［摘要］ 探究德赢vwin登录 醇提取物( CTEE) 对缺氧/缺糖再灌注( OGD/Ｒ) 所致的PC12 细胞损伤的抑制作用及潜在机制。实验以OGD/Ｒ 诱导PC12 细胞作为损伤模型，通过MTT 法检测细胞存活率、通过AO/EB 与Hoechst 33258 染色法考察细胞凋亡、通过JC-1 染色法考察线粒体膜电位变化、通过MitoSOX 染色法考察线粒体氧化应激反应，通过Western blot 法考察凋亡相关蛋白( PAＲP， cleaved PAＲP， caspase-3， cleavd caspase-3，Bax，Bcl-2) 的表达，研究了CTEE( 12. 5， 25， 50 mg·L－1 ) 对神经细胞的保护作用。结果显示，CTEE 可以有效保护OGD/Ｒ 诱导的PC12 细胞损伤，并提高PC12 细胞存活率，AO/EB 与Hoechst 33258染色法显示CTEE 可以有效抑制细胞凋亡。此外， JC-1 与MitoSOX 染色法显示CTEE 可显著降低细胞中线粒体的氧化应激及线粒体膜电位的失调，且呈剂量依赖性。同时，CTEE 可明显抑制线粒体凋亡信号通路中关键蛋白caspase-3 和PAＲP 的激活，且明显抑制Bax 的升高和Bcl-2 的下调。以上结果表明，德赢vwin登录 醇提取物对OGD/Ｒ 所致的PC12 细胞损伤具有较好的保护作用，其潜在机制可能是通过抑制线粒体氧化应激及相关凋亡信号通路实现的。［关键词］ 神经损伤; 缺氧/缺糖再灌注; 德赢vwin登录 ; 醇提取物; 线粒体通路缺血性脑中风( ischemic stroke) 是现代社会威胁老年群体的重要致死性疾病，也是当前药物研发的热点领域［1-2］。脑是人体中对氧需求量最高的器官，因此脑缺血常常对脑组织造成十分严重的损伤，并引发脑死亡甚至危及生命。现代研究发现，缺血性脑中风最主要的特点是缺氧状态所诱发的神经细胞内的氧化应激反应，该过程中生成的氧自由基会损伤神经细胞内的线粒体，增加线粒体膜通透性，进而激活下游凋亡信号通路，诱导神经细胞凋亡［3-4］。此外，由于线粒体是合成细胞能量的源头，其功能受损必然会影响到神经细胞功能的发挥，并引起脑功能损伤。因此，以线粒体为靶向的神经保护剂的研发是治疗缺血性脑中风的一个关键方向［5-6］。德赢vwin登录 Cistanche tubulosa ( Schenk ) Ｒ．Wight 是传统中药之一，具有补肾阳、益精血、润肠通便的药理功效。现代药理学研究发现，德赢vwin登录 具有抗氧化、抗衰老、抗凋亡、抗辐射和改善学习记忆等作用［7-9］，特别是对于脑缺血再灌注有很好的保护作用，相关药品苁蓉总苷胶囊主要在临床上用于治疗轻中度血管性痴呆并得到广泛应用［10］。但是关于德赢vwin登录 治疗脑缺血和发挥神经保护的分子药理机制目前还尚不清楚，亟待揭示。因此，本研究旨在探讨德赢vwin登录 醇提取物对缺氧/缺糖再灌注所致的神经细胞损伤的保护作用，特别是探究了德赢vwin登录 发挥神经细胞保护作用的线粒体调控机制，最终为缺血性脑中风的创新药物研发提供全新候选药物及干预策略。1 材料PC12 细胞系购自中国医学科学院细胞中心。德赢vwin登录 95%乙醇提取物由北京大学中医药现代研究中心制备; AO/EB 双染色试剂盒( CA1140)购自北京索莱宝科技有限公司; Hoechst 33258 染色液( C0021) 购自北京索莱宝科技有限公司; 线粒体膜电位染色试剂盒( JC-1) ( C0026) 购自南京碧云天生物技术公司; 结晶紫染色液( DZ0056) 购自北京雷根( Leagene) 生物技术有限公司; MitoSOX 染色试剂盒( S0033) 购自南京碧云天生物技术公司; DMEM 培养基( CM15019) 购自北京中科迈晨( Macgene) 科技有限公司; 胎牛血清购自PAN-Biotech 上海斯信生物科技有限公司( 德国) ; 溴化噻唑蓝四氮唑( MTT) ( Amresco0793) 购自北京中科科奥公司; 蛋白抗体购自CellSignaling Technology 公司( 美国) ; Tanon-5200 Multi凝胶成像分体系统购自上海天能; Sunrise-Basic 酶标仪购自TECAN 公司( 美国) ; 倒置荧光显微镜( IX73)购自OLYMPUS 公司( 日本) 。2 方法2. 1 细胞培养与处理PC12 细胞系用高糖DMEM培养基( 含10%胎牛血清，100 U·L－1 青霉素，100μg·L－1链霉素) 进行传代培养，每2 天传代1 次。将细胞分为空白对照组，缺氧/缺糖再灌注损伤组和不同浓度药物处理组( 12. 5，25，50 mg·L－1 ) 。用1 体积的DMEM 培养液正常培养细胞，构建缺氧/缺糖再灌注损伤模型时，用1 /2 体积的Earle' s溶液替换原DMEM 培养液，并将其置于缺氧盒中孵育4 h。造成缺氧/缺糖损伤后，往1 /2 体积的Earle's溶液中加入3 /2 体积的DMEM 培养液，实现缺氧/缺糖再灌注损伤。2. 2 MTT 法检测细胞存活率PC12 细胞以1×104个/孔接种于96 孔板，模型组诱导缺氧/缺糖再灌注损伤，药物处理组按照上述浓度处理细胞。缺氧后复氧24 h，弃去上清液，并加0. 5 g·L－1MTT 染色，温箱孵育2 h; 加入DMSO 后，酶标仪检测吸光度( A570 nm) 。2. 3 结晶紫染色分析PC12 细胞以5×104 个/孔接种于24 孔板，模型组诱导缺氧/缺糖再灌注损伤，药物处理组按照上述浓度处理细胞。缺氧后复氧24 h，加入4%多聚甲醛固定10 min; 将多聚甲醛吸走，加入PBS 清洗，清洗3 次; 弃去PBS，加入结晶紫染液，染10 min; 将染液吸走，加入PBS 清洗，清洗3次，用倒置显微镜( ×10) 观察细胞形态。2. 4 AO/EB 染色分析PC12 细胞以5×104 个/孔接种于24 孔板，模型组诱导缺氧/缺糖再灌注损伤，药物处理组按照上述浓度处理细胞。缺氧后复氧24 h，加入PBS 清洗，清洗3 次; 弃去PBS，加入200 μL AO/EB( 100 μL AO 和100 μL EB 等体积混合) 染液，避光，染色2 min; 将染液吸走，加入PBS 清洗，清洗3 次，用荧光显微镜观察( ×200) 细胞核形态。2. 5 Hoechst 33258 染色分析PC12 细胞以5×104个/孔接种于24 孔板，模型组诱导缺氧/缺糖再灌注损伤，药物处理组按照上述浓度处理细胞。缺氧后复氧24 h。加入4%多聚甲醛固定30 min; 将多聚甲醛吸走，加入PBS 清洗3 次; 弃去PBS，加入Hoechst33258 染液染色30 min; 将染液吸走，加入PBS 清洗3 次，每次5 min。用荧光显微镜( 激发波长352 nm，发射波长461 nm) 观察( ×200) 细胞核形态。2. 6 JC-1 染色分析PC12 细胞以5×104 个/孔接种于24 孔板，模型组诱导缺氧/缺糖再灌注损伤，药物处理组按照上述浓度处理细胞。缺氧后复氧24h，按试剂盒要求将母液配置成工作液，加入工作液，避光，染色30 min; 将工作液吸走，加入PBS 清洗，清洗3 次，用荧光显微镜( 激发波长514 nm，发射波长529 nm) 观察( ×200) 细胞线粒体形态。2. 7 MitoSOX 染色分析PC12 细胞以5×104 个/孔接种于24 孔板，模型组诱导缺氧/缺糖再灌注损伤，药物处理组按照上述浓度处理细胞。缺氧后复氧24 h，加入PBS 清洗3 次; 弃去PBS，按试剂盒要求将母液配置成工作液，加入工作液，避光，染色20min; 将工作液吸走，加入PBS 清洗3 次，用荧光显微镜( 激发波长488 nm，发射波长525 nm) 观察( ×200) 细胞线粒体形态。2. 8 蛋白免疫印记( Western blot) 分析PC12 细胞经药物处理后，用ＲIPA 裂解液( 含蛋白酶抑制剂) 裂解细胞，得到细胞总蛋白提取液。总蛋白经过定量后，用6%～ 12% SDS-PAGE 分离，湿法转移至PVDF膜上。脱脂奶粉封闭PVDF 膜后加入一抗，室温孵育2 h，充分洗涤后加入二抗，室温孵育1 h。最后加ECL 显色试剂并在凝胶成像系统上拍照。2. 9 统计学分析所有数据用x－ ± s 表示，采用GraphPad Prism 5 统计学软件进行t 检验和单因素方差分析，P＜0. 05 认为有统计学意义。3 结果3. 1 德赢vwin登录 醇提取物保护缺氧/缺糖再灌注所致神经细胞的存活缺氧/缺糖再灌注损伤显著诱导神经细胞存活率降低，而加入德赢vwin登录 醇提取物后，有效逆转了这一过程，在12. 5，25，50 mg·L－13 个剂量下，德赢vwin登录 醇提取物对神经细胞的存活率具有显著提升作用，表明在此实验条件下，德赢vwin登录 醇提取物具有较好的抗缺氧/缺糖再灌注所致神经细胞损伤作用; 而德赢vwin登录 醇提取物在相同剂量条件下对神经细胞存活无明显毒性( 图1) 。此外，从结晶紫染色结果看，德赢vwin登录 醇提取物可以显著保护缺氧/缺糖再灌注所致神经细胞形态学变化，维持细胞正常的形态( 图1) ，这与细胞存活率的研究结果存在一致性。3. 2 德赢vwin登录 醇提取物抑制缺氧/缺糖再灌注所致神经细胞的凋亡AO/EB 染色分析发现，缺氧/缺糖再灌注损伤显著诱导神经细胞凋亡的发生( 红色荧光表示) ; 与损伤组相比，德赢vwin登录 醇提取物显著抑制了神经细胞凋亡的产生，且具有剂量依赖性( 图2) 。Hoechst 33258 染色分析表明缺氧/缺糖再灌注损伤诱导的神经细胞凋亡( 细胞核致密浓染) 被德赢vwin登录 醇提取物显著逆转( 图2) 。由此可见，德赢vwin登录 醇提取物具有较好的神经保护和抗凋亡作用。3. 3 德赢vwin登录 醇提取物抑制缺氧/缺糖再灌注所致神经细胞线粒体损伤线粒体损伤在脑缺血所致的神经凋亡中扮演重要角色。缺氧/缺糖再灌注可引起神经细胞线粒体膜的显著去极化( 绿色荧光) ，而德赢vwin登录 醇提取物处理后的细胞中，绿色荧光显著降低，提示德赢vwin登录 醇提取物可较好的稳定神经细胞线粒体的膜电位( 图3) 。此外，实验采用荧光染料MitoSOX 来特异性标记线粒体内的活性氧自由基( ＲOS) ，结果发现缺氧/缺糖再灌注可引起线粒体内ＲOS 水平显著升高，而德赢vwin登录 醇提取物处理后的细胞中，ＲOS 水平显著降低，且呈剂量依赖性。由此看出，德赢vwin登录 醇提取物可能是通过降低线粒体内的ＲOS 进而发挥线粒体保护作用的。3. 4 德赢vwin登录 醇提取物抑制Bcl-2/Bax 介导的线粒体caspase-3/PAＲP 凋亡通路当缺氧/缺糖再灌注处理细胞后，caspase-3 的表达量下调，cleavedcaspase-3 的表达量上调，提示caspase-3 被激活; 当加入德赢vwin登录 醇提取物后，可见caspase-3 的表达量明显升高，而cleaved caspase-3 的表达量明显下调，即caspase-3 的激活被德赢vwin登录 醇提取物所抑制; PAＲP 的变化规律与caspase-3 类似，当加入德赢vwin登录 醇提取物进行干预后，PAＲP 的表达量明显升高，而cleaved PAＲP 的表达量明显下调，即PAＲP 的激活被德赢vwin登录 醇提取物所抑制; 另外，作为线粒体功能标志蛋白的Bcl-2 表达量被德赢vwin登录 醇提取物显著上调，而Bax 的表达量被显著下调( 图4) 。由此表明，德赢vwin登录 醇提取物可明显抑制Bcl-2/Bax 介导的线粒体caspase-3/PAＲP 凋亡通路。4 讨论随着现代社会的老龄化不断发展，缺血性脑中风及其并发症的发生率也在逐年升高，已经成为目前威胁老年群体的重要致死性疾病。因此寻找治疗此类疾病的特效药物一直是药物研发领域的重要课题。前期研究发现，缺血性脑中风所造成的神经细胞损伤，主要就是缺氧状态影响神经细胞内的线粒体正常功能，引发线粒体内过氧化损伤进而削弱线粒体合成能量的效率，引发整体细胞功能的失调，最终导致神经功能受损［11-12］。因此，针对脑缺血诱发的神经损伤最为有效的手段之一就是保护神经细胞内的线粒体功能。源于中医药的脑保护剂的研发一直是人们关注的热点。德赢vwin登录 是最具代表性的神经保护剂，研究发现其对于神经细胞的过氧化损伤、脂质代谢、单胺类神经递质以及水通道蛋白等均具有较好的逆转和保护作用［13-16］。德赢vwin登录 的活性成分能否通过血脑屏障是其发挥作用的关键因素。前期研究发现，肉苁蓉的主要成分松果菊苷等可通过血脑屏障进而发挥神经保护作用，具有潜在的治疗脑缺血和脑水肿的功效［17-19］。本研究发现，德赢vwin登录 的醇提取物具有较好的抗神经细胞损伤作用，其可能是通过降低神经细胞内的线粒体氧化性损伤，进而抑制线粒体去极化水平来发挥作用的。值得一提的是，笔者发现当线粒体损伤时，其倾向于聚集成团，而德赢vwin登录 能够有效地抑制受损线粒体的成团趋势，提示德赢vwin登录 可能会在一定程度上调控线粒体的动力学过程，但是相关机制有待进一步探究。此外，作为线粒体功能密切相关的2 个标志性蛋白Bcl-2 和Bax 的表达来看，德赢vwin登录 对Bcl-2 的调控作用更为明显，几乎完全逆转了Bcl-2 的降低，由此推测德赢vwin登录 对Bcl-2 的调控可能主要参与了线粒体保护作用。综上所述，本实验从线粒体信号通路探讨了德赢vwin登录 的神经保护作用，并初步阐明了分子作用机制，这对今后开发具有抗神经缺血作用的药物及相关疾病的治疗具有重要的参考意义。［参考文献］［1］ 陈孝男，杨爱琳，赵亚楠，等． 缺血性脑中风的发病机制及其常用治疗中药研究进展［J］． 中国中药杂志，2019，44 ( 3) :422．［2］ 杨薇，黎明全，李杨，等． 缺血性中风病急性期中西药群组模块探索［J］． 中国中药杂志，2018，43( 3) : 618．［3］ Bernardi P，Scorrano L，Colonna Ｒ，et al． Mitochondria and celldeath． Mechanistic aspects and methodological issues［J］． Eur JBiochem，1999，264( 3) : 687．［4］ 张静，赵建军，杨伟，等．基于中医证候特征的缺血性中风复发风险的横断面分析［J］．中国实验方剂学杂志，2018，24( 12) :194．［5］ Soustiel J F，Zaaroor M． Mitochondrial targeting for developmentof novel drug strategies in brain injury［J］．Cent Nerv Syst AgentsMed Chem，2012，12( 2) : 131．［6］ 孙丽新，严明，江振洲，等． 银杏内酯对PC12 细胞缺糖损伤凋亡相关基因的影响［J］． 中国中药杂志，2007，32( 6) : 532．［7］ 汤小蕾，孙平飞． 德赢vwin登录 的研究进展［J］． 中医药导报，2009，15( 5) : 101．［8］ Song D，Cao Z，Liu Z，et al． Cistanche deserticola polysaccharideattenuates osteoclastogenesis and bone resorption via inhibitingＲANKL signaling and reactive oxygen species production［J］．J Cell Physiol，2018，233( 12) : 9674．［9］ 刘文静，刘瑶，宋青青，等． 利用1H-NMＲ 比较德赢vwin登录 野生品和栽培品的化学成分组［J］． 中国中药杂志，2018，43( 17) : 3506．［10］ 安军明，柯铁军．苁蓉总苷胶囊治疗血管性痴呆99 例［J］． 陕西中医学院学报，2011，34( 2) : 36．［11］ Farajdokht F，Mohaddes G，Karimi-Sales E，et al． Inhibition ofPTEN protects PC12 cells against oxygen－glucose deprivation inducedcell death through mitoprotection［J］． Brain Ｒes，2018，1692: 100．［12］ 杜肖，路畅，贺晓丽，等． 小续命汤有效成分组对脑缺血/再灌注大鼠恢复早期脑线粒体的保护作用研究［J］． 中国中药杂志，2017，42( 11) : 2139．［13］ Liu Y，Wang H，Yang M，et al． Cistanche deserticola polysaccharidesprotects PC12 cells against OGD/ＲP-induced injury［J］． Biomed Pharmacother，2018，99: 671．［14］ Li M，Xu T，Zhou F，et al． Neuroprotective effects of four phenylethanoidglycosides on H2O2-induced apoptosis on PC12 cellsvia the Nrf2 /AＲE pathway［J］． Int J Mol Sci，2018，19( 4) :1135．［15］ Chen M，Wang X，Hu B，et al． Protective effects of echinacosideagainst anoxia /reperfusion injury in H9c2 cells via up-regulatingp-AKT and SLC8A3［J］． Biomed Pharmacother，2018，104: 52．［16］ Fu Z，Fan X，Wang X，et al． Cistanches Herba: an overview ofits chemistry，pharmacology and pharmacokinetics property［J］．J Ethnopharmacol，2018，219: 233．［17］ 骆新，李建英，许永华，等． 肉苁蓉苯乙醇苷对大鼠高原脑水肿的防治作用［J］． 中南药学，2014，12( 8) : 747．［18］ 魏丽丽，陈虹，姜勇，等． 高效液相法测定松果菊苷在脑缺血大鼠血浆和脑组织中的浓度［J］． 中国药理学通报，2011，27( 5) : 737．［19］ 陶义存，董翔，许永华，等． 肉苁蓉苯乙醇总苷对高原脑水肿大鼠水通道蛋白4 的影响［J］． 中国现代中药， 2015， 17( 4) : 302．

摘要：目的对德赢vwin登录 产地适宜区进行分析以指导德赢vwin登录 区划和生产。方法应用“中药材产地适宜性分析地理信息系统”‚以新疆南疆德赢vwin登录 分布区的生态因子为依据分析德赢vwin登录 在全国适宜产地。结果　德赢vwin登录 最适宜产区只在新疆南疆塔克拉玛干沙漠边缘的27个县市‚分布有明显的区域性。结论　德赢vwin登录 与其寄主植物柽柳的分布不同步‚德赢vwin登录 在新疆北疆及我国其他省区种植应慎重。关键词：德赢vwin登录 ；产地适宜性；ＡＨＰ分析；判断矩阵肉苁蓉（ＣｉｓｔａｎｃｈｅｄｅｓｅｒｔｉｃｏｌａＹ∙Ｃ∙Ｍａ）为列当科多年生寄生性草本植物‚寄生于藜科植物梭梭（Ｈａｌｏｘｙｌｏｎａｍｍｏｄｅｎｄｒｏｎ）的根部‚以干燥带鳞叶的肉质茎入药‚味甘、咸‚性温‚有补肾阳‚益经血‚润肠通便等功效‚始载于《神农本草经》‚后为《中华人民共和国药典》所收载‚是我国传统名贵中药材之一［1-2］。德赢vwin登录 ［Ｃｉｓｔａｎｃｈｅｔｕｂｕｌｏｓａ （Ｓｃｈｒｅｎｋ） Ｗｉｇｈｔ］是我国肉苁蓉属中产量最大的种［3］‚寄生于柽柳属Ｔａｍａｒｉｘ植物的根部‚自然分布于我国新疆南疆‚近年来巨大的市场需求导致肉苁蓉资源濒临枯竭‚为缓解肉苁蓉资源的紧缺现状‚2005年德赢vwin登录 被收录于2005年版《中国药典》一部［4］。由于德赢vwin登录 寄主植物柽柳属植物在全国均有分布‚尤其在德赢vwin登录 进入药典后‚我国西北各省区人工种植德赢vwin登录 的积极性日趋高涨‚一些过去未见报道有德赢vwin登录 自然分布的省区如甘肃、内蒙古、宁夏等也纷纷进行德赢vwin登录 的引种试种‚陆续有接种德赢vwin登录 成功的报道［5-6］。为指导德赢vwin登录 适宜种植区域选择及其科学区划‚笔者曾应用中药材产地适宜性分析地理信息系统（ＴＣＭＧＩＳ-Ⅰ）‚对肉苁蓉及德赢vwin登录 产地适宜性进行数值分析［7-8］‚以野生德赢vwin登录 产区新疆南疆塔克拉玛干沙漠四周的生长环境因子－－－1月平均气温、7月平均气温；年均降水量；海拔；土壤因子为依据‚对我国德赢vwin登录 产地适宜性数值分析结果表明‚德赢vwin登录 适宜产区有新疆、内蒙古、宁夏、甘肃、青海5省区‚最适宜产区包括新疆、内蒙古、甘肃3省区的56个县市［8］。但近几年的实践发现‚在内蒙古、甘肃、宁夏等省区的柽柳根部接种德赢vwin登录 ‚基本上都能萌发寄生并在当年正常生长‚但常常在冬季过后出现冻害‚导致德赢vwin登录 全部被冻死‚几乎无1株存活‚此现象在引种省区普遍发生‚引发作者对德赢vwin登录 产地适宜性数值分析结果进行思考‚经过大量的调研、分析‚笔者认为‚在影响德赢vwin登录 生长的多种环境因子中‚冬季低温有可能是影响德赢vwin登录 分布的最关键因子。以往研究在生态环境因子的选择上‚虽然考虑了德赢vwin登录 原产区的冬季温度范围（一月平均气温）‚但忽略了一月最低气温和低温的持续月份‚导致分析结果与生产实践有出入‚为此‚笔者以冬季最低气温作为最重要的环境气象因子‚再次对德赢vwin登录 产地适宜性进行分析。1　中药材产地适宜性分析原理“中药材生态适宜性数值区划分析系统（ＴＣＭＧＩＳ）”的空间分析分为栅格数据空间分析和矢量数据空间分析两大类。栅格数据空间分析首先根据中药材道地产区的生长环境确定各个环境因子的权重‚然后对数据库中各生态因子数据进行栅格数据空间分析‚用于对中药材适宜生长的气候环境进行分析‚从而得出中药材生长环境的综合指标栅格数据图。经过栅格空间分析后的栅格数据只是表达了中药材生长环境的指标及空间分布特征‚并不包含社会、经济信息‚必须将分析后的栅格数据转化为矢量数据‚并和全国行政区划信息进行矢量空间分析‚才能将中药材的产地信息同行政区划信息统一起来。矢量数据空间分析主要是对分析出的生长区域和行政区划进行叠加‚进一步分析适宜区的行政范围和面积等。根据药材原生地（主产区）的气候因子数据（一月最低气温、七月最高气温、年均降水量、年均日照时数等）、地形因子数据（海拔高度）和土壤类型数据‚采用等权绝对值距离法分析出每种药材不同等级的适宜区。利用中药材生态适宜性数值区划分析系统（ＴＣＭＧＩＳ）进行中药材的数值区划分析流程图见图1。2　德赢vwin登录 生态因子选择和因子范围确定应用ＴＣＭＧＩＳ-Ⅰ系统提取新疆南疆德赢vwin登录 自然分布区塔克拉玛干沙漠周边111个点（图2）的环境因子值‚并做平均值、标准差和变异系数的计算统计‚见表1。变异系数是各观测值标准差与平均数的比值‚是概率分布离散程度的归一化量度‚在比较量纲不同或均值不同的不同类别数据时‚应该用变异系数而不是标准差来作为比较的参考。对表中各因子的变异系数进行排序‚年均日照时数＜七月平均气温＜年均相对湿度＜一月最低气温＜年均降水量＜一月平均气温＜十二月平均气温＜海拔＜二月平均气温‚变异系数较小的因子有一月平均气温、七月平均气温、年均降水量、年均日照时数、年均相对湿度、一月最低气温等‚根据变异系数数学意义可知德赢vwin登录 对这些生态因子的要求较强‚是德赢vwin登录 生长的主要限制指标；而二月平均气温、十二月平均气温和海拔的变异系数都较大‚说明不是德赢vwin登录 生长的限制指标。因此选取变异系数较小的上述6个因子和土壤作为德赢vwin登录 适宜性的分析指标。采用半峰宽公式计算德赢vwin登录 各因子的最适宜范围：ｘｉ±12×2∙354ｓｉ‚ｓｉ为第ｉ个生态因子的标准差。经计算所得各因子的最适范围分别为：一月最低气温－12∙5℃‚一月平均气温－10∙0～－4∙8℃‚七月平均气温22∙7～27∙3℃‚年均降水量为49～97ｍｍ‚年均日照时数：每年2357～2805ｈ‚年均相对湿度：37∙3％ ～52∙7％‚土壤：棕漠土、石膏棕漠土、固定荒漠风沙土、半固定荒漠风沙土。3　德赢vwin登录 生态因子权重确定由于德赢vwin登录 的适宜产区受多种生态因子指标的影响和制约‚因此采用ＡＨＰ层次分析法考虑各因子对德赢vwin登录 的分布影响。3∙1　建立层次结构模型按照任务要求建立德赢vwin登录 的气候区划指标的层次结构模型‚第一层目标层为德赢vwin登录 气候区划层‚第二层为因子层即7个气候土壤区划指标层（图3）。判断矩阵（成对比较阵）是层次分析法中各因子相对重要度计算的重要依据。判断矩阵是以评价结构模型中的上一级的某一要素Ｈｓ为评价标准‚专家对本级要素进行两两比较后‚用专家知识的判断标准进行重要度评定。判断标度采用1～9标度‚建立的7因子的判断矩阵Ａ具有下列特点：Ａ＝（ａｉｊ）ｎ×ｎ，ａｉｊ＞0，ａｊｉ＝1/ａｉｊ求矩阵Ａ的最大特征根λ＝7∙6770。3∙3　计算权向量并作一致性检验为判别权重是否合理需要对判断矩阵进行一致性检验‚目的是检查判断矩阵构造的不一致误差是否在容许的范围内‚一致性检验指标为：ＣＲ是判断矩阵的一致性比率‚λ为矩阵的最大特征根‚ｎ是矩阵Ａ的阶数。ＲＩ是随机一致性指标‚对于1～9阶判断矩阵‚ｎ＝1～11‚ＲＩ值分别为0‚0‚0∙58‚0∙90‚1012‚1∙24‚1∙32‚1∙41‚1∙45‚1∙49‚1∙51。致性指标：ＣＩ＝（7∙6770－7/7－1） ＝0∙113由表1可知‚Ａ矩阵的随机一致性指标ＲＩ＝1∙32‚一致性比率为ＣＲ＝0∙113／1∙32＝0∙086＜0∙1‚即认为判断矩阵Ａ具有满意的一致性。因此可用该特征值的特征向量作为权向量ω＝（0∙042‚0∙025‚0∙088‚0∙574‚0∙055‚0∙053‚0∙163）Ｔ。根据“3∙2”、“3∙3”分析结果‚德赢vwin登录 的生态适宜性分析采用的生态因子、数值范围以及权重见表2。4　结果与分析采用ＴＣＭＧＩＳ-Ⅰ系统分析后得出德赢vwin登录 产地适宜区全国分布情况（图4‚5［审图号：ＧＳ（2007）533］、表3）。分析结果显示‚德赢vwin登录 最适宜产区全部分布在新疆南疆塔克拉玛干沙漠边缘的27个县市‚总面积为46949ｋｍ2。其中最适宜区面积在3000ｋｍ2以上的县有皮山县、墨玉县、于田县、策勒县、洛浦县、巴楚县。5　结论与讨论5∙1　为进一步明确德赢vwin登录 冻害与温度的关系‚笔者实地调查了新疆南疆民丰县2004～2009年1月出现过的最低温度‚依次为：－20∙6、－21∙5、－19∙7、－24∙8、－18∙9、－17∙6℃‚2007年1月最低气温达到－24∙8℃‚当年民丰县德赢vwin登录 属于受灾年‚许多德赢vwin登录 被冻坏‚人工栽培的德赢vwin登录 无一幸免‚几乎绝收。证明冬季低温是限制德赢vwin登录 分布的关键因子之一。5∙2　应用中药材产地适宜性分析地理信息系统（ＴＣＭＧＩＳ-Ⅰ ）分析发现‚新疆南疆地区一月最低气温和七月平均气温明显高于新疆其他地区‚而其他因子没有明显差异‚表明新疆南疆在冬季最冷季节及夏季最热季节具有西北其他地区不具备的气候条件‚也许正是新疆南疆这些独特的地理气候条件才能保证德赢vwin登录 的生长和繁衍‚同时也是形成德赢vwin登录 道地产区的关键所在。5∙3　本实验结合德赢vwin登录 的生物学特性及其对生长环境条件的要求‚在应用ＴＣＭＧＩＳ-Ⅰ系统进行产地适宜性数值分析时‚增加了一月最低气温、日照和湿度3个生态因子‚并利用统计分析方法和ＡＨＰ层次分析法对各生态因子范围及权重系数进行了科学的确定‚增加了中药材产地适宜性分析地理信息系统（ＴＣＭＧＩＳ-Ⅰ ）的准确性和科学内涵。5∙4　系统分析结果表明‚德赢vwin登录 最适宜产区只在新疆南疆塔克拉玛干沙漠边缘的27个县市‚刘铭庭等［9］认为德赢vwin登录 仅寄生于各种柽柳的根部‚因为该种起源于古地中海植物区系‚因此‚该种在我国仅分布于塔里木盆地柽柳的根部‚其他地区柽柳不产。本实验结果与文献和实际调查认定的我国德赢vwin登录 仅自然分布于我国新疆天山以南塔克拉玛干沙漠周围各县的结论十分吻合‚证明德赢vwin登录 分布有明显的区域性和局限性‚其分布与其寄主植物柽柳的分布不同步‚新疆北疆及我国其他省区种植德赢vwin登录 应慎重。ＲＥＦＥＲＥＮＣＥＳ［1］　ＴＵＰＦ‚ＨＥＹＰ‚ＬＯＵＺＣ‚ｅｔａｌ∙ＳｕｒｖｅｙａｎｄｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍｅｄｉｃｉｎａｌｒｅｓｏｕｒｃｅｓｏｆＤｅｓｅｒｔｌｉｖｉｎｇＣｉｓｔａｎｃｈｅ（Ｃｉｓｔａｎｃｈｅｄｅｓｅｒｔｉｃｏｌａ）［Ｊ］∙ＣｈｉｎＴｒａｄｉｔＨｅｒｂｄｒｕｇｓ（中草药）‚1994‚24（4）：205-208∙［2］　ＦＵＬＫ∙ＣｈｉｎａＰｌａｎｔＲｅｄＤａｔａＢｏｏｋ-ＲａｒｅａｎｄＥｎｄａｎｇｅｒｅｄＰｌａｎｔｓ：（ｖｏｌ∙1） （中国植物红皮书：第一卷） ［Ｍ ］∙Ｂｅｉｊｉｎｇ：ＳｃｉｅｎｃｅＰｒｅｓｓ‚1992：502．［3］　ＴＩＡＮＨＺ‚ＺＨＡＯＺＪ‚ＺＨＯＵＸＨ∙ＳｔｕｄｙｏｎｒａｐｉｄｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎａｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＣｉｓｔａｎｃｈｅｔｕｂｕｌｏｓａ［Ｊ］∙ＸｉｎｊｉａｎｇＡｇｒｉｃＴｅｃｈｎｏｌ（新疆农业科技）‚2004‚（6）：29-30∙［4］　Ｃｈ∙Ｐ（2005） ＶｏｌⅠ （中国药典2005年版∙一部） ［Ｓ］∙2005：90∙［5］　ＴＡＮＧＴＸ‚ＷＡＮＧＨＬ‚ＧＵＯＹＨ‚ｅｔａｌ∙ＳｔｕｄｙｏｎｐａｒａｓｉｔｉｓｍｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｏｆＣｉｓｔａｎｃｈｅｔｕｂｕｌｏｓａ［Ｊ］∙ＣｈｉｎａＪＣｈｉｎＭａｔｅｒＭｅｄ（中国中药杂志）‚2005‚30（17）：1380-1383∙［6］　ＬＩＴＲ‚ＣＡＯＲ‚ＭＡＨ‚ｅｔａｌ∙ＣｉｓｔａｎｃｈｅｔｕｂｕｌｏｓａｐｒｏｐａｇａｔｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｉｎＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａ［Ｊ］∙ＣｈｉｎａＷｉｌｄＰｌａｎｔＲｅｓｏｕｒ（中国野生植物资源）‚2002‚21（5）：54∙［7］　ＣＨＥＮＪ‚ＸＩＥＣＸ‚ＣＨＥＮＳＬ‚ｅｔａｌ∙ＳｕｉｔａｂｉｌｉｔｙｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆＣｉｓｔａｎｃｈｅｄｅｓｅｒｔｉｃｏｌａｂａｓｅｄｏｎＴＣＭＧＩＳ-Ⅰ ［Ｊ］∙ＣｈｉｎａＪＣｈｉｎＭａｔｅｒＭｅｄ（中国中药杂志）‚2007‚32（13）：14-19∙［8］　ＣＨＥＮＪ‚ＸＩＥＣＸ‚ＣＨＥＮＳＬ‚ｅｔａｌ∙ＳｕｉｔａｂｉｌｉｔｙｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆＣｉｓｔａｎｃｈｅｔｕｂｕｌｏｓａｂａｓｅｄｏｎＴＣＭＧＩＳ-Ⅰ ［Ｊ］∙ＣｈｉｎａＪＣｈｉｎＭａｔｅｒＭｅｄ（中国中药杂志）‚2008‚33（5）：6-11∙［9］　ＬＩＵＭＴ∙ＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＬａｒｇｅＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｎＴａｍａｒｉｓｋＬ（柽柳属植物综合研究及大面积推广应用） ［Ｍ ］∙Ｌａｎｚｈｏｕ：ＬａｎｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ‚1995∙

摘要: 目的测定分析德赢vwin登录 不同生长时间和部位的松果菊苷、毛蕊花糖苷及半乳糖醇含量。方法高效液相色谱法。结果德赢vwin登录 不同生长时间的松果菊苷和毛蕊花糖苷含量以11 月最高，分别为295． 25 mg·g － 1和48． 25mg·g － 1，两者均表现为11 月＞ 10 月＞ 12 月;半乳糖醇含量12 月最高为36． 71 mg·g － 1，12 月＞ 11 月＞ 10 月。德赢vwin登录 不同部位的松果菊苷和毛蕊花糖苷含量基部＞中部＞顶部，半乳糖醇含量顶部＞中部＞基部。结论德赢vwin登录 不同生长时间和部位的松果菊苷、毛蕊花糖苷和半乳糖醇含量差异显著。关键词: 德赢vwin登录 ; 有效成分; 生长时间; 部位; 高效液相色谱法德赢vwin登录 Cistanche tubulosa ( Schrenk) Wight 为列当科肉苁蓉属全寄生草本植物，作为中药肉苁蓉的基源植物载入《中国药典》，具补肾阳、益精血、润肠通便之功效［1］。德赢vwin登录 的主要成分为苯乙醇苷类，关于不同产地德赢vwin登录 化学成分的差异及测定方法多见报道，熊元君等［2］报道了不同产地德赢vwin登录 6种苯乙苷类活性成分的HPLC 指纹图谱，王果平［3］分析指出不同产地德赢vwin登录 中松果菊苷含量差异较大，同一产地栽培和野生品的松果菊苷含量也存在差异，笔者分析了中国柽柳和德赢vwin登录 复合体不同部位的松果菊苷含量［4］，蔡鸿等［5］建立了德赢vwin登录 药材中的松果菊苷、毛蕊花糖苷和半乳糖醇含量的测定方法，并分析了不同栽培地点和同一栽培地点不同批次的成分差异，陈敏等［6］测定分析了德赢vwin登录 野生种和栽培种以及人工种植不同寄主、不同大小药材的松果菊苷和毛蕊花糖苷含量，王长林等［7］分析了栽培德赢vwin登录 不同生长时间、不同部位的松果菊苷含量，郭雄飞等［8］比较了德赢vwin登录 根部和顶部的松果菊苷、毛蕊花糖苷含量的差异，赵奎君等［9］HPLC － ELSD 测定分析了肉苁蓉及德赢vwin登录 中半乳糖醇含量。综上，关于德赢vwin登录 不同生长时间和不同部位的化学成分研究报道较少，本文研究了人工栽培德赢vwin登录 不同生长时间和不同部位的松果菊苷、毛蕊花糖苷及半乳糖醇含量的差异，为明确德赢vwin登录 不同生长时间和不同部位的成分变化，指导德赢vwin登录 药材的适期采收和科学使用提供理论依据。1 材料美国AgiLent 1100 系列( G1322A 在线真空脱气机，G1311A四元梯度泵，G1313A 自动进样器，G1316A 柱温箱，G1314A VWD紫外检测器) ; 法国SEDEX 75 型蒸发光散射检测器( ELSD) 。德赢vwin登录 取自河北农业大学标本园寄生于中国柽柳的栽培德赢vwin登录 植株( 河北农业大学——————教授鉴定) 。松果菊苷、毛蕊花糖苷和半乳糖醇对照品均购自中国药品生物制品鉴定所，色谱纯乙腈( 美国，J． T． Baker) ，色谱纯甲醇( 天津市西华特种试剂厂) ，其他试剂均为分析纯。2 方法2． 1 德赢vwin登录 取样与处理不同时间德赢vwin登录 样品的取样和处理: 10、11、12 月每月3 号随机挖去4 株德赢vwin登录 样品，鲜样洗净，切片， 50℃烘干至恒重，干燥样品粉碎后过80 目筛备用，重复3 次。德赢vwin登录 不同部位取样和处理: 12 月挖去的德赢vwin登录 鲜样洗净后，按照长度平均分成3 段( 基部、中部和顶部) ，分别切片，50℃烘干至恒重，干燥样品粉碎后过80 目筛备用，重复3 次。2． 2 松果菊苷和毛蕊花糖苷含量的测定色谱条件［1］: 色谱柱Agilent Zorbax SB C18( 150 mm × 4． 6 mm，5μm) ; 流动相: 甲醇－0． 1%甲酸梯度洗脱，按甲醇－ 0． 1% 甲酸( 26． 5∶ 73． 5) ，保持17min，3 min 内换成29． 5∶ 70． 5，保持7 min; 体积流量为1． 0 ml /min; 检测波长为330 nm; 柱温35℃。理论塔板数按松果菊苷峰计应不低于3000。松果菊苷和毛蕊花糖苷对照品、样品色谱图见图1。对照品及供试品溶液制备: 精密称取松果菊苷和毛蕊花糖苷对照品适量，加50%甲醇制成质量浓度分别为0． 5 mg /ml 的混合溶液，摇匀，即得对照品溶液。精确称取“2． 1”项中德赢vwin登录 样品1． 0 g，置100 ml 棕色量瓶中，精密加入50% 甲醇50 ml，密塞，摇匀，称定质量，浸泡0． 5 h，超声处理40 min，取出，放冷，再称定质量，用50% 甲醇补足减失质量，摇匀，静置，取上清液用0． 45μm微孔滤膜滤过，滤液置棕色样品瓶保存，作为测定松果菊苷和毛蕊花糖苷的供试品溶液。松果菊苷和毛蕊花糖苷的测定: 分别精密吸取松果菊苷和毛蕊花糖苷混合对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，按外标一点法计算质量分数，即得。标准曲线的制作: 分别精密吸取松果菊苷和毛蕊花糖苷对照品溶液，在色谱条件下，分别进样0． 1，0． 5，1． 0，5． 0，10． 0，20． 0μl，测定峰面积。以峰面积积分值为纵坐标( Y) 、进样量( μg) 为横坐标( X) ，得回归方程。松果菊苷: Y = 1201． 527X －11． 437( r = 1． 0000，n = 6) ，线性范围0． 05 ～ 10． 00μg; 毛蕊花糖苷: Y = 1457． 737X － 16． 672( r = 1． 000 0，n = 6) ，线性范围0． 04 ～10． 00μg。2． 3 半乳糖醇含量的测定色谱条件: 色谱柱PrevailCarbohydrateES 聚合凝胶柱( 250 mm × 4． 6 mm，5 μm) ; 流动相: 乙腈－ 水( 77∶ 23) ; 体积流量为0． 7 ml /min; 柱温为25℃; 检测器为ELSD: 漂移管温度40℃，气体压力2． 4 bar，检测灵敏度设置为8; 理论塔板数按半乳糖醇峰计算不低于3 000。半乳糖醇对照品、样品色谱图见图2。对照品及供试品溶液制备: 取半乳糖醇对照品适量，加水制成质量浓度为0． 50mg /ml 的溶液，摇匀，即得对照品溶液。取“2． 2”项下供试品溶液5 ml 置25 ml 量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，用0． 2μm 微孔滤膜滤过，作为测定半乳糖醇的供试品溶液。半乳糖醇的测定: 分别精密吸取对照品溶液5、25μl，供试品溶液5μl，注入液相色谱仪，记录峰面积，按外标二点法对数方程计算，即得。标准曲线的制作: 取质量分数为0． 50 mg /ml 半乳糖醇对照品溶液，分别进样0． 5，1． 0，2． 0，5． 0， 10． 0， 20． 0μl，按色谱条件测定峰面积，以峰面积积分值对数( Y) 为纵坐标、半乳糖醇进样量( μg) 对数( X) 为横坐标，得回归方程为Y = 1． 548 8X + 2． 918 4( r= 0． 999 2，n = 6) ，线性范围0． 25 ～ 10． 00 μg。3 结果3． 1 德赢vwin登录 不同生长时间的化学成分分析德赢vwin登录 不同生长时间的松果菊苷、毛蕊花糖苷及半乳糖醇含量的差异均达显著水平( 表1 ) 。松果菊苷含量以11 月最高，达295． 25 mg·g － 1 ，其次为10 月含量， 12 月含量最低，仅为176． 70mg·g － 1 ; 其毛蕊花糖苷含量变化与松果菊苷相同，11 月含量最高，为48． 25 mg·g － 1， 10 月含量次之， 12 月含量最低，仅为22． 88mg·g － 1 ; 松果菊苷和毛蕊花糖苷含量的变化均为11 月＞ 10 月＞ 12 月。半乳糖醇含量变化与松果菊苷、毛蕊花糖苷含量变化存在差异， 12 月半乳糖醇含量最高，为36． 71 mg·g － 1 ，11 月含量次之， 10 月含量最低，仅为13． 66 mg·g － 1 ，半乳糖醇含量的变化为12 月＞ 11 月＞ 10 月。可见，年内不同生长时间德赢vwin登录 的有效成分变化存在差异，松果菊苷和毛蕊花糖苷含量以11 月最高，半乳糖醇含量以12 月最高。3． 2 德赢vwin登录 不同部位的化学成分分析由表2 可见，德赢vwin登录 不同部位的松果菊苷、毛蕊花糖苷及半乳糖醇含量的差异均达显著水平。德赢vwin登录 基部的松果菊苷含量最高，达237． 34mg·g － 1 ，中部含量次之，顶部含量最低，仅为114． 69 mg·g － 1 ;其毛蕊花糖苷含量变化与松果菊苷相同，基部含量最高，为26． 37 mg·g － 1 ，中部含量次之，顶部含量最低，仅为16． 12 mg·g － 1 ; 松果菊苷和毛蕊花糖苷含量的变化均为基部＞ 中部＞ 顶部。半乳糖醇含量的变化与松果菊苷、毛蕊花糖苷含量变化存在差异，顶部含量最高，为53． 09 mg·g － 1 ，中部含量次之，顶部含量最低，仅为17． 25 mg·g － 1 ，不同部位半乳糖醇含量的变化为顶部＞中部＞ 基部。4 讨论德赢vwin登录 是一种全寄生濒危中药材，其自身生长发育所需的碳水化合物全部来源于寄主柽柳的光合产物，其体内有效成分来源于初生代谢产物的次生代谢转化，因此柽柳光合产物的供给和德赢vwin登录 体内的次生代谢水平影响德赢vwin登录 的有效成分含量。本试验结果表明: 随着德赢vwin登录 的寄生生长，不同时间的松果菊苷、毛蕊花糖苷及半乳糖醇含量的差异显著，松果菊苷和毛蕊花糖苷含量的变化均为11 月＞ 10 月＞ 12 月，半乳糖醇含量的变化为12 月＞ 11 月＞ 10 月，试验结果对确定德赢vwin登录 的秋季采收时间具有指导作用。德赢vwin登录 不同有效成分变化的差异性可能与不同时间柽柳光合产物对德赢vwin登录 的供给水平，及不同时间温度变化对德赢vwin登录 体内次生代谢的影响有关。关于德赢vwin登录 不同部位有效成分的差异性，本试验结果表明: 德赢vwin登录 不同部位的松果菊苷、毛蕊花糖苷及半乳糖醇含量的差异显著，松果菊苷和毛蕊花糖苷含量的变化均为基部＞ 中部＞ 顶部，半乳糖醇含量的变化为顶部＞ 中部＞ 基部。不同部位松果菊苷含量的变化趋势与王长林等报道结果一致［7］，不同部位松果菊苷与毛蕊花糖苷含量的变化规律与郭雄飞等报道结果一致［8］。实验结果将为合理科学地使用德赢vwin登录 提供依据，关于德赢vwin登录 不同部位半乳糖醇含量变化与松果菊苷、毛蕊花糖苷含量变化存在较大差异的原因，有待进一步探讨。参考文献:［1］ 国家药典委员会． 中国药典，一部［S］． 北京: 中国医药科技出版社，2010: 126．［2］ 熊元君，李勇，贾晓光，等． 不同产地德赢vwin登录 苯乙苷类成分HPLC 指纹图谱研究［J］． 中成药，2009，31 ( 11) : 1644．［3］ 王果平，卿德刚，凯撒·苏来曼，等． 南疆不同产地肉从蓉中松果菊苷含量的测定［J］． 新疆中医药，2007，25( 4) : 85．［4］ 杨太新，张喜焕，蔡景竹． 德赢vwin登录 松果菊苷次生代谢部位研究［J］． 中国中药杂志，2006，32 ( 24) : 2591．［5］ 蔡鸿，鲍忠，姜勇，等． 不同产地德赢vwin登录 中有效成分的定量分析［J］． 中草药，2007，38( 3) : 452．［6］ 陈敏，肖苏萍，崔光红，等． 管花肉从蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量测定［J］． 中国中药杂志，2005，30( 11) : 839．［7］ 王长林，屠鹏飞，郭玉海，等． 人工栽培管花肉从蓉的化学成分分析［J］． 中草药，2004，35( 6) : 676．［8］ 郭雄飞，吴亚东，倪慧，等． 德赢vwin登录 不同部位有效成分含量的考察比较［J］． 新疆医科大学学报，2012，35( 1) : 48．［9］ 赵奎君，梁丽娟，毕丹，等． HPLC － ELSD 测定肉苁蓉及德赢vwin登录 中半乳糖醇含量［J］． 中国中医药信息杂志，2012，19( 8) : 52．

摘要:目的　研究苯乙醇苷类化合物在狗胃肠道内的代谢规律。探讨中药有效部位体内转化的研究方法。方法　用反相HPLC, 对ig 苯乙醇总苷的狗粪便中的化合物进行分离, 并以含量最高的3 个化合物为标准, 比较不同时间胃肠容物及粪便中的含量。结果　从粪便中分离得到4 个苯乙醇苷类化合物, 分别为松果菊苷( echinacoside, I) 、类叶升麻苷( acteoside, II) 、异类叶升麻苷( isoacteoside, III) 和2′-乙酰基类叶升麻苷( 2′-acetylacteoside, IV) ;经HPLC分析发现, 各成分在胃及小肠运行期间相对比例未发生明显变化, 但在粪便中变化很大, 其中松果菊苷由总苷中的48.0%降低到16.0 %, 而类叶升麻苷由11.0%升高为34.7%。结论　苯乙醇苷类成分的代谢主要发生在大肠, 其中松果菊苷经脱糖反应转化成类叶升麻苷。关键词:苯乙醇总苷;药物代谢;松果菊苷;类叶升麻苷;高效液相色谱法肉苁蓉( Herba cistanches) 为传统补肾、壮阳药物, 其使用频率名列补肾阳药物之首。大量研究[ 1 -4] 表明, 其主要有效成分为苯乙醇苷类化合物。本研究室在多年的研究基础上采用现代提取分离手段, 研究出德赢vwin登录 Cistanche tubulosa(Schenk) R.Wig ht 的有效部位苯乙醇总苷的制备工艺, 使苯乙醇苷含量达到90 %以上, 其中松果菊苷高达48 %, 类叶升麻苷11 %, 并已将其开发成为二类新药。　　近年来, 随着临床药理学、临床药学和生物医学的不断发展, 以及现代分析分离技术的应用, 使洞察药物在体内的运行过程成为可能, 也成为新药从科研到临床的必要环节, 在此基础上发展出一门新兴的边缘学科体内药物学, 即对药物在生物体内的吸收、分布、代谢、排泄过程进行系统研究, 了解药物在体内的吸收变化和消除规律, 从而正确评价药物的安全性与有效性[ 5] 。　　本文对苯乙醇总苷在狗胃肠道内的生物转化进行初步研究, 探讨苯乙醇苷类成分在胃肠道内的代谢规律。对苯乙醇苷类成分体内代谢的研究国内外尚未见报道。本研究采用制备型高效液相色谱法( prep-HPLC) 对粪便中几个含量较高的苯乙醇苷类化合物进行了分离鉴定, 并利用HPLC 对不同时间胃、肠容物及粪便中所含的3 个主要成分进行了相对含量的测定。结果表明苯乙醇苷类成分的代谢主要发生在大肠, 其中含量最高的松果菊苷经脱糖反应转化为类叶升麻苷。本研究可为中药有效部位体内代谢转化的方法学研究提供参考。实验部分　　仪器　高效液相色谱仪( 包括Waters 600 泵,Waters 2487 双波长紫外检测器;Waters 510 泵,Waters 996 光电二级管阵列检测器, Millennium2010 系统工作站) 为美国Waters 液相色谱公司产品, ChromStationtm 数据处理系统( 美国Sage 公司) 。　　材料　动物:德国产纯种Beagle 犬8 只( 体重10 kg 左右) ;药品:德赢vwin登录 苯乙醇总苷( phenylethanoid glycosides, PhGs) ( 本室自制) ;松果菊苷( echinacoside) 和类叶升麻苷( acteoside) 对照品( 自制) ;葡聚糖凝胶LH-20 ( Sephadex LH-20,Pharmacia 公司) ;试剂:分析纯甲醇( 北京化工厂) ,色谱纯甲醇( 天津西华特种试剂厂) , 色谱纯乙腈( Fisher Chemicals 公司) , 重蒸水( 自制) 。　　色谱条件　色谱柱:Waters Spherisorb ODS 柱( 4.6 mm ×250 mm, 5 μm) , Phenomenex kromasilC18柱( 10 mm ×250 mm, 5 μm) ;分析型HPLC 的流动相:乙腈-1 %冰乙酸( 17∶83, V/V) ;柱温:室温;流速:1 mL·min-1 ;检测波长:254 nm, 331 nm( 双波长检测) ;灵敏度:1.000 AUFS 。　　样品处理　禁食24 h 的狗6 只, 1 只作空白, 其余5 只po 苯乙醇总苷, 剂量3 g·kg-1体重, 分别在0.75, 4, 7 和16 h 宰杀后取胃肠空物及24 h 内粪便作为样品( 见表1) 。样品以甲醇为溶剂进行匀浆、离心后取上清液, 浓缩至干, 取少量样品加甲醇溶解。以HPLC 的峰面积作100 %为基准进行相对含量的测定。给药组粪便样品经以上步骤处理后, 除少许留做分析测定, 其余样品先后经Sephadex LH-20 柱色谱分离( 洗脱剂分别为甲醇, 70 %甲醇, 30 %甲醇和水) , 并以聚酰胺T LC 检测, 合并三氯化铁显色阳性的组分浓缩后作下一步分离。最后使用制备型HPLC 进行纯化, 流动相采用不同浓度的乙腈。结果　　从给药组粪便中分离得到4 个苯乙醇苷类成分, 以核磁共振氢谱和碳谱鉴定, 并与标准品的谱图对照。其结构分别为:松果菊苷( echinacoside, I) 、类叶升麻苷( acteoside, II) 、2′-乙酰基类叶升麻苷( 2′-acety lacteoside, III ) 、异类叶升麻苷( isoacteoside, IV) , 其结构式见图1 。利用分析型HPLC, 对上述样品中含量较高的3个主要成分即松果菊苷、类叶升麻苷及1 个未知物进行相对含量的测定。胃、肠及便中成分比例变化见图2 和图3 ;胃肠道成分及便中成分变化的HPLC图见图4 和图5 。讨论　　中药有效成分的药物代谢研究已有大量报道。随着中药现代化的发展, 复方及中药有效部位的体内药物学研究正在引起药物学家的普遍重视, 但由于成分复杂, 这一方向的研究仍处于探索中。本实验以主要成分的积分值作对照, 得出作为肉苁蓉有效部位的苯乙醇总苷在胃肠道中的运行趋势及主要成分的转化规律。　　HPLC 在体内药物学研究中的应用日益广泛。苯乙醇苷类成分极性较大, 有很强的紫外吸收, 尤其适用于反相高效液相色谱法( RP-HPLC) 。为排除样品中内源性杂质的干扰, 采用光电二级管阵列检测器, 通过比较样品各组分的保留时间及紫外图谱,对目标峰进行定性分析。此外, 为减少样品中其它峰的干扰, 采用目标峰峰面积的对比来进行相对含量的测定。　　从图2 -5 可见苯乙醇总苷( PhGs) 在胃肠道内的运行趋势和变化规律。PhGs 在胃中停留0.75 h后主要成分的比例基本未变化, 这是由于在正常胃排空时间内苷键未受到胃液中胃酸及胃蛋白酶的影响。这种状态保持到总苷从胃运行到小肠, 因此在7 h 内肠容物中3 种成分的含量基本没有改变。给药4 h 后胃中药物已大部分排出, 残余的总苷因长期受胃环境的影响, 苷键发生一定程度的水解, 各成分的相对含量发生改变, 其中松果菊苷由原药中含量是类叶升麻苷的4 倍多降至与之相近的水平。在16 h 后的小肠内容物中仅仅检识出极微量的有关成分, 比例未有明显变化。经过近20 h 后胃肠道内的转运, 药物及其代谢物随粪便排出体外, 其中松果菊苷的相对含量大大降低, 仅有16.0 %, 而类叶升麻苷含量高达34.7 %。药物的吸收主要发生在小肠内, 且小分子、低极性的化合物易于吸收。因此比较而言, 类叶升麻苷较松果菊苷更易吸收。而粪便中类叶升麻苷相对含量的急剧增加以及松果菊苷的大大降低, 充分说明松果菊苷在大肠中发生了变化,即在大肠内微生物酶的影响发生水解反应, 脱去一分子葡萄糖转化为类叶升麻苷( 如图6 所示) 。　综上所述, 推测苯乙醇总苷在胃及小肠运行过程中未受明显影响, 其代谢主要发生在大肠内, 松果菊苷经酶作用转化为类叶升麻苷。在大肠中, 由于厌氧菌的主导地位, 尤以还原反应及水解反应为主。本实验的结果验证了有效成分在胃肠道内的代谢特点即为小分子化和低极性化。进一步的研究还在进行中。REFERENCES:[ 1] Sato T, Kozima S, Kobay ashi K, et al .Studies on thepharmacology o f Cistanchis Herba [ J] . YakugakuZasshi, 1985, 105( 12) :1131 -1141 .[ 2] He W, Zong GZ, Wu GL, et al .Initial studies onandrogenic-like function of active compositions inCistanchis Herba [ J] .China J Chin Mater Med ( inChinese) , 1996, 21( 9) :564-565 .[ 3] Jimenez C, Riguera R. Phenylethanoid glycosides inplants:structure and bio logical activity [ J] .Nat ProdRep, 1994, 11( 6) :591-606 .[ 4] Cometa S, Tomassini I , Nicoletti M .Phenylethanoidg lycosides:distribution and pharmacological activity [ J] .Fitoterapia, 1993, 64( 3) :195-217 .[ 5] Zeng JZ.Impo rtance and sig nificance of Biopharmaceuticanalysis [ A] .Zeng JZ.Biopharmaceutic Analysis [ M] .Beijing: China Medical Science and TechnologyPublishing House, 1990 .3 -11 .

李媛，宋媛媛，褚春明，张洪泉”（扬州大学医药研究所，江苏扬州 225001）摘要：目的 探讨肉苁蓉提取物松果药苷（BH）延线衰老的药理作用及其可能的作用机制，方法 小鼠皮下注射 106 D-GAL 10 ml，W1每天1次，连续8周，建立亚急性表老模型，阳性组和BCH各组分别问时灌胃给 予维生素 E40m KF1和 ECH 20 40 60m kg1每天1次。检测小风抗应激绝力，血清中1-2 1-6含量以及脑组织中一氧化素（NOy．超氧化物歧化酶（SOD）和丙二経（MDA）含量。结果 与正常组比较，模型组小风抗应激烧力下降，血清 L-2含量和脑组织 N．SOD含量均显著下降，1-6和脑组织MDA含量显著升高。BCH各剂量组和维生素E阴性对照组均能提高衰老小鼠抗应激能力，血清L-2含量和脑组织N1 SOD含量，降低 L-6和脑组织 MDA含量，结论 ECH能够提高衰老小鼠的免疫能力、NO含量，减轻 D-GAL诱导衰老小鼠的活性氧自由基损伤，这些可能是其延缓衰老的机制之一关键词内苁蓉；松果菊苷；表老；超氧化物歧化酶中图分类号：R282   文献标志码：A   文章编号：1001-2494（2011）14-1077-04肉苁蓉（Heba Cisanchg为常用的传统补益中药，在历代抗老防衰类方剂中仅次于人参占第2位。松果菊苷（echnacoside ECH是肉苁蓉中苯乙醇总苷的主要成分，近年研究表明，ECH具有神经保护，抗炎、促进伤口愈合和保肝”等作用。本实验建立衰老小鼠模型，观察 HCH对各衰老相关指标的影响，研究 ECH对衰老大鼠延缓衰老的作用及其机制，为进一步开发利用 ECH提供实验依据。1 实验材料1.1 实验动物3月龄 IR小鼠，清洁级，26～32号雌雄各半［扬州大学实验动物中心，生产许可证：SCNK（苏）2002-0009使用许可证：SYXK（苏）2002-0045］，动物于实验前适应环境饲养 1周，控制室温 20～22℃.给予充足的标准饲料和饮用水，光照充足，实验过程符合相关动物伦理学要求。1.2 药物与试剂ECH（纯度＞90％，棕色粉末，蒸馏水溶解）（和田帝辰沙生药物开发有限公司）；维生素 E淡黄色透明胶丸，食用油溶解，上海东海制药股份有限公司，批号：090102）；D半乳糖（D-gajaciose D-Gal BioBast n公司，批号：GS0417B2091）；考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒（批号：20090924）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（批号：20090916）、丙二醛（MDA）试剂盒（批号：20091009），NO（批号：20090814）、11-2L6 ELEA试剂盒（批号：20091124），均购自南京建成生物工程研究所；其他所用试剂均为国产分析纯。1.3 仪器722型紫外分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）：ELX8ooUV酶标仪（美国 BiaTk公司）：PT-MR3100D组织匀浆机（瑞士 Popuom公司）：MODEL．550台式冷冻离心机（德国 EPPenddor公司）：BH10S型电子天平（德国 Sanorins公司）。2 实验方法2.1 动物分组、模型制备及给药取 CR小鼠．随机分成6组．即正常对照组，衰老模型组，维生素 F阳性对照组 ECH20． 40和 60mg．k组，每组 36只，雌雄各半，除正常组外，各组按文献1方法制备衰老小鼠模型，注射用水配置10％ DG小鼠颈背部皮下注射10mL·kg，正常组小鼠相应注射等体积注射用水，每天1次，连续8周，同时，正常对照组和衰老模型组每天灌胃生理盐水，容量为20mL·kg，对照组每天灌胃等体积食用油溶解的维生素 E其余3组每天灌胃等体积的 20 40和60 mgkg＇ECH2.2 ECH对小鼠的抗应激的作用2.2.1 耐缺氧实验 取250 ml广口磨口瓶若干只，瓶内放置钠石灰 10多以吸收二氧化碳和水蒸气，每组取 12只小鼠，雌雄各半，分别放入备用的广口瓶内，每瓶一只，在常温常压下，将涂有凡士林的磨口瓶瓶盖严密封紧，自封紧瓶口开始计时，直至呼吸停止，用秒表记录每只小鼠的存活时间。2.2.2 小鼠负重游泳实验 末次给药 24 h后，每组取小鼠12只，给小鼠尾部负重其体重5％的重物，放入水温25℃，水深30m游泳测试箱中，以小鼠头部沉入水面下超过10的时间为标准，记录各组动物游泳时间。2.3 小鼠脏器指数的测定末次给药24 h后，每组取小鼠12只，称体重，摘眼球取血，然后断椎处死，解剖取其胸腺和脾脏，分别称重，计算脾指数和胸腺指数，胸腺指数＝胸腺质量（m号／身体质量（10 ％：脾脏指数＝脾脏质量（mg／身体质量（10号。2.4 血清 L-2和 IL6水平的测定摘眼球取血后，室温放置1b离心（3000 Fmir．10 min分离血清，根据试剂盒使用说明书操作，在酶标仪 450 m处检测各组小鼠血清中 1-2和 IL-6的水平。2.5 脑组织中 NO SOD和 MDA的测定末次给药24 h后，取出胸腺和脾脏后断头处理小鼠，迅速剥离出脑（除掉小脑），称重后，用冷生理盐水制成10％组织匀浆，按试剂盒要求严格操作。NO测定采用硝酸还原酶法，SOD采用黄嘌呤氧化酶比色法，MDA用硫代巴比妥酸法。2.6 统计学处理多组间比较用单因素方差分析，各组间用配对！检验，P＜0.05为统计学上有意义，所有计数资料采用均数 士标准差（）表示，采用 SPS软件通过Pean法进行相关分析。3 实验结果3.1 ECH对小鼠抗应激能力的影响衰老模型组连续给 D-Gal8周后，毛色逐渐枯槁没光泽，易脱落、皮肤弹性差，精神萎靡，倦怠嗜睡，群体喜扎堆，进食明显减少，体质量增加缓慢，呈现出明显衰老体征。与正常对照组相比，衰老模型组耐缺氧时间明显缩短，结果显著（R＜0.01）：ECH组显著改善衰老小鼠的耐缺氧时间，统计结果有差异（R＜0.0L P＜0.05）．与模型组小鼠相比，ECH可延长衰老小鼠游泳时间，低剂量组有差异（P＜0.05）．高剂量组差异显著（R＜0.01），雌雄各组间数据无差异，结果见表13.2 ECH对小鼠脏器指数的影响胸腺和脾脏是机体主要的免疫器官，免疫器官指数可反映免疫器官的发育和免疫细胞的功能状态，间接反映了机体的免疫水平，实验结果显示，ECH能促进衰老小鼠胸腺和脾脏重量的增加，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.01P＜0.05）．雌雄各组间数据无差异，结果见表23.3 EXCH对衰老小鼠血清1-2L-6含量的影响与正常对照组比较，模型组小鼠血清 11-2含量表1 EXCH对小鼠抗应激能力的影响，n＝12±”Tah 1 EffcrofECH on te ansstess biav of aggg mjce n=12%±* Gop300x1ade4ssSwpmge ne?Twu/Nomal2.9±379)40.69±2.679DG421.7±419)21.92±3.85=HH21.71±38户29.47±.3690(ビET32.67±5,429030.90±309)36.3135.139VE30.5±536)37.7815,469wihD.Gajmddgoup 明显降低，血清 1-6含量明显升高，有显著性差异（P＜0 05）：EOH各组能剂量依赖性升高血清 1-2含量．降低 L6含量，与衰老模型组比较，有显著性差异（P＜0.05）．雌雄各组间数据无差异，结果见表3．3.4 ECH对衰老小鼠脑组织中 NOQ SOD MDA的影响与正常对照组小鼠相比，衰老模型组小鼠脑组织中的 NO含量、SOD活性明显降低，而MDA含量则明显高于正常对照组，在统计学上差异显著（P＜0.01），给药后各组脑组织 NO含量、SOD活性和MDA含量与正常对照组相比差异不显著，与衰老模型组相比，差异显著（P＜0.01 P＜0.05）．雌雄各组间数据无差异。结果见表44讨论免疫系统作为一个完整的，自主的系统在维护和调整生命活动中起着重要作用，免疫功能下降是衰老最突出的特征，胸腺、脾脏是动物体内主要的免疫器官，免疫器官的重量是反应机体非特异性免表2 ECH对小鼠脏器指数的影响，12±Tab 2 Effct ofEXH on the vicem] ndex ofagjng mjoe T ＃干x21GmpDomeTHns 서xPhe ndes真.8t!I81Nomal3059±2.059.55±3.44DLRAI1960±3.9430.02±4312023.22±3.7932.35±1.79925.58±3.745.62±4.279602890±3.48*8. 14±4.59)VE29.85±2.1730.42±2.89)注，与正常对照比，2）RC0.01 与视型组比，＜0.05FC0.01表3 ECH对血清 L-2 1-6含量的影响，R＝12Tab:3 Effct ofECH on conens of pertukh-2(L-2) and tekukn6(1-6)a8gmn=12*± GrapDme12표6LA/ m-11-7 /Nome3 8930371)84.15±4.20%18지1.60±0 447)目09011371032.05±0 582)302.07±10089〒2 59±06498.78±7.96*60312±06292.78±8.883A403 30±0.61989.6136.339注：与正常对照比，2RC0.01与型组比 3，PC0 05 1）RC0.01表4 ECH对脑组织 NO． SOO MDA含量的影响，n＝12＊±Tab:4 EffetofECH on he NO SOD and MDA conte ns be bap ssue ofagjngmjce n=12 X±8 GRp

蒙元结束了分裂局面，疆域远比之前辽阔，肉苁蓉的产地叙述不再为西羌，转面用类似唐代形容域内方物的话语描述。药物知识的书写更为重视既有见载药物的药理闹释，面非尚有不足的产地和状貌的叙写。朱丹溪众多方书中以肉苁蓉配伍其他药物的处方极多，描述肉苁蓉生境和状貌的措辞也十分肯定，当为其临床用药经验的总结。但无论是唐宋本草还是（本草纲目》的肉苁蓉修治，或者是炮制前的实际药物形态，都有鳞甲。若朱丹溪所用为真肉苁蓉，以所用所闻记述，极有可能是其从医经历中用以人药的肉苁蓉并非采挖晾晒后的药物品，而是经过刮除鳞甲修治之后的肉苁蓉，可见药物的转运贸易和炮制分工可能较唐宋时期有不少进步。这一时期锁阳的性味首次见载本草，虽然已有与诸多药物配伍治病的记录，但产地和状貌仍旧阔如，与肉苁蓉本草书写早期的状况类似。另外，参照周密《癸辛杂识》的叙写，其所在的药物消费地并非对锁阳生境和状貌茫然不知。再观检（本草衍义补遗》所载的其他药物，鲜有药物产地及状貌的叙写，与《本草衍义》一脉相承，重在既有药物书写的辨伪和药效闸发①，面非补写新近纳人本草书写的新药物知识。延续至明代，肉苁蓉的本草叙写更侧重结合撰者的临床经验，甄别和整理已有的本草知识，炮制、辨伪和用药宜忌三个方面内容的增加较为突出。《本草纲目》接续《重修政和经史证类本草》集合多种本草论著的著述方式，总结已有的本草知识，还在“集解”部分补充了前代本草论著不具的锁阳生境、产地等本草知识。但《本草纲目》之后的历史时期，集合式的巨著书写不再能满足医患的日常需要，以“十剂”“七方”等医理来契领的约简化本草书写，成为当时医家撰述本草的主要呈现方式。药物的生境、状貌等早期本草论著具备的本草知识，不再是医家本草书写的主题。锁阳在这一时期作为肉苁蓉颇为适宜的代用药物，没有类假草苁蓉功效劣于肉苁蓉的忧虑。适用病症和用药宜忌的记录相较元代又有增加，也有较为明确的产地记录，但其生境和生发方式又蒙上肉苁蓉人药初期“马精落地面生”的色彩。《本草纲目》的内容在这一时期的诸多论述中，对肉苁蓉本草知识的整理最为丰富，特别是以药性“补而不峻”解释了肉苁蓉“从容”之名的由来②。整理已有的本草知识之外，肉苁蓉新增的药物知识较少，但大都源自撰书者的临床用药经验，可以呈现这一时期本草知识书写的新变化，例如肉苁蓉的炮制中增加了忌铁器、宜酒蒸的内容③。又由于真肉苁蓉比较难以获得，时人多会以嫩松、金莲根、草苁蓉来伪饰①，并以为肉苁蓉在补肾方面于年长者颇有效用。锁阳本草知识叙写较以往大为增加，《本草纲目》所记最为丰富：【条解】［时珍曰］锁阳出肃州。按陶九成《辍拼录）云：锁阳生鞑和田地，野马或与蚊龙遗精入地，久之发起如笋，上丰下俭，鳞甲栉比，筋脉连络，绝类男阳，即肉苁蓉之类。或谓里之淫妇，就而合之，一得别气，勃然怒长。土人振取洗涤，去皮薄切晒干，以充药货，功力百倍于苁蓉也。时珍疑此自有种类，如肉苁蓉、列当，亦未必尽是遗新所生此。【气味】甘，温，无毒。【主治】大补阴气，益精血，利大便。虚人大使燥结者，啖之可代苁蓉，煮粥弥佳。不燥结者勿用。（震亨）润燥养筋，治癌弱。（时诊）⑥从产地肃州，再到性温无毒、养筋、治痿弱，都是这一时期李时珍对锁阳本草知识书写的增益。此外，陈嘉谟颇为重视药物的产地，所记录的锁阳产地陕西⑦，较李时珍记述的肃州更为广阔，与锁阳的实际产地更为贴近。再有，与前述朱丹溪着重锁阳药物配伍的叙写不同，李时珍更重视锁阳药理的阐释，往往与有着相似功用的肉苁蓉在同一个类目下相邻记载。例如同为补血、疗阴痿及虚寒之药®，治疗“痛风”则是锁阳有面肉苁蓉无的效用9。此外，李时珍引述陶宗仪对锁阳的描述，用以补足此前本草书写不具的锁阳的生境和状貌，却使得锁阳的入药蒙上类似肉苁蓉见载早期”马精落地而生”的边地色彩，并对明以降的锁阳本草知识叙写多有影响。到明代，类似锁阳生境、状貌尚不甚明确的常用药物不多见，有者如茜草生自人血、海蛤自的已有本草知识书写，于医家生民之术卓有贡献①。五种改编本就删繁约简之旨再行推进，卷铁更少，更为简易适用2。因而在约简化的本草书写环境下，晚近人药的锁阳在生境和状貌的叙写上仍旧停留在（本草纲目》的叙事方式之内，药物适应证、归经等药理方面的内容多有闸发。早期本草书写具备的药物状貌、生境、商贸等内容已然在医药分业的影响下，不再出现在当时医家的本草书写中。药物状貌、生境，乃至向所认为受医界影响深刻的地道药材的形成，主要由医家之外的社会群体参与完成和书写。三、本草知识更新与新地道药材名录的形成《本草纲目》之后，医药分业更加成熟，医、药的分离和专业化程度更加显著③，药物状貌、生境乃至新地道药材的形成受医家之外群体的影响越发突出，地志和商贸记录等载体接替了早期本草书写具备的相关内容。药图是产地叙事在本草叙事中的另外一种表达形式，但伴随着医药分业和本草自身约简化书写中产地叙事的淡化，图文不符的问题仍旧未能厘清。诸多旨在让草木书写与插图更为相符的论著中，李中立的《本草原始》和吴其溶的《植物名实图考》可为代表。《本草原始》是李中立在梳理已有记述和考察药材市场之后亲自绘制的药图④，吴其濬更是以宦迹所至的“耳治目验”来撰写（植物名实图考》）⑤。但从两书初刻本所绘制的肉苁蓉和锁阳药图来看，明代李中立所绘儿与药物的实际状貌相同，晚至清代后期的吴其溶所绘与药物实际状貌则相去甚远⑥，图文不符的状况仍旧未能辨明。《本草原始》文字部分本草知识的增益在前文已经梳理，此处不再重复。《植物名实图考》中肉苁蓉和锁阳生境状貌的描述与之前的本草书写几乎无异⑦，但用来撰写书的资料长编摘录了一段颇为有益的记述：二西委谭；甘州多锁阳肉苁蓉，锁阳形甚不雅，茎上生，肉苁蓉生土中，掘得之，形其大，色红 鲜如肉，助（甫）一识之，令卒之田间，摇得异来，俨一大人臂。因悟苏子所主内苁蓉耳，宜其不能仙也。《二百委谭是曾任陕西学政的王世燃所撰。由记述可知，王世懋是从“助甫人”处听闻甘州多锁阳、肉苁蓉的⑨，差道“助甫”从田野间掘来，得见肉苁蓉的实际状貌。甘州多产和鲜品颜色的记录均能补以往本草叙写的锁阳药物知识之阙。就吴其濬的宦迹履历®来看，距肉苁蓉产地最近时是在山西，且任职不满两年竞病逝于山西节署。他很有可能未得亲见肉苁蓉，尚不能甄别王世懋记述的真伪，所以存面不论，仍旧承继前人未加辨明的药物知识。面究本草书写约简化趋势影响下产地和边疆叙事淡化的缘由，主要有以下两个方面：第一，医药知识自身的发展，从开始数量相对较少的药物，到明清至少十倍于《神农本草经》时代的药物，需要用类似五味、四气、十剂等以医理牵引和归类现有药物的整理方式，以提纲挈领的本草书写和更少的卷铁来满足日常医疗实践的现实需要。第二，在这一时期广阔多源的药物产地和长久兴盛的药物贸易的作用下，医药间的分离更加明显。医患能够接触到的药物更多由商贸贩运面来，最先接触的是药物的品质及疗效，产地在此时的作用更像是一种社会文化标签，尤其是距离药物消费地相对更为遥远的边疆药物。比如医家以河西枸杞、肉苁蓉为最佳⑪，其他诸如陕西、山西等地也有品相不错的两药产出，但河西药物本身的品相和已有的医药社会文化标签，使得这一地区枸杞和肉苁蓉的优越仍旧留存在当时的药物贸易记录和医家本草书写的溯源追念之中。与医家本草书写淡化产地叙写并不注重地道药材产地的叙事相比，当时的商业贸易和药物产地的地志书写相对更多的留有这一时期地道药材的生境和状貌叙写，接替了早期本草书写具备的叙事内容。商业贸易记录在反映当时地道药物产地信息方面最为灵敏，但所记录的药物产地又带有当时药材贸易兴盛、医药分离已久的痕迹，药物加工转运之地甚至也路身药物产地之列。以海关贸易统计资料中汉口、宁波、广州三关记录的锁阳和肉苁蓉的产地为例，汉口的肉苁蓉和锁阳为四川、湖北①，宁波的苁蓉记为陕西、锁阳为山西②，广州的肉苁蓉记为四川、山东、直隶。见录的六处肉苁蓉、锁阳产地中实际只有陕西、山西出产，其余四川、直隶、山东、湖北四地均无两药产出的记录，但又的确记为药物产地，与当时颇为繁荣的药物贸易相关。是时在锁阳、肉苁蓉的重要产地之一甘肃的对外贸易路线中，北向托运至宁夏，沿黄河到包头转运京津，直隶的祁州是当时北方重要的药材加工集散地：面京津至广东的水陆交通又相对便利，甘肃南向自文县碧口镇转运至四川，再沿长江东向转运湖北汉口④。再有，即便是医者的药物产地记述也深受当时药材贸易兴盛的影响。陈仁山自清末开始损写《药物出产辨》，是访问药商及同好后面作5，锁阳与肉苁蓉的产地记载为陕西、山西、河南⑩。其中河南也并非两种药物的产地，这当与河南禹州是北方另一处重要的药物加工集散地所在密切相关。地道药材肉苁蓉和锁阳产地的地志记述，与本草书写早期药物产地的清晰描述更为相像。疆域内部产出两药的地区均位于北部、西北部，其中记录有肉苁蓉、锁阳出产的陕西、山西、甘肃、宁夏四处地志的叙写中，陕西、山西和宁夏只载列名称，鲜有名称之外的描述⑦。而甘肃河西及其邻近地区的地志中，肉苁蓉和锁阳的生、状貌描述颇为丰富，确能补相关本草书写之阙。以确有新知的靖远、镇番、肃州三处地志为例；康《重纂靖远卫志》：锁阳，生近道田野中，三月间未出土时，土人能识之，摇取状如山药，粗细长短不等，皮带赤黑色，肉白可生啖，但味甘而涩耳。切片晒干，克药用，功力十倍内苁蓉，出土则不堪用矣。肉九乘《辍耕录》所说大谬。⑧民国（靖远县新志》：锁阳 生沙土中，以九头者为上。制镇阳者用竹子刀切剥，砂锅蒸煮，最忌铁器。采掘时需三九三日冬今，积雪满地，惟生锁阳地，雪落即消。⑨乾隆（镇番县志》：苁蓉伏于地中，通体有辨，似龙形，梭俊柴根所发·····锁阳，三九者佳，和面作饼，味甘可食，入春尚可用，入夏则取以喂系，质老而味苦也，盛夏则枯。茅茨柴所发，发处地当冬而不冻。⑩光绪《肃州新志》：锁阳·出成碱滩中，四月后萌芽，出土如桃如笔，红色，取之口常于严冬掘得口口口，味凝聚特良，至春后生叶，则气散无纹，故又云三九锁阳。⑪靖远地志除细述锁阳鲜品的状貌和味道之外，还指出陶说的讹误，并且叙写了锁阳生长之处雪落即消融，于农历三九寒天采收药效最佳的生长境况。镇番地志进一步记叙了两种药物赖以生发的寄主植物”梭梭柴”和“茅茨柴”。此外，以锁阳、肉苁蓉的生发物候标识当地时令的肃州＠，最先记录了锁阳的生境-“出成碱滩中”，并且主要以尚未萌生出地面的嫩茎人药，过老则不堪药用。以上摘录的地志本草描述，在增益以往本草书写的同时，亦与而今植物学的描述①及当地生民的讲述颇为吻合，确为两种药物实际生境和状貌的叙写。此外，从相关本草书写来看，产于边疆一隅的地道药材肉苁蓉与锁阳，纳入主流医患用药的更多是抽离原有地方性药物利用知识之后的内容。边民作为时令蔬菜等更能反映药物产地的人、药与环境共存的智慧，转面与本草药物产地叙写等内容一道相维淡化乃至消失，与许多同类药物样成为只是具备疗疾祛病单一意象的药物。传统医学往往会以天人合一的理念来理解药物疗效与其状貌、生发方式间的关联。面随着产地生民对既有本草记录的辨伪和相关植物学知识的向外传布，本草书写中“马精落地而生”的说法逐渐委弃。随着医药分离的深化和本草学撰述主题的变更，早期本草书写具备的地道药材等药物知识，转面由医家以外的群体记述，产地的地志、药物运销过程中的贸易记录等载体最先反映了药材地道产区的变化。四、结 语医患用药中的锁阳，最初是因能“补阴气”和治疗“虚面大便燥结”的病症而作为肉苁蓉的代用药物见载。元以降，诸多医家再就两种药物的异同多方闸发，迄至清末，大抵两者的产地、形质、性味、功用、禁忌等几乎相同，业已成为当时医家本草书写的共识2。并且就疗疾药效面言，锁阳与肉苁蓉功力相当甚至略有优长。同样作为代用药物之一但功效不及的草苁蓉，虽为本草书写的记载早于锁阳，但后世对其药理、配伍等内容的闸发远不及锁阳。荒漠野生的寄生植物肉苁蓉，分布和产出都十分有限，代用药或盐润嫩松、金莲根等伪药都曾作为替代药物出现。面类似肉苁蓉和锁阳用以“润燥养筋”的补益药物，本就相对多源，虽各有不同，但相互之间并非不可替代，比如胆的脐就是与两种药物功效相类的补益药物③。肉苁蓉和锁阳除状貌和寄主显著不同之外，药效上显著的不同在于病患若大便不燥结，便不能施用锁阳，相较肉苁蓉，锁阳有更多的禁忌。这或许也是肉苁蓉纳入本草书写至少早于锁阳十个世纪的原因之一。本草书写早期的肉苁蓉本草知识中，产地所在的北部、西北部疆域尚处于变动之中，药物地道产区的本草知识书写也带有是时疆域变动的痕迹。元以来河西混一日久，本草知识不断丰富的同时，药物产地所在的疆域也鲜有变动。大型本草（重修政和经史证类本草）   《本草纲目）纂修和广为流传之后，本草书写的撰述主题发生了明显变更：此之前药物知识不断增加，主要由大型的本草著述尽可能全面地呈现疆域内外各种可以疗疾的药物；此之后直至中西医会通之前，医药分业及两者的专业化程度不断深化，医家主要致力于对瑕瑜并存大型本草进行约简整理，不断涌现更为简易切用的本草书籍，繁多的药物知识也用“十剂”“七方”等医理来契领和约简。代用药物锁阳入药之初的本草知识，已经较（神农本草经》的注解时代大为丰富。最早记录锁阳的《本草衍义补遗》，是以医理约简已有本草书写的早期实践之一。面是时医药分业日趋成熟，纳人主流医患用药的锁阳生境、状貌的描写也并非最先由医家记录，医家之外的士人等群体的记述，大量成为补充医界尚且间如的药物知识的来源。早期疆域变动影响了本草书写中地道药材产区的叙事。至晚在（本草纲目）之时，随着医药分业的深化和本草书写主题变更后药物知识的不断更新，地道药材的名录虽然由医家撰述，但名录的形成已非仅受医患药效评价影响的单一意象。由宋元以来的本草书写来看，疆域变动、环境变化、产地叙事、商业贸易等多种因素均会作用其中，而药物的商业贸易将诸多因素和更为广远的地域纳入同一网络之中。从肉苁蓉及替代药物锁阳，还有宁夏枸杞成为新道地药材的本草内外的药物知识书写来看，约简化的本草书写虽然淡化了地道药材的叙事，但在能敏锐反映一个时期优质药物来源的药物贸易记录中，地道药材的影响并未同本草书写的产地叙事淡化一样减退，医家之外的社会群体仍旧注重地道药材的采选和贩售流通。此外，在医药知识谱系内部，本草是记录药物产地与状貌最为详细的书写体裁。但到本草知识大为丰富、河西混一已久的明清，本草书写主题的增益已非药物生境和状貌的描述。从肉苁蓉和锁阳两种药物最初人药，再到明清着力于约简的本草书写的整个历程，就本草书写反映的本草知识面言，当是其时已经十分通行的本草知识的总结。所呈现的新增药物知识，与前一个时代的本草书写相较是有进步，若与当时实际用于医患疗疾的药物知识相较，已不能视为进益。在明清以来医理约简化趋势影响下的本草书写中，新增但也烦冗的药物知识再难进人这一时代的本草书写，明清留存众多的医案应该更能体现这一时期实际的医药知识水准。

   灵州产草苁蓉，肃州产肉苁蓉①。此外，不论是官方《新修本草》，还是民间孙思邈的《千金翼方》于肉苁蓉知识的损益，不再与马精落地所生相关②。五代迄宋，肉苁蓉本草知识中“马精落地而生”之说渐除，但仍旧留有前代遗绪的影响。这一时期新增加的肉苁蓉本草知识，已经与“马精落地而生”鲜有关联，到吴越日华子撰述时，则依据“采访人”的陈述直指陶说“肉苁蓉马精落地而生”为误③。之后参与编修《嘉祐本草》的宋人苏颂，仿照唐代《新修本草》撰写图经的故事，奉敕采访，并绘制药图兼写图经，在肉苁蓉的本草知识上又有丰富：肉苁蓉，生河西山谷及代都原门，今陕西州都多有之，然不及西羌界中未者，内厚而力紧。旧说是野马速沥落地所生。今西人云大木间及土塑垣中多生，此非游北之所乃有，则知自有种类耳。或疑其初生于马沥，后乃滋挂，如萏根生于人血之类是也。皮如松子有鳞甲，苗下有一细扁根，长尺余。三月采根，采时报取中央好者，以绳穿，阴干。至八月乃堪用。《本经》云：五月五日采。五月恐已老不堪，故多三月采之，西人多用作食品啖之。刮去鳞甲，以酒净洗去黑汁，薄切，合山芋、羊肉作羹，极美好，益人，食之胜服补药。又有一种草苁蓉，极相类，但根短，茎圆，紫色。比未人多取，刮去花，压令扁，以代肉者，功力殊劣耳。又下品有列当条，云生山南岩石上，如藕根，初生振取，阴干，亦名草苁蓉。性温，补男子，疑即是此物。今人鲜用，故少有辩之者，因附见于此。⑤虽从搜集的药物标本中得益颇多，也相信西人讲述的“大木间及土堑坦中多生”-肉苁蓉自有种类的说法，但没有直指陶说为非，而是以“茜根生于人血”来类比，将两种认识进行调和。这一时期，西羌所产的肉苁蓉优于陕西州郡所产，成为“河西山谷及代郡雁门”范围内的优质产地。并且兼带记述了肉苁蓉在“西人”日常生活中作为食品，面非既有本草知识谱系中仅仅作为疗疾药物的利用方式。开始以食疗类药物进入传统的本草医药体系，于之后肉苁蓉纳人更为广远的药物消费地的日常补益和保健有颇为重要的意义。此外，还记述了药效劣于肉苁蓉、状貌却与肉苁蓉相似的两种代用药物草苁蓉与列当。宋时肉苁蓉的产地知识虽沿袭《本草经集注》以来惯用的产地描述-“生河西山谷及代郡雁门”，但也记录有宋朝自身能够获得肉苁蓉的产地所在西州郡多有之”，同时指出“不及西羌界中来者”的局促境况。在宋陕西州郡地处兵燹纷争的边疆，作为优质肉苁蓉产地的西羌，则是与边疆战事息息相关的“四商”所居之地⑥。相较唐时的肉苁蓉产地叙述一肃州福禄县面言，是时这些地区均属西夏，面西夏也以肉苁蓉在同赵宋的推场贸易中获益颇丰⑦。疆城更迭亦体现在这一时期药物产地的话语叙述之中，河西肉苁蓉也从唐代域内的寻常土贡变更为“四裔”居地或是边福州郡产出的药物。二、肉苁蓉代用药物锁阳从元至清的入药史至晚从元代朱丹溪开始，锁阳作为肉苁蓉的代用药物开始见诸本草记载，但药理内容的阐释远比同时期经为医患广泛认可的肉苁蓉要少，与地道药材宁夏枸杞形成初期的状况类似⑧。医家之外的士人对代用药物锁阳的记录远早于朱丹溪，并对锁阳生境、状貌的描述颇为详细。与肉苁蓉相关的本草知识中，同样也少有药物生境、状貌、采收时节等内容的摘录，治疗前述诸多病症的药理网释多有增加。宋代集合诸多本草论著的《重修政和经史证类本草》刊刻之后，又受医药分业渐趋深化的影响⑨，此前本草论著中颇为详细的药物状貌、产地知识开始约简不见。朱丹溪与王好古记述的相关药物知识可视为这一时期医家看法的代表。朱丹溪记曰：肉苁蓉属土，而有水与火，峻补精血，骤用反致动火使滑。河西自从混一之后，人方知其真形，何曾有所谓峰甲者。以酒洗净去黑汁，作羹，黑汁既去，气味皆尽。然嫩者方可作羹，老者苦，入药少则不效。......锁阳 味甘，可啖，煮粥弥佳。补阴气，治虚而大便燥结者用，虚而大使不燥结者勿用，亦可代苁蓉也。①王好古写道：苁蓉，气温，味甘成酸，无毒。《本草》云：主五劳七伤，补中，除茎中寒热痛，养五脏，强阴，益精气，多子，妇人症疲，除脖胱邪气，腰痛，止痢。久服轻身。《波》云：命门相火不足，以此补之。②肉苁蓉在这一时期为医家归入补命门相火类药物，五行归经也得以明晰。王好古受其师张洁古、李东垣的影响频深，《汤液本草》可以认为是集成了三位医家的用药智识，将肉苁蓉归入补命门相火类药物的做法，也影响了之后肉苁蓉本草知识的叙写。朱丹溪载录肉苁蓉的《本草衍义补》，是宋人寇宗爽（本草衍义》的续写，因而在内容上也多有重叠3，增益的新论是明晰了肉苁蓉的五行归经。此外，朱丹溪将锁阳归入补命门类药物，功用、归经已与肉苁蓉颇为相像，并且增补了用药宜忌。再有，锁阳最先在朱丹溪的叙写下纳人本草书写，并对后世本草书写中的锁阳药物知识影响深远，但锁阳为医患熟知的时间则要早于宋元之际。翻检朱丹溪其他论著可见，锁阳已经与诸多药物相互配伍，行“补损”之功效⑤，且与肉苁蓉一道作为治疗血虚的辅助药物在方书的总论部分出现⑥。此外，再以宋元之际文士周密《癸辛杂识》记录颇为详细的锁阳相佐：鞑靶野地有野马与蛟龙合，所遗精于地，遇春时则勃然如笋出地中。大者如猫儿头，笋上丰下俭，其形不与，亦有鳞甲筋脉，其名曰“锁阳”，即所谓肉苁蓉之类也。或谓鞑靶妇人之淫者，亦从而好合之，其物得阴气，到怒而长。土人收之，以薄刀去皮毛，洗涤令净，日干之为药。其力百倍于苁蓉，其价亦百倍于常品也。五峰云：“亦尝得少许。”⑦《癸辛杂识》是浙江吴兴（今湖州）士人周密与“野人時士”交流闻见后的叙写。再有自“或谓”处的听闻，还记有因战乱流寓两湖衡山五峰一带的胡宏（号五峰）也曾获得少许锁阳的追述⑨，又有朱丹溪世居浙江义乌行医的经历相佐。那么可以推知，在朱丹溪将锁阳纳人本草书写之前，锁阳已经在距离原产地遥远的浙江、两湖一带获得了一定程度的认可，是一种可以替代肉苁蓉且药效卓著的药物，在当时医患的用药中较为通行。但（癸辛杂识成书后，仅有零星抄本流传，首次刊刻要晚至《本草纲目》已经梨枣的万历年间⑩，并且《本草纲目》的锁阳状貌叙写是来自元明之际文士陶宗仪（南村辍耕录》的记述，陶著曰：基和田地野马或与蛟龙交，遗精入地，久之发起如笋，上丰下俭，辩甲带比，筋脉连络，其形绝类男阴，名曰锁阳，即肉从（苁）蓉之类。或谓里妇之淫者就合之，一得阴气，扬然怒长。土人掘取，洗涤去皮，薄切晒干，以克药货，功力百信于从容也。⑩随着李著的广为传布，后世本草几乎都会征引陶著中的文字来描述锁阳的状貌及生境。面校读《癸辛杂识）与《南村辍耕录》的锁阳叙写可以看到，陶著的相关内容儿乎由周著简化面来。这也与其读书随笔，摘录的著述指归相符。再有，两书都是朝代更迭之际不愿出仕新朝的土人隐居后所著，又同在江浙一带，惺惺相惜，约简抄录前贤之作也在情理之中。即便（癸辛杂识》和《本草纲目》差不多在同一时期刊刻，但周密在医界的影响力远不及李时珍。故面本草书写体系内的锁阳状貌与生境描述，则要晚至《本草纲目》征引《南村辍耕录》时开始，后世对锁阳“马精落地而生”说法的批驳也直指陶宗仅而非周密。

   以肉苁蓉和锁阳的入药史为例汪燕平，余新忠我国西北和北部农牧交错地带，生长有一种成效显著的先锋治沙植物 -梭梭，其根部寄生有被称作“沙漠人参”的药用植物肉苁蓉，现代药理意义上具有改善性功能障碍、抗衰老、抗疲劳、抗阿尔茨海默病等效用①，目前，肉苁蓉在科学化研究、人工培植和开发利用方面，均有非常出色的成果，但它何以能成为医患疗疾和日常养生用物的药物知识形成史尚待厘清。肉苁蓉早在《神农本草经时代就已成为诸多医患认可的颐养佳药，承传至清末乃至当下面不衰。肉苁蓉的药效如何被发现，以及怎样纳入医患的日常用药均缺乏相关文字记载。而与肉苁蓉产地，效用相似，晚至元代才作为代用药物的锁阳，为理解这一问题提供了路径。锁阳同样是寄生植株，主要以白刺为寄主，也有益于沙化治理和生态改善②。相较这两种北部边疆药物，人们更熟悉的补益药物当属人参。或许是为了更好地借助由人参等物构建的温补文化3影响下的公众认可，在肉苁蓉有“沙漠人参”之称外，锁阳也有“三九锁阳赛人参”的譬喻。锁阳自元代作为医患的日常用药之后，元以降的本草记述中往往与肉苁蓉比邻见载，西北所在是两种药材的地道产区。地道药材宁夏枸杞的形成史业已明晰了地道药材内涵的部分面向，环境变化、商业贸易和社会文化等都会作用于新地道药材的形成，医家记述的地道药材名录是诸多因素综合作用的结果，医药高下并非新地道药材形成的决定性因素④。当然，这也与古代医药分业的境况密切相关⑤。面对肉苁蓉替代药物锁阳人药历程的梳理，又可从药物知识本身更新的角度来理解既有地道药材名录的含义。肉苁蓉和锁阳两种药物相关史实的厘清，除与现实需要、地道药材意涵等关系密切之外，还会对当下的药物史研究有所增益。明代集本草学大成的《本草纲目》，所载药物至少十倍于《神农本草经》，药物种类和产地均有极大的扩展。新增药物的来源中，带有殊异医学文化的域外药物获得了更多研究者的青睐，成果丰硕①。但为医患常用、数量上占绝对优势的国产药物，相关研究多着力于传统药物药理方面的科学化研究，如何融入医患日常生活的相关研究并不多见②。再与中草药深刻嵌人的社会文化生活图景及全球药物史的研究相较，国内相关药物史的研究相对有限。故面本文以肉苁蓉及代用药物锁阳为例，探究药物知识自身的更新和疆域变动、华夏边缘变迁①等因素对地道药材形成的影响，以及边疆物产如何参与到更为广阔的药物消费日常之中的历史。一、汉宋间肉苁蓉药物知识的流变肉苁蓉早在《神农本草经》时代就已作为医患的常用药物见请记载，面产地、效用相似的锁阳则要晚至元代才被纳人医患认可的本草叙事。锁阳最初记录在册的药物知识，都自本草书写已相对丰富且早已获得医患普遍认可的肉苁蓉承继而来，元以降的本草书写中两者也往往比邻记载。因面要厘清替代药物锁阳何以成为医患常用的药物，须从肉苁蓉的本草知识谱系说起。另外，在人工成功培植之前，两种药物产量和生境都十分有限，并未能像人参、枸杞等北方药物那样为人们所熟知，故而两种药物参与的社会生活境况主要从本草书籍中来。这些包含有医家临床经验和已有药物知识的书籍本身，即是医家与患者、社会医药文化互动的知识载体。因而本草医籍并非仅仅是医家所掌握的药物知识的书写，面且可以体现当时的社会医药文化生活状貌。以下论述也以本草医籍为主，兼及其他能丰富两种药物社会文化图景的史籍。肉苁蓉最早记载在作为本草学嚆矢的《神农本草经》之中，当时是作为应天养命、不老延年的上药记载⑤，同时还有“治五劳七伤，补中，除茎中寒热痛，养五脏，强阴，益精气，多子。妇人症瘕。久服轻身”⑥的效用。此时本草书写侧重于肉苁蓉能缓解患者的病痛，产地与所载的其他诸多药物一样尚无明确的记录，仅模糊记述为“山谷”⑦。此外，与《神农本草经》差不多同一时期成书的医家陪葬简牍中⑧，也有肉苁蓉与防风、远志等许多药物一道治疗男子“七伤”之疾的记录⑨。并且此方是由东汉东海王刘疆和中水侯李忠共同奏报的民间智慧，广为流布之后又为武威医家抄录®。可以推知，此方在刻人简牍之前，就已作为民间通行的治疾验方传播。肉苁蓉也并非新近人药，入药和为医患认可的时间要早于汉简记录和《神农本草经》成书之时。《神农本草经》以简面要的撰述方式综述了两汉乃至更早历史时期生民治疗疾病的药物知识，诸多医家为了更好领会《神农本草经》的经义和切于当时医药利用的实际，开始为其作注。以陶弘景的编著存世最多，对后世药物知识发展的影响也更为显著，记述有肉苁蓉药物知识的本草尚有辑佚本的《本草经集注》和《名医别录》存世，于肉苁蓉的药物知识有不少增益，其中关于产地的述论额有意味：内苁蓉味酸、成，无毒。除膀胱邪气、腰痛，止病。生河西及代郡原门。五月五日采，阴干。①肉苁蓉······强阴，益精气，多子，治妇人症痕，除膀胱邪气，腰痛，止痢，久服轻身，生河西山谷及代郡雁门。五月五日采，阴干。代郡雁门属并州，多马处便有，言是野马精落地所生。生时似肉，以作羊肉羹，补虚乏极佳，本可生啖，芮芮河南间至多。今第一出陇西，形扁广，柔润，多花而味甘。次出北国者，形短而少花。巴东、建平间亦有，而不如也。②从引文可见，在适用病症的记述上两书均较《神农本草经》有申发和增加。《名医别录》集两汉魏晋以来多位名医的用药经验而成，重在增加药物的五味分别和适应证的叙写。《本草经集注》对肉苁蓉产地的论述，不同程度地带有与游牧边民额为相关的意象：河西所在，水草丰茂，牛马众多；代郡、雁门本就处于马背族群鲜卑的辖区，出产肉苁蓉最多的芮芮、河南（即柔然、吐谷浑别称）③亦为羌胡所居之地。河西山谷和陇西具体指代的范围多有重叠，再加上“马多处便有”的生境描述，当时的肉苁蓉可以视为一种与边疆、马匹有关的药产。由两书呈现的这一时期药物知识的总体状况之外，再以撰写于这一时期，出土于敦煌的《本草经集注序录》残卷佐证，摘录部分文字如下：今之所存，有此四卷，是其本经。所出郡县，乃后汉时制，疑仲景、元化等所记，又云有《桐君采药录》说其花叶形色。《药对》四卷，论其佐使相须。魏、晋以来，买普、李当之等，更复损益。.....或三品混糅·····医家不能备见，则智识有浅深。今辄芭综诸经，研括烦省。···精担皆取，无复道落，分别科条，区吵物类，兼注明世用土地所出，及仙经道术所须，并此序录，合为三卷。④陶弘景所在的时代，桐君、徐之才、吴普、李当之等医家从不同的角度对《神农本草经进行申发。记载的药物数量、产地、状貌和适用症等方面都有不少进益，但仍有性味讹误、基原未辨等不足。陶著“精粗皆取”、条陈分明地综述了这一时期诸多医家的本草知识，重在“苞综诸经”。从《神农本草经》的概述到《名医别录》和《本草经集注》的丰富，肉苁蓉本草知识的增益与这一过程相适宜。此外，肉苁蓉仍旧作为上品药物见载，上药之所以能不老延年的医理在这一时期又有申发，以其“势力和厚，不为仓促之效，然面岁月将服，必获大益”⑤，所以是应天养命的上药。六朝纷乱结束，隋唐混，肉苁蓉的药物知识又有增加，开始有草苁蓉、肉苁蓉之分的记述。新增的本草知识中，与马匹、边疆有关的意象淡化，开始作为城内方物进行描述和书写。唐代疆域辽间，加上实证纂修方式的采用-绘制药图、撰写图经，使得官方《新修本草》在药物状貌和生境的叙写方面，与六朝时期相比颇有新见。还弥补了陶弘景写书之年“时钟鼎峙，闻见阙于殊方；事非金议，诠释于独学”- 多政权分立，陶氏面于南梁一隅的不足，以“摭陶氏之乖违，辨俗用之纰素”⑥为指归来叙写本草。而具体到肉苁蓉本草知识的增益则有，唐本草以为陶弘景所叙写的苁蓉是草苁蓉刮去花序后所得，药力不及肉苁蓉⑦。纂修是书的同时，绘有颇为实证的药图和解说性文字 图经。药图为精美的彩绘，很难复制流传，因面散佚较早军，部分图经幸得《蜀本草》（图经本草）抄录，得以保存在《证类本草》中⑨。肉苁蓉即是个例之一，其文曰：［蜀本图经云］由肃州福禄县沙中，三月，四月振根，切取中央好者三四寸，绳穿丽干。八月始好，皮如松子鳞甲，根长尺余，其草苁蓉，四月中的来，长五六寸至一尺已来，茎国紫色，采取压令扁，日干。原州、秦州、灵州皆有之。⑲《新修本草》图经已经就草苁蓉与肉苁蓉的外形、采收时节、干燥方式的不同有清晰的分别，肉苁蓉的产地又从“河西山谷及代郡雁门”进一步明晰到肃州福禄县（今甘肃酒泉东南）。虽未直接辩驳马精落地而生苁蓉的生长方式，但长于“沙中”的生境叙写即是实际生长状况的部分描述，较陶氏的叙写更贴近肉苁蓉生长的实际。另外三处产地中，灵州属于河西，秦州（今平凉）、原州（今固原）虽然不属，但与灵州邻近，也可视作肉苁蓉本草知识谱系中更为明确的新增产地。另外，唐代相关地志和方书中也有两种苁蓉的记录。

蔡英傲，赵文瑄，罗煜桐，李敏，李亚峻，王宏国（滨州学院 生物与环境工程学院，山东滨州25600）摘要：利用虹吸原理对管花内苁紫活性成分进行索氏提取，探寻了提取管花内苁蒙适宜的温度、红吸时间、回流次数，从而优选管花内苁蓉提取工艺；利用紫外分光光度计，测定了供试样品的OD值，活性成分的浓度与OD值成正比，能够反映活性成分含量。结果表明：温度为80℃时，回流7次，时间56min，提取的活性成分含量最高。关键词：德赢vwin登录 ；索氏提取法；活性成分中图分类号：R284      文献标识码：A          文章编号：1674-9944（2021）14-0167-03DOI:10.16663/j.cnki.lskj.2021.14.057 1 引言德赢vwin登录 （Cistanche tubulosa Schenk R.Wight） 俗称大芸，为列当科肉苁蓉属，专性寄生于柽柳根部，是一种名贵中药材，素有“沙漠人参”之美誉。原产于新疆、内蒙等地区，在黄河三角洲引种成功，且产量高于原产地。其中松果菊苷类化合物（苯乙醇苷和毛蕊花糖苷）活性成分，具有补肾阳、增强记忆力、调节免疫等功效印，可用于保健食品和功能食品的开发，国内外的许多专家和学者在德赢vwin登录 的人工种植0，化学成分研究、药理作用（、加工工艺和产品开发P～”等方面进行了大量的研究，但索氏提取工艺研究较少。索氏提取法，又名连续提取法，是从固体物质中提取化合物的一种方法，不同的提取时间对提取到的活性物质浓度不同间，考虑到本实验提取时间较短，溶剂消耗少并且不影响活性化合物的提取［］。因此，使用该方法提取德赢vwin登录 活性成分高效、便捷、低成本。2 材料与方法2.1 试验样品采集德赢vwin登录 的有效成分主要分布在根部，挑选生长旺盛的柽柳［，挖出德赢vwin登录 并将其晾干，磨成粉末状备用2.2 试验材料、药品与用具  德赢vwin登录 ，石油醚（沸程：60～90℃），蒸馏水。 电子天平，索氏提取管（由3部分组成：提取瓶，提取管，冷凝器），水浴锅，紫外分光光度计，比色皿，滤纸袋，铁架台，烧杯，圆底烧瓶，锥形瓶，试管夹，橡胶管。2.3 材料的制备与称取用电子天平称取20g德赢vwin登录 干粉末，将其放入3层的滤纸袋中备用，用量简量取200ml的石油醚11（沸程：60～90℃），并倒入圆底烧瓶（250mL）中。2.4 提取装置的组装将有装20g德赢vwin登录 粉的滤纸袋放入提取管中，组装仪器，用水浴锅进行加热，并控制冷凝水的流速适中2.5 试验设计选用石油醚为提取溶液，对提取温度、虹吸次数和回流时间3个因素进行记录，称取4份20g德赢vwin登录 粉，置于250mL圆底烧瓶中，加入10倍量的石油醚，于75℃．78℃，80℃．83 ℃．85℃．90℃的水浴中分别进行提取，统计其回流次数，提取液冷却至室温，定容。测定活性成分的提取量。利用紫外分光光度计测量提取液OD值，每回流一次，记录好时间，以石油醚作为空白对照，将紫外分光光度计的入值调为333nmF．］，放入空白对照进行调零，调零后，将提取液放入进行测量读数，记录每次测量的数值，待数值基本稳定时，记录回流次数。3 试验结果与分析3.1 不同温度下德赢vwin登录 活性成分OD值的测由图1可知：提取温度从75℃随着温度的升高活性成分OD值升高，提取温度80℃时，活性成分OD值最高，温度继续升高，活性成分OD值降低。 图1 不同温度对德赢vwin登录 活性成分OD值的测定3.2 不同温度下的回流次数对德赢vwin登录 活性成分OD值的影响 由图2知：提取温度在75℃时，活性成分OD值随着回流次数的增加逐渐变大，在6次回流后活性成分OD值不再变化，对德赢vwin登录 提取基本完成。图2 75 ℃温度下回流次数对活性成分OD值的影响  由图3可知：提取温度为80℃时，活性成分OD值随回流次数增加变化趋势较75℃时变化趋势大。经过7次回流后德赢vwin登录 提取基本完成，提取效果与75℃相比有了明显的提升。图3 80 ℃温度下回流次数对活性成分OD值的影响  由图4可知：提取温度在85℃时，活性成分OD值的变化趋势较为稳定，但一直保持增长趋势，经过8次回流后德赢vwin登录 提取基本完成。提取效果与80℃相比较有明显的下降，与75℃的提取效果相差不大。图4 85℃温度下回流次数对活性成分OD值的影响  由图5可知：提取温度为90℃时，在第三次回流时，活性成分OD值明显的增多，经过6次回流后德赢vwin登录 提取基本完成。此个温度条件下提取效果与75℃条件下的效果基本一致。          根据前面的试验结果，发现提取温度为80℃提取效果最好，进而又设定了78℃和83℃两个温度梯度。图5 90℃温度下回流次数对活性成分OD值的影响  由图6可知，提取温度为78℃时，德赢vwin登录 活性成分OD值随回流次数的增加不断变大。提取液在第8次回流后OD值保持平稳。 图7 83℃温度下回流次数对活性成分OD值的影响由图7可知：83℃时，德赢vwin登录 活性成分OD值随回流次数的增加不断变大，在第6和第8次之间变化趋势较大，在第9次回流后OD值不在变化，提取完成。提取得到的德赢vwin登录 活性成分OD值与回流次在以上总结中比较各个提取温度提取得到活性成分OD值，发现在80℃时浓度最大，其次是78℃和83℃，继而我们通过计算提取所用时间，寻找最佳的提取温度。由表1可知，当提取度为80℃时，提取液中活性成分OD值最大，所需回流7次，提取总时间为56min。综合提取温度，流次数及所用时间各项因素之后，认为选择提取温度80℃是最适提取活性成分的温度。表1 提取温度，回流次数及所用时间对活性物质OD值得影响提取温度／C回流次数时间／min浓度（CD值）7551180.50278⑭970.610807560.737830.620858510.53190득340.501结论与讨论本试验采用索氏提取法对德赢vwin登录 中的活性成分进行提取，设定不同的提取温度（75℃，78℃．80℃，83℃．85℃．90℃）以寻找最适的提取温度和回流次数。通过对试验数据统计和分析发现：随着提取温度的提高，回流1次所需要时间与提取完成所用的时间均变短，83℃时，由于所需的回流次数增加所以需要的试验总时长增加。提取得到的德赢vwin登录 活性成分OD值与回流次数呈正相关的关系。当提取温度为80℃时提取得到的活性成分OD值最大且提取总时间相对较少为56分钟。提取活性成分OD值，提取时间和回流次数表明利用索氏提取法提取德赢vwin登录 活性成分最适温度为80 ℃．经过7次回流后，对活性成分的提取基本完成。80℃时，试验所需要的温度与85℃，90℃相比能耗低，较为安全。该方法成本低，周期短，简单易操作，为德赢vwin登录 的提取加工和深入研究提供理论依据。参考文献：［1］巴哈尔古丽·阿尤南·徐业勇，郭泉水，等，德赢vwin登录 资源，贸易与人工培核的调查与分析［J］．中国野生植物资源，2013. 32（2）：47-50. ［2］杨建华，胡君萍·热辉·卡斯木，等，肉苁吞苯乙醇总苷对酪氨酸酶活性的按制作用［1］．华西药学杂志，2010.25（5）．533-535．［3］张 娟，鲜德刚，贾晓光，等．德赢vwin登录 提取物安全性评价研究［J］．新疆医科大学学报，2012.35（7）：870-873．［4］贾晓光，新疆常用中草药载培技术［M］．乌鲁木齐：新硬科学技术出版社，2004.84--88． ［5］贾晓光，谢海辉，李 勇，等，德赢vwin登录 化学成分研究

摘要: 目的: 研究德赢vwin登录 苯乙醇苷对巨噬细胞的激活作用，并筛选获得一个复方，研究其对正常小鼠的增强免疫力作用。方法: 通过巨噬细胞激活实验，考察德赢vwin登录 苯乙醇苷提取物对巨噬细胞ＲAW264.7 吞噬活性和TNF－α、IL－6 等分泌的影响; 研究当归、黄芪提取物的配伍对苯乙醇苷提取物的巨噬细胞激活作用的影响; 据此制备复方片剂，通过ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验、迟发型变态反应试验、抗体生成细胞检测、小鼠碳廓清试验和小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验，评价其对正常小鼠的免疫调节作用。结果: 75、100、125 g /L 苯乙醇苷提取物均能提高ＲAW264.7 细胞吞噬活性，以及NO、iNOS、TNF－α、IL－6 水平，其中以100 g /L 苯乙醇苷提取物效果最佳( P ＜ 0.01) ; 并且，当归、黄芪提取物对苯乙醇苷提取物的巨噬细胞激活功能具有极显著的促进作用( P ＜ 0.01) ; 以此为依据制备的复方片剂，0.4、1.2 g /kg·bw/d 组可显著促进淋巴细胞增殖( P ＜ 0.05) 、1.2 g /kg·bw/d 组可显著促进细胞免疫反应( P ＜ 0.05) ，0.4 g /kg·bw/d 组可显著促进抗体生成( P ＜ 0.05) ，1.2 g /kg·bw/d 组可显著提高小鼠碳廓清能力和巨噬细胞吞噬能力( P ＜ 0.05) 。结论: 苯乙醇苷提取物可通过诱导iNOS 表达，刺激巨噬细胞合成NO，同时刺激巨噬细胞释放TNF－α 和IL－6，激活巨噬细胞的免疫调节功能; 以其与当归、黄芪提取物制备的复方片剂，可通过调节细胞免疫、单核－巨噬细胞功能而发挥对正常小鼠的增强免疫力作用，并对体液免疫有积极影响。关键词: 德赢vwin登录 ，苯乙醇苷，当归，黄芪，巨噬细胞激活，增强免疫力列当科植物德赢vwin登录 ( Cistanche tubulosa( Schrenk) Wight) 是《中国药典》收载的肉苁蓉品种之一［1］，主产于新疆南疆地区，是著名的补益中药，“主五劳七伤，补中，除茎中寒热痛，养五脏，强阴，益精气，多子，妇人症瘕，久服轻身”。现代药理学研究表明，肉苁蓉具有抗疲劳［2－3］、抗衰老［4］、保护神经［5］、增强免疫力［6］、润肠通便［7］等多种生物活性，在保健食品开发方面具有独特的优势。苯乙醇苷和多糖被认为是肉苁蓉中的主要活性成分，其中，多糖的调节免疫活性已得到较多研究证实，它可通过免疫球蛋白受体Fcγ 依赖的吞噬作用、TNF－α NF－ κB 通路、糖酵解/糖原异生以及三羧酸循环和呼吸电子运输等实现对巨噬细胞ＲAW264.7的激活作用［8－10］，并可能通过促进细胞内钙释放促进小鼠胸腺淋巴细胞的增殖，通过促进IL－2 分泌提高正常小鼠的脾指数［10－11］。松果菊苷、毛蕊花糖苷等为代表的苯乙醇苷是肉苁蓉发挥药理活性的核心物质基础，但在调节免疫方面的研究则较少。文献报道，肉苁蓉苯乙醇苷能明显增加小鼠血中Mφ 的吞噬能力及免疫器官的重量［12］，松果菊苷为主要成分的肉苁蓉提取物可通过免疫调节等作用拮抗结肠炎，毛蕊花糖苷对免疫器官、免疫细胞和免疫因子均有明显的调节作用，对D－氨基半乳糖和脂多糖致肝功能衰竭小鼠的细胞凋亡和炎症反应也都有明显的抑制作用［6，13－14］，说明肉苁蓉中的苯乙醇苷类同样是很有潜力的免疫调节剂。本文首先研究了德赢vwin登录 苯乙醇苷对巨噬细胞的激活作用，其次，基于传统中医药理论将其与当归、黄芪配伍，通过细胞实验证明3 者对巨噬细胞激活的协同作用，并以此为依据制备复方片剂，通过动物实验考察复方片剂对正常小鼠的细胞免疫、体液免疫、单核－巨噬细胞功能的调节作用，以期为德赢vwin登录 苯乙醇苷在调节免疫产品方面的应用提供数据支持。1 材料与方法1.1 材料与仪器Hank’s 液、ＲPMI1640 培养液、DMEM 培养基、MTT、PBS 购自武汉普诺赛生命科技有限公司;DNFB 购自吴江市青云精细化工厂; SＲBC、豚鼠血清购自广州蕊特生物科技有限公司; ConA、大肠杆菌脂多糖( LPS) 购自美国Sigma 公司; NO 试剂盒、iNOS 试剂盒购自南京建成生物工程研究所;ELISA 试剂盒( Mouse TNF－α、Mouse IL－6) 购自武汉艾美捷科技有限公司; 巨噬细胞ＲAW264.7 购自中国医学科学院细胞中心; SPF 级CI /F1 代健康雌性小鼠( 生产许可证号SCXK( 沪) 2013－0016) 购自上海西普尔－ 必凯实验动物有限公司; 德赢vwin登录 购自和田秋永霞德赢vwin登录 有限责任公司; 当归、黄芪购自新疆九州通医药有限公司。JA2003 电子天平上海上天精密仪器有限公司; JJ－100 电子天平美国双杰公司; SG－603 生物安全柜美国Baker 公司; Varioskan LUX 多功能酶标仪Thermo Fisher Scientific 公司; QP80 二氧化碳培养箱山东博科科学仪器有限公司。1.2 实验方法1.2.1 各提取物及复方片剂的制备德赢vwin登录 苯乙醇苷提取物: 德赢vwin登录 以75% 乙醇溶液提取2次，浓缩干燥，即得( 松果菊苷+ 毛蕊花糖苷: 21.3%，总苷: 41%) ; 当归提取物: 当归以水提取2 次，浓缩后80%醇沉，浓缩干燥，即得( 阿魏酸: 0.3%) ; 黄芪提取物: 黄芪以水提取2 次，浓缩后70% 醇沉，干燥沉淀，即得( 多糖: 32.3%) 。复方片剂: 德赢vwin登录 苯乙醇苷提取物、当归提取物、黄芪提取物按15∶ 18∶ 12 的比例，辅以10% 微晶纤维素、9% 羧甲基淀粉钠、1% 硬脂酸镁混合均匀，湿法制粒、压片( 0.6 g /片) ，即得。1.2.2 苯乙醇苷提取物的巨噬细胞激活作用1.2.2.1 对ＲAW264.7 细胞吞噬活性的影响取对数生长期ＲAW264.7 细胞，胰酶消化后调整细胞数至5 × 106 个/mL，接种于48 孔板( 100 μL /孔) ，37 ℃，5% CO2条件下培养，待细胞贴壁后，PBS 清洗。分别加入DMEM 培养基( 空白对照组) 、LPS( 20 mg /L)和样品( 苯乙醇苷提取物25、50、75、100、125 g /L) 培养24 h，弃上清，加0.075%中性红溶液( 100 μL/孔) ，继续培养1 h，弃上清，PBS 清洗2～3 遍，加细胞裂解液( 100 μL /孔) ，4℃ 下放置2 h，酶标仪测定吸光度( 540 nm) ，计算相对细胞吞噬活性。相对细胞吞噬活性( %) = 处理组吸光度/空白对照组吸光度×100。1.2.2.2 对ＲAW264.7 细胞NO、iNOS、TNF－ α、IL－6的影响按上述方法培养ＲAW264.7 细胞，分别加入DMEM 培养基( 空白对照组) 、LPS( 20 mg /L) 和样品( 苯乙醇苷提取物25、50、75、100、125 g /L) 培养24 h收集上清液，根据试剂盒说明测定NO、iNOS，Elisa 法测定TNF－α、IL－6 含量。1.2.3 苯乙醇苷提取物及其与当归和黄芪提取物的组合物对巨噬细胞激活的作用比较1.2.3.1 对ＲAW264.7 细胞吞噬活性的影响以苯乙醇苷提取物和当归提取物按15∶ 18 的比例混合得到组合物B，以苯乙醇苷提取物、当归提取物和黄芪提取物以15∶ 18∶ 12 的比例混合得到组合物C( 组合物配比依据《中国药典》中各药材的推荐服用量［1］和各提取物的得率折算) 。参照“1.2.2.1”方法，对比苯乙醇苷提取物( A) 、组合物B 和C( 50、75 g /L) 对ＲAW264.7 细胞吞噬活性的影响。1.2.3.2 对ＲAW264.7 细胞NO 释放量的影响参照“1.2.2.2”方法，对比苯乙醇苷提取物( A) 、组合物B和C( 50、75 g /L) 对ＲAW264.7 细胞产生NO 的影响。1.2.4 复方片剂对正常小鼠的免疫力的影响参考文献［15］的操作研究复方片剂对正常小鼠淋巴细胞等的影响。1.2.4.1 分组及处理SPF 级CI /F1 代健康雌性小鼠200 只，体重19.0～21.7 g，随机分五大组，每大组40 只，Ⅰ组进行ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验，Ⅱ组进行耳肿胀试验，Ⅲ组进行抗体生成细胞检测，Ⅳ组进行小鼠碳廓清试验，Ⅴ组进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验。每大组分别设复方片剂低、中、高剂量组0.2、0.4、1.2 g /kg·bw/d( 分别相当于受试样品人体推荐摄入量的5 倍、10 倍、30 倍; 折算人体推荐摄入量，各药材服用量均小于《中国药典》规定的用药量) 和空白对照组，灌胃体积0.1 mL/10 g·bw，空白对照组给予等体积蒸馏水，1次/d，连续灌胃30 d。1.2.4.2 ConA 诱导的小鼠淋巴细胞转化试验灌胃30 d 后，处死小鼠，无菌取脾，制细胞悬液，用ＲPMI1640 培养液调整细胞浓度为3 × 106 个/mL。将细胞悬液分两孔加入24 孔培养板，每孔1 mL，一孔加75 μL ConA 液( 100 μg /mL) ，另一孔作对照，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养72 h。培养结束后，用酶标仪按MTT 法在570 nm 测定OD 值。淋巴细胞增殖能力= 加ConA 孔的OD 值－不加ConA 孔的OD 值。1.2.4.3 迟发型变态反应灌胃30 d 后，每鼠腹部剃毛( 3 cm × 3 cm) ，以10 mg /mL DNFB 溶液50 μL均匀涂抹致敏。5 d 后以10 mg /mL DNFB 溶液10 μL均匀涂抹于小鼠右耳( 两面) 攻击，攻击24 h后处死小鼠，分别以打孔器取左右耳片( d = 8 mm) ，称重。耳重差( mg) = 右耳重( mg) －左耳重( mg) 。1.2.4.4 抗体生成细胞检测灌胃30 d 后，每鼠腹腔注射0.2 mL 2%( v /v) SＲBC 悬液免疫，4d 后处死小鼠，取脾，制细胞悬液，按Jerne 改良玻片法检测溶血空斑数。溶血空斑数= 溶血空斑计数× 320。1.2.4.5 小鼠碳廓清试验灌胃30 d 后，每鼠尾静脉注入4 倍稀释的印度墨汁( 0.1 mL /10 g·bw) ，注入后2 min 及10 min 时分别从眼内眦静脉丛取血20 μL，加入2 mL 0.1% Na2CO3溶液中，用酶标仪在600 nm 处测OD 值，并取胸腺、肝、脾称重，计算胸腺/体比、脾/体比和吞噬指数a。K = ( lgOD1－ lgOD2) / ( t2－ t1) ，a = 体重/ ( 肝重+ 脾重) × K1 /3。1.2.4.6 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验试验前4 d 给每鼠腹腔注射2% 压积羊血红细胞0.2 mL。处死小鼠，腹腔注射加小牛血清的Hank’s液( 4 mL /只) ，轻轻按揉腹部20 次，然后将腹壁剪开一个小口，吸取腹腔洗液2 mL 于试管内。吸取0.5 mL腹腔洗液加入盛有0.5 mL 1% 鸡血红细胞悬液的试管内，混匀。取混合液加入玻片琼脂圈内，37 ℃孵育15～20 min。孵育后将未贴壁细胞洗掉，固定，Giemsa 染色，洗片，晾干，显微镜计数，计算吞噬率和吞噬指数。吞噬百分率( %) = 吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的吞噬细胞数× 100，吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数。1.3 数据分析数据均以珋x ± s 表示，用SPSS 软件对各实验原始数据进行方差分析。以P ＜ 0.01 作为非极显著性差异，P ＜ 0.05 作为显著性差异。2 结果与分析2.1 苯乙醇苷提取物的巨噬细胞激活作用2.1.1 苯乙醇苷提取物对ＲAW264.7 细胞吞噬活性的影响本实验首先研究了25、50、75、100、125 g /L苯乙醇苷提取物对ＲAW264.7 细胞吞噬活性的影响。结果表明，LPS 组细胞吞噬活性相比空白对照组具有极显著差异( P ＜ 0.01) ， 75、100 g /L 组样品可极显著提高细胞吞噬活性( P ＜ 0.01) ，125 g /L 组可显著增强细胞吞噬活性( P ＜ 0.05) ，提示苯乙醇苷提取物具有激活巨噬细胞的作用，见图1。2.1.2 苯乙醇苷提取物对ＲAW264.7 细胞NO、iNOS、TNF－α 和IL－6 释放的影响为了进一步明确苯乙醇苷提取物对巨噬细胞的激活作用，分别检测了巨噬细胞经不同浓度样品刺激后，细胞上清液中NO、iNOS、TNF－ α 和IL － 6 的含量。结果表明，LPS 组NO、iNOS、TNF－α 和IL－6 相比空白对照组均具有极显著差异( P ＜ 0.01) ， 75、100、125 g /L 苯乙醇苷提取物组均能改善ＲAW264.7 细胞NO 生成量、iNOS 活性和TNF－α 分泌水平，50、75、100、125 g /L 苯乙醇苷提取物组还能提高ＲAW264.7 细胞IL－6 分泌水平，其中，100、125 g /L 组样品的作用具有极显著差异( P ＜ 0.01) ，这也提示苯乙醇苷提取物可能通过促进巨噬细胞表达TNF－ α、IL－6 从而激活免疫吞噬功能，见图2～ 图5。2.2 苯乙醇苷提取物及其与当归和黄芪提取物的组合物对巨噬细胞激活作用的比较通过对比苯乙醇苷提取物A、苯乙醇苷提取物:当归提取物( 15∶ 18) 的组合物B、苯乙醇苷提取物:当归提取物: 当归提取物( 15∶ 18∶ 22) 的组合物C 对巨噬细胞吞噬活性和NO 释放的影响，考察3 者是否具有协同增效的作用，为下一步复方片剂的制备提供依据。结果表明，LPS 组细胞吞噬活性和NO 释放量相比空白对照组均具有极显著差异( P ＜ 0.01) ，A、B 仅有高剂量组能提高巨噬细胞吞噬活性和NO 释放量( P ＜ 0.05) ，而以3 种提取物共同制备的组合物C 低、高剂量组均能提高巨噬细胞吞噬活性和NO 释放量，并且，C 高剂量组对巨噬细胞吞噬活性和NO分泌的影响具有极显著差异( P ＜ 0.01) ，即苯乙醇苷提取物、当归提取物、黄芪提取物在激活巨噬细胞方面具有协同作用，故以组合物C 的配比为依据制备复方片剂继续考察其对正常小鼠的免疫调节活性，见图6～图7。2.3 复方片剂对正常小鼠的免疫调节活性为了进一步证明苯乙醇苷提取物、当归提取物和黄芪提取物配伍在增强免疫力方面的实际效果，通过动物实验，综合考察以3 者制备的复方片剂对正常小鼠细胞免疫、体液免疫、单核－ 巨噬细胞功能和NK 细胞活性的影响。2.3.1 ConA 诱导的小鼠淋巴细胞转化试验淋巴细胞的增殖和分化是机体免疫反应中的重要阶段，淋巴细胞受到抗原或者促有丝分裂原刺激时增殖能力的大小，可以反映机体的免疫功能状态［16］。0.4、1.2 g /kg·bw /d 组小鼠淋巴细胞中加ConA 孔与不加ConA 孔的OD 值差值显著高于空白对照组( P ＜ 0.05) ，说明样品可以增强ConA 诱导的淋巴细胞增殖能力，即其可以促进机体的免疫反应，见表1。2.3.2 迟发型变态反应1.2 g /kg·bw /d 组小鼠耳壳增重显著高于空白对照组( P ＜ 0.05) ，说明抗原攻击局部引起了炎症反应导致的肿胀［17－18］，并且样品可以增强这一作用，即样品能够增强DNFB 诱发的迟发型变态反应，综合“2.3.1”结果，可以判定样品能够促进小鼠的细胞免疫功能，见表2。2.3.3 抗体生成细胞检测抗原特异性抗体的产生可以裂解抗原致敏后的绵羊红细胞，从而在抗体形成细胞周围形成溶血空斑。0.4 g /kg·bw /d 组小鼠溶血空斑数显著高于空白对照组( P ＜ 0.05) ，说明样品可以促进抗体生成，即其对小鼠特异性体液免疫有积极影响，见表3。2.3.4 小鼠碳廓清试验单核巨噬细胞系统能够快速吞噬廓清异体颗粒和某些可溶性异物，并可迅速清除自体产生的某些有害物质，是机体最重要的防御系统［19］。1.2 g /kg·bw /d 组小鼠碳廓清吞噬指数a显著高于空白对照组( P ＜ 0.05) ，表明样品可以提高小鼠碳廓清能力，增强单核－ 巨噬细胞系统吞噬功能，并且，“2.2”结果也显示混合物在体外可以激活巨噬细胞，提高其吞噬活性，说明样品可以增强机体的非特异性免疫功能［20］，见表4。2.3.5 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验鸡红细胞对于小鼠是一种较强的抗原，其与小鼠腹腔巨噬细胞共孵育一定时间后，会被吞噬，吞噬百分率和吞噬指数可以反映小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力［21］。1.2 g /kg·bw /d 组吞噬百分率及吞噬指数均显著高于空白对照组( P ＜ 0.05) ，表明样品可以提高巨噬细胞的吞噬能力，综合“2.3.4”结果可以判定样品可以通过影响正常小鼠单核－ 巨噬细胞系统的吞噬功能发挥增强免疫力的作用，见表5。3 结论巨噬细胞在机体内不仅起呈递抗原的作用，还可通过非特异性吞噬病原微生物和肿瘤细胞等维持机体稳态，在宿主防御系统中占重要地位［22］。NO 是杀伤病原微生物和肿瘤细胞的主要物质，激活的巨噬细胞可以合成大量NO，从而杀伤微生物、寄生虫和肿瘤细胞［22］。iNOS 则是其合成的关键酶之一，当巨噬细胞被激活时会大量表达iNOS，进而诱发机体产生NO，可发挥防御作用［22］。TNF－α 和IL－6 则是巨噬细胞分泌的2 种主要炎性因子，不仅参与机体免疫应答反应，而且对机体的免疫反应有重要调节作用［23］。因此，本实验选择这些指标研究德赢vwin登录 苯乙醇苷的巨噬细胞激活作用，并考察其与当归和黄芪提取物的协同作用。结果表明，75、100、125 g /L的德赢vwin登录 苯乙醇苷提取物可显著提高细胞对中性红的吞噬能力，说明其可提高机体的非特异性免疫，并且可能是通过诱导iNOS 表达提高刺激巨噬细胞合成NO，同时刺激巨噬细胞释放TNF－ α和IL－6，激活细胞免疫吞噬功能。此外，当归提取物、黄芪提取物可明显提升苯乙醇苷提取物对巨噬细胞的激活作用，即三者在巨噬细胞激活方面具有协同增效作用。肉苁蓉补肾气、益精血［24］，当归补血活血［25］，黄芪补诸虚不足、益元气、壮脾胃［26］，三者合用，平补阴阳，调养五脏，温而不燥，补而不腻，性味平和，无阴阳偏盛之弊，全方共奏补肾填精养血活血之功效，因而能够发挥增强机体免疫力的功效。动物实验也证明，以3 者作为原料制备的复方片剂，可以提高正常小鼠淋巴细胞增殖能力、促进抗原攻击下的迟发型变态反应、提高小鼠体内碳颗粒被清除的速率、巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力和脾细胞抗体生成能力，但是，对溶血素水平、NK 细胞活性没有积极影响( 数据未列出) 。根据《保健食品检验与评价技术规范》之标准［15］，受试样品在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核－巨噬细胞功能、NK 细胞活性4 个方面任2个方面结果为阳性，即具有增强免疫力功能。因此，可以判定本复方片剂具有增强免疫力功能，且主要是通过调节正常小鼠细胞免疫、单核－巨噬细胞功能发挥增强免疫力作用的。