摘要：目的考察德赢vwin登录 复方制剂对小鼠细胞免疫和体液免疫的作用。方法SPF 级昆明种雌性小鼠200 只分5 大组，每组分低、中、高（0.067、0.133、0.400 g/kg·bw）和对照4 个剂量组，连续给药30 天，分别进行迟发型变态反应试验、淋巴细胞转化试验、抗体生成细胞检测、血清溶血素测定、小鼠碳廓清试验、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验、NK 细胞活性试验，测定相关免疫学指标。结果0.133、0.400g/kg·bw 剂量组能增加小鼠迟发型变态反应能力、NK 细胞活性、抗体生成细胞数，0.400g/kg·bw 剂量组能显著提高小鼠血清半数溶血值（P＜0.05），各剂量组对小鼠体重、脾脏/ 体重比值、胸腺/体重比值、单核- 巨噬细胞碳廓清能力、淋巴细胞转化能力及腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力均无明显影响（P＞0.05）。结论德赢vwin登录 复方制剂对小鼠具有增强免疫力功能。关键词：德赢vwin登录 ；复方制剂；增强免疫力德赢vwin登录 Cistanche tubulosa （Schrenk）Wight 主产于新疆南疆地区，2005 年被中国药典收载，具有补肾阳、益精血等功效[1]。现代药理研究表明，德赢vwin登录 具有壮阳、抗衰老、增强记忆力、通便、抗疲劳等多种作用[2-5]。德赢vwin登录 复方制剂主要以德赢vwin登录 为主要原料，每克制剂中相当于含有德赢vwin登录 原药材4.05g。本实验以不同剂量的德赢vwin登录 复方制剂灌胃小鼠30 天，通过测定小鼠相关生化指标，研究德赢vwin登录 复方制剂对增强小鼠免疫力作用的影响。1 材料和试剂1.1 样品德赢vwin登录 复方制剂由新疆维吾尔自治区中药民族药研究所提供，人体口服推荐剂量为每日0.8g，以每人60kg 体重计算，折合剂量0.013 3g/kg·bw。1.2 实验动物与分组SPF 级昆明种雄性小鼠200只，体重为18～22g，由长沙市天勤生物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号为SCXK（湘）2009-0012，饲料由同一单位提供。每组40 只小鼠为一组，共五大组。免疫Ⅰ组，进行碳廓清试验；免疫Ⅱ组，进行ConA 诱导的小鼠淋巴细胞转换实验、NK细胞的活性测定；免疫Ⅲ组，进行脏提比值测定、半数溶血值（HC50）的测定和抗体生产细胞数的测定；免疫Ⅳ组，进行迟发型变态反应实验；免疫Ⅴ组，进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验。每大组40只小鼠按体重随机分为4 小组，即对照组和低、中、高剂量组。1.3 剂量选择及样品处理据人体口服推荐量，设低、中、高剂量组分别为0.067g/kg·bw、0.133g/kg·bw、0.400g/kg·bw （分别相当于人体推荐剂量的5、10、30 倍），灌胃体积0.2mL/10g·bw，对照组给予等体积蒸馏水，连续灌胃30 天。试验时，分别取德赢vwin登录 复方制剂0.67g、1.33g、4.00g 加蒸馏水定容至200mL，按0.2mL/10g·bw 体积给小鼠灌胃，每天1 次，连续灌胃30 天。对照组灌胃予以等体积的蒸馏水。1.4 主要仪器与试剂动物台秤、分析天平、CO2培养箱、离心机、722 分光光度计、恒温水浴箱、酶标仪、显微镜、细胞计数器等。2 试验方法2.1 样品对脏器/体重比值的影响称重后处死小鼠，取出脾脏和胸腺，称重后计算脏/体比值。2.2 样品对细胞免疫功能的影响2.2.1 迟发型变态反应（DTH）（足跖增厚法） 小鼠腹腔注射2%（v/v）SRBC（0.2 mL 每鼠）致敏后4 天，测量左后足跖部厚度，然后在测量部位皮下注射20%（v/v）SRBC（20 μL 每鼠），于注射后24h 测量左后足跖部厚度，同一部位测量3 次，取平均值。以攻击前后足跖厚度差值（足跖肿胀度）来表示DTH 的程度。2.2.2 ConA 诱导的小鼠淋巴细胞转化实验（MTT法） 无菌取脾，分离单个脾细胞，用RPMI 1 640培养液调整细胞浓度为3×106 个/mL。用酶标仪按MTT 法以570nm 测定光密度值（OD 值）。淋巴细胞增值能力用加ConA 孔的OD 值减去不加ConA 孔的OD 值表示。2.3 样品对体液免疫功能的影响2.3.1 抗体生成细胞检测（Jerne 改良玻片法）每鼠腹腔注射0.2mL2%（v/v）绵羊红细胞（SRBC）悬液。4 天后处死小鼠，取脾，制成脾细胞悬液。按Jerne 改良玻片法进行抗体生成细胞测定，用溶血空斑数/106 脾细胞表示抗体生成细胞数。2.3.2 半数溶血值（HC50） 的测定每鼠腹腔注射0.2mL 2%SRBC 进行免疫。4 天后摘除眼球取血，离心、收集血清。用SA 缓冲液将血清稀释200 倍，按检验方法测定样品管及SRBC 半数溶血时的OD值，溶血素的量以半数溶血值（HC50）表示。2.4 样品对单核—巨噬细胞功能的影响2.4.1 小鼠碳廓清试验小鼠尾静脉注射4 倍稀释的印度墨汁（0.1mL/10g·bw），注入后2min 和10min 分别从内眦静脉丛取血20μL，加至2mL0.1%Na2CO3 溶液中，摇匀。以0.1%Na2CO3 溶液作空白对照，在600nm 波长处比色测定OD 值。将小鼠处死，取肝、脾称重，计算吞噬指数a。2.4.2 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验（半体内法） 小鼠腹腔注射20%（v/v） 鸡红细胞悬液1mL，间隔30min，颈椎脱臼处死，取腹腔巨噬细胞洗液1mL 制片，置37℃孵箱温育30min。孵毕，取出玻片于生理盐水中漂洗后晾干，以甲醇∶丙酮（1∶1）固定，4%（v/v）Giemsa-磷酸缓冲液染色，用蒸馏水漂洗晾干。油镜下每片计数100 个巨噬细胞，计算吞噬率和吞噬指数。2.5 样品对NK 细胞活性的影响受试小鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾，制成脾细胞悬液2×107 个/mL此为效应细胞，取传代后24h 生长良好的YAC-1细胞用RPMI 1 640 完全培养液调整细胞浓度为4×105 个/mL 此为靶细胞；取靶细胞和效应细胞各100μL（效靶比50∶1），加入U 型96 孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和2.5%Triton 各100μL；上述各项均设3 个平行孔，于37℃，5%CO2 培养箱中培养4h，然后将96 孔培养板以1 500r/min 离心5min，每孔吸取上清100μL 置平底96 孔培养板中，同时加入LDH 基质液100μL，根据室温反应3-10min，每孔加入1mol/L 的HCl30μL，在酶标仪490nm 处测定光密度（OD），计算NK 细胞活性。2.6 数据处理用SPSS11.0 软件进行数据转化和统计分析。分析时，先对数据进行方差齐性检验，若方差齐，采用单因素方差分析进行总体比较，发现差异再用Dunnett 法进行多个剂量组与一个对照组均数间的两两比较。若方差不齐，则对原始数据进行适当的变量转换，满足方差齐性检验后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到方差齐，则改用秩和检验进行统计，发现总体比较有差异，则采用不要求方差齐性的Tamhane’sT2 检验进行两两比较。3 结果3.1 对小鼠免疫器官脏器/体重比值的影响各剂量组对小鼠免疫器官脏器/体重比值无显著影响（P>0.05）。3.2 对小鼠细胞免疫功能的影响中、高剂量组对小鼠迟发型变态反应（DTH）能力与对照组比较显著提高（P<0.05），各剂量组队小鼠淋巴细胞转化能力无显著影响（P>0.05），见表1。3.3 对小鼠体液免疫功能的影响中、高剂量组对小鼠抗体生产细胞数与对照组比较显著提高（P<0.05），高剂量组小鼠半数溶血值（HC50）与对照组比较显著提高（P<0.05）。3.4 对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响各剂量对小鼠碳廓清能力无显著影响（P＞0.05）。对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力无显著影响（P＞0.05）。3.5 对小鼠NK 细胞活性的影响中、高剂量组小鼠NK 细胞活性与对照组比较显著提高（P＜0.05）。4 讨论4.1 本实验根据《保健食品检验与评价技术规范》[6]，在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核—巨噬细胞功能、NK 细胞活性4 个方面任2 个方面结果阳性，可判定该受试样品具有增加免疫力作用。4.2 在本实验条件下，经口灌胃给予小鼠0.067、0.133、0.400 剂量的德赢vwin登录 复方制剂30 天，与对照组比较0.133、0.400 剂量能显著提高小鼠迟发型变态反应能力、NK 细胞活性、抗体生产细胞数，0.400 剂量能显著提高小鼠血清半数溶血值（P<0.05），各剂量对小鼠胸腺/体重比值、脾脏/体重比值、单核—巨噬细胞碳廓清能力、淋巴细胞转化能力及巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力均无显著影响（P>0.05），提示德赢vwin登录 复方制剂具有增强免疫力功能。参考文献：[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010 年版一部[S].北京:化学工业出版社，2010：124-126.[2] 侯志华,常国文.肉苁蓉的药理学研究进展[J].中国民族医药杂志，2003，9（4）:3-4.[3] 李勇，熊元君，贾晓光，等.德赢vwin登录 粉对高盐饲养大鼠血压、红细胞膜流动性及全血黏度的影响[J].天然产物研究与开发，2009，21：220-222.[4] 吴波，顾少菊，傅玉梅，等.肉苁蓉和德赢vwin登录 通便与补肾壮阳药理作用的研究[J].中医药学刊，2003,21（4）：539-540.[5] 卿德刚，张娟，倪慧.德赢vwin登录 复方制剂缓解体力疲劳功能研究[J].新疆中医药，2011，29（2）：37-39.[6] 中华人民共和国卫生部. 保健食品检验与评价技术规范[S].2003:22-35.

摘要目的：分离德赢vwin登录 多糖水提物，考察分离物的体外免疫活性。方法：采用AB-8 大孔吸附树脂法对德赢vwin登录 多糖进行脱色，以多糖保留率和多糖脱色率为指标进行综合评分，以吸附速率、脱色时间、上样质量浓度为因素，采用正交实验优化脱色工艺并验证。采用DEAE-650M离子交换柱层析柱对脱色后的德赢vwin登录 多糖水提物进行分离。采用CCK-8 法检测不用质量浓度（6.25～100 μg/mL）分离前、后各种多糖对小鼠巨噬细RAW264.7 增殖率的影响，采用Griess 法和酶联免疫吸附测定法检测低、中、高质量浓度（12.5、25、50 μg/mL）分离前、后各种多糖对脂多糖（LPS）诱导RAW264.7 细胞一氧化氮（NO）、白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）释放量的影响。结果：AB-8 大孔吸附树脂的最优脱色工艺为吸附流速1.2 BV/h，脱色时间9 h，上样质量浓度25 mg/mL；3 次验证实验的综合评分分别为63.43％、63.29％、63.34％，平均值为63.35％（RSD＝0.11％，n＝3）。从德赢vwin登录 多糖水提物中分离出1 种中性多糖（CTZ）和5 种酸性多糖（CT1、CT2、CT3、CT4、CT5），含量分别为299.2、168.0、123.2、121.6、54.4、11.2 mg/g。与对照组比较，6.25～100 μg/mL的CTZ（6.25 μg/mL除外）、CT2、CT4、CT5 和6.25 μg/mL的CTC（即分离前的多糖）均可显著增加RAW264.7 细胞的增殖率（P＜0.05），6.25～100 μg/mL 的CT1、CT3 和50 μg/mL 的CTC 均可显著降低RAW264.7 细胞的增殖率（P＜0.05）。与LPS 组比较，低、中、高质量浓度CTC、CT2、CT3、CT5 组和低质量浓度CTZ组细胞的NO释放量均显著降低（P＜0.05），高质量浓度CT1、CT4 组细胞的NO释放量均显著升高（P＜0.05）；低、中、高质量浓度各组细胞的IL-6（高质量浓度CT1 组和低质量浓度CT5 组除外）、TNF-α释放量（中质量浓度CT1 组除外）均显著降低（P＜0.05）。结论：本研究所优化的大孔吸附树脂脱色工艺稳定、可行；德赢vwin登录 多糖水提物中可分离出1 种中性多糖、5 种酸性多糖，其中酸性多糖CT2的免疫活性较强。关键词德赢vwin登录 多糖；脱色；分离；免疫活性德赢vwin登录 为列当科德赢vwin登录 Cistanche tubulosa（Schenk）Wight 的干燥带鳞叶的肉质茎。现代研究表明，德赢vwin登录 含有苯乙醇苷类、环烯醚萜苷类、木脂素类、多糖类、生物碱类等多种生物活性物质，具有壮阳、通便、保肝、抗衰老、抗疲劳、增强免疫力及益智等功效[1－4]，可用于临床治疗肾阳不足、精血亏虚、阳痿不孕、腰膝酸软、筋骨无力、肠燥便秘等症[5]。德赢vwin登录 多糖水提物呈棕黄色，本课题组前期实验发现，该水提物中除含德赢vwin登录 多糖外，还包含水溶性色素、蛋白质等非目标成分，这给多糖的分离纯化、生物活性研究等造成了很大的困难。传统的有机溶剂脱色处理会破坏粗提物中目标成分的化学结构，降低后者的药理活性，并引入对人体有害的成分[6]。大孔吸附树脂是中药提取物中多糖脱色的常用材料，是一种性价比较高的高分子吸附材料，其物理、化学性质稳定，利用其对色素成分的选择吸附和筛分性能，可针对性地去除中药提取物中的色素，加之其可通过酸洗碱洗的方式进行再生，因而得以广泛应用[7]。本研究拟利用大孔吸附树脂对德赢vwin登录 多糖水提物进行脱色处理，并采用正交实验对脱色条件进行优化；提取物经脱色处理后，依据多糖所携带基团性质的不同，拟用离子交换柱层析的方法，进一步分离德赢vwin登录 多糖中的中性、酸性多糖组分。已有研究表明，植物多糖具有免疫调节作用，是天然的免疫调节剂，可以激活补体系统和T/B 淋巴细胞、巨噬细胞、自然杀伤（NK）细胞等免疫细胞，同时亦可促进多种细胞因子的释放，并促进抗体的生成等[8－11]。脂多糖（LPS）可激活巨噬细胞的炎症信号通路，诱导一氧化氮（NO）和诸如白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）等促炎细胞因子诱导的合成及释放，从而引发机体一系列的炎症反应[12]。本研究拟建立LPS 诱导的小鼠RAW264.7 巨噬细胞炎症模型，从德赢vwin登录 多糖对巨噬细胞增殖、炎症因子分泌和NO产生等方面的影响入手，初步评价其对机体免疫活性的影响，旨在为深入研究德赢vwin登录 多糖抗炎活性物质基础以及开发其多糖资源提供理论依据。1 材料1.1 主要仪器本研究所用主要仪器包括UV-2550 型紫外-可见分光光度计（日本Shimadzu 公司）、Multiskan Go型全波长酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）、Herocell180 型CO2 培养箱（上海润度生物科技有限公司）、AB135-S 型分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）、OSB-2100EYELA型油浴锅（上海爱郎仪器有限公司）、N-1001EYELA 型旋转蒸发仪（上海爱郎仪器有限公司）、THZ-100 型恒温摇床（上海一恒仪器有限公司）、3-18K型离心机（德国Sartorius AG公司）、IX71-12FL/PH型荧光倒置显微镜（日本Olympus公司）等。1.2 主要药品与试剂德赢vwin登录 多糖水提物（批号20180201，每克多糖相当于17.36 g 德赢vwin登录 ）由新疆win德赢官方 惠赠，样品于密封、阴凉、干燥处存放；蒽酮（批号20190120）购自上海科丰实业有限责任公司；无水葡萄糖（分析纯，批号：20181115）购自天津市科密欧化学试剂有限公司；DEAE-650M离子交换填料（粒径40～90 μm）购自日本Tosoh 公司；AB-8 大孔吸附树脂（粒径3.3～1.25 mm）购自天津市光复精细化工研究所；胎牛血清（FBS，批号1966173C）购自美国Gibco 公司；DMEM高糖培养基（批号AF29562465）、链霉素+青霉素双抗（批号AB10166019）、胰蛋白酶（批号SH30042.01）均购自美国Hyclone 公司；磷酸盐缓冲液（PBS，批号2035126，pH 7.4）购自以色列BI 公司；NO 检测试剂盒（Griess 法）（批号011020200430）购自北京索莱宝科技有限公司；LPS购自美国Sigma 公司；CCK-8 细胞增殖毒性测定试剂盒（批号BJ05203090）购自北京博奥森生物技术有限公司；IL-6（批号202012）、TNF-α（批号201922）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司；其余试剂均为分析纯，水为纯化水。1.3 细胞株小鼠巨噬细胞RAW264.7 购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。2 方法与结果2.1 相关指标的检测2.1.1 色素波长的选择及多糖脱色率的计算德赢vwin登录 多糖水提物经水适当稀释后，使用紫外-可见分光光度计进行紫外-可见全波长扫描，结果未见最大吸收波长。因溶液呈现的颜色是溶液吸收光的互补色，德赢vwin登录 多糖水提物脱色前后、稀释前后均为黄棕色，可知溶液主要吸收蓝色波段的可见光[13]。因此，选择处于该波段吸光度较大的450 nm作为检测波长，并按如下公式计算多糖脱色率：多糖脱色率（％）＝（A1－A2）/A1×100％（式中，A1和A2分别为德赢vwin登录 多糖水提物经大孔吸附树脂处理前、后在450 nm波长处的吸光度）。2.1.2 多糖质量浓度的测定及多糖保留率的计算按2020 年版《中国药典》（一部）中灵芝多糖含量测定项下的硫酸-蒽酮法处理德赢vwin登录 中多糖[14]：使用使用紫外-可见分光光度计于625 nm波长处测定吸光度（A），并根据回归方程A＝39.603c－0.077 1（R 2＝0.999 8）计算德赢vwin登录 多糖的质量浓度[15]，并按如下公式计算多糖保留率：多糖保留率（％）＝c2/c1×100％（式中，c1和c2分别为德赢vwin登录 多糖水提物用大孔吸附树脂处理前、后德赢vwin登录 多糖的质量浓度）。该方法的方法学考察结果均符合2020年版《中国药典》（四部）的相关规定[16]。2.2 吸附脱色实验2.2.1 大孔吸附树脂的预处理AB-8 大孔吸附树脂（类型据前期研究结果选择）用95％乙醇浸泡24 h，倒去浮在水面的小颗粒树脂后，用水清洗至澄清、无醇味，然后分别用5％盐酸溶液和5％氢氧化钠溶液浸泡24 h，用水清洗至中性，最后用水浸泡并封存，备用。2.2.2 洗脱方法取经预处理的AB-8 大孔吸附树脂1.0 g，置于锥形瓶中，加入质量浓度为8 mg/mL 的德赢vwin登录 多糖溶液50 mL，摇床振摇3 h，抽滤，接流出液，浓缩，烘干，备用。2.2.3 实验参数优化在参考文献[17－19]和前期单因素实验的基础上，以多糖脱色率、多糖保留率为指标计算综合评分（根据前期研究结果设置权重均为50％），选用L（9 34）正交实验设计对大孔吸附树脂脱色的洗脱流速（A，BV/h）、脱色时间（B，h）、上样质量浓度（C，mg/mL）进行优化，确定德赢vwin登录 多糖的大孔吸附树脂脱色最优工艺条件。德赢vwin登录 多糖大孔吸附树脂脱色的正交实验因素与水平见表1，实验设计与结果见表2，方差分析结果见表3。由表2 的极差结果可知，各因素对综合评分的影响由高到低为C＞A＞B，说明上样质量浓度对大孔吸附树脂脱色效果的影响最大，其次是洗脱流速和脱色时间。由表3 的方差分析结果可知，上样质量浓度和洗脱流速对大孔吸附树脂的脱色效果均有显著影响，脱色时间的影响不显著。根据上述正交实验结果可知，大孔吸附树脂脱色的最优参数组合为A2B1C3，即洗脱流速1.2 BV/h，脱色时间9 h，上样质量浓度25 mg/mL。2.2.4 验证实验取质量浓度为25 mg/mL的德赢vwin登录 多糖溶液3 份，分别上样至填有大孔吸附树脂的层析柱（100 cm×6 cm）中，分别吸附9 h 后开始洗脱，洗脱流速为1.2 BV/h，接流出液，浓缩后检测多糖脱色率、多糖保留率并计算综合评分。结果，3 次重复试验综合评分分别为63.43％ 、63.29％ 、63.34％ ，平均值为63.35％（RSD＝0.11％，n＝3），表明此脱色方法可行。2.3 德赢vwin登录 粗多糖的初步分离2.3.1 DEAE-650M 离子交换填料的预处理先把DEAE-650M离子交换填料倒入较大的容器内，加入3～4 倍体积的水浸泡，等填料大部分沉底后弃去上清液，再加入水重复以上操作3～5 次，备用。2.3.2 粗多糖分离将层析柱（80 cm×4 cm）垂直固定在层析架上，装上经预处理的DEAE-650M离子交换填料，将已脱色的德赢vwin登录 多糖（记为CTC）溶液250mL，以25 mg/mL 的质量浓度上样至层析柱中，分别用水和系列浓度的氯化钠溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L）依次进行洗脱，收集洗脱液。其中，水洗脱下来的成分为中性多糖，不同浓度的氯化钠溶液洗脱得到的为酸性多糖。将收集的洗脱液按洗脱曲线合并，经浓缩、透析后，冻干得到多个多糖组分。结果，分离出1 种中性多糖，记为CTZ，含量为229.2 mg/g；0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L 氯化钠溶液洗脱的各酸性多糖分别命名为CT-1、CT-2、CT-3、CT-4、CT-5，含量分别为168.0、123.2、121.6、54.4、11.2 mg/g。2.4 德赢vwin登录 多糖对巨噬细胞免疫活性的影响2.4.1 细胞增殖率的检测采用CCK-8 法进行检测。实验分为空白组[只含完全培养基（含有10％FBS、100U/mL 的链霉素和100 U/mL 青霉素，下同）]、对照组（含细胞与完全培养基）和不同质量浓度的CTC、CTZ、CT1、CT2、CT3、CT4、CT5 组（含细胞、完全培养基和6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的德赢vwin登录 多糖、中性多糖和各酸性多糖，根据预实验结果设置质量浓度），每组设5个复孔。取对数生长期的RAW264.7 细胞，用胰蛋白酶消化后，以1 000 r/min 离心5 min，吸弃上清液，加入完全培养基调整细胞浓度，并按1×105 mL－1接种至96 孔板中，每孔100 μL，置于37 ℃、5％CO2培养箱（下同）内培养。待细胞贴壁后，每孔吸弃上清液，按上述分组加入完全培养基或含相应药液的完全培养基，继续培养24 h后，每孔加入CCK-8 试剂10 μL，室温孵育1 h 后，用酶标仪在450 nm 波长处检测各孔的吸光度（A）值并计算细胞增殖率：细胞增殖率（％）＝（实验组A 值－空白组A值）/（对照组A 值－空白组A 值）×100％。采用SPSS25.0 软件对数据进行统计分析。计量资料以x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。德赢vwin登录 多糖对RAW264.7 细胞增殖率的影响见表4。由表4 可知，与对照组比较，6.25～100 μg/mL CTZ（6.25 μg/mL除外）、CT2、CT4、CT5 组和6.25 μg/mL CTC组细胞的增殖率均显著增加（P＜0.05），6.25～100μg/mL CT1、CT3 组和50 μg/mL CTC组细胞的增殖率均显著降低（P＜0.05）。按照毒性分级标准，细胞增殖率≥100％为0 级，75％～99％为1 级，50％～74％为2 级，25％～49％为3级，1％～24％为4 级，＜1％为5 级，其中0 和1 级被认为对细胞无毒性[13]。结果，当CT1、CT3 质量浓度为100μg/mL时，毒性可达到2 级，因此选择12.5、25、50 μg/mL作为后续研究的低、中、高质量浓度。2.4.2 NO释放量的检测采用Griess 法进行检测。实验分为对照组（含细胞与完全培养基）、LPS 组（含细胞、完全培养基和终质量浓度为1 μg/mL 的LPS）和低、中、高质量浓度的CTC、CTZ、CT1、CT2、CT3、CT4、CT5组[含细胞、完全培养基、终质量浓度为1 μg/mL 的LPS和低、中、高质量浓度（12.5、25、50 μg/mL）的德赢vwin登录 多糖、中性多糖和各酸性多糖]，每组设3 个复孔。取对数生长期的RAW264.7 细胞，按“2.4.1”项下方法消化、重悬后，按1×105 mL－1接种至48 孔板中，每孔300 μL，同法培养。待细胞贴壁后，吸弃去上清液，按上述分组加入完全培养基或含相应药液的完全培养基，继续培养48 h后，收集细胞上清液，以1 000 r/min 离心15 min，取上清液，使用酶标仪在540 nm 波长处检测各孔的A 值，按NO 检测试剂盒说明书方法计算NO 释放量，并按“2.4.1”项下方法进行统计分析，结果见表5。由表5 可知，与对照组比较，LPS 组细胞的NO释放量显著升高（P＜0.05）。与LPS 组比较，低、中、高质量浓度CTC、CTZ（中、高质量浓度除外）、CT2、CT3、CT5组细胞的NO释放量均显著降低（P＜0.05）；此外，高质量浓度CT1、CT4 组细胞的NO释放量均显著升高（P＜0.05）。2.4.3 IL-6、TNF-α释放量的检测按ELISA 法进行检测。取对数生长期RAW264.7 细胞，按“2.4.1”项下方法消化、重悬后，按1×105 mL－1接种至48 孔板中，每孔500μL，同法培养。待细胞贴壁后，吸弃上清液，按“2.4.2”项下方法进行分组、加药、培养，收集细胞上清液，以1 000r/min 离心15 min，收集上清液，使用酶标仪在450 nm波长处检测各孔的A值，按ELISA 试剂盒说明书方法计算IL-6、TNF-α释放量，并按“2.4.1”项下方法进行统计分析，结果见表5。由表5 可知，与对照组比较，LPS 组细胞的IL-6、TNF-α释放量均显著升高（P＜0.05）。与LPS组比较，除高质量浓度CT1 组细胞的IL-6 释放量显著升高（P＜0.05）、中质量浓度CT1 组细胞的TNF-α和低质量浓度CT5 组细胞的IL-6 释放量均无显著变化（P＞0.05）外，其余各组细胞的IL-6、TNF-α 释放量均显著降低（P＜0.05）。3 讨论前期研究发现，水提德赢vwin登录 中多糖时会有较多水溶性物质一同溶出，影响德赢vwin登录 多糖纯度，因此进一步对其进行分离纯化，可为多糖物质基础及生物活性研究奠定基础。大孔吸附树脂法是常用的脱色方法[17－19]。由于目前还不清楚德赢vwin登录 中色素成分的极性，所以课题组前期通过静态吸附实验，从不同极性的大孔吸附树脂中筛选了最适大孔吸附树脂AB-8，该树脂对非目标成分具有较好的吸附能力，又对德赢vwin登录 多糖具有较好保留能力。为达到更好的脱色效果，本研究在前期研究基础上，采用正交实验对脱色工艺（洗脱流速、脱色时间、上样质量浓度）进行了优化。结果，德赢vwin登录 多糖的最优脱色方法为洗脱流速1.2 BV/h，脱色时间9 h，上样质量浓度25 mg/mL。验证实验结果显示，本脱色方法可行。天然多糖的纯度及种类是影响其活性的重要因素，因此多糖分离纯化方法的相关研究仍然是天然活性多糖研究工作的重点。多糖分离常用的方法有沉淀法、凝胶色谱法、阴离子交换色谱法、大孔树脂柱色谱法和超滤法等[20]。多糖因单糖组成不同，其所带电荷性质也会有一定的差异，可被分为中性多糖和酸性多糖。中性多糖是由2 种以上不含有机酸的不同糖基单体构成的聚合物；而酸性多糖在组成成分和结构上要比中性多糖复杂，除含有2 种以上的糖基单体外，还含有糖醛酸单体[21]。阴离子交换柱层析法是利用多糖所带电荷的差异将中性多糖与酸性多糖进行分离[22]。为此，本研究采用DEAE-650M离子交换柱层析柱对德赢vwin登录 多糖进行分离，共分离出1 种中性多糖、5种酸性多糖。巨噬细胞是免疫活性细胞，可通过吞噬和杀伤病原微生物，从而起到调节免疫的作用。已有研究表明，当人体受到病理或机械损伤刺激时，药物干预可激活巨噬细胞使LPS 诱导的巨噬细胞吞噬能力增强，进而抑制NO的产生和IL-6、TNF-α等系列炎症细胞因子的分泌，从而保护宿主免受病原体的侵害[23]。为此，本研究检测了各种德赢vwin登录 多糖对RAW264.7 细胞增殖率的影响，以及对LPS 诱导巨噬细胞释放NO、IL-6、TNF-α的影响。结果，在12.5、25、50 μg/mL质量浓度范围内，既对RAW264.7 细胞增殖起一定的促进作用，又可显著抑制LPS 诱导的RAW264.7 细胞释放NO、IL-6、TNF-α的德赢vwin登录 多糖为CT2。相关研究显示，多糖的单糖组成和分子量会影响其免疫调节活性，半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖以及葡萄糖等单糖与多糖的免疫活性成正相关[24]，分子量较大的多糖可能含有较多的高度重复结构，可以多向性交叉连接质膜表面受体，特异性增强免疫调节效果[25]。因此本研究中的酸性多糖CT2 的单糖组成中可能含有特殊的单糖或含多个与免疫活性正相关的单糖，且分子量可能较中性多糖和其他酸性多糖大，但有待进一步研究确认。综上所述，本研究所优化的大孔吸附树脂脱色工艺稳定、可行；可从德赢vwin登录 多糖水提物中分离出1 种中性多糖、5 种酸性多糖，其中酸性多糖CT2 的免疫活性较强。本研究可为德赢vwin登录 多糖的开发利用奠定实验基础。

［摘要］ 德赢vwin登录 Cistanche tubulosa( Schenk) Ｒ. Wight 为中药肉苁蓉的基源植物之一，也是肉苁蓉属植物中最易发展大规模栽培的种。为了促进德赢vwin登录 高产稳产栽培技术的研究与推广，本文对德赢vwin登录 的植物学形态特征、寄生生物学特性、分子生物学等方面研究进展进行了概述，并对其进一步研究提出了展望。［关键词］ 德赢vwin登录 ; 植物学形态; 生物学特性; 分子生物学中药肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉Cistanchedeserticola Y. C. Ma 或德赢vwin登录 Cistanche tubulosa( Schenk) Ｒ. Wight 的干燥带鳞叶的肉质茎，具有补肾阳、益精血、润肠通便等功效［1］。国内外对肉苁蓉属植物的研究主要集中于肉苁蓉、德赢vwin登录 和盐生肉苁蓉Cistanche salsa ( C. A. Mey) G. Beck ［2］。德赢vwin登录 主要分布于新疆南疆的塔克拉玛干沙漠及其周围地区，由于长期的不合理采挖，其野生资源已面临濒危。为保证中药肉苁蓉的原料供应，同时保护野生资源，从二十世纪九十年代开始发展德赢vwin登录 的人工种植，二十多年来已在新疆和田地区种植柽柳并接种德赢vwin登录 达到1. 3 万hm2。为了促进德赢vwin登录 高产稳产栽培技术的研究和推广应用，同时也促进野生资源的有效保护，本文对德赢vwin登录 的植物学形态特征、寄生生物学特性及分子生物学等方面的研究进展进行概述，并对其进一步研究提出了展望。1 植物学形态特征1. 1 植物学形态德赢vwin登录 为多年生寄生草本，植株高20 ～150 cm，少数可达2 m 以上，地上部分高30 ～70 cm，少数可达120 cm。茎肉质，不分枝，基部常呈纺锤形，中上部呈圆柱型，直径5 ～ 15 cm，鲜时白色，干后棕褐色，断面白色。叶乳白色，干后变褐，三角形，长0. 5 ～ 4 cm，宽0. 5 ～ 2 cm，生于茎上部的渐狭为三角状披针形或披针形。穗状花序，长10 ～ 70 cm，少数达110 cm，直径5 ～ 20 cm; 苞片长圆状披针形或卵状披针形，长2 ～ 2. 7 cm，宽5 ～ 11 mm，边缘被柔毛，两面无毛; 小苞片2 枚，线状披针形或匙形，长1. 5 ～ 1. 7 cm，宽1 ～ 5 mm，近无毛。花萼筒状，长1. 5 ～ 1. 8 cm，顶端5 裂至近中部，有的裂片再分裂成2 ～ 3 个小裂片，乳白色，干后变黄白色，近等大，长卵状三角形或披针形，长6 ～ 10 mm，宽2. 5 ～ 3 mm。花冠管状漏斗形，长3. 5 ～ 4. 2 cm，顶端5 裂，裂片在花蕾时多数为紫色至粉红色，少数白色或鲜黄色，干后变棕褐色，近等大，近圆形，长8 mm，宽1 cm，两面无毛。雄蕊4 枚，花丝着生于距筒基部7 ～ 8 mm 处，长1. 5 ～1. 7 cm，基部膨大并密被黄白色长柔毛，花药卵形，长4 ～ 6 mm，密被黄白色长柔毛，基部钝圆，不具小尖头。子房长卵形，花柱长2. 2 ～ 2. 5 cm，柱头扁圆球形，2 浅裂。蒴果长圆形，长1 ～ 2 cm，直径0. 7 ～ 1. 5 cm。种子多数，近圆形，干后变黑褐色，外面网状; 种胚为球型原胚; 珠柄突起处有种孔，直径100 ～ 200 μm。花期4 ～ 6 月，果期6 ～ 8 月［3］。1. 2 组织结构屠鹏飞等［4］最先对肉苁蓉属植物肉质茎的组织结构进行了系统研究，此后付桂芳等［5］对荒漠肉苁蓉和德赢vwin登录 的茎、叶、花的组织构造进行了报道，李志军等［6］对德赢vwin登录 的异常构造的发生进行了研究。由于屠鹏飞等的研究内容发表在有关专著中，为了便于阅读，本文对德赢vwin登录 茎组织构造进行详细介绍，并对其叶、花的组织结构进行简要介绍。德赢vwin登录 肉质茎组织特征( 图1) : 表皮为一列扁平类长方形、类椭圆形薄壁细胞组成，外被角质层，有些部位表皮细胞和角质层脱落。后生皮层由十多列类圆形、类长圆形细胞组成，壁木栓化，外侧挤压破裂，有些部位与表皮细胞一起脱落。皮层狭窄。中柱维管束散生，外韧型，最外侧维管束单个散生，内侧常3 ～ 6 个维管束成群，韧皮部向心，木质部向外，排列成梅花形，横切面每一个维管束呈卵圆形; 韧皮部由薄壁性细胞组成，茎上部有少量纤维，中下部无纤维，韧皮纤维呈长条形，长至600 μm，宽11 ～ 43 μm，壁厚1 ～ 5 μm。无纹孔和孔沟; 木质部由导管和木薄壁细胞组成; 导管主为网纹和具缘纹孔导管，少螺纹和孔纹导管，网纹、具缘纹孔、孔纹导管分子长80 ～ 270 μm，直径25 ～ 55 μm，壁厚2 ～ 5 μm，具缘纹孔导管纹孔呈网状或梯状排列， 螺纹导管分子长270 ～ 500 ～800 μm，直径13 ～ 20 μm，壁厚2 μm。茎上部韧皮部外侧和木质部内侧孔纹细胞易见，有些部位连接成环，木质部内侧孔纹细胞长方形至长条形，纹孔、孔沟明显，纹孔狭椭圆形，排列成网状或交叉; 茎中下部木质部内侧孔纹细胞类圆形，壁略增厚，纹孔、孔沟明显。皮层和中柱基本组织中含有大量淀粉粒，单粒，类球形、卵形、椭圆形，直径10 ～ 70 μm，脐点星状、人字形、一字形、裂隙状，层纹不明显［4］。德赢vwin登录 肉质茎异常构造的形成: 德赢vwin登录 肉质茎的维管束散生，而且随着茎的增大，不断分化新的维管束，这种类型的维管束在双子叶植物茎的组织构造中是极罕见的。研究表明，其维管束主要发生在两个部位。首先是中柱外侧，相当于中柱鞘的部位，细胞分化，先形成韧皮部，然后向内分化木质部，向外分化韧皮部，形成新的维管束，使茎不断变粗，所以在中柱外侧可见仅有韧皮部的维管束( 图2-A) ; 其次为中柱内侧，在韧皮部外侧的薄壁细胞，恢复分生能力，形成新的维管束，分化过程也同样先分化韧皮部，然后再向外分化木质部，向内分化韧皮部，从而形成韧皮部向心、木质部向外的维管束群，此类维管束分化的结果，使中柱部分的细胞相互挤压而成脑纹状结构［4］( 图2-B) 。德赢vwin登录 叶的组织结构: 为等面叶，上表皮为一层扁平多边形细胞，叶肉组织不分化，均为海绵状组织。维管束无限外韧型，具束中形成层，多6 ～ 13 束，均有侧分枝，无髓部。上表皮无气孔，下表皮具有大量的平轴式及不等式两种气孔［5］( 图3) 。德赢vwin登录 花的组织结构: 子房表皮细胞由一层整齐扁平多边形细胞组成，略角质化，皮层由数十层薄壁细胞组成，心皮的胚珠着生于每一无限外韧型的维管束上，珠柄较长，每一心皮的维管束数约2 ～ 3 束。开花与未开花有明显变化，四心皮单雌蕊，侧膜胎座，未开花时将子房不均分成5 ～ 7室不等，开花后将子房呈不均匀地分成8 室不等( 图4) ; 空心花柱表皮由一层扁平的多边形细胞组成，皮层由数十层薄壁细胞组成，偶尔形成大的细胞腔隙，2 束对生周木型维管束，腺组织由一些细胞壁增厚的薄壁细胞的腺体组成，与子房相对应的成多束( 图5) ; 开花与未开花略有变化，偶从实心的花柱到空心的花柱变化。柱头的表皮细胞均延长成乳头状［5］。2 寄生生物学特性2. 1 种子休眠与萌发种子休眠是长期自然选择的结果，是植物在系统发育中所形成的抵抗不良环境条件的适应性［7］。德赢vwin登录 种子休眠是其对沙漠环境长期适应的结果。近年来由于肉苁蓉需求量不断增加，野生资源已无法满足需求，开展了人工种植德赢vwin登录 的研究［8-10］，但接种率普遍较低，这主要是因为德赢vwin登录 是寄生植物，其种子具有休眠特性，其萌发机制尚需进一步明确，自然条件下，需要寄主释放的信号物质刺激才能萌发［11］。故打破德赢vwin登录 种子休眠，提高其萌发率成为人工种植德赢vwin登录 的关键。近年来，有关德赢vwin登录 种子休眠与促进萌发的研究很多。王华磊等［12-13］研究指出氟啶酮处理可打破德赢vwin登录 种子休眠，ABA 可能参与德赢vwin登录 种子休眠的调控。乔学义等［14］研究认为氟啶酮能有效刺激肉苁蓉种子萌发和吸器发育。赵东平等［15， 23］研究认为，酚酸处理对德赢vwin登录 种子发芽有明显影响，且与酚酸的浓度及种类有关，2，6-二甲氧基对苯醌对芽管膨大形成吸器的诱导作用显著。马东明等［16-17］研究了德赢vwin登录 种子脱离寄主条件下的离体萌发和吸器形成的形态学，认为德赢vwin登录 的种子萌发刺激物质可能为还原性氢醌类物质。杨重军等［18］认为适宜浓度的乙酰胆碱可促进肉苁蓉种子萌发，并改变了内源IAA 和ABA 含量。可见，氟啶酮、酚酸、2，6-二甲氧基对苯醌、氢醌类物质等对种子萌发均有促进作用。另外，闫妍等［19］研究表明，德赢vwin登录 花序不同部位的种子萌发率有所不同，花序中部蒴果种子萌发率显著高于基部和上部，原因为不同的有效积温所导致。2. 2 寄生过程和机理明确德赢vwin登录 寄生过程是揭示其寄生关系建立的重要内容。德赢vwin登录 种子萌发时胚根从软化的内种皮种孔端伸出，接着形成芽管状物，继而发育出初生吸器，厚的带状表皮分化出若干吸根毛，在初生吸器顶端带状表皮围成窝状，表皮上的褶皱和窝内分布有乳头状突起，吸根毛和乳突是黏着寄主根、刺穿寄主皮层发育为内生吸器最终建立寄生关系的基础［20］。王华磊等［21］研究提出其寄生过程遵循种子萌发长出芽管，接触寄主根形成吸器并侵入寄主根，德赢vwin登录 幼体出现3 个阶段( 图6) 。苗中芹等［22］研究认为德赢vwin登录 吸器侵入寄主根是一个主动过程，并有机械力的参与，吸器顶端分化出侵入细胞侵入寄主根的皮层、中柱，与寄主的木质部相连，最后完成幼苗的建成。为了更好地观察德赢vwin登录 的寄生过程，张金霞等发明了木箱-玻璃板法，这种方法可以在不伤害德赢vwin登录 种子和柽柳根系的情况下，直观地观察到德赢vwin登录 寄生的整个过程，为进一步明确德赢vwin登录 寄生过程和寄生机理提供了一种研究模型［24］。德赢vwin登录 侵入寄主柽柳根的机理研究是提高德赢vwin登录 接种率的关键问题。赵东平等［23］测定了德赢vwin登录 芽管形成过程中果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶的活性变化，呈先增加后降低的趋势。苗东琴等［25］研究指出，德赢vwin登录 吸器侵入寄主根的过程中有果胶酶和纤维素酶的参与，离体的芽管、吸器均分泌果胶酶和纤维素酶，其含量随着芽管和吸器生长呈增加趋势。在吸器和寄主根的侵染结构界面，侵入细胞也分泌果胶酶和纤维素酶，并在吸器和寄主根相邻的胞间层、寄主细胞壁周边部位分布，导致寄主细胞间连接被解除和细胞的降解( 图7) 。研究结果加深了对德赢vwin登录 侵入寄主柽柳根的机理认识，但分泌降解酶所需的环境条件和调控措施仍需深入探讨。2. 3 生长环境德赢vwin登录 生长于海拔高度约1200 m 水分较充足的柽柳丛中及沙丘地，常寄生于多枝柽柳Tamarixvamosissima Bunge、多花柽柳T. hohenackeri Bunge、塔克拉玛干柽柳T. talamakanensis M. T. Liu 和密花柽柳T. arceuthoides Bunge 的根部。土壤的固相、液相和气相组成了德赢vwin登录 寄生生长的环境，影响德赢vwin登录 的生长发育状况。土壤固相决定于土壤容重和土壤密度，通常用孔隙度表示土壤固相的通气状况，不同土壤类型间存在差异［26］。杨太新等［27］研究，在沙子、沙土和壤土3 种类型土壤中，德赢vwin登录 在土壤相对水分含量40% ～ 60% 时生长迅速，沙土和壤土水分含量超过80% 时德赢vwin登录 出现腐烂; 在沙子、沙土和壤土中，德赢vwin登录 适宜生长的固、液、气三相比分别为1∶ ( 0. 11 ～ 0. 16) ∶( 0. 52 ～ 0. 57) ，1∶0. 23 ∶0. 57 和1 ∶0. 31 ∶0. 67，沙土三相比1∶0. 38∶0. 43 和壤土三相比1∶0. 52∶0. 46 为该土壤类型德赢vwin登录 腐烂的三相比临界指标。郭玉海等［28］研究指出，黑暗、相对湿度100%、温度为20 ～ 30 ℃是德赢vwin登录 寄生的适宜环境条件。2. 4 干物质积累和成分变化近年针对德赢vwin登录 干物质积累的研究也屡有报道。杨太新等［29-30］研究，德赢vwin登录 干物质积累呈“S”型动态变化，9 月份干物质积累增加最多，生长12 个月单株干物质量可达138. 58 g; 不同接种时间的德赢vwin登录 ，随着接种时间的推迟，年内干物质积累量显著降低。杜友等［31］研究认为，多效唑具有通过抑制柽柳生长、提高柽柳光合速率和增加柽柳同化物向德赢vwin登录 的分配而提高德赢vwin登录 生物量的作用。骆翔等［32］研究认为，德赢vwin登录 寄生优化了柽柳同化物在器官间的分配，促使更多的同化产物向德赢vwin登录 分配; 德赢vwin登录 呼吸可能是导致柽柳-德赢vwin登录 总干重降低的一个原因。郭东峰等研究认为，寄生肉苁蓉的柽柳与未寄生植株间水分利用效率的不同，可能是寄生肉苁蓉的柽柳植株生长速度缓慢、生物量降低的一个重要原因［33］。郭雄飞等［34］研究认为，德赢vwin登录 各部位有效成分含量的差异悬殊，有效成分主要分布在肉质茎基部。骆翔等［35］研究认为，接种有德赢vwin登录 的柽柳根随着德赢vwin登录 的生长而增粗，其初生导管有黄色粘性物质阻塞，这些阻塞物中含有糖类和脂类物质，随着德赢vwin登录 的生长而消失。关于德赢vwin登录 活性成分变化，杨太新等［29-30］研究指出，德赢vwin登录 松果菊苷含量以生长5 个月时最高，之后逐渐降低，吸器韧皮部可能是德赢vwin登录 松果菊苷的次生代谢部位。刘淑红等［36］指出德赢vwin登录 的松果菊苷和毛蕊花糖苷含量均以11 月最高，12 月半乳糖醇含量最高，不同部位的松果菊苷和毛蕊花糖苷含量均差异显著，基部含量最高。郭东峰等［37］研究了矿质元素在德赢vwin登录 不同部位的分布规律，结果显示，矿质元素的横向分布和纵向分布中，Na、K 含量最高，其次为P 和Ca; 除Na外，其他几种元素含量从外层到内层逐渐降低; K含量从顶端到基部逐渐降低，P、Ca、Fe 和Mn 含量两端高中间低; Al 含量基部最高( 0. 82%) ，Mg、Zn含量顶端最高，其他部位差别不大。3 分子生物学及其他3. 1 遗传多样性目前，国内外学者对于德赢vwin登录 的分子生物学研究相对较少。然而，在产业化生产时如何防止其物种的衰退，以及如何尽快恢复有限的野生居群，保存珍贵的野生种质资源，是实现其可持续利用的关键。崔光红等［38］采用随机扩增多态性DNA 方法对德赢vwin登录 的4 个野生居群和2 个人工栽培居群的123 个个体进行了遗传多样性研究，结果显示: 用10 个随机引物共扩增出清晰谱带87 条( 图8) ，野生居群平均多态位点百分率27. 59，各居群多态位点百分率19. 54 ～ 25. 29，其中安迪尔居群的最高为25. 29，2 个人工栽培居群的多态位点百分率仅为13. 79 和11. 49; 用UPGMA 法聚类得出，4 个野生居群聚为一类，2 个人工栽培居群聚为一类( 图9) 。结果表明野生居群与人工居群间已发生了遗传分化，栽培德赢vwin登录 遗传背景单一，故对野生德赢vwin登录 的保护十分重要。3. 2 ＲAPD 分析王长林等［39］用筛选出来的16 个10-mer 寡聚核苷酸引物对寄生于8 种柽柳上的德赢vwin登录 遗传物质进行了ＲAPD 分析，寄生于8 种不同柽柳上的德赢vwin登录 遗传多态性为66. 7%，德赢vwin登录 不同居群之间存在有较丰富的遗传多样性，其中以刚毛柽柳和中国柽柳上寄生的德赢vwin登录 最为特别。结果表明，生长区域比寄主柽柳对德赢vwin登录 遗传物质的影响较为明显，异地引种对保持德赢vwin登录 较高的遗传多样性有利，德赢vwin登录 种内居群间遗传物质差异远小于肉苁蓉属植物种间的遗传差异。3. 3 试管苗培养马东明等［40］用去果皮的德赢vwin登录 种子对柽柳试管苗进行接种，建立德赢vwin登录 种子与柽柳的离体接种体系，体视显微镜观察接种情况表明，通过寄主柽柳的离体快速繁殖得到的试管苗与德赢vwin登录 种子的共培养能够建立德赢vwin登录 -柽柳接种复合体( 图10) ，为研究柽柳-德赢vwin登录 相互关系提供了有效的实验体系。4 展望关于德赢vwin登录 植物学形态、种子萌发、吸器形成和寄生过程的形态学研究已多见报道，然而决定德赢vwin登录 种子萌发、专性寄生的信号物质及寄生关系建立的机理还有待进一步深入探讨。如何建立适宜的德赢vwin登录 寄生环境，提高其田间种子萌发率和接种率仍是发展人工栽培的重点。德赢vwin登录 分子生物学研究为其濒危资源保护和种质资源创新提供了新思路。今后应将保护德赢vwin登录 野生资源和发展人工栽培相结合，加强德赢vwin登录 寄生机理的理论探讨和提高田间接种率的技术研究，探求人工栽培实现高产优质的调控途径，合理开发利用德赢vwin登录 资源。参考文献［1］ 国家药典委员会． 中华人民共和国药典: 一部［S］． 北京:中国医药科技出版社，2010: 126．［2］ 汤小蕾，孙平飞． 德赢vwin登录 的研究进展［J］． 中医药导报，2009，15( 5) : 101-104．［3］ 中国植物志编辑委员会． 中国植物志: 第69 卷［M］． 北京:科学出版社，1990［4］ 蔡少青，李胜华． 常用中药材品种整理和质量研究: 第四册［M］． 北京:北京医科大学出版社，2001: 27-28．［5］ 付桂芳，陈敏，崔光红，等．荒漠肉苁蓉和德赢vwin登录 的组织结构比较研究［J］．中华中医药杂志，2007，22( 12) :840-843．［6］ 李志军，吕春霞． 德赢vwin登录 异常结构的发育解剖学研究． 西北植物学报，1997，17( 5) : 118-122．［7］ 王忠． 植物生理学［M］，4 版． 北京: 中国农业出版社，2002: 415．［8］ 王学先． 肉苁蓉人工栽培技术［J］． 新疆农业科技，2002，( 1) : 13．［9］ 刘永博，杨黎明． 肉苁蓉栽培与管理［J］． 特种经济动植物，2001，( 8) : 22．［10］徐胜利，陈小青． 南疆肉苁蓉人工栽培新技术［J］． 新疆农业科技，2002，( 1) : 16．［11］Press MC，Graves JD． Paras it ic plants［M ］． New York:Chap-man Hall，1995: 18．［12］王华磊，郭玉海，翟志席，等．氟啶酮对德赢vwin登录 种子萌发影响的研究［J］．中国中药杂志，2006，31( 19) : 1638-1639．［13］Jing MY，Zhang JH． Abscisic acid and antioxidant defenseinplantcells［J］． Acta Bot Sin，2004，46( 1) : 1．［14］乔学义，王华磊，郭玉海． 一种刺激肉苁蓉种子萌发和吸器发育的方法［J］． 植物学通报，2007，24( 4) : 521-525．［15］赵东平，郭玉海． 不同酚酸处理对德赢vwin登录 种子发芽的影响［J］． 北方园艺，2011( 12) : 159-160．［16］马东明，徐淑莲，翟志席，等． 寄生药用植物德赢vwin登录 种子的离体萌发与吸器形成的形态学研究［J］． 植物学通报，2005，22( 1) : 39-43．［17］马东明，杨太新，翟志席，等． 一种简易的研究寄主中国柽柳刺激德赢vwin登录 种子萌发的技术［J］． 植物生理学通讯，2005，41( 5) : 662-664．［18］杨重军，张秀省，庄志坤． 乙酰胆碱对德赢vwin登录 种子萌发及其内源IAA 和ABA 含量的影响［J］． 植物生理学通讯，2007，43( 2) : 295-297．［19］闫妍，郭玉海． 德赢vwin登录 花序不同部位种子质量与有效积温的关系［J］． 中国农学通报，2009，25( 09) : 70-73．［20］马东明，徐淑莲，翟志席，等． 寄生药用植物德赢vwin登录 种子的离体萌发与吸器形成的形态学研究［J］． 植物学通报，2005，22( 1) : 39-43．［21］王华磊，杨太新，杨重军，等． 德赢vwin登录 种子萌发和寄生过程的形态学研究［J］． 中国中药杂志，2005，30( 23) :1812-1814．［22］苗中芹，刘海虹，贾君镇，等． 德赢vwin登录 幼苗发育解剖学研究［J］． 中国农业大学学报，2014，19( 2) : 131-136．［23］赵东平，郭玉海，朱艳霞，等．吸器诱导因子对德赢vwin登录 吸器形成的影响［J］．中国农业大学学报，2011，16( 4) : 38-42．［24］张金霞，王华磊，郭玉海，等． 一种简易观察德赢vwin登录 寄生过程的方法［J］． 江苏农业科学，2014，42 ( 1 ) :211-212．［25］苗东琴，赵东平，郭玉海． 果胶酶和纤维素酶参与德赢vwin登录 侵入寄主根的研究［J］． 中国农业大学学报，2014，19( 6) : 88-94．［26］林大仪． 土壤学［M］． 北京:中国林业出版社，2002，96．［27］杨太新，王华磊，郭玉海，等． 华北平原德赢vwin登录 寄生环境研究［J］． 中国中药杂志，2005，30( 17) : 1380-1383．［28］郭玉海，张金霞，翟志席． 德赢vwin登录 寄生实验体系的研究［J］． 中国药学杂志，2011，46( 12) : 910-912．［29］杨太新，卢月霞，郭玉海，等． 华北平原德赢vwin登录 干物质积累和松果菊苷含量动态变化研究［J］． 中国中药杂志，2006，31( 16) : 1317-1320．［30］杨太新，张喜焕，蔡景竹． 德赢vwin登录 松果菊苷次生代谢部位研究［J］． 中国中药杂志，2007，32( 24) : 2591-2594．［31］杜友，魏民，马召，等． 多效唑对柽柳和德赢vwin登录 物质分配的调控作用［J］． 中国农业大学学报，2013，18( 6) :107-112．［32］骆翔，翟志席，郭玉海，等． 德赢vwin登录 对柽柳器官同化物分配的优化［J］．中国农业大学学报，2011，16( 4) : 43-47．［33］郭东锋，郭玉海，黄勇，等．德赢vwin登录 的寄生对柽柳光合特性的影响［J］．安徽农业科学，2009，37( 23) : 11293-11295．［34］郭雄飞，吴亚东，倪慧，等． 德赢vwin登录 不同部位有效成分含量的考察比较［J］．新疆医科大学学报，35( 1) : 49-50．［35］骆翔，朱艳霞，赵东平，等． 柽柳根对德赢vwin登录 寄生的反应［J］． 植物生理学通讯，2010，46( 12) : 1211-1214．［36］刘淑红． 中国柽柳光和特性及其与德赢vwin登录 源库关系的研究［D］． 河北农业大学，2010．［37］郭东锋，郭玉海，黄勇，等． 德赢vwin登录 不同部位主要矿质元素含量研究［J］． 安徽农业科学，2009，37 ( 22 ) :10494-10495，10499．［38］崔光红，陈敏，黄璐琦，等． 野生与栽培德赢vwin登录 的遗传多样性分析［J］． 中国中药杂志，2006，31 ( 15 ) :1227-1230．［39］王长林，郭玉海，屠鹏飞，等． 不同种柽柳上寄生的德赢vwin登录 ＲAPD 分析［J］． 中国中药杂志，2009，34 ( 3) :264-268．［40］马东明． 管花肉从蓉种子的萌发诱导及离体接种的研究［D］． 中国农业大学，2005．

摘　要　采用各种色谱技术主要为HPLC从国产德赢vwin登录 Cistanche tubulosa ( Schenk) Wigh t 中分离得到7个苯乙醇苷类化合物,根据理化性质和波谱数据鉴定它们的结构为2′-乙酰基类叶升麻苷(Ⅰ )、类叶升麻苷(Ⅱ )、crenato side(Ⅲ )、丁香苷A 3′-α-L-吡喃鼠李糖苷(Ⅳ )、异类叶升麻苷(Ⅴ )、去咖啡酰基类叶升麻苷(Ⅵ )和红景天苷(Ⅶ )。化合物Ⅲ 为首次从本属植物中分离得到,其它化合物为首次从本植物中分离得到。关键词　列当科　肉苁蓉属　德赢vwin登录 　苯乙醇苷中药肉苁蓉为列当科肉苁蓉属植物的干燥带鳞叶的肉质茎,是常用中药之一,具有补肾阳、益精血、润肠通便等功效,常用于治疗男子阳痿、女子不孕、腰膝冷痛、血枯便秘等症[1 ]。我国有肉苁蓉属植物4种1变种,中国药典一九九五年版收载的品种为肉苁蓉Cistanche desert icola Y. C. Ma. , 由于药源紧缺, 本属其它种也在各地使用[2 ]。德赢vwin登录 C.tubulosa ( Schrenk) Wight 主产于我国新疆,资源比较丰富,为目前中花肉苁蓉的主要基源植物[2 ]。在巴基斯坦、印度等国也有一种德赢vwin登录 C. tubulosa( Schrenk ) Hoo k. f. 作为药材使用,但它与国产管药肉苁蓉在形态、化学成分及寄主植物上都有较大区别,被认为是不同的种[ 3, 4]。日本学者对巴基斯坦产的德赢vwin登录 进行了深入研究,分离得到了苯乙醇苷、环烯醚萜苷、木脂素苷等成分[ 5, 6]。国内学者对国产德赢vwin登录 进行了初步的化学成分研究,并对其挥发油成分进行了GC-M S分析[7～ 9 ]。为了阐明国产德赢vwin登录 的化学成分,为中药肉苁蓉新药源的开发利用提供科学依据,我们对其化学成分进行了研究,采用HPLC法, 从95%乙醇提取物的正丁醇萃取部分分离得到了7个苯乙醇苷类化合物,根据理化性质和波谱数据鉴定它们的结构为2′-乙酰基类叶升麻苷( acetylacteoside, Ⅰ )、类叶升麻苷( acteoside,Ⅱ )、crena to side (Ⅲ )、丁香苷A 3′-α-L-吡喃鼠李糖苷( sy ring alide A 3′-α-Lrhamnopyrano side, Ⅳ )、异类叶升麻苷( isoacteoside, Ⅴ )、去咖啡酰基类叶升麻苷( decaffeo ylacteoside, Ⅵ ) 和红景天苷( rhodioloside,Ⅶ ) (图1)。Ⅲ 为首次从本属植物中分离得到,其它化合物为首次从本植物中分离得到。1　仪器和试剂红外光谱仪: Perkin-Elmer 983型, KBr 压片。核磁共振波谱仪: Bruker ARX-400 型、VarianUN ITY-500 型, TM S 或溶媒作内标。质谱仪:KYKY-ZHP-5# 型, Zab SpecE型。高效液相色谱仪:Waters 600 型( 600 泵, 486 紫外/可见检测器) ;Gil son 712型制备型( 306泵, 118 紫外/可见检测器)。HPLC色谱柱: a. Phenomenex Kromasil 5μmC18 10× 250 mm; b. All tech Eco no sil C18 10 μm22 mm× 250 mm; c. Phenomenex Prodig y 5 μmO DS ( 3) 100• 4. 6 mm× 250 mm。色谱纯甲醇、乙腈,水为去离子水重蒸后过滤使用。薄层层析硅胶为青岛海洋化工厂产品; 反相硅胶( RP-18, 100～ 120目)为北京欧亚新技术公司产品;Sephadex L H-20为Pharmacia 产品; D101大孔吸附树脂为天津南开大学化工厂产品; Diaion HP20大孔吸附树脂为日本三菱化工产品; 高效薄层板、RP-18F254薄层板均为Merck产品; 聚酰胺薄膜为浙江四青生化材料厂产品。德赢vwin登录 Cistanche tubulosa ( Schenk) R.Wigh t 的干燥肉质茎购于新疆于田县医药公司,经本文作者屠鹏飞教授鉴定,样品保存于本室。2　提取和分离德赢vwin登录 生药36. 0 kg,粉碎后用95% EtO H回流提取4次,合并滤液减压浓缩后得乙醇浸膏,再以适量的H2O混悬,依次用P. ether. 、EtO Ac和n-BuOH萃取。取n-BuOH萃取物( 500 g )进行D101大孔吸附树脂柱层析, H2 O、10% , 30% , 50% , 70%EtO H依次洗脱。50% EtO H部分( 10. 0 g )经反相硅胶柱层析( 30%→ 85% MeO H梯度洗脱)、Sephadex LH-20柱层析( 40% → 70% MeO H梯度洗脱)得12 个流份( Fr. 1～ 12) ,其中Fr. 8～ 9( 0. 36 g )经HPLC分离( C18柱b, H2O-MeOH-CH3 CN = 62∶ 29∶ 9, 8. 0m L /min, 330 nm)得化合物Ⅰ ( 21 mg )、Ⅱ ( 39 mg )、Ⅲ ( 13 mg )和Ⅳ ( 28 mg ) ; Fr. 10( 0. 38 g )经HPLC分离( C18柱b, 45% MeO H, 8. 0 m L /min, 330 nm)得化合物Ⅴ ( 170 mg )。H2 O 部分( 140. 0 g )经Diaion HP20大孔吸附树脂柱层析( H2 O→ MeO H梯度洗脱)得7 个流份( Fr.Ⅰ ～ Ⅶ )。Fr.Ⅳ ( 3. 2 g )经Sephadex LH-20柱层析( H2O→ 30% MeOH梯度洗脱、反相硅胶柱层析〔H2 O→ 50% MeO H(含0. 25% HCOO H)梯度洗脱〕得9个流份,其中流份5 和6( 0. 13 g )经HPLC分离( C18柱a , H2O-MeO H-HCOOH= 85∶ 15∶ 0. 5,2. 5 mL /min, 280 nm)得化合物Ⅵ ( 17 mg )和Ⅶ ( 12mg )。3　结构鉴定化合物Ⅰ : 淡黄色粉末, UV365下显蓝色荧光,FeCl3-K3 [Fe( CN) 6 ]显蓝色。IR, 1 HNM R, FABMS数据与文献[5 ]报道的2′-乙酰基类叶升麻苷基本一致,因此确定Ⅰ 为2′-乙酰基类叶升麻苷。化合物Ⅱ : 淡黄色粉末, UV365下显蓝色荧光,FeCl3-K3 [Fe( CN) 6 ]显蓝色。IR, 1 HNM R, FABMS数据与文献[ 5]报道的类叶升麻苷基本一致,因此确定Ⅱ 为类叶升麻苷。化合物Ⅲ : 淡黄色粉末, UV365下显蓝色荧光,FeCl3-K3 [ Fe( CN ) 6 ]显蓝色。IR( KBr) cm- 1: 3 394(羟基) , 2 928, 1 694和1 630(α,β -不饱和酯) , 1 600和1 515(苯环)。1 HNM R( 500 MHz, CD3OD)δ: 1. 16( 3H, d, 6. 5, R-CH3 ) , 4. 03( 1H, dd, 12. 0, 3. 0, A-H-α) , 4. 18( 1H, t , 9. 5, G-H-3) , 4. 59( 1H, d, 8. 0, G-H-1) , 4. 64( 1H, dd, 10. 5, 3. 0, A-H-β ) , 5. 14 ( 1H, t,9. 5, G-H-4) , 5. 21( 1H, d, 1. 5, R-H-1) , 6. 32 ( 1H,d, 16. 0, E-H-α) , 6. 73 ( 1H, dd, 8. 0, 2. 0, A-H-6) ,6. 77 ( 1H, d, 8. 0, A-H-5) , 6. 82 ( 1H, d, 8. 0, E-H-5) , 6. 87( 1H, d, 2. 0, A-H-2) , 7. 00 ( 1H, dd, 8. 0,2. 0, E-H-6) , 7. 10( 1H, d, 2. 0, E-H-2) , 7. 65( 1H, d,16. 0, E-H-β )。13 CNMR 数据见表1。FABMS( posi t. ) m / z: 663( M+ H)+ , 477( M+ H- Rha )+ ,325 ( M+ H- Rha-Aglyco ne )+ 。分子式为C29 H34O15。以上数据与文献[ 10]报道的crena toside基本一致。这是首次从本属植物中得到苷元β 位O H与Glc2位O H形成醚键的苯乙醇苷类化合物。化合物Ⅳ : 淡黄色粉末, UV365下显蓝色荧光,FeCl3-K3 [ Fe( CN ) 6 ]显蓝色。IR( KBr) cm- 1: 3 434(羟基) , 2 939, 1 692和1 628(α,β -不饱和酯) , 1 609和1 519(苯环)。1 HNM R( 500 MHz, CD3OD)δ: 1. 13( 3H, d, 6. 5, R-CH3 ) , 2. 89 ( 2H, m, A-H-β ) , 3. 75( 1H, m, A-H-α) , 4. 10( 1H, m, A-H-α) , 4. 42( 1H, d,8. 0, G-H-1) , 4. 96( 1H, t , 9. 0, G-H-4) , 5. 23( 1H, d,1. 5, R-H-1) , 6. 32( 1H, d, 16. 0, E-H-α) , 6. 74( 2H,d, 8. 5, A-H-3, 5) , 6. 82 ( 1H, d, 8. 0, E-H-5) , 7. 00( 1H, dd, 8. 0, 2. 0, E-H-6) , 7. 09( 1H, d, 2. 0, E-H-2) , 7. 11( 2H, d, 8. 5, A-H-2, 6) , 7. 63( 1H, d, 16. 0,E-H-β )。13 CNMR数据见表1。FABMS( posi t. ) m /631 ( M+ Na )+ , 609 ( M+ H)+ , 471 ( M+ HAglycone)+ , 463 ( M+ H- Rha )+ , 325 ( M+ HAglycone- Rha)+ 。分子式为C29 H36 O14。以上数据与文献[ 6]报道的丁香苷A 3′-α-L -吡喃鼠李糖苷基本一致。化合物Ⅴ : 灰白色粉末, UV365下显蓝色荧光,FeCl3-K3 [Fe( CN) 6 ]显蓝色。IR, 1 HNM R, FABMS数据与文献[5 ]报道的异类叶升麻苷基本一致。化合物Ⅵ : 白色粉末。IR, 1 HNM R, FABMS数据与文献[11 ]报道的去咖啡酰基类叶升麻苷基本一致。化合物Ⅶ : 白色粉末。IR( KBr) cm- 1: 3 374(羟基) , 2 918, 1 608和1 512 (苯环)。1 HNM R ( 400M Hz, DM SO-d6 )δ: 2. 73( 2H, m, A-H-β ) , 3. 56( 1H,m, A-H-α) , 3. 87( 1H, m, A-H-α) , 4. 16( 1H, d, 7. 8,G-H-1) , 6. 66( 2H, d, 8. 4, A-H-3, 5) , 7. 04( 2H, d,8. 4, A-H-2, 6)。13 CNMR 数据见表1。FABMS( po sit. ) m /z: 339( M+ K)+ , 323( M+ Na )+ , 301( M+ H)+ 。分子式为C14 H20O7。分析以上数据,Ⅶ 符合文献[12 ]报道的红景天苷。致谢: 防化研究院分析化学研究室及北京大学分析中心代测核磁共振谱,军事医学科学院分析中心代测质谱,本校药学院教学中心代测红外光谱。参考文献1　江苏新医学院编. 中药大辞典. 上册. 上海: 上海科学技术出版社, 1977: 8952　屠鹏飞,何　燕,楼之岑. 中草药, 1994, 25( 4): 2053　M ori ya A, Tu P F, Karasaw a D, et al . 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杜娟12，陈 虹2”，姜勇，屠鹏飞（1石河子大学药学院，新疆 石河子 8320022省部共建教育部新疆特种植物药资源重点实验室，新疆石河子 8320023．北京大学药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室，北京 (161001摘要：目的观察松果菊苷（BCH）对大鼠脑缺血损伤海马区神经细胞凋亡的影响，方法雄性SD大凰，随机分为假手术组、模型组、川芎嗪组、ECH大剂量组、ECH小剂量组。采用大民大脑中动脉线栓法（MCAO）建立局灶性脑缺血损伤模型，各组造模后24h处死取脑，应用HE染色法观察脑组织病理改变，脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口 末端标记（TUNEL）法观察大鼠脑缺血后海马区神经细胞凋亡，结果脑缺血后海马区神经细胞正常组织结构消失、胞核碎裂、溶解坏死等形态学改变，亡神经细胞数量明显增加与模型组比较，川芎嗪组，ECH大剂量组和BCH小剂量组海马区凋亡神经细胞表达数量均有不同程度的减少，结论 ECH对脑缺血大民脑组织具有保护作用，其机制可能与抗细胞凋亡作用有关。关键词：松果莉苷；脑缺血 细胞凋亡中图分类号：R285.5 文献标识码：B 文章编号：1008-0805（2010）06-1324-02近年来脑缺血损伤与神经元死亡的关系受到广泛关注，而细胞凋亡是神经元死亡的主要方式研究发现在缺血损伤，兴奋毒性引起的脑损伤中，神经元凋亡明显增加，脑损伤中神经元的凋亡及其发生机制现成为广泛研究的重点。本文采用大鼠脑缺血模型，观察松果菊苷（Echinacoside ECH）对脑缺血损伤的保护作用。1 材料与方法11 药品与试剂 ECH由北京大学药学院居鹏飞教授惠赠（纯度95％以上）注射用盐酸川芎嗪（哈尔滨三联药业有限公司）红四氯唑（中国华东师范大学化工厂）水合氯醛（天津市福晨化学试剂厂）多聚甲醛（天津市化学试剂研究所）细胞亡试剂盒（购自 Prom（ga公司），市售鱼线（直径0 26mm），L2 动物分组及模型制备 雄性 SD大鼠共 50只，体质量 250-300 购自新疆实验动物研究中心（合格证号：2009-00531随机分为5组：①假手术组，生理盐水1m｝kg1·d1x74②模型组：生理盐水1mk kg-1·d1x74③脑缺血＋阳性药物对13 神经功能缺失体征评分 按文献［2）的5分制法进行评分。0分：无神经损伤症状：1分；不能完全伸展对侧前爪2分；向对侧转圈：3分；向对侧倾倒：4分；不能自发行走，意识丧失。1-3分为造模成功动物，0分．4分或死亡刷除，再随机补充。14 TTC染色 动物麻醉，取脑-20℃冰箱中速冻 20m冠状位每隔2mmm切片（5片）。切片置于2％TC液中，避光放入37℃水浴锅中孵育30mp4％多聚甲醛固定保存。15 HE染色 动物手术后 24h按文献操作甲，麻醉，打开胸腔暴露心脏，灌注针插入心尖并剪开右心耳，经左心室插入升主动脉快速生理盐水灌注至肝脏变白，再持续灌注4％多聚甲醛 30mp至大鼠四肢僵硬，完毕后取脑干上述固定液中4℃固定 48b常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明、浸蜡、包埋制成石蜡切块，在视交叉前后1mm范围切片，连续冠状切片，切片厚5μm HE染色后光镜下观察。16 细胞凋亡 采用 TUNEII＃法，按细胞凋亡原位检测试剂盒说明书标记凋亡细胞，具体步骤如下：脑组织切片常规石蜡脱水滴加 TUNEL．反应合物，37C孵育60mp滴加转化剂-POD（辣根过氧化酶标记）室温放置15m期间用磷酸缓冲液本实验，证实 ECH对脑缺血大队具有较好的保护作用，缺血预处理后可明显减轻细胞凋亡数量。PBS冲洗样本 3次，再滴加 100＃的12-二甲基苯胺（DAB）底 用，且随 EXH给药剂量的增加细胞凋亡数量进一步减少，通过物溶液，室温孵育5～20m镜下出现浅棕色背景时，终止反应苏木素复染，脱水透明，中性树胶封片，光镜下观察并拍照。2 结果21 脑片 TIC染色 缺血后缺血侧鼠脑肿胀，有明显的梗死灶形成。TIC染色显示正常脑组织呈红色，梗死灶脑组织呈苍白色。所有评分在1～3分大鼠的脑片经 TC染色后均有苍白色梗死灶出现（图1）表明模型的制作是成功的。 A正常组 B模型组 C利可楼组 DECH高剂量组图2 大脑皮层 HE染色图1 大脑 TTO染色22 HE染色 假手术组可见神经细胞形态完整，排列紧密，胞核完整，核仁清晰，胞周围间隙无水肿，模型组神经细胞肿胀，多数细胞核固缩，核仁欠清晰。缺血中心区神经细胞正常组织结构消失，胞核碎裂，溶解等坏色形志学改变，坏死灶边缘可见炎性细胞浸润：与模型组比较，川芎嗪组。EXH高.低剂量组神经元细胞数量均有增多，坏死灶周围胶质细胞增生，其中，川芎嗪组合EXH高剂量组肿胀的神经细胞明显减少，胞浆丰富，排列整齐。间质细胞增生，可见形态接近正常的神经元细胞（图2）23 细胞凋亡 TUNEL染色光学显微镜下观察（图3），阳性染色位于细胞胞核，呈棕黄色，正常细胞染色位于胞核，呈蓝色。①假手术组偶见细胞着棕色细胞结构尚好②模型组出现最为显著的神经元凋亡表现为整个细胞皱缩，体积缩小核固编；③与假手术组相比模型组海马区细胞高亡数量明显增加④与模型组比较，川芎嗪组，ECH大剂量组和ECH小剂量组海马区码亡神经细胞表达数量均有不同程度的减少。 A正常组 B模型组 C利可楼组 DECH高剂量组图2 大脑皮层 HE染色实验结果表明，假手术可见散在分布少量的凋亡细胞，表明正常神经细胞存在细胞凋亡，各组药物均显示明显抑制细胞凋亡的作用，与模型组比较具有显著差异，不同剂量的EXH給药均能明显减轻脑缺血后神经细胞凋亡，具有不同程度的脑保护作3 讨论细胞码亡是指在一定的生理或病理条件下，细胞启动自身基因调控机制，引起细胞自杀性死亡，其形态学特征为：细胞皱缩不能与周围细胞接触，胞浆浓缩，胞体出现泡状。胞核裂解成凋亡小体可被周围临近细胞吞噬，大量资料证明，脑缺血后脑损伤的病理变化为缺血中心区以坏死为主，半暗带区以凋亡为主，坏死是不可逆的死亡过程，而凋亡是可逆的过程，所以在缺血损伤中神经元凋亡扮演了重要角色，对凋亡机制的研究具有重要意义，目前国内外的研究均认为缺血后神经细胞凋亡主要是通过Casp依赖途径和非Cwpaw依赖途径实现的，其中Caspac-3和AF分别是这两种途径中的起作用的关键物质，凋亡诱导因子（AF）是近年来发现的一种码亡效应分子，正常情况下，AIF是一种定位于细胞线粒体膜间隙中的黄素蛋白，当有凋亡信号刺激时AF分子从线粒体释放到细胞浆，再通过其核定位信号转位到细胞核中，直接引起染色体凝集和 DNA呈大片段（～50 kb）断通ECH是苯乙醇苷类化合物，为德赢vwin登录 中的主要有效成分，近年研究表明，ECH具有抗 SH-SYSY神经元凋亡11＊，抗衰老門，改善学习记忆！”等神经保护作用，有研究表明，ECH可有效减少自由基的生成，抑制氧化应激反应的发生，进而产生明显的抗氧化作用，对神经元码亡具有预防作用！＂，本实验通过采用大鼠大脑中动脉梗塞模型，观察到 ECH预处理后，脑缺血大鼠码亡细胞明显减少，初步闸明了 ECH对脑缺血大鼠神经元的保护作用，为抗脑缺血药物的实验研究和临床应用研究提供了新的证据。

摘要：目的 研究松果菊苷（ECH）对局灶型脑缺血大鼠纹状体细胞外液中单胺类递质的影响，以探讨ECH对脑神经保护作用的可能机制。方法 SD大鼠随机分为对照组、模型组、ECH高、低剂量组和川芎嗪（CXQ）组。各组大鼠给予相应的药物或生理盐水腹腔注射，每天1次，连续7d。给药第3天，脑纹状体埋置探针套管，末次给药1五后，制作大鼠局灶性脑缺血模型（MCAO），造模后立刻进行微透析，将透析液注入高效液相-电化学检测器（HPLC-ECD）测定各组纹状体细胞外液中去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）、5-羟色胺（5-IT）3.4-二羟苯乙酸（DOPAC）、高香草酸（HVA）．5-羟吲乙酸（HIAA）的含量。结果 与对照组相比，模型组NE．DA、5HIT水平升高，其酸性代谢产物 DOPAC，HVA．HIAA也随之升高。与模型组比较，ECH高、低剂量组（30、15mg＊kg＊＇·d-1）和CXQ组的6种物质的含量均有所降低。结论 ECH的神经保护作用可能与对抗脑缺血后单胺类神经递质的升高有关。关键词：松果菊苷；脑缺血：纹状体；HPLC-ECD：单胺类神经递质及代谢产物。松果菊苷（echinacoside，ECH）是从新疆特色植物药德赢vwin登录 中分离、纯化的一种苯乙醇苷类有效成分。研究表明，ECH具有抗氧化0-2、保护神经D-0、抗衰老B、改善学习记忆B-等神经保护作用。陈虹等的研究结果证实，ECH对帕金森病的DA能神经元具有保护作用。单胺类神经递质是一类调节机体生理活动的重要物质，组织中的含量能反映神经递质生物合成、释放、摄取、失活等过程［10-i］。目前关于ECH对脑缺血大鼠脑内单胺类递质的影响尚未见相关报道。本研究运用脑微透析技术，考察了ECH对脑缺血大鼠纹状体细胞外液中各单胺类神经递质含量的影响，初步探讨了ECH对脑神经保护的可能机制。1 材料1.1 实验动物 SD大鼠，6，体质量250～300g（购于新疆实验动物中心，许可证编号：2009-0053)。 1.2 药品和试剂 ECH由北京大学药学院屠鹏飞教授惠赠（纯度95％以上）；去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）、5-羟色胺（54IT）、3,4-二羟苯乙酸（DOPAC）、高香草酸（HVA）．5羟吲哚乙酸（HIAA）均为Sigma公司：注射用盐酸川芎嗪（CXQ，哈尔滨三联药业有限公司）；磷酸锌水门汀（上海医疗器械股份有限公司产品，由液体和粉剂组成，用时调和）；1-烷基硫酸钠（DIKMA公司）；水合柠檬酸（天津市津科精细化工研究所）；柠檬酸三钠（Acros 公司）：乙二胺四乙酸二钠（J T Baker Chemical co）；甲醇（DIKMA 公司）：乙腈（DIKMA 公司）：脑微透析灌流液为复方氯化钠注射液（北京双鹤药业股份有限公司）：所用水均为重蒸水。1.3 仪器 美国BAS4100型大鼠脑立体定位仪：CMA／12探针及探针套管；CMA／120清醒动物装置：CMA／402微量泵；CMA／150低温样品自动收集器。Esa 公司5600A型输液泵：Esa公司5600A 型输液泵：Esa公司542型自动进样装置；Esa公司 CoulAr-ray电化学检测器：玻璃碳工作电极和Ag／AgCl参考电极：C18色谱柱（DIKMA 公司，ODS 5 μm．150mmx4.6 mm）：CoulArray win 色谱工作站（Exa公司）：漩涡混旋器（QL-861型）；台式酸度测定仪（HAN-NA211型）；台式高速离心机（XYJ-2型）。2 方法2.1 动物分组及给药 大鼠30只，随机分为5组：①对照组（Control）：生理盐水1ml·kg-＇·d-1：②模型组（Model）：生理盐水1ml·kg＊1·d＂1：③模型＋川芎嗪（CXQ）30 mg·kg＊＇·d＂＇：④～⑤模型＋ECH 高、低剂量组（ECHB，ECHS）：30.15mg＊kg＊·d：各组动物均腹腔注射给药7d。2.2 造模方法和微透析 每只大鼠均于给药第3天埋置套管：将大鼠用10％水合氯醛（3.5ml·kg“）麻醉，固定于BAS 4100脑立体定位仪，参照George Paxinos《大鼠脑立体定位图谱》将探针导管植入左侧纹状体（坐标 AP：＋0.2 mm；ML：-3.0mm：DV：-3.5mm），末次给药1h后麻醉，采用杨赞章改进 Longa线拴法制作大鼠大脑局灶型脑缺血模型（MCAO模型）。对照组鱼线仅插入10mm，其余步骤同手术组。造模后在清醒自由活动状态下插入微透析探针，用Ringer液以1.5μl·min-的速度灌流，4℃下收集脑微透析液，20min收集1管透析液。每管透析液收集完毕后均立即置于-20℃冰箱保存，并在透析结束后转存-70℃冰箱，择日测定。探针在使用前做回收率测定，用于折算透析液中各单胺类神经递质的浓度。2.3 HPLC-ECD分析 流动相配置：测定流动相每升含0.15 mol·L-＇柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液829 ml；0.1 mol·L-＇乙二胺四乙酸二钠1ml；甲醇150 ml；1-烷基硫酸钠0.283g。设定流动相流速为0.7ml·min-＇，柱温箱温度为28℃。电化学检测器工作电压为：200 mV、400 mV．600 mV，分别为2、3、4通道；增益为2nA。进样量为25μl。标准曲线用0.025、0.05、0.1、0.2、0.5mg·L＇的梯度含混合标准溶液绘制。SPSS 13.0 统计软件做重复测量数据的方差分析。3 结果Fig1～6描绘了大鼠纹状体细胞外液中NE、DA．DOPAC．HIAA、HVA和5-HT水平的变化情况。从图中可以看出，脑缺血后，纹状体细胞外液单胺类神经递质存在代谢紊乱，各递质含量均有所升高，在一定范围内，随缺血时间的延长而升高的更加明显。在缺血90min时，纹状体细胞外液DA、NE 浓度可达对照组水平的3倍之多。对照组的NE、DA、DOPAC、HIAA、HVA 和5-IT水平由高渐低，其原因可能与结扎其左侧颈总动脉后，左脑暂时性缺血及插入探针时产生的损伤有关。从变化的曲线上看，ECH与CXQ均可降低脑缺血后DA、DOPAC、HIAA、HVA和5-IT的达峰浓度，CXQ与高剂量的ECH较为明显。各递质时程曲线下移说明ECH可抑制脑缺血大鼠脑内神经递质及其代谢产物的升      Fle 1 Elect of ECH os estraceBular level of NE in striatum of rats      Flg 2 Ellect of ECH en estracelular level 4 讨论脑缺血引起的脑损伤机制较为复杂。在脑缺血情况下，脑内单胺类神经递质发生素乱，NE、DA、5-HT含量明显降低，脑缺血越重，脑组织NE、DA、5-HT含量就越低吗。而脑内微透析法证明，脑缺血时单胺类神经递质含量在细胞外液中升高，持续整个缺血期，且随着缺血时间延长而进一步上升，实验结果与报道一致。ECH是从新疆特色植物药德赢vwin登录 中分离、纯化的一种苯乙醇苷类有效成分。其具有抗衰老、改善学习记忆、抗神经元凋亡等多种神经保护作用。本研究采用国内较先进的脑微透析联用HPLC-ECD检测技术，初步探讨ECH 对各脑缺血实验大鼠纹状体细胞外液中单胺类递质及其代谢产物的影响，结果表明，ECH可降低由脑缺血所致的纹状体细胞外液中单胺类神经递质的升高作用，具有较好的改善脑缺血组织的损伤作用。本实验研究结果发现，模型所致的脑缺血损伤可使细胞外液中DA．NE和5-IT的含量升高，变化的幅度与缺血的时间和程度呈正相关。与此同时，其酸性代谢产物DOPAC.HVA，HIAA也随之升高。这是由于脑缺血时，脑组织供血供氧减少，细胞内能量耗竭，神经递质再摄取受到抑制；另一方面单胺氧化酶活性下降，递质降解减少，二者致使单胺类递质及代谢物蓄积在细胞外，进而产生脑缺血性神经损害作用。在ECH和CXQ作用下，脑缺血大鼠纹状体细胞外液中 DA．5-HT、HVA、HIAA 及DOPAC 水平均明显下降，此可能是由于ECH和CXQ抑制了缺血期DA、和5-HT的过量释放，减轻了DA、和5-HT合成、存储和再摄取的代谢障碍，进而起到了脑神经保护作用。我们的实验从ECH对脑内单胺类神经递质影响，初步探讨ECH抗脑缺血的作用机制，为临床应用和深入的科学研究奠定了新的理论依据。

摘要：目的 观察松果菊苷对MPIP致小鼠帕金森病（PD）模型中对动物行为学和对黑质纹状体组织蛋白表达的影响在蛋白质水平探讨松果菊苷的多巴胺能神经元保护作用机制，方法 以MPIP损伤建立C37BL／6小鼠 D模型 通过自主活动实验和滚简实验观察动物行为学表现，用双向电泳、图像分析、质谱鉴定等蛋白质组学技术研究松果菊苷对MPTP致小鼠 D模型行为学的影响和黑质纹状体组织蛋白表达的变化，结果 ①经MPIP诱导，小鼠的自主活动次数，滚筒运动潜伏期均低于对照组（RK0.01）经松果菊苷（20m kg-1）预处理后，MPTP诱导小鼠的行为学表现明显改善（R0.01）②经过双向电泳及HDQUS软件分析，硝酸银染色 对照组、模型组和松果菊苷给药组分别分离出282个、269个和236个的蛋白质斑点，对一个稳定差异表达的斑点进行 MAIDLTOF质谱鉴定，数据库检索结果为胆绿素还原酶 B 结论 松果菊苷对 MPIT致小鼠 PD模型的行为学障碍具有改善作用，其神经保护作用机制可能与胆绿素还原酶 B水平降低有关。关键词：松果菊苷；MPIR帕金森病；双向凝胶电泳 胆绿素还原酶 B帕金森病（Pak hsons diease PD）是一种以选择性和进行性多巴胺能神经元变性和坏死为特征的神经退行性疾病。D患者因黑质纹状体神经递质多巴胺不足，形成特有的运动功能障碍。肉苁蓉（Heba Cisanhes）为常用的传统补益中药，具有补肾阳，益精血，润肠通便的功效。本实验室前期工作显示，其提取物苯乙醇总苷以及总苷成分中的松果菊苷（echinacosile）和类叶升麻苷均对多巴胺能神经元具有保护作用“，目前研究显示松果菊苷神经细胞保护作用可能与降低细胞内活性氧水平，抑制 Caspase-3的活性和维持线粒体膜电位的高能状态有关＂，Geng等！”研究发现肉苁蓉提取物苯乙醇总苷（其中含松果菊苷40％。类叶升麻苷10％，其它微量苯乙醇苷50％1对 MPIP锈导所致C57BL／6小鼠 PD模型的行为学改变，神经递质多巴胺降低及酪氨酸羟化酶的表达降低等均有改善作用，但其作用机制仍待进一步研究，因此，本实验应用以双向电泳技术和质谱技术为基础的蛋白质组学方法.探讨 MPIP致 C57BL／6小鼠 HD模型中松果菊苷对行为学障碍改善作用的可能机制。1 材料与方法1.1 动物 C57BL／6小鼠，含，体重 20～258由北京大学医学部试验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（京）2002-0001 12 药品 松果菊苷由北京大学医学部药学院天然药物学系屠鹏飞教授提供，从盐生肉苁蓉的乙醇提取物中分离纯化而成，纯度达到98％以上，1.3 试剂 1甲基-4苯基-123 6四氢吡啶（MPIP）以及 CHAPS丙烯酰胺／甲叉双丙烯酰胺等，为 Sina公司产品。碘乙酰胺、二硫苏糖醇（DTT）为Merk公司产品。固相 IH梯度干胶条（H3-10 7cm）．尿素、两性电解质（BiaLF H3-10等其他双向电泳试剂均购自 BiaRad公司。14 仪器 等电聚焦仪（Prosat EF SySm）垂直电泳系统（Proeane Il xicell.PDQues图像分析软件均为 BiaRad公司产品。XZ4型小鼠自主活动仪由中国医学科学院药物研究所研制，SD-2型小鼠滚筒仪由北京大学医学部实验仪器生产。1.5 动物分组与给药 C57BL／6小鼠随机分为对照组．模型组以及松果菊苷给药组（20mg-kg＇）每组15只，松果菊苷给药组连续给药14 d于 d11开始 灌胃给药前 1 1模型组腹腔注射 MPIP30 mg·kg，对照组给予等体积生理盐水，连续4d最后1次给药后 1d进行行为学指标测试．4后处死，冰上操作，分别分离和摘取小鼠黑质和纹状体，-80℃保存。16 行为学指标测定161 -般行为学观察 观察小鼠在 MPIP造模后一般行为学表现！”。1.62 自主活动实验 将小鼠放入 XZ4型小鼠自主活动仪自主活动箱中（高：13 直径：25每次同时测定 4只，每个活动箱1只1由记录仪自动记录小鼠活动，测定每只小鼠5m内活动次数＂，并采用 检验进行统计学分析。1.63 浪筒实验 使用 SD22型小鼠滚筒仪测试小鼠的滚简行为表现！”，在测试前，预先进行训练，连续2d每天 2次，转速为12Fmir，训练时间120测试时设置转速25rmir，测试小鼠从滚筒开始旋转到离开滚筒的时间作为小鼠运动潜伏期 测试时间最长为605每只小鼠测 3次取平均值，采用 检验进行统计学分析。17 差异蛋白表达鉴定1 7.1 组织蛋白 样品提取与处理 0.38小鼠黑质和纹状体组织 加入1.5m含有蛋白酶抑制剂的裂解液（7mo）·1＇尿素，40mmol-L＇TrAHCI H7.4 65 nmol-'DIT20&L' CHAPS).40 有1h后超声匀浆，匀浆后的样品在4℃．15000·mir离心1b吸取上清液，最后，用2D ckarupki试剂盒（Amerhm公司）对提取液进行处理，样品用 BCA蛋白定量试剂盒（Peroe公司）进行蛋白定量后，均调整蛋白浓度为7L．加入4倍体积的上样缓冲液（8mo）＇U208-＇CHAPS50 mmo·C' DIT2 8·C' BALyE IH3-10 0.00281＇溴酚蓝 后上样。17.2 双向电泳 双向电泳按文献”报道的方法稍加改进，取含蛋白质 100＃的样品，于50 V电压下主动水化 16 b水化结束之后，添加盐桥，升压程序依次为 250 V线性升压 30 min，500 V快速升压30 min 4 000 V线性升压3h4000 V快速升压至20 000 V．h，等电聚焦结束之后，进行胶条平衡，然后以100 V恒压进行分离胶浓度为125％（9.0 mx6.0 mx1.0mm）的十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳，以银染法”对凝胶进行染色。采用凝胶成像系统获取双向电泳图谱，以HDQues软件进行图像分析。173 蛋白质鉴定和数据库检索 比较对照组、模型组以及松果菊苷给药组双向电泳图谱，确定差异蛋白，从胶上切下置于0.5ml的EPPendor管中，按文献［1的方法处理样品，MAIDVTOF质谱分析在美国 AB公司的 Vovger BiospecronetePM worl sntjo质谱仪上进行，采用反射模式，离子源加速电压为20 KV N激光波长 337 m脉冲3 呼质谱信号单次扫描累加 50次。用标准 Make峰作为外标校正质谱峰，正离子谱测定，获得肽质量指纹图谱，根据得到的信息，利用因特网上 Mascot seachn8ine检索 NCBn数据库（hp／／www matrjxscjenog com）寻找匹配的蛋白质，并查阅其生物学功能，检索条件：分子量，等电点未作限定，检索参数设置为允许±150 PPm的误差，允许 1处酶切位点漏切种属选择为小鼠。2 结果21 一般行为学 腹腔注射 MPIP（30 mg·kr＇）后约5mp与对照组相比，模型组小鼠的一般行为表现开始发生异常，出现竖毛，举尾，呼吸加快、肌张力减退，对外环境刺激敏感，牙颤等现象，约可持续2-3b 松果菊苷给药组（20mgkg＇）症状表现较轻，持续时间较短。22 自主活动实验 实验结果显示。与对照组相比模型组活动次数明显减少（R＜0.01）与模型组相比，松果菊苷给药组活动次数明显增加（P＜0.01 F81). 23 滚筒实验 实验结果显示，与对照组相比模型组运动潜伏期明显缩短（P＜0.01）与模型组相比松果菊苷给药组滚筒运动潜伏期明显增加（P＜0.01 F82) 24 小鼠黑质纹状体组织蛋白双向电泳图谱比较对照组、模型组及松果菊苷给药组黑质纹状体组织蛋白的双向电泳图谱如F的所示，使用 PDQuestFR1 The nm ber of m[movei nis p Lpc@nape.counts wer desgay rotucel bF MPIP roment (6.1±23)when.compurdwih be comol grop(295 2±21 9) Howevg the rouein inmopr acwif was prvniol by edbacoile  Tle durjon of tne on the pmpr nd we smigang omrd I MPIP wm( 3.3±27)ommpand wgh be coml grup (52.2±5.6%buuthin deiawspewael W chhacosge pr.s 软件对3张 2-DE图谱进行比较分析，3者的蛋白斑点数分别为对照组282个、模型组 269个以及松果菊苷给药组236个，对照组与模型组斑点匹配率为71％，松果菊苷给药组与模型组斑点匹配率为67％，蛋白斑点主要集中在 Pls-9 MW8-100 ku的区域，对3个不同对照组小鼠黑质纹状体组织蛋白双向电泳图谱进行比较，选出了1个多次重复试验中变化差异有显著性的蛋白斑点，进行进一步的实验分析，该蛋白斑点以箭头标出（FE3）该蛋白在对照组和松果菊苷组表达量较少，而在模型组表达较高，F84显示了使用 HDQues软件对 3次实验中该差异蛋白相对含量检测值进行 检验统计学分析的结果。ComDl(A)MPIP.eand(B)and chimcoe Pr.eament (C)mks vinatnol W sgwr sepygand mpgol ng pnsofbe rspee The poen Pdkaed IF be arrows echbind pbst d@camces in xpes sgn among the broe grospy The exmcn wer sepa miol b usink PG Kel (H3-10 7 m) n be Srt Pbae nd 12.5% Popacrinile gln be seoond Plase SDS.PVGE San Plel Porjn we no Kp meel  FiK4 Quan sntse change of te Pdkard Prorp(*±/n=3) The repatpe abindance of be indicntal Poep was sEnifganty in cmard  MPP.rond up(427±32) omn pured wih he cotol g(117±71 bet bis hcrase was rejucnd n be ecinacose pr. 25 质谱分析 对选出的差异蛋白进行 MAIDLKF分析，得到其肽质量指纹图谱（FB5）根据所得肽质量指纹图谱数据，通过 Mascot seach enghe检索 NCBP数据库，查询与之相匹配的蛋白，结果为胆绿素还原酶 B（bilverdin rejuctase B） MW22.297 kg P］6.49匹配肽段详见 F863 讨论肉苁蓉是中医补益药物中的常用品种，属列当科肉苁蓉属植物 始载于《神农本草经》列为“上品”，具有补肾益精，润肠通便之功效，主治男子阳痿、女子不孕等证，近年来研究显示肉苁蓉及其所含的一些化学成分具有神经保护作用，对帕金森病及脑卒中等神经系统疾病防治显示出明显疗效，这使肉苁蓉及其有效成分研究成为了中医药研究领域的热点之一，松果菊苷是从肉苁蓉中分离，纯化的一种苯乙醇苷类化合物。目前的研究表明，它可能通过降低细胞内活性氧水平，抑制 Caspa3的活性和维持线粒体膜电位而发挥其神经细胞保护作用，为进一步研究该成分的神经保护作用，本实验以MPIT致小鼠多巴胺能神经元损伤为 PD模型，利用双向电泳技术以及质谱技术为基础的蛋白质组学方法，探讨松果菊苷在多巴胺能神经元损伤过程中保护作用的可能机制，寻找其在蛋白质整体表达水平上的作用靶点。为开发具有抗 PD作用的天然药物提供实验依据。通过比较分析 3个不同处理组间黑质纹状体组织的蛋白表达图谱，找到了1个在多次重复试验中变化差异有显著性的蛋白斑点，这个蛋白可能与多巴胺能神经元损伤过程及松果菊苷的神经保护作用机制相关，我们对该斑点进行了质谱鉴定，并对质谱数据进行了数据库检索，结果表明这个蛋白斑点与胆绿素还原酶 B相匹配。胆绿素还原酶 B作为一种丝氨酸苏氨酸激酶能够利用 NAD（P）H将亚铁血红蛋白（Fe PIDRQPorPhyrin K）在亚铁血红素加氧酶（heme oxygenmHO）系统作用下的产物胆绿素还原为胆红素场，目前还没有该蛋白与 PD或 PD动物模型有关的报道。然面，已有研究显示该酶的作用产物胆红素是一种抗氧化剂，可能作为生理上的抗毒剂而起作用1＂，实验结果显示，与对照组相比，胆绿素还原酶 B在模型组表达上调，而在松果菊苷给药组胆绿素还原酶 B表达上调的现象明显减轻，联系其抗氧化作用，我们推测，这可能与松果菊苷抗多巴胺能神经元氧化应激损伤有关。在MPIP致小鼠H模型中，MPIP在单胺氧化酶 B的作用下，变成离子形式的 1甲基4苯基吡啶（1-meth／14-Phenxridnin MPP1有研究显示 MPP可能通过线粒体途径或其他方式产生活性氧（reactive oxygenPcc ROS而介导神经毒性！”，这可能激发胆绿素还原酶 B的过量表达，使其具有抗氧化作用的产物胆红素产生量增加，发挥抗氧化作用，而松果菊苷给药后，可以减少胆绿素还原酶 B的过量表达提示松果菊苷在预防给药中，可能通过其抗氧化应激作用，减低了氧化应激导致的胆绿素还原酶 B升高的水平，保护多巴胺能神经元免受氧化应激损伤。然而，胆绿素还原酶 B与 PD发生之间的关系及松果菊苷的详细作用机制还有待于进一步研究。

田枫张阔 康爱君 姜勇 周淑佩 郑振辉（1．北京大学医学部实验动物科学部 北京 100083)（2 北京大学现代中医药研究中心，北京 100083）摘要：目的 探讨松果菊苷对SAM-P／8小鼠学习记忆能力的影响，方法 以SAM-P／8小鼠为对象，给予松果菊苷连续灌胃301用化学比色试剂盒法测定脑组织总蛋白含量，总抗氧化能力和乙酰胆碱酯酶活性，用放免法测定血清中1-2含量，结果 松果菊苷能显著提高脑组织总蛋白含量，总抗氧化能力．降低乙酰胆碱酯酶活性及血清中11-2含量，结论 松果菊苷可能通过降低SAM-BV8小鼠脑组织氧化损伤改善其学习记忆能力。关键词：松果菊苷；快速老化模型小鼠；学习记忆中图分类号：R285 5 文献标识码：A 文章编号：1006-6179（2006）02-0014-02松果菊苷是菊科多年生草本植物，含有多种药用有效成份。包括多糖、糖蛋白和烷基酰胺等＂，松果菊苷的治疗用途十分广泛，包括对免疫系统的增强作用、抗癌作用、抗氧化作用等”，目前国内对松果菊苷改善记忆学习能力的作用尚无报道。SAM小鼠包括快速老化的P系（senesomoe-acoeleratedmousrproe，SAM-P）和抗快速老化的R系（seneseence-acoeleated mouse-resistant，SAM-R），其中 SAM-P／8亚系主要以学习记忆功能呈增龄性加速衰退为主要特征，而且脑内具有APP及β-淀粉样蛋白含量升高等病理变化。因此SAM-P／8小鼠被认为是研究AD（老年痴呆症）较为理想的动物模型，常用于老年痴呆的致病机理及抗老年痴呆药物的筛选研究，本文以SAM-P／8小鼠为研究对象，初步探讨松果菊苷改善其记忆学习能力的作用机制。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 实验动物：快速老化痴呆模型小鼠SAM-P／8．及抗快速老化模型小鼠SAM-R／1由北京大学医学部实验动物科学部供给，实验中使用8月龄SAM-P／8小鼠12只，雌雄各半；8月龄SAM-R／1小鼠6只，雌雄各半。1.1.2 实验药物：中国传统中药肉苁蓉提取物松果菊苷由北京大学现代中医药研究中心提供。113 试剂：总蛋白试剂盒、总抗氧化能力试剂盒，乙酰胆碱酯酶试剂盒由南京建成生物工程研究所提供；IL-2标准放免试剂盒由中国人民解放军总医院科技开发中心放射免疫研究所提供。12 方法及检测指标121 动物分组及给药方法：SAM-P／8小鼠12只随机分为试验组和模型组，每组6只；6只 SAM-R／I小鼠作为正常对照组，共3组，SAM-P／8试验组按松果菊苷50mgkg小鼠体重的剂量灌胃；SAM-P／8模型组和SAM-R／1正常对照组均用等体积蒸馏水灌胃，每日给药1次．连续30d，122 标本制备及指标检测：①脑组织总蛋白含量、总抗氧化能力、乙酰胆碱酯酶活性的测定：实验进行第31d灌胃后30min断颈处死小鼠，立即取脑组织，用冷生理盐水冲洗后称重，于09％冰冷生理盐水中进行冰浴匀浆，制成10％脑匀浆液，4℃3000 ／min 离心 10min，取上清液，用化学比色法测定脑组织总蛋白含量、总抗氧化能力、乙酰胆碱酯酶活性，测定方法按试剂盒说明操作，②血清IL-2水平的测定：从小鼠内眦取血，10 000r／min 离心 10min，分离血清，用全自动Y谱仪放射免疫分析技术测定血清IL-2含量，测定方法按试剂盒说明进行操作。123 统计方法：各项数据以x±s表示，各组间差异显著性统计采用SPSS 10.0 for windows 统计软件进行分析，以P＜0.05为显著性差异水平。2 结果2.1 松果菊苷对SAM-P／8小鼠脑组织总蛋白含表1 松果菊苷对SAM-P／8小鼠脑组织总蛋白含量，总抗氧化能力，乙酰胆碱酯酶活性的影响（X±x）组别（n＝6）总蛋白含量总抗氧化能力乙酰胆碱背酶活性(mg/nD)(U/mg)(L/mg)SAM4V8模型组153.70±72 193.40±1.280.53±0.42SAM-IY8 松果试验组253.24±52.33**4.91±0.36*10 0F910SAM-R／I 正常对照组266.98±39 00**4.97±0.52"0.15±004*＊与SAM-P／8模型对照组相比。P＜005”与SAM-Ir8模型对照组相比。P＜O．O．2.2 松果菊苷对 SAM-P／8小鼠血清IL-2水平的影响如表2所示模型组IL-2明显升高，而松果菊苷实验组IL-2水平较模型组明显降低。两组间有显著性差异，而与SAM-RV1正常对照组间无差异。表2 松果菊苷对SAMP／8小鼠血清11-2水平的影响（天土x）组别（n＝6）1-2(m/ml)SAM-PV8模型组104±0.08SAM-8松果试验组092±0.09*SAM-IVI 正常对照组091±0.10*＊与SAM-P／8模型组相比P＜06．3 讨论SAM P／8松果菊苷组脑组织总蛋白含量、总抗氧化能力较模型组明显升高，乙酰胆碱酯酶活性降低，两组间有显著性差异（P＜0.05）。松果菊苷组与SAM-R／1正常对照组间无显著差异（表1）。药理研究表明，松果菊苷在抗衰老，抗氧化、益智等方面具有广泛的生物活性”，如松果菊苷具有抗氧自由基作用，可阻止胶原蛋白降解，另外松果菊苷醇提取物可刺巨噬细胞产生大量免疫增效因子，如肿瘤坏死因子、白介素I、II、VI.X等＂，但是白介素I等又是炎性介质之一，机体内适量的免疫增效因子可使免疫反应维持着机体的稳定；白介素日等过多可能又使机体发生病变如炎性反应。我们的实验结果表明松果菊苷单体有明显抑制 SAM-P／8小鼠体内白介素II产生，故推测松果菊苷可能是一个有效的抗炎性药物 但需要进一步探讨。对中药提取物单体益智作用的研究并不多见本试验发现松果菊苷单体可显著提高SAM-P／8小鼠脑组织总蛋白含量、总抗氧化能力，降低乙酰胆碱酯酶活性及血清中白介素II含量，并且上述指标与SAM-R／1正常对照小鼠无显著差异，实验结果不仅提示SAM-P／8小鼠是研究老年痴呆致病机理及其药物筛选的良好动物模型，而且提示松果菊苷可能通过提高中枢胆碱能系统的功能，提高总抗氧化能力，促进蛋白质和核酸合成，调节免疫状态而提高SAM-P／8小鼠的学习记忆能力，很可能是一种良好的抗痴呆药物。

齐晓岚＇，肖海涛，肖 雁＇，郝小燕，官志忠”（1．贵阳医学院分子生物学重点实验室，贵州贵阳 550004；    2．贵阳医学院药学院·贵州 贵阳 550004;    3．贵阳医学院病理学教研室，贵州 贵阳 550004）摘要：目的 研究肉苁蓉活性成分松果菊苷及异麦角留苷对神经母细胞瘤（SH-SY5Y）细胞神经型尼古丁受体表达的影响及其对抗β淀粉样蛋白（Aβ）神经毒性作用机制，以了解其神经保护作用机制，方法 比色法测定细胞 MTT还原率筛选松果菊苷及异麦角留苷安全浓度范围，并用Aβ-ss处理细胞后，测定 MTT还原率，蛋白质印迹法（Western blot）测定尼古丁受体α3．a7蛋白表达的变化，结果 松果菊苷及异麦角甾苷能提高细胞a3及a7 神经型尼古丁受体亚单位蛋白质表达水平，呈剂量依赖关系：并能对抗Aβs-g引起的a3和a7受体亚单位蛋白质水平降低，减弱AB2-w引起的细胞损伤，结论 松果菊苷及异麦角甾苷可能通过上调神经型尼古丁受体亚单位蛋白来发挥神经保护作用，在阿尔茨海默氏病的治疗中可能起到一定作用。关键词：松果菊苷；异麦角甾苷；尼古丁受体；β-淀粉样蛋白： SH-SY5Y细胞：DOI标识：dai：10.3969／j．issn．1008-0805.2011.07.006        中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1008-0805（2011）07-1561-03阿尔茨海默氏病（Alheimer＇s dsease，简称 AD）是一种主要在老年期发生的以进行性痴呆为主要特征的神经元退行性变疾病，其主要临床表现为进行性认知功能障码，记忆力衰退、性格和行为改变等［0.2］。病理学上以脑细胞内神经原纤维缠结及细胞外老年斑形成为主要特征，老年斑的主要成分为β-淀粉样蛋白（β-amyloid peptide，Aβ），是一种神经毒性物质，可以引起神经元的损伤和死亡，是AD发病过程中的个重要因素，能促进AD的发生和发展。尼古丁乙酰胆碱受体（Nicotinie acetylcholine receptor. nAChR 或称尼古丁受体）与学习和记忆等认知功能密切相关，并具有明显的神经保护作用。在较早的一些研究中就发现，AD患者大脑皮层尼古丁受体出现持续和严重的丢失，大脑皮层nAChR 缺失与AD患者认知障码有显著的相关性。由于AD的发病机制复杂，目前尚无有确切疗效的治疗药物。中医药在延缓衰老以及防治痴呆等相关疾病方面有着丰富的理论和实践经验，具有潜在的优势和广阔的发展前景。肉苁蓉作为一种著名的补益药，在延缓衰老，增强机体免疫功能、激活超氧化物歧化酶活性和降低体内脂褐素堆积方面都有着重要的作用，有“沙漠人参”之美誉，其主要活性成分为苯乙醇苷类化合物回，其中松果菊苷（echinaroside，ECH）及异麦角晶苷（isnacte-oside，CAS）是肉苁蓉总苷的主要成分，本研究用ABg-m处理来源于人脑的神经母细胞瘤（SH-SY5Y）细胞作为研究对象，以研究ECH及CAS神经保护作用机制。1 材料肉苁蓉来源于新疆的德赢vwin登录 Ciatanch tubulasa（Schenk.）R.Wight.D-MEM 培养液购自 Gibon Invitrogrn 公司 （英国）；源于人脑的神经母细胞瘤细胞株（SH-SYSY 细胞）购于Geman Callection of Microorganisms and Cell Culture 公司（德 国）：羊抗a3．a7及鼠抗-肌动蛋白（β-actin）多克隆抗体及HRP标记的抗羊及抗鼠二抗购自 Santa Cru Biodechnology le（美国）。聚乙烯二氟（PVDF）展、ECL.-Plus发光试剂、高效显影胶片购自 Amerhum公司：其它化学试剂均购自 Sigma公司。2 方法2.1 松果菊苷及异麦角甾苷的提取 取肉苁蓉粗粉3kg，用10倍量的水提取3次，2h／次，合并煎煮液，滤过，滤液浓缩至相对密度约为1.1（70-80℃）的浸膏，在搅拌下加入乙醇，醇沉质量分数为70％，沉淀24h，取上清液，滤过。滤液回收乙醇并浓缩至相对密度约1.2（70-80℃）的浸膏乙醇。取浸膏加水分散，用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇分别萃取。回收溶媒得石油醚萃取物（ASP），醋酸乙酯萃取物（ASE），正丁醇萃取物（ASB），余下水层回收溶媒后得水部分（ASW）。正丁醇萃取物（ASE）上Sephadex LH-20，用氯仿-甲醇（1：1）洗脱，薄层点板跟踪，合并12-15流份，经微品纤维素柱层析，用醋酸乙酯：甲醇：水（30：1：0.5→1：1：0.5）洗脱·低温减压回收溶剂得异麦角甾苷粗提物；经HPLC半制备分离〖Wa-ters 2475，Sun FireM-C，10μm，10mmx150 mm柱）；柱温：室 理细胞后，可减弱AB-w对细胞的毒性作用。AB组与松果菊苷温：检测波长：335 mm；流动相：43％甲醇：流速：2.00ml／min］得到化合物异麦角甾苷（27mg）。松果菊苷（8mg）。2.2 细胞培养，β-淀粉样肽及肉苁蓉的处理 先用含15％胎牛血清的 DMEM 培养液培养SH-SY5Y细胞，待细胞生长稳定后，改用不含血清的 DMEM 培养液继续培养，培养箱中含5％CO2＋温度为37℃。在SH-SY5Y细胞中加入10 μmol／L的Aβs-5＊培养48h。为观察松果菊苷及异麦角甾苷对ABs-m毒性作用的影响，先分别加入80 μmol／L松果菊苷及异麦角甾苷培养24h后·再加入Aβs-s培养48h。每一实验组均设3个复孔，重复3次实验。2.3 3-4,5-二甲基噻唑-2.5-二酚四唑澳化物3-（4,5-dimethylbiaaol-2-yl)-2,5-dipbeayletraaolium bromide,MTT] 测定 为筛选松果菊苷及异麦角甾苷的安全浓度，选择0.5.10，20.40,80,160,200.300 μmol／L浓度处理SH-SY5Y细胞后24h 后测定 MTT还原率，以检测其对细胞是否具有毒性作用及其安全浓度范围。2.4 细胞分组诱导及相应的药物干预 ①正常对照组：不经药物处理，培养期为48h。②Aβ处理组：在培养的细胞中加入10μmol／L．Aβs-w，培养时间为48h（Aβs-s用PBS溶解后，37℃孵有72h）。③单纯化合物单体理组：加入20.40,80.160 μmol／LECH及CAS 培养48h。加入80 μmol／LECH及CAS培养24,48及72h。④化合物单体和Aβ处理组：先加入80 μmol／LECH及CAS预培养24h后，再按照Aβ处理组方法进行处理。2.5 药物处理后MTT还原率测定 向96孔细胞培养板中，加入一定数量（约1x10＃／孔）待检测细胞，分组药物处理细胞后测定MTT水平。2.6 尼古丁受体亚单位蛋白表达测定 参照Guan等的方法进行提取细胞膜蛋白及用蛋白印迹（Western blotting）方法检测尼古丁受体亚单位a3、a7亚单位蛋白水平。以Bandscan软件分析结果时以β-actin 蛋白条带作为内参照，计算a3、a7蛋白条带与β-actin蛋白条带像素灰度的百分比值作为a3．a7基因蛋白质表达的相对水平比。2.7 统计学分析 每组所得结果用±＊表示，结果用SPSS12.0统计软件进行单因素方差分析。P＜0.05或P＜0.01表示差异有显著性或高度显著性意义。3 结果3.1 松果菊苷及异麦角區苷安全浓度筛查 见表1．松果菊苷及异麦角甾苷的浓度等于或大于200 μmol／L时，SH-SYSY神经细胞MTT还原率出现降低，表明样品浓度等于或大于200μmal／L时明显降低细胞增殖能力，具有一定的细胞毒性作用在0-160μmol／L范围时细胞MTT还原率无明显变化，表明该浓度对细胞毒性作用较小。因此选择此浓度范围研究药物选用浓度。大量研究已经证明在AD脑组织中老年斑的主要成分 Aβ是由其前体蛋白（APP）经β-和γ-分泌酶水解后形成的，具有一定的神经毒性作用，近来也有研究表明，AB的损伤作用是AD发生发展的首要因素，其损伤机制之一是通过增强氧化应反应和释放自由基产物，从而引起神经元受损。本研究Aβs-s处理来源于人类的SH-SYSY神经细胞，模拟AD患者内神经细胞的病理过程，以此作为肉苁蓉主要成分松果菊苷及麦角留苷体外研究的类 AD细胞模型。研究结果显示，与对照相比，AB2s-3s处理组SH-SY5Y神经细胞的 MTT还原率明显低，进一步证实ABs-8可引起神经细胞的损伤。松果菊苷及异麦角留苷预处理的SH-SY5Y神经细胞能够对抗Aβs-3s引起MTT 还原率降低，进一步表明松果菊苷及异麦角甾苷具有Aβs.s引起的神经细胞毒性的作用。神经型尼古丁受体是神经系统中一类非第二信使介导性经递质结合的离子通道，与学习和记忆关系密切，是一类明确自具有神经保护功能的受体，其减少与AD的发生有关。AD病脑内神经型尼古丁受体-配体结合率降低，其亚基的蛋白表达平也降低回，目前寻找可上调nAChR受体表达且副作用小的物是治疗 AD药物研究的方向之一。在SH-SY5Y 神经细胞中3和β7是主要的尼古丁受体亚类，本研究中，通过测定a3a7 nAChR 蛋白水平发现，Aβs．w能够明显降低a3．a7亚单位白的表达。松果菊苷及异麦角甾苷能够明显地上调a3和nAChR 蛋白的表达水平，且能对抗Aβs-w所导致a3．a7亚单蛋白的表达降低。这样的作用说明在治疗 AD 药物的选择中苁蓉可能具有重要的作用。综上所述，松果菊苷及异麦角甾苷具有上调a3．a7 nACh蛋白表达的作用；可对抗AB引起的 nAChR表达降低；松果菊及异麦角甾苷在细胞整体水平有抗Aβ的神经细胞毒性作用，作用机制可能与其刺激 nAChR表达有关，肉苁蓉可能在AD中药治疗中发挥重要作用。

［摘　要］ 为探索德赢vwin登录 活性成分多糖的最佳提取方法‚初步评价其抗氧化活性‚分别采用超声-微波协同萃取、微波、水浴及超声波4种不同方法提取德赢vwin登录 中的粗多糖‚并对其清除DPPH 自由基的效果进行了初步研究。结果表明‚超声-微波协同提取效果最佳‚其次是微波、水浴和超声波。德赢vwin登录 粗多糖的最佳提取条件为：提取温度95℃‚提取时间180min‚料液比1∶20。德赢vwin登录 粗多糖对DPPH 自由基具有较好的清除作用［关键词］ 管花肉苁。蓉；粗多糖；超声-微波协同萃取；DPPH中药肉苁蓉（Cistanche deserticola Y．C．Ma）为列当科肉苁蓉属植物‚由于药源紧缺‚本属其他种也在各地使用。德赢vwin登录 主产于我国新疆‚分布于南疆的塔克拉玛干沙漠周围‚资源丰富‚为目前中药肉苁蓉的主要基源植物［1］ 。随着肉苁蓉需求量的急剧增长‚其自然资源受到掠夺式的采挖‚现已被列为我国濒危保护植物［2-3］ 。近年来‚很多学者开展了肉苁蓉活性成分多糖的研究‚但对德赢vwin登录 的研究主要集中在苯乙醇苷类成分方面［4-6］ ‚对多糖的研究较少‚尤其是超声-微波协同提取多糖及清除DPPH自由基方面的研究尚未见报道。多糖作为德赢vwin登录 活性成分之一‚对其提取方法进行探讨尤为重要‚笔者旨在通过对超声-微波协同萃取、微波、水浴及超声波4种不同方法提取德赢vwin登录 粗多糖效果的比较‚确定最佳提取方法‚并初步确定最佳方法提取条件‚同时通过清除DPPH 自由基试验初步评价德赢vwin登录 多糖的抗氧化活性‚以期为德赢vwin登录 多糖的进一步研究提供依据。1 材料与方法1．1 材料、仪器与试剂1．1．1 材料德赢vwin登录 于2008年11月采自新疆塔里木盆地‚经塔里木大学植物科学学院邱爱军老师鉴定为Cistanche tubulosa （Schenk ） R．Wight。1．1．2 仪器SartoriusBS210S 电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）‚723分光光度计（上海光谱仪器有限公司）‚DZF-6021型真空干燥箱（上海精宏实验仪器设备有限公司）‚CW-2000型超声-微波协同萃取仪（上海新拓微波溶样测试有限公司）‚WTS03-1型微波提取设备（中国南京杰金微波设备有限公司）‚SK3200LH 超声波清洗器（上海科导超声波仪器有限公司）‚HH-S 型恒温水浴锅（江苏省金坛市医疗仪器厂）‚RZ52-99型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。1．1．3 试剂葡萄糖（上海山浦化工有限公司）‚蒽酮（上海山浦化工有限公司）‚二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）（Sigma 公司）‚无水乙醇（洛阳市化学试剂厂）‚浓硫酸（乌鲁木齐化学试剂厂）‚均为分析纯。1．2 试验方法1．2．1 标准曲线的绘制参照赵小亮等［7］ 方法制备标准溶液‚于620nm 处测定吸光度‚以葡萄糖浓度为横坐标（C）‚以吸光度为纵坐标（A）绘制标准曲线。1．2．2 德赢vwin登录 粗多糖的提取将德赢vwin登录 阴干粉碎‚过40目筛‚称取一定量‚用95％乙醇回流去除色素及脂溶性杂质‚残渣挥干溶剂备用。分别采用超声-微波协同萃取、微波、超声波及水浴法提取德赢vwin登录 粗多糖。水浴法：取次干粉5．000g‚加蒸馏水50mL‚85℃水浴提取1h‚2次重复‚合并滤液‚定容至100mL‚备用。其余3种方法除辅以超声、微波手段外‚料液比、提取时间、提取温度皆同水浴法。1．2．3 德赢vwin登录 粗多糖含量的测定取1．000mg／mL样品溶液按标准曲线制备方法‚在2h内测定其吸光度‚计算德赢vwin登录 粗多糖含量。粗多糖含量／％＝（C ·D ·f／W ）×100‚其中‚C 为多糖质量浓度（mg／mL）‚D 为稀释因素‚f ＝0．4167‚W 为样品质量（mg）。1．2．4 不同因素对德赢vwin登录 粗多糖提取率的影响1） 提取温度。考察65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃条件下德赢vwin登录 粗多糖提取率‚其他条件：料液比1∶10‚提取时间1h。2） 提取时间。考察提取时间为60min、90min、120min、150min、180min、210min、240min、270min时德赢vwin登录 粗多糖提取率‚其他条件：料液比1∶10‚提取温度85℃。3） 料液比。考察料液比为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40时德赢vwin登录 粗多糖提取率‚其他条件：提取温度85℃‚提取时间1h。1．2．5 德赢vwin登录 粗多糖对DPPH 自由基的清除效果分别取2mL 不同浓度的德赢vwin登录 粗多糖溶液‚各加入0．0002mol／LDPPH 溶液2．0mL‚摇匀‚黑暗中放置30min‚以60％ 乙醇为空白‚在517nm 下测定吸光值A样品‚同时测定2．0mL 粗多糖溶液与2．0mL60％乙醇混合液吸光度值A对照‚再测定2．0mL DPPH 溶液与2．0mL60％乙醇吸光度值A空白。清除率／％＝［1－（A样品－A对照）／A空白］×100运用Graphpad Prism5．0软件计算IC50（半抑制率）。2 结果与分析2．1 标准曲线的绘制按1．2．1方法绘制标准曲线‚得回归方程A ＝0．0162C＋0．0042‚r＝0．9992。表明‚葡萄糖浓度在25．08～100．3μg／mL 范围内与吸光度线性关系良好。2．2 提取方法的比较由表1可知‚超声-微波协同萃取效果最好‚其次是微波、水浴及超声波法。微波具有穿透加热的特性‚可被极性溶剂（如水等）选择性吸收‚从而被加热‚适于水溶性多糖的提取。超声波萃取可加速介质质点运动‚其空化作用可加速有效成分的浸出‚振动匀化‚使样品介质内各点受到的作用一致‚萃取更均匀。超声-微波协同萃取法兼有超声和微波提取的优点‚可加速目标物从固相进入溶剂的过程［7］ 。此外‚微波较水浴、超声波提取效果好‚可见微波的穿透加热在多糖提取过程中发挥了重要的作用。超声波提取效果尚不如水浴提取‚可见温度也是多糖提取中重要的影响因素。2．3 不同因素对德赢vwin登录 粗多糖提取率的影响由图示可见‚随着提取温度的升高‚粗多糖提取率逐渐提高‚至95℃达到最高（13．01％）‚之后逐渐下降‚这可能是温度过高导致杂质溶出量增多所致；随着提取时间的延长‚粗多糖提取率逐渐提高‚至180min 达到最高（13．37％）‚之后开始下降‚这可能是因为时间过长‚增加了其他干扰物质的溶出‚抑制了粗多糖的提取；粗多糖提取率随着料液比的升高而提高‚1∶20时达到最高（13．45％）‚随后粗多糖提取率随料液比的升高而下降‚这说明增大料液比有利于提高粗多糖提取率‚但料液比过高不利于粗多糖的提取。根据以上结果得出‚德赢vwin登录 粗多糖提取的最佳工艺条件为提取温度95℃、提取时间180min、料液比1∶20。2．4 德赢vwin登录 粗多糖对DPPH 自由基的清除效果由表2可以看出‚在一定浓度范围内‚DPPH 自由基清除率与粗多糖浓度呈正相关。当德赢vwin登录 粗多糖浓度为200μg／mL 时‚德赢vwin登录 粗多糖对DPPH 自由基的清除率达76．2％‚IC50为79μg／mL。3 讨论笔者首次运用超声-微波协同萃取法从德赢vwin登录 中提取粗多糖‚并对其含量进行测定‚粗多糖提取率较传统的水浴法提高了1．28％。与微波、超声波、传统的水浴提取法相比‚超声-微波协同萃取法可使样品介质内各点受到的作用一致‚降低目标物与样品基体的结合力‚加速目标物从固相进入溶剂的过程‚提取效果最好‚可作为德赢vwin登录 粗多糖提取的首选方法。温度、时间、料液比对德赢vwin登录 粗多糖的提取率均有较大影响‚最佳提取条件为：提取温度95℃‚提取时间180min‚料液比1∶20‚可为其工业化生产提供理论依据。德赢vwin登录 粗多糖具有较强的清除DPPH 自由基的能力‚说明肉苁蓉及德赢vwin登录 多糖可能通过清除机体内自由基‚从而起到延缓衰老的作用‚这与薛德钧等［8］ 的研究结果一致。［参考文献］［1］ 蔡鸿‚鲍忠‚姜勇‚等．不同产地德赢vwin登录 中有效成分的定量分析［J］．中草药‚2007‚38（3）：452-455．［2］ 屠鹏飞‚何燕萍‚楼之岑．肉苁蓉类药源调查与资源保护［J］．中草药‚1994‚25（4）：205-208．［3］ 傅立国．中国植物红皮书－－－稀有濒危植物［M］．北京：科学出版社‚1991：502．［4］ 杨太新‚张喜焕‚蔡景竹．德赢vwin登录 松果菊苷次生代谢部位研究［J］．中国中药杂志‚2007‚32（24）：2591-2594．［5］ 任　璐‚顾小红‚汤　坚‚等．栽培德赢vwin登录 中苯乙醇苷的乙醇提取工艺［J］．食品与生物技术学报‚2006‚25（3）：33-36．［6］ 陈　敏‚肖苏萍‚崔光红‚等．德赢vwin登录 中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量测定［J］．中国中药杂志‚2005‚30（11）：839-841．［7］ 赵小亮‚白红进‚汪河滨‚等．杜梨果实多糖提取方法及含量测定的研究［J］．西北农业学报‚2007‚16（4）：279-281．［8］ 薛德钧‚章明‚吴小红‚等．肉苁蓉抗衰老活性成分的研究［J］．中国中药杂志‚1995‚20（11）：687-688．