL-GCND：0.4g／L-GCw E40.8g／L-GC．3 讨论Berry等首先建立了生理条件下用胶原酶灌流肝脏获取肝细胞的原位灌流法，后来经过Seg-len等”发展，使这种胶原酶灌流技术更加完善。该法具有细胞产量大，存活率高等。本实验采用小鼠肝细胞原位灌流法获取原代肝细胞，并进行培养，方法稳定，细胞活性较强，通过生长曲线测定发现。获取的原代肝细胞4d即进入对数生长期MTT比色微量分析法是一种检测细胞生长和存活的灵敏方法，重复性好，活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶可将黄色的MTT还原为蓝紫色结晶物，而死亡细胞则无此功能。通过测定光密度即可反映细胞活性，本实验通过MTT法检测发现肝细胞经酒精损伤后，细胞存活率明显降低.肉苁蓉总苷可以明显增加肝细胞存活率（P＜0.05），且作用呈剂量依赖性（P＜0.05）．凋亡是一种特殊形式的细胞死亡，当细胞发生凋亡时会出现特殊的形态学和生化学的改变-，实验证实当酒精处理后大部分肝细胞细胞发生了凋亡，细胞出现了明显的形态改变，表现为：细胞变小，细胞表面微绒毛消失，细胞表面皱缩、有空泡形成、细胞核聚缩、有凋亡小体形成等；同时伴有坏死产生，肉苁蓉总苷处理后凋亡率明显下降，坏死情况也有所缓解。bc-2基因为原癌基因，目前已发现5个bel-2基因家族（bd-2．bcl-x．bax．mc-1和A1），其中bel-2可抑制细胞程序性死亡（PCD）．bcl-2的作用机理可能有：（1）抑制Ca的释放，bel-2是一种跨膜蛋白，其主要位于核膜上，核内外膜之间由内质网管腔相连，后者是细胞内Ca2＋的主要贮存场所，而Ca在细胞调亡过程中起重要作用。应用转基因方法发现bcl-2高表达可抑制内质网释放Ca，故推测bc-2对细胞凋亡的抑制作用可能与细胞内质网中Ca2有关。（2）bd-2通过阻止促调亡基因信号传递，或阻止这些诱导基因产物而发挥抗细胞调亡作用，研究表明bcF2蛋白可抑制P53．c-fox诱导的细胞凋亡等。（3）bel-2可通过抑制自由基而发挥抗凋亡作用，bd-2具有抗氧化剂作用，它可抑制超氧化物的产生和作用，从而抑制细胞凋亡的发生。生，而持续过度表达与继发性损害有关。并认为二者的表达机制不一样，因此可以认为c-fos等IEG，起到双重作用。当修复防御系统完全被抑制时，它们参与凋亡；未被抑制时则对病灶周围的细胞有保护作用，参与细胞的修复及再生过程间.Webster KR用反义核苷酸降低c-fos的转录而阻止凋亡发生，表明c-fos过度表达与细胞凋亡有必然联系，与多种疾病的发生，发展有关。在本实验中，肝细胞经酒精损伤后，凋亡抑制因子bel-2表达明显减弱，e-fos表达增强，提示肉苁蓉总苷可能通过增强bel-2表达，抑制c-fos表达.减少肝细胞损伤与凋亡，实现对肝细胞的保护作用.参考文献11 Qunbe X.Shigetoshi K.Tadao T.etal. Antioxi datice efbeete of pheny l-thanoih from Cistanche de erticola[J].Bol Pham BdL 1996,19(12):1580 -1585. 13 罗慧英，刘渊席国柱，等，肉苁蓉总普对小鼠酒精性肝损伤的保护作月.中国临床药理学与治疗学，2009.14(11):1225-1228. 13 van de Losdreht AA, Beekn RH.Osmkoppele GJ.et al A tetramliumrbaed cobrimetre MTT assay to quntitale human moncyte mediated eytor tosicity against leskemic cells from eell lms and par tiente wih acue myeloid bukemil 1.JImmunol Methods,1994,174(1/2):311-320 14 Bradford MM.A rapil and semitive method for the quanttation of micrgrm cuantties of proein atili zing the principle of proteirye binding[JI.Anal Biochem,1976.72(1/2):248-254.

摘要 目的：研究内苁蓉总苷对原代培养肝细胞的保护作用。方法：采用原位灌流法收集原代肝细胞，MTT法评价肉苁蓉总苷对酒精损伤原代培养肝细胞存活率的影响；荧光显微镜技术评价肉苁蒙总苷对酒精损伤原代培养肝细胞及细胞核形态的影响；流式细胞仪检测肉苁蓉总苷对酒精损伤原代培养肝细胞凋亡的影响；免疫细胞化学染色 法检测内 苁蓉总苷对bd-2和c-fos表达的影响。结果：原代肝细胞经酒精损伤后，存活率降低，出现明显凋亡和坏死改变，凋亡抑制基因bcl-2减弱．促凋亡基因c-fos表达增强。肉苁蓉总苷可明显提高细胞存活率，改善凋亡和坏死情况，增强bcl-2 表达，抑制c-fos表达。且作用呈剂量依赖性，结论：肉苁蓉总苷可通过增加凋亡抑制基因bcl2表达，减少促凋亡基因c-fos表达，减少凋亡和坏死，增加细胞存活率来实现对原代培养肝细胞的保护作用。关键词内苁蓉总苷；原代培养；肝细胞；酒精性肝损伤；凋亡近年来，随着人们生活水平的提高，酒精消费量快速上升，伴随而来的是各种与酒精相关的疾病的增加，酒精性肝损伤是其中一个重要的问题。研究表明肉苁蓉具有增强机体的免疫功能、抗衰老、抗辐射、抗氧化以及抗脂质过氧化和对酒精肝损伤的保护作用”，苷类物质是肉苁蓉的主要活性物质，在前期的实验中通过动物试验证实肉苁蓉总苷可能通过减少自由基的产生，增强对自由基及其代谢产物的清除能力，从而抑制脂质过氧化，起到对酒精性肝损伤的保护作用，本实验将通过肝细胞原代培养，从细胞水平探讨肉苁蓉总苷对酒精性肝损伤的保护作用。1 材料与方法1.1 试剂及仪器 肉苁蓉总苷，深褐色粉末，由兰州大学药学院提供，含苯乙醇总苷88.6％。双蒸水溶解，培养液稀释成所需浓度，酶标仪（美国贝克曼库尔特AD340），荧光显微镜（Olympus，BX51），倒置相差显微镜（Leicn DM13000B），流式细胞分析仪（Beekman coulter cell.Cell Lab Quanta SC）等. 1.2 原代肝细胞分离培养 采用原位灌流法。取昆明小鼠1只，0.5％戊巴比妥0.5mL腹腔注射麻醉。常规皮肤消毒后开腹，将胃肠移向左侧。暴露门静脉，小心将输液器的输液针自门静脉远端刺入并结扎固定。将输液器的流量开至最大（约4mL／min），滴入经37℃预热的无钙预灌流液，待肝脏肿大，迅速自下腔静脉远端切断，间歇性压迫下腔静脉近端，使肝脏交替回缩与膨大。预灌流至冲尽残血，肝脏呈均匀黄白色时，换用预温的0.05％胶原酶（Sigma）灌流液进行消化灌流，当肝脏变软无弹性，肝包膜下出现小液泡，或肝组织出现均匀裂隙时停止消化，小心游离肝脏，移至盛有适量DMEM高糖培养液（Sigma）的无菌平皿中，剥离肝包膜并轻轻振荡，即可将肝细胞散落于培养液中，收集于锥形管内，振荡培养10min（振频为100次／min），离心3mim（4℃，1000r／min），弃上清。用培养液悬浮细胞，200目尼龙网过滤，滤液反复离心3次（4℃，1000r／min），即获得肝实质细胞。调整细胞浓度为5x10°个／mL后，接种于用鼠尾胶原预处理的25ml培养瓶中．37℃．5％CO2孵育箱静置培养，24h后换液，弃去未贴壁细胞，继续培养，供后续试验使用.1.3 原代培养小鼠肝细胞的生长曲线的测定将分离纯化后的肝细胞调整至5x10个／mL接种于24孔板，每孔接种细胞悬液1ml，共接种21孔，含10％胎牛血清（Sigma）的DMEM高糖培养液培养7d．每天随机取3孔，0.25％胰消化吹打均匀后计数板计数，并绘制生长曲线。1.4 酒精肝细胞损伤模型的建立 将以上述方法获得的呈对数生长的肝细胞接种于鼠尾胶原预处理的96孔板，每孔接种100L．10％胎牛血清的DMEM 培养液培养24h后换液，再培养24h，设空白组，50.75.100.125.150mmol／L五 个酒精干预组，每组设五个复孔，肝细胞与不同浓度的酒精培养24h后，每孔加0.5％的MTT（Sigma）20严L，再继续培养4h，弃上清液，每孔加DMSO 150严L，置摇床混匀15min，570nm检测吸光度值，并计算细胞存活率。细胞存活率＝给药组OD值／对照组 OD值x100% 1.5 肉苁蓉总苷对酒精损伤原代培养肝细胞存活率的影响 将上述方法获取的肝细胞接种于鼠尾胶原预处理的96孔板，每孔接种100＃L，10％胎牛血清的DMEM培养液培养24h后换液，再培养24h后，给药组分别加入终浓度为0.2．0.4.0.8g／L的GCs，酒精模型组和空白组不加药继续培养，每组设五个复孔。24h后模型组和GCs干预组分别加入终浓度为100mmol／L的酒精，培养12h后，MTT法测定细胞存活率。1.6 肉苁蓉总苷对酒精损伤原代培养肝细胞及细胞核形态的影响 将预先灭菌处理的盖玻片置于6孔板中，接种浓度为5x10个／mL的细胞悬液、设模型组、肉苁蓉组（0.2.0.4.0.8g／L）和空白组，培养24h后，加入终浓度为100mmol／L的酒精，培养24h后取出载玻片95％的乙醇固定15min，PBS洗两次，重新分散于PBS中，调整细胞浓度在5x10个细胞／mL加入10＃L的丫啶橙一溴化乙啶混合液（Sigma）（0.01＃g／mLY啶橙溶液．0.02＃g／mL溴乙啶溶液，混合体积比：1／1），孵育30min后，荧光显微镜下观察、摄像1.7 肉苁蓉总苷对酒精损伤原代培养肝细胞凋亡的影响 将消化好的细胞悬液密度调整为5X10个／mL接种于六孔板中培养24h后，设模型组．肉苁蓉组（0.2.0.4、0.8g／L）和空白组，培养24h后，加入终浓度为100mmol／L的酒精，孵育24h，消化收集细胞，PBS洗涤2遍后，用70％的预冷乙醇4C固定过夜，PBS液洗涤两次，加入RNA酶（Sigma），Pl（100＂g／mL）（Sigma）均匀染色，放入37℃水浴30min，流式细胞仪测定细胞凋亡率。1.8 肉苁蓉总苷对酒精损伤原代培养肝细胞凋亡抑制基因bcl-2和促凋亡基因c-fos表达的影响取6孔培养板三张，每3孔为一组，设模型组、肉苁蓉组（0.2.0.4.0.8g／L）和空白组，每孔置入1块无菌玻片，取对数生长期细胞，胰酶消化制备单细胞悬液，调整细胞密度为5x10／mL，接种于6孔板，2ml／孔，培养24h后，加入终浓度为100mmol／L的酒精，继续培养24h，取出爬满细胞的玻片，PBS洗2遍，常规免疫组化ABC法染色，简要步骤如下：以40％多聚甲醛固定 10min，正常羊血清封闭30min，滴加beF-2多克隆抗体（Invitrogen）（1：75）或e-fos多克隆抗体（Invitro- gen）（1：50），室温反应1.5h，加入ABC复合物室温反应2h，DAB显色，明胶封片，光镜下观察并摄像，比较Bcl-2和c-fos蛋白表达。1.9 统计学处理 实验数据用SPSS 13.5软件处理。以均数士标准差（x土s）表示，组间比较采用：检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。2 结果2.1 原代培养小鼠肝细胞的生长曲线 由图1可以看出随着孵育时间延长，肝细胞数不断增加。在第4天时进入对数生长期。图1 原代培养小鼠肝细胞的生长曲线2.2 不同浓度酒精对原代培养小鼠肝细胞存活率的影响 由表1可知，酒精对原代培养的肝细胞有很强的损伤作用，且作用呈剂量依赖性。结合试验需要，在后续的试验中将采用100mmol／L．作为工作浓度，其细胞存活率为43.40%. 2.3 肉苁蓉总苷对酒精损伤原代培养肝细胞存活率的影响 由表2可知，肝细胞经酒精损伤后，存活率明显降低，肉苁蓉总苷可以明显增加肝细胞存活率（P＜0.05）．且作用呈剂量依赖性（P＜0.05). 表1 不同浓度酒精对肝细胞损伤情况比较（土＝5）组别浓度（mmd／））吸光度（OD值）细胞存活率（％）对照组-0.761±0.183-酒精组500.614±0.12280.68%750.524±0.12268.90%1000.330±0.02643.40%*1250.243±0.47231.92%*1500.147±1.33319.31%*与对照组比较＊PK0.05．＊P＜0.01表2 肉苁蓉总苷对肝细胞存活率的影响（土，5）组别浓度（）吸光度（OD值）细胞存活率（％）对照组-0.73±1.52-模型组-0.36±2.0248.84%肉苁蓉总苷组0.20.39±0.5353.64%0.40.44±1.3760.65%0.80.51±0.1769.87%*与梗型细PC0.05＊P＜0.012.4 肉苁蓉总苷对酒精损伤原代培养肝细胞及细胞核形态的影响 丫啶橙进入细胞后显绿色荧光，溴乙啶只能使细胞膜不完整的坏死细胞染色。通过观察发现（图2），空白组肝细胞呈均匀绿色，未见坏死细胞的溴红染色（A）；肝细胞经酒精处理后，细胞变小，出现了大量溴红染色的坏死细胞和核内染色质浓缩的凋亡细胞（细胞核呈亮绿色）（B），因此认为酒精在诱导肝细胞凋亡的同时，还可引起细胞的坏死。GC。可明显减轻坏死，减少凋亡，且作用与剂量呈正相关（C.D、E）.