与OVA组比，＊．P＜0.05：＊＊．P＜0.01．＊··．P＜0.01；与Alum组相比，＊，P＜0.05Compared with OVA group.*.P<0.05:**.P<0.01.*·*.P<0.001:Compared with Alum group.".P<0.05图4 EEWCD对CD4＊和CD8＊T细胞IL-4和IFN-Y分泌的影响Fig.4 Analysis of EEWCD on IL-4 and IFN-y in CD4+ and CD8+ T cells有抗炎，抗病毒，免疫调节等多种功能。利用已经建立的体内疫苗佐剂筛选平台，采用动物试验对荒漠肉苁蓉醇提物进行体内免疫调节活性评价，通过检测DCs成熟和Treg的表达来初步分析其作用机制。在动物模型中，发现 EEWCD针对OVA抗原具有良好的免疫增强活性，在EEWCD免疫的小鼠中未观察到炎症反应和异常行为，提示EE-WCD具有一定的安全性。中草药活性成分对非特异和特异性免疫反应及各类免疫细胞的功能有明显的调节作用，可以促进T／B淋巴细胞的活化、抗原递呈细胞的成熟和功能），且这些免疫调节作用存在一定的量效关系［。试验中筛选到EEWCD-M和EEWCD-H提高OVA特异性1gG抗体滴度2～3倍，仅次于AI-um.且EEWCD没有免疫原性。从MTT试验中可以看出，与Alum相比．EEWCD的3个剂量都可以与OVA组相比，＊．P＜0.05；＊＊．P＜0.01，＊＊＊．P＜0.001；与Alum组相比，．P＜0.05．＊＊，P＜0.01，＊＃＃．P＜0.001 Compared with OVA group.*.P<0.05;**.P<0.01.**.P<0.001;Compared with Alum group..P<0.05,#. P<0.01,*#P<0.001 图3 EEWCD对脾细胞增殖的影响Fig.3 Effects of EEWCD en splenie lymphocyte proliferation用，如黄芪多糖作为口蹄疫疫苗的免疫增强剂能够提供更好的免疫保护作用，枸杞多糖可通过抑制炎症改善过敏性哮喘，人参醇提物具有良好的抗炎活性等，由于中草药活性成分良好的免疫调节活性和安全性，因此，许多中草药用于免疫调节活性物质的筛选研究。本研究选取新疆荒漠地区的益补类中药荒漠肉苁蓉醇提物为研究材料，已有研究表明，肉苁蓉醇提物中主要活性成分是苯乙醇苷，具

CD11c-PE、CD40-FITC、CD80-APC、CD86-APC和 MHCII-FITC避光染色 20 min．FACS检测，Flow-Jo分析结果。1.7 FCAS检测CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg 细胞用eBioscience试剂盒进行检测EEWCD对小鼠CD4＋CD25Foxp3＋Treg 细胞的影响，具体操作：PBS洗涤牌单细胞，CD4-APC和CD25-FITC细胞避光染色20min，用eBioscience Fixation／Perme-abilization buffer的进行固定破膜细胞，室温孵育20 min，Permeabilization buffer 洗涤后，加入PBS 后，FCAS检测，FlowJo分析结果。1.8 EEWCD对小鼠生长状况的影响EEWCD皮下免疫小鼠后，在免疫前和免疫后不同时间点观察小鼠行为，测量小鼠体重，观察小鼠的日常行为，同时，检测EEWCD免疫后对小鼠体重的影响，初步判断EEWCD免疫小鼠后的安全性。1.9 数据分析试验组与对照组的差异通过One-way ANO-VA分析后，用Turkey＇s post-test进行多重比较分析差异性。试验数据采用“x士s”表示。GraphPadPrism 5.0进行绘图和数据分析。P＜0.05表示差异显著。2结果2.1 EEWCD对OVA特异性抗体滴度的影响为了检测 EEWCD对体液免疫的影响，采用ELISA检测了初免后14、21、35和49d小鼠血清中OVA特异性的抗体滴度。从图1中可以看出，EE-WCD的抗体滴度与0.9％NaCl空白对照组相当，免疫后各组的抗体滴度随着免疫时间的增加抗体水平有所增加，与OVA处理组相比，EEWCD-M组和EEWCD-H组在21、35和49d均能够提高OVA特异性抗体2倍左右，抗体滴度为18万～24万，Alum组的抗体滴度为24万～30万。EEWCD-M组和EEWCD-H组抗体水平高于EEWCD-L组，EEWCD-M为最佳剂量组，Alum组为抗体水平最高剂量组。这些结果表明，EEWCD可以提高体液免疫水平。图1 初免后不同时期EEWAR对OVA特异性抗体滴度的影响（n）Fig.1 Detection of IgG titer in different time after immunization(n)2.2 EEWCD对OVA特异性抗体亚类的影响小鼠初免后35d对其抗体分型进行了检测，图2的结果表明，EEWCD-M和EEWCD-H极显著促进OVA特异性1gG水平（P＜0.01），显著促进了IgG1的水平（P＜0.05），与铝佐剂没有显著差异（P＞0.05）；EEWCD-M极显著促进lgGa的水平（P＜0.01）．与Alum相比差异显著（P＜0.05），EE-WCD-H显著促进IgG2的水平（P＜0.05），与Alum相比差异不显著（P＞0.05）。这表明EEWCD不仅可以提高体液免疫水平，也可以促进Th，和Th2的免疫反应，与Alum相比，尤其是可以促进Th，的反应。2.3 EEWCD对脾细胞增殖的影响采用MTT法进行了EEWCD对小鼠脾细胞增殖的检测。首先，采用间接ELISA 检测小鼠初免后21d抗体水平，如图3A所示，EEWCD-L、EE-WCD-M和EEWCD-H均能够显著或极显著促进抗体水平（P＜0.05或P＜0.01）．Alum 也能够极显著促进抗体水平（P＜0.05），EEWCD-M为最佳剂量，且与Alum之间无显著差异（P＞0.05）。在与OVA组相比，＊．P＜0.05：＊＊．P＜0.01；与Alum组相比，＊．P＜0.05Compared with OVA group.*.P<0.05;··.P<0.01;Compared with Alum group.".P<0.05图2 EEWCD对OVA特异性抗体亚型的影响（n＝5）Fig.2 Effects of the EEWCD en OVA-specific IgG subclasses(n=5)此基础上，采用MTT法检测了EEWCD对脾细胞增殖的影响，如图3B-E所示，在OVA和OVA刺激下，EEWCD-L、EEWCD-M和EEWCD-H均能 够显著或极显著促进牌细胞增殖水平（P＜0.05或P＜0.01），EEWCD-M和EEWCD-H的刺激作用 显著高于Alum（P＜0.05）．EEWCD-M为最佳剂量。在ConA和LPS刺激下，EEWCD-L、EEWCD-M、EEWCD-H和Alum对脾细胞增殖的作用也达到了显著或极显著的水平（P＜0.05或P＜0.01），EEWCD-M和EEWCD-H显著高于Alum（P＜ 0.05），且EEWCD-M为最佳剂量。试验结果表明，EEWCD可以促进OVA特异性的脾细胞增殖。2.4 EEWCD对T细胞分泌细胞因子的作用细胞因子在调节免疫细胞功能和防御感染中起重要的作用。为了检测EEWCD对IL-4和IFN-Y分泌的影响，EEWCD加强免疫7d后，分离制备小鼠脾单细胞悬液，与OVA抗原体外共培养后进行CD4＋／IL-4、CD4＊／IFN-y、CD8＋／IFN-Y染色， FACS检测结果如图4．EEWCD-M显著促进CD4＋T细胞IL-4和IFN-y的分泌（P＜0.05），与Alum相比差异显著（P＜0.05）；EEWCD-M极显著促进CD8＋T细胞IFN-y的产生（P＜0.01），与Alum相比差异显著（P＜0.05）。综上表明．EEWCD可以促进细胞因子的产生，尤其促进了IFN-y的产生。2.5 EEWCD对DCs成熟的影响DCs在调节免疫反应中发挥了重要的作用，采用FACS检测了初免后21d小鼠脾细胞中DCs共刺激分子CD80、CD40．CD86和MHCII的表达水平，探究EEWCD对DCs成熟的影响。从图5可以看出，EECCD-M极显著CD40的表达水平（P＜0.01）．EECCD-L、EWCCD-M和EWCCD-H 均能够极显著促进CD80和MHCII的表达（P＜0.01），与Alum相比差异显著（P＜0.05）。EWC-CD-M、EWCCD-H和Alum可以显著增强CD86的 表达（P＜0.05），与Alum相比差异不显著（P＞0.05）。这些结果表明，EEWCD可以促进DCs的成熟，2.6 EEWCD对Treg的影响为了更好地了解EEWCD在免疫应答中的调节作用，小鼠加强免疫后7d，利用FACS检测了CD4＋CD25＊Foxp3＊Treg细胞的变化。如图6所示，与OVA组相比，EECCD-L、EWCCD-M和EWCCD-H极显著降低了CD4＊CD25＊Foxp3＋ Treg频率（P＜0.01），Alum 也极显著降低了 Treg频率（P＜0.01），EWCCD处理组和Alum组没有显著差异，EEWCD可以显著下调Treg的水平。2.7 EEWCD免疫小鼠对体重的影响EEWCD免疫小鼠后，观察小鼠的日常行为，每周称量小鼠的体重，观察整个免疫期间EEWCD对小鼠的影响。在整个免疫期间小鼠无任何异常行为，如没有脱毛、拒食等现象，在同一时间点，各组体重之间无显著差异（P＜0.01），同一组小鼠随着免疫时间的延长体重也在不断增加，详见表2

杨秀梅，杨 雨，王丹阳，张爱莲（新疆大学生命科学与技术学院，新疆生物资源与基因工程重点实验室，乌鲁木齐830046）摘要：旨在探讨新疆野生荒漠肉苁蓉醇提物（ethanol extracts of wild Cistanche deserticola，EEWCD）调节 Thl／Th2免疫反应的特点及初步的作用机制，采用卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）为抗原，研究EEWCD对小鼠体液免疫，细胞免疫，细胞因子分泌，树突状细胞（dendritic cells，DCs）的成熟和调节性T器胞（regulatory T cell，Treg）等的影响。EEWCD低、中、高剂量（分别记作L、M、H）分别与OVA混合．ICR小鼠随机分为0.9％ NaCl，EEWCD、OVA．OVA-EEWCD-L．OVA-EEWCD-M．OVA-EEWCD-H和OVA-铝佐剂免疫组。皮下免疫2次，间隔2周。小鼠免疫后，ELISA法检测抗体滴度及分型，MTT检测牌细胞增殖水平，FACS 检测CD4＊IL-4．CD4＋IFN-y和CD8＋IFN-y的水平，以及DCs表面分子与Treg表达水平。结果显示，EEWCD提高了OVA特异性1gG抗体2～3倍：在初次免疫后21d显著促进1gG，和1gG的表达水平（P＜0.05）；显著促进OVA特异性脾细胞增殖以及T／B细胞的活化（P＜0.05）；显著促进CD4＋IL-4，CD4＊IFN-y和CD8＋IFN-y的分泌（P＜0.05），同时，EEWCD也星著促进了DCs的CD40，CD80，CD86和MHCI的表达（P＜0.05），下调了Treg的水平（P＜0.05）。EEWCD-M为最佳剂量。监测免疫后小鼠行为及体重，小鼠行为没有异常，且同一时间点各组体重之间差异不显著（P＞0.05）。综上表明，EEWCD能够促进OVA特异性的Th／The免疫反应，尤其促进Th型反应，具有良好的免疫调节活性，其作用机制可能为通过激活DCs的成熟，促进1L-4和1FN-y的分泌，降低Treg的水平调节Thi／Th免疫反应的动态平衡。关键词：醇提物：新疆野生荒漠肉苁蓉：Th／The反应；免疫增强；树突状细胞中图分类号：S853.74       文献标志码：A      文章编号：0366-6964（2021）03-0820-11中草药含有多种免疫调节成分，中草药中的黄酮、多糖以及皂苷等具有良好的免疫调节作用近年来，中草药活性成分作为有效的免疫刺激物在防治人和动物多种疾病中发挥了重要的作用。补益类中药一般均能较好地增强机体的免疫功能，提高机体的免疫力，且对正常细胞没有毒副作用，是良好的生物反应调节剂，作为天然、安全生物活性成分的来源用于动物和人类传染病的防治有着不可替代的优势。新疆荒漠肉苁蓉（Cistanche deserticola）为列当科植物，产于我国新疆等荒漠化干旱地区，是一种具有极高药用价值的中草药，有“沙漠人参”的美誉，作为补益类中药在中国等地被普追用作滋补食品已有多年历史，研究者对肉苁蓉已经做了大量的研究，主要针对肉苁蓉有效成分分离、药理作用，药物疗效，肉苁蓉的化学组成等方面开展了深入面细致的研究，分离了百余种化合物，包括苯乙醇苷、木脂素类及生物碱和多糖等成分，可以增强机体的免疫功能，具有抗衰老、抗氧化以及免疫调节等作用。由于不同中草药的活性成分含量有很大的差别，从具有免疫活性的中草药中进行广泛筛选，寻找合适的中草药活性成分对于动物和人类各种疾病的防治具有实际的意义。为了阐明新疆野生荒漠肉苁蓉醇提物对特异性免疫反应的调节性质和强度，基于中药有效成分可通过激活抗原提呈细胞树突状细胞（dendriticcells，DCs）的成熟和功能面发挥重要的免疫调节作用，本研究以新疆野生荒漠肉苁蓉醇提物为研究材料，OVA为抗原，采用皮下途径免疫小鼠，检测体液和细胞免疫反应，以及促进DCs成熟和对Treg的影响，通过深入探究新疆野生荒漠肉苁蓉醇提物对OVA特异性免疫应答的特点和作用机制的初步研究，为筛选具有良好免疫调节作用的中草药活性成分的研究和新型疫苗佐剂的发现提供理论参考。1 材料与方法1.1 材料健康ICR小鼠，雌性（5～6周龄，体重18～22g）购于新疆医科大学动物中心，进行适应性饲养1．周后开始试验。新疆野生荒漠肉苁蓉（EEWCD，其中，苯乙醇苷类化合物含量为17.12％，作者实验室制备）；OVA、噻唑蓝（MTT）、刀豆蛋白A（concanavalin A.ConA）和脂多糖（lipopolysac charide，LPS）均购自 Sigma公司：铝佐剂（ImjectAlum Adjuvant，Alum）购自 Thermo公司；羊抗鼠过氧化物酶抗体（IgG-HRP、IgG1-HRP、IgG2aHRP）购自美国Southern Biotech 公司：Cytofix／ Cytoperm buffer、Perm/Wash buffer、CD4-FITC、 CD8-FITC、IL-4-PE、IFN-y-APC,CD11c-PE、CD40-FITC，CD80-APC、CD86-APC和MHCII-FITC抗 体购自BD公司。Treg染色试剂盒购自 eBio-science公司，其他各类试剂和耗材均为国产或进口产品。1.2 免疫及分组EEWCD用Tween-20：0.9％ NaCl＝1：9溶解。EEWCD与溶解在0.9％ NaC1的OVA配制成疫苗后备用，小鼠免疫抗体检测分组见表1，共分为7组，每组5只小鼠，0.9％ NaCl组为空白对照组，EEWCD为对照组，Alum和OVA为阳性对照组，其他组为试验组。皮下免疫两次，间隔2周，免疫前眼眶采集小鼠血，制备血清后用于抗体检测。MTT、细胞因子、DCs及Treg检测采用同样的策略免疫小鼠，免疫分组见表1，在抗体检测分组的基础上增加了Tween-20为对照组。表1 小鼠抗体水平、MTT检测分组设计（n＝5）Table 1 The group of antibody,MIT detection in immunized mice(n=5)检测项目 Detection item组别Groups动物Animals数量Number疫苗Vaccine抗体水平MTT检测Antibody levelMTT test1ICR小鼠50.9% NaC1+十21CR小鼠5Tween-20十31CR小鼠5EEWCD(EEWCD 400 pg)+十41CR小鼠5OVA(OVAI0 pR)+十5ICR小鼠5OVA-EEWCD-L(OVA10 pg+EEWCD 50 pg)十十6ICR小鼠5OVA-EEWCD-M(OVA10 pg+EEWCD 200 pg)十十7ICR小鼠5OVA-EEWCD-H (OVAI0 pg+EEWCD 400μg)+十8ICR小鼠5Alum(OVA10 pg+Alum 200μg)十十1.3 EEWCD免疫小鼠后抗体滴度及亚类检测EEWCD与OVA皮下免疫小鼠后，小鼠眼眶采血，收集初免疫后各个时间点血清，间接ELISA法检测OVA特异性IgG抗体滴度及分型：将OVA抗原（2.5μg＊mL-）包被96孔板后4℃过夜。将稀释好的血清加入到96孔板中37℃孵育1b．接着，加入IgG-HRP、IgG，-HRP和IgGz-HRP的抗 体稀释液到96孔板中，37℃避光1h，加入TMB显色液，避光显色10～20min后，加入终止液终止反应，酶标仪上检测ODs／ODs的值。1.4 EEWCD免疫小鼠后对脾细胞增殖的检测ELISA 检测初次免疫后21d小鼠血清中IgG抗体水平，验证抗体有效后，采用MTT法检测EEWCD对牌细胞的增殖作用：制备初次后21d牌单细胞悬液，加入96孔细胞培养板后，分别加入20；L浓度为10μg·mL-的OVA，10μg·mL-的OVA 5μg＊mL-的ConA和5pg·mL-的LPS刺激 细胞48h，设置3个复孔，未处理的空细胞和空培养基为对照。刺激后加入20L的5mg·mL-的MTT，37℃孵育3～4h，弃上清后，加入DMSO溶解甲瓒颗粒后，检测ODm／OD-值，计算刺激指数SI（stimulation index，SI）：（OD-ODasa)/(ODe-ODana)。1.5 FCAS检测胞内细胞因子采用 FACS 进行CD4＊IL-4、CD4＋IFN-y和CD8＋IFN-y的检测，具体步骤：初次免疫后21d，制备脾单细胞悬液，将细胞浓度调整为2x10个·mL-，单细胞悬液铺到24孔板细胞培养中，OVA刺激4h，加入Golgi stop 继续孵育12h，收集细胞，Perm／Washing buffer洗涤2次，先进行细胞表面分子CD4-FITC和CD8-FITC染色，避光20 min，细胞用 Cytofix／Cytoperm buffer 进行固定和破膜后，Perm／Washing buffer洗涤细胞后，分别加入IL-4和IFN-y，避光孵育15～20 min，Perm／Wash buffer洗涤细胞后，FACS检测，FlowJo 7.6 软件分析检测结果。1.6 FCAS检测DCs表面分子采用FCAS检测 EEWCD对小鼠脾中DCs的成熟和Treg的影响：制备初次免疫后21d脾单细胞悬液，用PBS洗涤细胞后，进行DCs表面分子

事先用机械铺好1.2m地膜和双毛管代用，选择多枝柽柳、多花柽柳当年生枝条截取长10～15cm、粗0.8～1cm插穗并捆扎成小捆，浸泡生根粉12h后插入铺好的滴管毛管两侧，芽眼向上，地面露高5～8cm，行距30～40cm，株距5～8cm，及时滴水灌溉；依据生长发育节律全年滴水灌溉6～8次，9月前控水确保枝条木质化，浇足冬灌水，确保冬牙饱满；施肥（以N肥为主）4次，施肥量全年600kg·hm；生长发育期间定期抹芽2次：精细管理扦插育苗成活率可达到90％～95％，每公顷优质苗木产苗量8.2万～9.0万株，最多可达10.5万株。1.3 寄主造林与管理1.3.1 灌溉设施布置 以滴灌造林方式为主，滴灌管网铺设根据寄主株行距配置而定，采取行距1m、3.5m宽窄行，滴灌管网按一行寄主一条滴灌毛管布设，滴灌管与条田方向一致，南北向布置，滴头流量为2.0L·h-＇，毛管为黑色PE压力式补偿管，管径18mm，滴头工作压力0.15MPa，滴灌带长度50～80m，一块条田可双向布置滴灌带。支管垂直于毛管，主管和支管用闸阀连接，支管上打孔连接毛管，毛管间距窄行之间1m，滴头间距1m，宽行之间3.5m。寄主株行距配置相应是1mx1m，1mx3.5m，以提高土地利用率和接种率，便于机械化作业。1.3.2 寄主苗木定植 培育德赢vwin登录 应选择沙层厚度在60～80cm以上的沙土地，采用人工植苗造林，春秋两季皆可，春植宜早不宜迟，解冻后立即进行，秋植安排在苗木落叶后，封冻前必须栽完。选用1a生优质大苗、壮苗，严格按技术要求操作，栽植与灌水同步进行；定植前用保水剂溶液蘸苗木根系，定植于每个滴灌管滴头处，每穴定植1株，定植穴直径，深度为30cmx40cm，深度不得低于40cm，把苗木根系垂直平坦放入定植穴中，定植深度以根系以上5～10cm处为标准，覆土后踩实以免跑墒，随栽随滴水。寄主成活率高低是影响德赢vwin登录 产量的关键因素之一，生产中寄主成活率一般必须达到85％以上。1.3.3 寄主定植后接种前管理（1）灌水与施肥节水滴灌，全年灌水4～5次，每次灌水量690㎡·hm。为确保肉苁蓉绿色环保，不可施化肥，有条件的可在定植前施农家肥做底肥。（2）病虫害及杂草防治为确保肉苁蓉品质，病虫害及杂草防治不能采取化学药剂，宜采取物理、生物、人工等方法，防治鼠、兔啃食，定期清除沙拐枣、琵琶柴、芨芨草等田园杂草，保持田园干净透风透光，减少土壤养分和水分损耗，促进寄主健壮生长。2 人工接种肉苁蓉2.1 人工接种前接种纸制作德赢vwin登录 种子寿命非常长，可埋入沙土中数十年而不失去生命力，种子细小而繁多，千粒重0.09g左右，每克种子9000～11000粒。接种前将种子和吸水纸用高锰酸钾消毒待用，先将吸水纸一面刷上消过毒的粘性土，并将处理好的种子均匀撒在吸水纸上，再用同等大小的吸水纸覆盖在上面，晾干待用。2.2 人工接种方法2.2.1 接种时间 春、夏、秋季都可接种肉苁蓉，最佳时间为春季，寄主苗木根系复苏生长迅速，可大大提升接种率。接种年份有2种方式，一是寄主定植时接种，二是寄主造林成活后1～2a内接种。寄主定植时接种肉苁蓉：首先挖定植坑，长60cm、宽40cm，深40～60cm，将长方形坑的一头做成斜面（45＂左右），横放上种子纸，吸水纸面向上，回填适量土，在另一头栽植寄主，回填土，踩实，及时滴水，滴水管铺设在窄行中间。寄主造林成活后1～2a内接种方法有三种。（1）穴式接种在窄行中间距寄主50cm处选择接种坑位置，长、宽，深为40、40、40～60cm。将接种坑底部做成面向寄主的斜面（45左右），种子纸铺在斜面上，吸水纸面向上，回填土，为提高集约化条件下单位面积产量，也可在种子纸上回填适量土，撒上100粒左右的种子（经处理），并与沙土拌匀，将接种坑填平。（2）开沟接种在窄行寄主行间，距寄主50cm处开沟，沟宽40cm，深40～60cm，先将接种沟底做成面向寄主的斜面（45°左右），铺上种子纸（吸水纸面向上），回填土（也可在沟内撒上经处理的种子，平均每株对称100粒左右，每米沟长300粒左右，与回填的适量沙土拌匀），将沟填平。滴水管铺设在寄主与接种穴中间，利用植物根系趋水性，促进寄主根系向肉苁蓉种子方向生长，提高接种机率和产量。（3）机械化接种采用149团林业站研制的肉苁蓉精量播（接）种机RCR-1．RCR-2型），该机性能优越，是以开沟、播（接）种、覆土为一体的肉苁蓉精量播种机。机械接种每米下种量0.2～1g，单位面积用种量控制不超过120g·hm-，开沟器开沟深60cm，宽25cm，接种层数3层，分别距地表25cm，45cm．60cm，工作效率为150h㎡·h-（株行距配置按1、1,1、3.5m），日作业量可达7h㎡，降低劳动强度，提高工作效率，缓解劳动力紧缺，每公顷最少可节约成本5250元，提高接种率，推动林下经济作物发展。3 接种后寄主植物周年管理技术3.1 灌水节水滴灌轮管灌水，采用黑色PE压力式补偿管，每次滴水以渗透深度超过60cm（即地表下60cm处沙土手捏成团、落地上散开），或2窄行寄主地表水印链接合为佳；灌水前，查看土壤墙情，地表干土层达到20cm左右深时要及时按要求完成一次灌水。每年4-9月浇灌4～5次，每次灌水量690㎡·hm．9月底控水，11月底浇足冬灌水，全年确保6次水，全年灌水量不少于4500㎡·hm.3.2 施肥为确保肉苁蓉绿色环保切不可施用化肥（），有条件的可在定植前施农家肥做底肥，不可给已接种上的寄主施农家追肥，以免操作不当致使肉苁蓉掉落，影响产量。可随滴灌给寄主施有机肥，每次施肥量225kg·hm，全年追施3次即可。防治病虫害和清除杂草采取与接种前相同的方法。4 德赢vwin登录 采收与处理德赢vwin登录 接种当年就可采收，实现一次播种多次寄生，一次寄生多次采割，连续收获3～4．a。气温降至-15℃时，德赢vwin登录 就会发生冻害，而北疆冬季最低气温可降至-38℃，为避免冻害，一般应在11月上中旬采收。鲜德赢vwin登录 产量，接种当年一般900～1500kg·hm-，第二、三年为高产稳产期，一般3000～3800kg·hm-，第四年以后产量下降，采收后应复播滴水，灌透灌足。将收获的德赢vwin登录 采取机械或人工方法切片，厚1～1.5cm，摊平晾晒在通风避雨处。切忌暴晒，以免肉苁蓉片卷曲，影响品质。

葛廷进＇，吕瑞恒2，王峰3，朱海东＇，陈家力（1．新疆生产建设兵团林业工作管理总站，乌鲁木齐830013：2．塔里木大学 植物科学学院，新疆 阿拉尔 843300：3．新疆生产建设兵团 第八师149团，新疆 石河子832052：4．新疆生产建设兵团第十二师西山农牧场农业发展服务中心，乌鲁木齐830089）摘要：天然分布并主要载植于南疆地区的德赢vwin登录 具有重要药用价值。针对其载植技术尚不完备的问题，在实践经验基础上，提出了北疆地区德赢vwin登录 栽培技术，包括寄主植物和土地选择，适宜寄主多枝柽柳、多花柽柳育苗及造林技术，接种时间与方法，接种后寄主施肥，灌溉，病虫及杂草控制技术，产品收获与处理技术等，可为北疆地区德赢vwin登录 栽培推广提供技术参考。关键词：德赢vwin登录 ；栽培技术；接种；寄主；新疆北部中图分类号：S567.2318725.7    文献标志码：B    文章编号：1001-2117（2021）03-0110-03Cultivation Techniques of Cistanche tubulosa in Northern XinjiangGE Ting-jin',LV Rui-heng,WANG Feng',ZHU Hai-dong',CHEN Jia-li(1.Forestry Work Station,Xinjiang Corps of Production and Comstruction,Urumqi,Xinjiang 830013;2.College of Plant Science and Technology,Tarim University,Alar,Xinjiang 843300;3.149 crops,8th Division,Xinjiang Corps of Production and Construction,Shihezi,Xinjiang 832052;4.Agriculture Seivice Centre of Xishan Farm.12th Division.Xinjiang Corps of Productionand Construction,Urumqi,Xinjiang 830089)Abstract:Cistanchetubulosa has an important medicinal value and has been widely cultivated.This re search takes as an example of Cistanche grown by the Xinjiang Production and Construction Corps 149 Regiment.Cultivation and management technologies were developed,regarding host plant and site se lection,host plant breeding and planting,Cistanche inoculation,post-inoculation irrigation,fertili-zation,disease and pest control,product harvest and treatment.Key words:Cistanche tubulosa;cultivation;inoculation;Northern Xinjiang德赢vwin登录 （Cistanche tubulosa）为列当科（Orobanchaceae）肉苁蓉属多年生寄生草本植物，因具有重要药用价值而受到广泛重视，新疆南部既是其天然分布区，也是主要的人工大面积栽培区，受客观条件限制，栽培模式、规模化高效栽培技术不成熟。为此，在第八师149团生产实践基础上，总结提出新疆北部德赢vwin登录 人工栽培技术，以期促进德赢vwin登录 规模化产业化发展。1 寄主植物的选择与造林技术寄主植物的选择 1.2 寄主育苗柽柳属植物是德赢vwin登录 的寄主，我国现有     育苗方法采用膜下滴灌扦插育苗法，每年419种，其中新疆分布有15种，试验成功接种者有多枝柽柳、多花柽柳、蜜花柽柳、异花柽柳、甘肃柽柳、中国柽柳、紫杆柽柳、塔里木柽柳、白花柽柳、垂枝柽柳等，其中接种率较高者有多枝柽柳、多花柽柳、蜜花柽柳。原生于重度盐碱土壤的长穗柽柳、短穗柽柳、细穗柽柳、短毛柽柳等，不但接种率低，而且栽植在盐碱度较低的地段反而生长发育不良，影响德赢vwin登录 产量-，不宜作为寄主植物选择利用。北疆地区德赢vwin登录 栽培寄主应主选多枝柽柳、多花柽柳。

摘要：目的　探讨肉苁蓉总苷对血管性痴呆病人认知功能和血清ｐ－ｔａｕ蛋白表达的影响。方法　采用随机数字法将１９８例血管性痴呆病人随机分为治疗组和对照组，各９９例。两组均给予基础治疗，对照组采用脑复康治疗，治疗组采用肉苁蓉总苷治疗。治疗结束后比较两组治疗效果、认知功能及血清ｐ－ｔａｕ蛋白表达水平。结果　治疗后，治疗组有效率明显高于对照组（９０．９１％与８２．８３％，Ｐ ＜０．０５），治疗组简易精神状态量表（ＭＭＳＥ）、临床痴呆程度量表（ＣＤＲ）评分及血清ｐ－ｔａｕ浓度均明显优于治疗前及对照组，差异均有统计学意义（Ｐ ＜０．０５）。治疗组住院时间较对照组明显缩短，住院费用明显降低，且出院时日常生活活动能力评分明显低于对照组，两组比较差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０５）。结论　肉苁蓉总苷可有效改善血管性痴呆病人认知功能，有利于缩短住院时间，提高日常生活能力，其机制可能与降低病人血清Ｐ－ｔａｕ蛋白水平有关。关键词：血管性痴呆；肉苁蓉总苷；血清ｐ－ｔａｕ蛋白；认知功能；简易精神状态量表；临床痴呆程度量表；日常生活活动能力　血管性痴呆与阿尔茨海默病同属于老年期痴呆的主要类型，病人认知功能障碍主要由于血管相关疾病因素导致［１］。有研究证实，肉苁蓉总苷可有效改善老年痴呆病人的认知功能［２］，目前针对肉苁蓉总苷改善血管性痴呆病人认知功能的机制未完全明确。已有报道指出，老年斑属于阿尔茨海默病特征性病理改变之一，且超微结构分析结果显示，老年斑的主要组成成分包括ｐ－ｔａｕ蛋白［３］。本研究探讨肉苁蓉总苷对血管性痴呆病人认知功能的影响，并进一步分析其影响机制，旨在为临床治疗血管性痴呆提供依据。１　资料与方法１．１　一般资料　本研究选取２０１４年５月—２０１６年５月我院收治的血管性痴呆病人１９８例为研究对象。１．１．１　入组标准　经颅脑ＣＴ或ＭＲＩ扫描确诊为血管性痴呆，性别不限；首次住院治疗，病程＞６个月；总体衰退量表（ＧＤＳ）评分≥２分；Ｈａｃｈｉａｓｋｉ缺血量表（ＨＩＳ）评分≥７分；短期内未服用改善认知功能药物；临床资料完整。１．１．２　排除标准　合并恶性肿瘤；严重精神疾病；短期内可能死亡；临床资料不全；拒绝或放弃治疗。１．２　研究方法１．２．１　分组　采用随机数字表法将１９８例血管性痴呆病人分为对照组和治疗组，各９９例。１．２．２　治疗措施　两组均给予肠溶阿司匹林（哈尔滨天地药业有限公司，国药准字Ｈ２３０２３１６７）每次１００ｍｇ，每日１次口服；尼莫地平（亚宝药业集团股份有限公司，国药准字Ｈ１９９９９２２５）每次３０　ｍｇ，每日３次。对照组加服吡拉西坦片（脑复康片，宜昌人福药业有限责任公司，国药准字Ｈ４２０２２１３０）每次８００　ｍｇ，每日３次。治疗组加服肉苁蓉总苷（江苏康缘药业股份有限公司，国药准字Ｚ２０１４３０１３），每次２粒，每日３次。两组均连续服药１６周。１．２．３　观察指标　收集两组性别、年龄、病程、高血压、糖尿病、吸烟、饮酒、受教育年限等基本信息。评价两组临床疗效，采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）测定两组血清ｐ－ｔａｕ蛋白水平，以酶标仪测定４５０　ｎｍ波长下吸光度（ＯＤ值），血清ｐ－ｔａｕ蛋白浓度采用标准曲线进行计算。人ｐ－ｔａｕ蛋白试剂盒购自上海恒远生物科技有限公司。记录两组住院时间、住院费用，采用日常生活活动能力（ＡＤＬ）评分评价病人日常生活能力。采用简易精神状态量表（ＭＭＳＥ）及临床痴呆程度量表（ＣＤＲ）评分评价两组治疗前后认知功能。１．３　临床疗效判定标准　显效：主要症状基本恢复正常，可生活自理，定向健全；有效：治疗后主要症状基本恢复正常，生活基本能自理，反应一般；无效：治疗后主要症状较前无明显变化，生活无法自理，定向不健全，反应迟钝。１．４　统计学处理　本研究数据采用ＳＰＳＳ　２０．０统计分析软件（美国ＩＢＭ 公司）进行处理。计量资料以均数±标准差（ｘ ±ｓ）表示，多组间比较采用单因素方差分析或重复测量方差分析，组间两两比较采用ＬＳＤ－ｔ检验；计数资料以百分率（％）表示，采用χ２ 检验。以Ｐ ＜０．０５为差异有统计学意义。２　结　果２．１　两组一般资料比较（见表１）２．４　两组治疗前后血清ｐ－ｔａｕ浓度比较　治疗前，两组血清ｐ－ｔａｕ浓度比较，差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）；治疗后，两组血清ｐ－ｔａｕ浓度明显低于治疗前，且治疗组明显低于对照组，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。详见表４。２．５　两组住院时间、住院费用、日常生活能力比较　治疗组住院时间较对照组明显缩短，住院费用明显降低，两组比较差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０５）；治疗组出院时ＡＤＬ评分明显低于对照组，差异有统计学意义（Ｐ ＜０．０５）。详见表５。３　讨　论　　流行病调查结果表明，我国６５岁以上人群血管性痴呆患病率为１．１％，占痴呆总患病率３０％左右［４］，因此有必要探讨血管性痴呆的发病机制及不同药物治疗血管性痴呆的疗效。肉苁蓉总苷提取自北疆产盐生肉苁蓉，主要活性成分包括苯乙醇苷类，有研究证实，肉苁蓉总苷是一种强抗氧化剂，可有效清除体内自由基，最终发挥神经保护及促进神经功能恢复的作用，大量临床研究证实该药物对多种神经系统疾病效果显著［５－６］。　　动物实验研究结果显示，肉苁蓉总苷可提高阿尔茨海默病模型鼠学习能力，分析其机制包括提高自由基清除酶活性，降低脂质过氧化反应，减少脑组织钙含量及抑制喹啉酸诱导的脑细胞凋亡；相关研究对β－淀粉样肽导致的阿尔茨海默病小鼠模型发现，肉苁蓉总苷可改善模型组小鼠学习记忆能力，下调阿尔茨海默病小鼠脑组织丙二醛浓度，促进超氧化物歧化酶的激活，提示肉苁蓉总苷具有神经保护功能［７－９］。本研究结果显示，治疗组临床疗效及ＭＭＳＥ、ＣＤＲ评分均明显优于对照组，提示肉苁蓉总苷可有效改善血管性痴呆病人的认知功能，与超微结构提示肉苁蓉总苷可延缓脑组织衰老退化结论一致。　　ｔａｕ蛋白是一种磷酸化蛋白，病理情况下被异常磷酸化，丧失维持微管运输功能，在细胞内以磷酸化形式（ｐ－ｔａｕ）沉积，形成神经原纤维缠结，最终导致认知功能受损［１０］。有研究表明，异常ｐ－ｔａｕ水平升高提示脑实质内有神经纤维缠结形成［１１－１２］。多项临床研究证实，阿尔茨海默病病人脑脊液ｐ－ｔａｕ蛋白浓度显著高于健康人群；另有研究表明，癫痫病人认知功能改善可能与ｐ－ｔａｕ蛋白水平降低相关［１３－１５］。本研究结果显示，治疗组血清ｐ－ｔａｕ蛋白水平较治疗前及对照组均明显降低，提示血清ｐ－ｔａｕ蛋白水平降低可有效改善血管性痴呆病人认知功能。　　综上所述，肉苁蓉总苷可有效改善血管性痴呆病人认知功能，有利于缩短住院时间，提高日常生活能力，其机制可能与降低病人血清ｐ－ｔａｕ蛋白水平有关。参考文献：［１］　韩颖，崔鹏，王娇兰，等．不同治疗方法对血管性痴呆患者认知功能的影响［Ｊ］．中国老年学杂志，２０１３，３３（１１）：２５０９－２５１１．［２］　颜贵卉，田金虎，龙本文．肉苁蓉中苯乙醇苷类成分的研究进展［Ｊ］．中南药学，２０１２，１０（９）：６９２－６９５．［３］　方宇，张璐．脑脊液磷酸化ｔａｕ蛋白及β淀粉样蛋白检测在老年期痴呆患者早期鉴别诊断中的价值［Ｊ］．中国老年学杂志，２０１１，３１（７）：２５６１－２５６２．［４］　ＳＵＮ　Ｊ　Ｈ，ＴＡＮ　Ｌ，ＷＡＮＧ　Ｈ　Ｆ，ｅｔ　ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｄｅｍｅｎｔｉａ：ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ｒｅｖｉｅｗ　ａｎｄ　ｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｊ　Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ　Ｄｉｓ，２０１５，４６（３）：６１１－６２９．［５］　冯银玲，陈金，张艳梅，等．ＧＣｓ对血管痴呆大鼠认知功能及海马脑区ＮＦ－κＢ表达影响的实验研究［Ｊ］．中风与神经疾病杂志，２０１３，３０（１１）：９９７－１０００．［６］　ＶＥＮＫＡＴ　Ｐ，ＣＨＯＰＰ　Ｍ，ＣＨＥＮ　Ｊ．Ｍｏｄｅｌｓ　ａｎｄ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｄｅｍｅｎｔｉａ［Ｊ］．Ｅｘｐ　Ｎｅｕｒｏｌ，２０１５，２７２：９７－１０８．［７］　李娜，李文玲，董长征，等．神经肽Ｙ基因转染对大鼠癫痫发作及海马磷酸化ｔａｕ蛋白的影响［Ｊ］．中华行为医学与脑科学杂志，２０１４，２３（２）：１０４－１０６．［８］　董亚莉，李剑锋．不同质量浓度肉苁蓉总苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞样细胞的定向分化［Ｊ］．中国组织工程研究，２０１２，１６（１）：１０３－１０６．［９］　ＭＣＧＵＩＮＮＥＳＳ　Ｂ，ＣＡＲＳＯＮ　Ｒ，ＢＡＲＲＥＴＴ　Ｓ　Ｌ，ｅｔ　ａｌ．Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｐｓｉｌｏｎ　４　ａｎｄ　ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｉｎ　Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ′ｓｄｉｓｅａｓｅ　ａｎｄ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｄｅｍｅｎｔｉａ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ　Ｌｅｔｔ，２０１０，４８３（１）：６２－６６．［１０］　梁国聪，石胜良，毕桂南，等．β淀粉样蛋白和ｔａｕ蛋白在血管性痴呆发病机制中的作用［Ｊ］．广西医科大学学报，２０１１，２８（５）：６６１－６６４．［１１］　ＭＡＲＣＥＬＯ　Ａ，ＢＩＸ　Ｇ．Ｔｈｅ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｐｅｒｌｅｃａｎ　ｄｏｍａｉｎ　Ｖ　ａｓｎｏｖｅｌ　ｔｈｅｒａｐｙ　ｉｎ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｄｅｍｅｎｔｉａ［Ｊ］．Ｍｅｔａｂ　Ｂｒａｉｎ　Ｄｉｓ，２０１５，３０（１）：１－５．［１２］　张媚，熊莉君．轻度认知功能损害患者血清磷酸化ｔａｕ蛋白水平变化及其临床意义［Ｊ］．中国现代医学杂志，２０１４，１１（１２４）：７９－８１．［１３］　王珊珊，郑加平，董丽华，等．轻度认知功能障碍患者认知损害及与血清ｐ－ｔａｕ蛋白的相关性研究［Ｊ］．中华临床医师杂志（电子版），２０１５，９（１７）：３２１０－３２１３．［１４］　ＪＩＡ　Ｈ，ＺＨＡＮＧ　Ｘ　Ｍ，ＺＨＡＮＧ　Ｂ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｏｆｎｅｕｒｏｎｓｉｎ　ｍｅｄｉａｌ　ｐｒｅｆｒｏｔａｌ　ｃｏｒｔｅｘ　ａｎｄ　ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ　ｉｎ　２ＶＯ　ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２０１２，３３（５）：１０６３－１０７０．［１５］　ＫＡＬＡＲＩＡ　Ｒ　Ｎ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｃｏｇｎｉｔｉｖｅｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｄｅｍｅｎｔｉａ　ｗｉｔｈ　ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ′ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ａｃｔａ　Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ，２０１６，１３１（５）：６５９－６８５．

摘要：本研究建立了紫外-可见分光光度法测定肉苁蓉中多酚类物质（以没食子酸计）含量的方法。当乙醇浓度为70%、温度为60℃、提取时间为30min、料液比为1：20时，肉苁蓉中多酚类物质（以没食子酸计）的提取效果最好。同时肉苁蓉样品中多酚类物质（以没食子酸计）的平均质量百分比为0.2422%。精密度、稳定性和加标回收结果显示该方法可行可靠。关键词：肉苁蓉；紫外-可见光分光光度法；多酚类物质；没食子酸肉苁蓉素有“沙漠人参”之美誉，它具有改善性功能障碍、抗衰老、抗疲劳、抗阿尔兹海默症等效用[1]，具有极高的药用价值，是中国传统的名贵中药材。同时肉苁蓉还可入菜，李保定研究出具有独特风味的肉苁蓉炖鸡滋补类菜肴[2]。主要产于甘肃、新疆等地。植物单宁，又称植物多酚，是一类广泛存在于植物体内的多元酚化合物，是植物的次生代谢产物，大部分存在于植物的果皮中[3]。多酚具有抗病作用、抗衰老、抗氧化、抗癌防癌、抗诱变、抗病毒、抗微生物、减缓骨质疏松、健齿、降血脂和血糖等很多方面具有良好的作用。植物总多酚常用的含量测定方法有高锰酸钾法、紫外-可见光分光光度法、原子吸收光度法、化学发光发等[4]，本实验对紫外-可见光分光光度法进行了研究，以没食子酸为标准品，确定了肉苁蓉提取的最佳条件（乙醇含量、料液比、提取时间、提取温度），并对肉苁蓉中多酚的含量进行了测定。1 仪器与试剂仪器：756型紫外-可见分光光度计（上海旦鼎国际贸易有限公司）、1cm石英比色皿（宜兴创新光学玻璃有限公司）、KH3200DB 数控超声波清洗器（上海双旭电子有限公司为）、HH-4数显恒温水浴锅（聚创环保）、电子天平（梅特勒-托利多）、TG16高速台式离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）。试剂：肉苁蓉（甘肃省酒泉市瓜州县）、没食子酸（标准品，sigma公司）、无水乙醇、Folin-酚试剂、碳酸钠，均为国产分析纯。2 实验方法2.1 溶液的配置2.1.1 没食子酸标准储备液的配制准确称取0.2500g 没食子酸，先用5mL 乙醇进行溶解，再用蒸馏水准确定容至50mL（现配），浓度为5000mg/L；2.1.2 没食子酸工作液的配制分别准确移取没食子酸标准储备液0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL至25mL容量瓶中并用蒸馏水进行定容。浓度分别为：0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mg/L。2.1.3 肉苁蓉供试品溶液的制备将在阴暗通风处进行自然风干的肉苁蓉原料进行粉碎后过40目筛。然后准确称取粉末状肉苁蓉样品1.0000g，先用25ml乙醇（70％）进行初步溶解，再在水浴（60℃）中进行超声提取，提取时间为20min，料液比为1：30，最后定容至50ml。2.2 工作曲线的绘制测定方法为Folin-酚[5]法，具体操作如下：分别吸取0.5mL不同浓度的没食子酸工作液加入到50mL容量瓶中，分别加入30mL蒸馏水混合、2.5mL的Folin-酚试剂，混匀；5min内加入7.5mL质量分数为20％的Na2CO3溶液，混合并定容至50mL；将上述配置的溶液在20℃下放置2h后，在760nm下测定吸光值[6]。然后以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，见图1，得到线性回归方程Y=0.3372X+0.1992，R2=0.9925。3 实验结果与讨论3.1 肉苁蓉中多酚类物质提取条件的优化3.1.1 乙醇含量的确定多酚类物质极易溶于乙醇溶液中，所以分别用50％、70％和90％的乙醇溶液作为提取液，考察乙醇含量对多酚类物质的提取的影响。测定结果见图2，由图可知，当温度为60℃，提取时间为30min，料液比为1：20 时，乙醇含量为70％时，提取效果最好。3.1.2 提取温度的影响温度对物质的溶解度有较大的影响，所以以温度25℃、60℃、90℃为变量，确定最佳的提取温度。测定结果见图3，由图可知，当乙醇含量为70％，提取时间为30min，料液比为1：20 时，60℃提取效果最好。3.1.3 料液比的选取选择合适的料液比能使提取液发挥最大的效用。故本实验选择1：20、1：30、1：40的料液比进行实验。测定结果见图4，由图可知，当乙醇含量为70％，提取时间为30min，温度为60℃时，料液比为1：20、1：30和1：40的测定结果差别不大，本着节省原材料的原则，故料液比选择为1：20时较好。3.1.4 提取时间的确定溶解速度的快慢决定着提取时间的大小，为使溶解充分，需确定最佳提取时间，分别以10min、20min、30min为提取时间进行实验，测定结果见图5，由图可知，当乙醇含量为70％，料液比为1：20时，温度为60℃时，30min效果最好，提取时间为30min为最佳提取时间。3.1.5 肉苁蓉中多酚提取最佳条件的确定分别以乙醇含量（50%、70%、90%）；温度（25℃、60℃、95℃）；提取时间（10min、20min、30min）；料液比（1：20、1：30、1：40）为因素进行L9（34）单因素实验，以确定最佳提取条件。实验发现：当乙醇浓度为70%、温度为60℃、提取时间为30min、料液比为1：20时，提取效果最好。3.2 肉苁蓉中水分含量的测定测定肉苁蓉多酚含量时，需同时测定样品中水分含量，以便计算绝干样中的多酚含量。（1）取一只称量瓶洗干净，烘干备用。（2）称肉苁蓉1.0000g左右于称量瓶内，将不盖盖子，称肉苁蓉和称量瓶的质量，将其放入恒温干燥箱内放置1小时，温度设为105℃。（3）取出放入干燥器内冷却至室温后，用同一台天平调零后称量干燥后的质量。（4）水分含量%＝m前-m后/m肉苁蓉×100%3.3 肉苁蓉中多酚含量的测定取肉苁蓉供试品溶液1mL 到25mL 的容量瓶中，加2.5mL 的Folin-酚试剂，再加7.5mL 20％的Na2CO3混匀，蒸馏水定容至标线，放置2h后进行测定，测定结果见表5。3.3 紫外-可见分光光度法测定肉苁蓉中多酚类物质的方法评价3.3.1 精密度实验对紫外-可见分光光度法测定肉苁蓉中多酚类物质进行精密度实验，同一肉苁蓉供试品溶液平行测定6 次，测定结果见表6，相对标准偏差为0.4804%，表明该试验方法独立测量结果一致程度较高，随机误差较小。3.3.2 稳定性实验对紫外-可见分光光度法测定肉苁蓉中多酚类物质进行稳定性实验，同一肉苁蓉供试品溶液每间隔1h测定1次，重复测4次，测定结果见表7。相对标准偏差为0.9333%，表明该方法仪器的计量特性随时间不变化的能力较好，能够满足实验对稳定性的要求。3.3.3 加标回收实验准确量取已知含量的肉苁蓉供试品溶液0.5mL3 份，分别加入7 号的没食子酸工作液（2.0mg/L）11mL、12mL、13mL，加2.5mL 的Folin-酚试剂，再加7.5mL 20％的Na2CO3混匀，蒸馏水定容至50mL，放置2h后分别进行测定。测定结果见表8，由实验结果可以看出加标回收率分别为99.54%、98.46%、100.8%，平均回收率为99.65%，结果显示该方法准确度较高，可以用于肉苁蓉中多酚类物质的测定。4 结论针对尚未有关于甘肃河西地区肉苁蓉中多酚提取实验的优化及含量的测定研究，本文建立了紫外-可见分光光度法测定肉苁蓉中多酚的提取及含量测定的方法。通过对结果精密度、稳定性和加标回收等方面的实验，发现精密度测定结果的RSD达到0.4804% ，稳定性测定结果的RSD 达到0.9333%。加标回收的回收率达到99.65%，本实验方法操作简单，可靠可行。参考文献[1] 汪燕平，余新忠，宋元.以降本草书写与地道药材建构讨论[J]，安徽大学学报，哲学社会科学版2018，3：92-101.[2] 李保定，肉苁蓉炖鸡风味形成研究[J]，中国调味品，2017，42（4）：96-102.[3] 石碧，狄莹.植物多酚[M].北京：科学出版社，2000：19.[4] 雷昌贵，陈锦屏，卢大新等.食品中多酚化合物的测定方法及研究进展[J]，食品与发酵业，2007，33（1）：100-104.[5] 王德吉，田笠卿，王连生.原子吸收在有机化学中的应用（Ⅲ）：茶叶中单宁的测定[J].高等学校化学学报，1995，16（4）：536-539.[6] 赵萍，王雅，王晓明等.锁阳多酚类物质的提取及抗氧化性研究[J]，学术论坛.CFI（12）DEC 2009.46-48.

摘要目的：采用网络药理学方法研究肉苁蓉治疗骨质疏松的作用机制。方法：通过检索中药系统药理学分析平台（TCMSP）获取肉苁蓉的活性成分，采用反向分子对接服务器DRAR-CPI及相关数据库GeneCards、OMIM筛选肉苁蓉活性成分治疗骨质疏松的作用靶标；采用软件Cytoscape 构建肉苁蓉的“成分-靶标”网络，结合数据库String 和Cytoscape 绘制靶标间相互作用关系；通过服务器Systems Dock WebSite 将靶标与活性成分进行分子对接评估二者间的结合活性以进行验证；最后再利用数据库DAVID对靶标基因进行基因本体分类富集分析与京都基因与基因组百科全书通路富集分析。结果：从肉苁蓉中筛选出的活性成分有13个，主要为毛蕊花糖苷、益母草碱、京尼平酸等；活性成分作用的潜在靶标有43 个，主要有成骨分化特异性转录分子2（RUNX2）、血管内皮生长因子（VEGF）、白细胞介素6（IL-6）、骨生长蛋白因子（BGP）、肿瘤坏死因子（TNF）等；靶标作用涉及的信号通路有多条，主要为WNT（Wingless/Integrated）、VEGF、TNF等。结论：本研究初步探讨并验证了肉苁蓉治疗骨质疏松的主要靶标和通路，为后续进一步研究其作用机制奠定了基础。关键词肉苁蓉；骨质疏松；网络药理学；活性成分；靶标；分子对接；信号通路骨质疏松（Osteoporosis，OP）是一种好发于中老年人的系统性、慢性疾病，以骨密度下降和骨的显微结构破坏为主要特征。因患者的骨质脆性增加，其发生骨折的风险大大增加，轻微的外伤即可导致骨折[1-2]。骨质疏松及其严重的并发症，给患者及其家庭和社会带来了沉重的经济负担，同时也严重地影响着患者的生活质量[3]。据统计，我国老年人口总数已占总人口数的13.26％[4]。因此，探究疗效更好、更安全的治疗骨质疏松的方法显得非常必要。目前对于骨质疏松的治疗主要采取药物治疗，包括以化学药为主的骨吸收抑制药、骨形成制剂、钙剂和维生素D等[5]。另外，中医药治疗骨质疏松的报道也较多，其中尤以肉苁蓉为主要组方药材[6-9]。肉苁蓉味甘、咸，性温，归肾、大肠经，具有补肾阳、益精血、润肠通便的功效，常常用于治疗由肾阳亏虚、精血不足所引起的病证[10]。近来，也有动物实验表明其对阿尔茨海默病模型大鼠有保护作用[11]。现代药理研究结果表明，肉苁蓉可以提高骨质疏松模型大鼠血清碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素及钙离子水平，促进大鼠成骨细胞骨形成蛋白2（BMP2）的表达，加快骨髓间充质干细胞的增殖，促使大鼠成骨细胞合成ALP等，从而达到治疗骨质疏松的作用[12-14]。但目前对于肉苁蓉治疗骨质疏松的作用机制研究尚停留在单项的细胞试验与动物实验上，难以详细地探究其更全面的作用机制。网络药理学以生物信息学、系统生物学、多向药理学、计算机科学等多个学科的技术和知识为基础，可多层次、全面地阐明药物治疗疾病的作用机制，使研究更能体现整体性和系统性[15]。由于网络药理学强调从多靶标、多途径进行分析，这与中药及其复方中多成分、多靶标治疗疾病的特点不谋而合[16]。因此，本研究采用网络药理学的方法，研究分析肉苁蓉的化学成分、作用靶标以及信号通路，并进行基因本体（Gene ontology，GO）分类富集分析及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopediaof genes and genomes，KEGG）通路富集分析，通过构建肉苁蓉治疗骨质疏松的“成分-靶标-通路”网络，从整体性角度揭示肉苁蓉多靶标、多通路的作用网络，为进一步探究其治疗骨质疏松的作用机制提供参考依据。1 资料本研究使用的数据库及相关分析平台见表1。2 方法2.1 化学成分的获取与活性成分的筛选于TCMSP 中以“肉苁蓉”作为关键词，搜索获取肉苁蓉所含的所有化学成分信息。以口服利用度（OB）大于30％、类药性（DL）大于0.18 作为限定条件[17]，筛选同时符合上述2 个条件的成分作为活性成分。利用Pubchem检索上述活性成分，得到各成分的3D 结构并以mol2 格式保存。2.2 活性成分作用靶标及骨质疏松作用靶标的获取本研究利用基于蛋白-配体相互作用亲合性函数的DRAR-CPI，使用该服务器通过分子对接预测各成分可能对应的靶标，并依据对接的紧密性进行打分[18]。具体操作如下：将“2.1”项检索所得肉苁蓉所有活性成分的mol2格式文件上传至DRAR-CPI ，选取Z-score＜－0.5[19]的靶点作为肉苁蓉活性成分的潜在靶点。利用UniProt知识库的UniProt Knowledgebase 搜索功能，导入肉苁蓉作用的蛋白靶点的靶蛋白编号（PBD ID），限定物种为“人”，经过检索和转化操作，得到肉苁蓉活性成分的相应靶标。利用GeneCards 数据库和OMIM数据库，以“Osteoporosis”或“OP”作为关键词检索，在数据库中收集与骨质疏松相关的靶标。将所得靶标与肉苁蓉活性成分的靶标进行对比，以此筛选出共同的靶标。2.3 “成分-靶标”网络构建与分析将“2.1”项得到的肉苁蓉的活性成分和“2.2”项收集的治疗骨质疏松的靶标导入Cytoscape 软件中，构建肉苁蓉的“成分-靶标”网络。2.4 靶标相互作用网络的构建与分析利用String 数据库进行蛋白质之间及与预测蛋白质之间相互作用的搜索[20]。将肉苁蓉的蛋白靶标导入String 数据库，限定物种为“人”，获取肉苁蓉治疗骨质疏松的潜在靶标间的相互关系。利用Cytoscape 软件，绘制蛋白相互作用网路，用Cytoscape 的工具NetworkAnalyzer进行网络分析，将节点大小和颜色设置为用于反映Degree（连接度，即在网络中通过该点的边的个数）值的大小，边的粗细设置为用于反映结合分数的大小，最终获得靶标间的相互作用网络。2.5 分子对接利用Systems Dock WebSite 进行网络药理学的预测和分析，研究配体对复杂的分子网络的作用。该服务器主要通过Dock-In 评分（平台内置评分功能）的分子对接功能评估蛋白-配体结合活性[21]，故可利用其得到相互作用网络中的Degree 值，对Degree 值排名前5 的分子与肉苁蓉的活性成分进行分子对接验证。之后保存分子对接结果，并对其进行Docking Score 评分，用以评价肉苁蓉活性成分与靶标之间的结合活性。2.6 生物过程与通路分析利用DAVID 为大规模的基因或蛋白提供系统而综合的生物功能注释信息的功能，获取最显著富集的生物学注释[22]。即在DAVID 中，对肉苁蓉的作用靶标进行GO通路和KEGG 通路富集分析，保存结果。其中，GO通路富集分析可分为细胞组分（Cellular component，CC）、分子功能（Molecular function，MF）和生物过程（Biologicalprocess，BP）3 部分。设定阈值P＜0.05，并按照涉及的靶标数目多少进行排序，筛选前20 名的生物过程或通路，利用GraphPad Prism 绘制GO 通路分析与KEGG通路分析图。2.7 “成分-靶标-通路”网络构建分析“2.6”项中排名前20 的作用靶标的KEGG 通路，结合文献检索，筛选出可能与治疗骨质疏松密切相关的通路，获取富集在这些通路上的肉苁蓉治疗骨质疏松的潜在靶标，并与相应的活性成分相对应，构建肉苁蓉治疗骨质疏松的“成分-靶标-通路”多维网络关系图。3 结果3.1 肉苁蓉活性成分分析在TSCMP数据库中，以OB值大于30％、DL值大于0.18 为筛选条件，收集肉苁蓉的活性成分，其中符合条件的活性成分共有13 个，包括益母草碱、右旋喇叭茶醇、去咖啡酰基类叶升麻苷、京尼平酸等。另外，本研究还选择了部分OB值低于30％，但含量较高，具有较高药理研究价值的活性成分，如橙花醛、蝙蝠葛碱、毛蕊花糖苷等。肉苁蓉主要活性成分基本信息见表2。3.2 潜在靶标预测在服务器DRAR-CPI 中检索肉苁蓉13 个活性分子对应的潜在靶标，共得到258 个，去除重复靶标后，共得137 个潜在靶标。通过与GeneCards、OMIM数据库中与骨质疏松相关靶标的对比，筛选出抗骨质疏松的可能潜在靶标43 个，其主要是成骨分化特异性转录分子2（RUNX2）、血管内皮生长因子（VEGF）、白细胞介素6（IL-6）、骨生长蛋白因子（BGP）等。3.3 “成分-靶标”网络构建通过将肉苁蓉活性成分和潜在靶标的相关信息输入软件Cytoscape 中，构建肉苁蓉的“成分-靶标”网络，见图1。在图1 中，共含有节点56 个，边线185 条。六边形节点即代表肉苁蓉活性成分，圆形节点代表潜在的靶标。边线代表活性成分与潜在靶标的相互关联。由此图可知，同一活性成分可以作用于不同靶标，同一靶标也可对应不同活性成分，体现出肉苁蓉治疗骨质疏松具有多成分、多靶标的特点。3.4 靶标间相互作用网络的构建通过数据库String 获取肉苁蓉活性分子与骨质疏松相关靶标的相互关系，并将数据导入软件Cytoscape 中构建靶标间相互作用网络，见图2。由图2 可知，靶标间相互作用网络中包含节点59个，边线453 条。其中圆形节点代表靶标，边线代表靶标之间的相关性，节点的面积大小表示靶标的Degree 值大小，节点面积越大，颜色越深，表示其Degree 值越大。通过比较Degree 值的大小，并结合现有的研究结果，推测肉苁蓉抗骨质疏松与RUNX2、VEGF、IL-6、肿瘤坏死因子（TNF）、BGP 这5 个靶标有关。3.5 分子对接选取靶标相互作用网络中Degree 值最大的5 个靶标即RUNX2、VEGF、IL-6、TNF、BGP，将其名称输入软件System Dock WebSite，并与肉苁蓉的13 个活性分子进行分子对接，5 个靶标Docking Score 值-活性成分数量结果见图3。由图3 可知，在肉苁蓉13 个活性分子与5 个靶标的对接中，共有6 个（占9％）的Docking Score 值大于7，36个（占55％）的Docking Score 值在5.0～7.0 之间，18 个（占28％）的Docking Score 值在4.25～5.0 之间，5 个（占8％）的Docking Score 值小于4.25。一般认为，DockingScore 值大于4.25 表示分子与靶标具有一定的结合能力，大于5.0 表示结合能力较强，大于7.0 表示结合能力很强[23]。因此，肉苁蓉的活性成分与靶标之间具有良好的结合能力。3.6 GO分类富集分析和KEGG通路富集分析对肉苁蓉活性分子的对应靶标进行GO分类富集分析和KEGG通路富集分析，以P＜0.05 为筛选条件，筛选出富集基因数量较大的通路和生物过程。CC分析结果见图4，MF分析见图5，BP 分析见图6，KEGG通路富集分析结果见图7。由图4～图6 可见，在CC 分析结果中，富集基因数量较大的有内涵体通路、顶端质膜通路、膜筏通路、髓鞘通路等；在MF分析结果中，富集基因数量较大的有蛋白酪氨激酶活性通路、肝素结合通路、细胞因子活性通路、蛋白结合通路等；在BP分析结果中，富集基因数量较大的有内皮细胞迁移负调控通路、一氧化氮介导信号转导通路、血管收缩调节通路、钠离子转运调节通路等。由图7 可见，在KEGG通路富集分析结果中，WNT（Wingless/Integrated）信号通路、核转录因子κB（NF-κB）受体活化因子（RANK）信号通路、叉头转录因子（FoxO）信号通路、环磷酸腺苷（cAMP）信号通路等与肉苁蓉治疗骨质疏松的潜在靶标的相关性明显。3.7 “成分-靶标-通路”网络构建综合GO通路和KEGG通路富集分析的结果，筛选出可能具有抗骨质疏松作用的通路，并将其与肉苁蓉的活性分子和相应的潜在靶标一一对应，即活性分子与靶标对应，靶标与可能通路对应，从而构建出肉苁蓉治疗骨质疏松的“成分-靶标-通路”网络，见图8。如图8 所示，肉苁蓉治疗骨质疏松的活性成分主要有益母草碱、毛蕊花糖苷、去咖啡酰基类叶升麻苷、京尼平酸等8 个，这些活性成分作用的靶标有RUNX2、IL-6、BGP、TNF、VEGF、结缔组织生长因子（CTGF）、过氧化物酶增殖激活受体（PPAR）-γ等32 个，这些靶标主要被包含在丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、VEGF、WNT、TNF等7条信号通路中。4 讨论4.1 肉苁蓉治疗骨质疏松的文献来源肉苁蓉是寄生在沙漠树木梭梭根部的列当科寄生植物，具有补肾阳、益精血、润肠通便之功效[24]。《神农本草经辑注》[25]中提到肉苁蓉“主五劳七伤，补中，除茎中寒热痛，养五脏，强阴，益精气，妇人症瘕”；相关研究表明[26]，肉苁蓉可降低相关因子的阳性表达，具有一定的抗骨质疏松作用，但与其相关的机制仍待研究。因此，研究肉苁蓉抗骨质疏松的分子作用机制有较大的意义。4.2 主要活性成分分析本次研究收集到肉苁蓉中具有抗骨质疏松的化学成分主要有毛蕊花糖苷、益母草碱、京尼平酸等。研究表明，肉苁蓉中的毛蕊花糖苷可以作为抗再吸收剂，通过阻断破骨细胞活化来减少骨质流失[27]。肉苁蓉中的益母草苷碱可通过抑制NF-κB 和磷脂酰肌醇三激酶（PI3K）/丝氨酸/苏氨酸激酶（Akt）信号通路抑制破骨细胞生成并预防与雌激素缺乏相关的骨质疏松症[28]。京尼平酸参与激活成骨细胞促进骨生成的相关步骤，并抑制破骨细胞活性以抑制骨质溶解[29]。4.3 主要靶标分析本次研究发现，肉苁蓉可通过对BGP、TNF、CTGF、PPAR-γ等靶标进行作用来达到抗骨质疏松的作用。多项研究显示，BGP可影响骨代谢、促进骨吸收，从而对骨质疏松的发生产生影响[30]；TNF-α通过激活PI3K/Akt 信号传导而协同促进RANK配体（RANKL）诱导的破骨细胞形成。此外，CTGF表达的下降可促进人骨成形蛋白2（BMP-2）诱导的成骨细胞分化，CTGF 的表达与调节成骨细胞分化有密切关系[31]。PPAR-γ作为PPAR基因家族的转录因子，与PPAR-β /δ 不同，其可减少骨保护素（OPG）的表达和成骨细胞介导的增加破骨细胞生成等作用[32]。结合本研究结果，推测肉苁蓉可能通过提高体内TNF、BGP、ALP 的水平或上调CTGF、PPAR-γ的表达来发挥抗骨质疏松作用。4.4 主要通路分析本次研究结果显示，与肉苁蓉治疗骨质疏松相关的通路有WNT、VEGF、IL-6 等。其中，WNT通路的表达可增加成骨细胞的成骨活性和矿化能力[33]，且另有相关的基础研究证实[34]，WNT可促进β-连环蛋白结合Lef1/Tcf 转录因子，并改变基因表达以促进成骨细胞的扩增和功能。间充质干细胞中VEGF 的表达升高会导致成骨细胞增加和脂肪细胞分化的减少，并调节二者之间的均衡比例[35]。RUNX2 是成骨细胞分化和骨形成的关键调节通路，对MSCs 成骨细胞谱系有着重大的作用[36]。而IL-6 的表达可诱导破骨细胞活化、增强破骨细胞活性[37]，可显著促进人成骨细胞、内皮细胞和单核细胞的增殖，以及人内皮细胞的迁移[38]。综上，本研究通过网络药理学的研究方法，分析肉苁蓉在抗骨质疏松治疗方面的有效活性成分和分子机制，结果显示肉苁蓉中具有治疗骨质疏松作用的化学成分可能是毛蕊花糖苷、益母草碱、京尼平酸等。此成分可能通过BGP、TNF、CTGF、PPAR-γ 等靶标及WNT、VEGF、IL-6 等信号通路发挥活性作用。另外，通过相关网络图的构建，可直观地显示出肉苁蓉治疗骨质疏松具有多成分、多途径共同作用的特点，符合中医药治疗疾病的特色，相比化学药的单基因-单靶点的作用机制，更有优势。且本研究通过分子对接验证了网络药理学数据的可靠性，但需要注意的是，本研究结果只是一种分子机制上的预测探讨，药物具体作用机制的确认仍需通过进一步的实验来验证。参考文献[ 1 ] 刘振海，刘红，王少君，等.防治骨质疏松症常用单味中药实验研究概况[J].环球中医药，2013，6（6）：473-479.[ 2 ] 汪呈，曹宇，顾永清，等.骨质疏松治疗药物的研究进展[J].科学通报，2014，59（13）：1209-1214.[ 3 ] 何渝煦，魏庆中，熊启良，等.骨质疏松性骨折与骨密度关系的研究进展[J].中国骨质疏松杂志，2014，20（2）：219-224.[ 4 ] 王胜今，舒莉.积极应对我国人口老龄化的战略思考[J].吉林大学社会科学学报，2018，58（6）：5-14，203.[ 5 ] 崔莹，冯正平.抗骨质疏松药物的研究进展[J].中国骨质疏松杂志，2015，21（3）：367-371.[ 6 ] 常睿洁.骨质疏松症的中西药治疗进展[J].中国新药杂志，2015，24（13）：1498-1503.[ 7 ] 严红梅，张振海，孙娥，等.中药治疗骨质疏松症的研究进展[J].中草药，2014，45（8）：1174-1178.[ 8 ] 张沙，李红霞，胡秋生，等.中医疗法治疗骨质疏松症的研究概况[J].河北中医药学报，2018，33（5）：61-64.[ 9 ] 罗彤，高毅，尹义辉，等.中药抗骨质疏松的研究现状[J].湖南中医杂志，2014，30（2）：148-149.[10] 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摘要：肉苁蓉属植物为多年生寄生草本植物，是重要的补益中药，具有多种药理活性，广泛应用于临床。本文简要介绍了文献中对肉苁蓉多糖、总黄酮和苯乙醇苷的化学提取工艺，并针对肉苁蓉对自由基的清除作用做了介绍，为肉苁蓉在化工领域的进一步研究提供参考。关键词：肉苁蓉；多糖；总黄酮；苯乙醇苷；亚硝酸盐；自由基清除作用肉苁蓉属植物为多年生寄生草本植物，我国有5种，分布于内蒙古、宁夏、甘肃、青海以及新疆等地。荒漠肉苁蓉（Cis⁃tanchedeserticolaY.C.Ma）为列当科(Orobanchaccae)肉苁蓉属(Cistanche)植物，是重要的补益中药，特产我国西北沙漠地区，素有“沙漠人参”之称。肉苁蓉中有苯乙醇苷类、环烯醚萜类及其苷类、木脂素及其苷类、多糖、挥发油等多种化学成分[1]。药理研究表明肉苁蓉可以调节神经系统、抗衰老和抗氧化作用、通便作用等方面药理活性，广泛应用于临床实践[2]。因此，关于肉苁蓉有效成分的提取工艺及清除作用一直是近年来化工领域的研究热点。近年来，众多学者在化工研究中发现肉苁蓉对自由基有清除作用。滕立平等在研究中发现德赢vwin登录 粗多糖对DPPH自由基具有较好的清除作用，这为肉苁蓉多糖通过清除机体内自由基延缓衰老方面的研究提供了理论依据。王晓雯等也在检测中发现肉苁蓉总苷对O2-，OH-，H2O2，1O2等自由基的清除作用。随着食品工业的不断发展，不少不法经营者通过加入高浓度的亚硝酸盐来改善肉制品的感观色泽，缩短肉制品的加工时间，而亚硝酸盐是剧毒物质，成人摄入0.2—0.5克即可引起中毒，3克即可致死[3]。同时由亚硝酸盐产生的亚硝胺还能够透过胎盘进入胎儿体内，对胎儿有致畸作用，因此积极研究和开发消解亚硝酸盐的天然药物已经成为一个迫切需要解决的问题。有关研究表明，肉苁蓉富含的多种成分能够清除亚硝酸盐，在化工生产中发挥着巨大作用[4-5]。1 肉苁蓉化学成分的提取方法化工生产中，肉苁蓉的提取工艺很多，但传统提取肉苁蓉有效成分的方法成本高、提取效率低、纯度低，亦影响了其生物学效应，降低了肉苁蓉的医学价值。因此，优化其提取工艺并研究其体外对自由基的清除作用，有利于肉苁蓉的进一步开发。1.1 提取肉苁蓉多糖王晓琴[6]等采用热水浸提法提取肉苁蓉多糖，在研究中发现，各因素对多糖得率的影响依次为浸提温度>水料比>浸提时间。最佳提取工艺为以1∶15的料水比在85℃下浸提2h，利用该工艺提取肉苁蓉多糖的平均得率为6.7857mg/g。进一步对肉苁蓉多糖提取物抗菌活性研究，发现肉苁蓉多糖提取物对在抗动植物病原菌方面有潜在应用价值。为提取德赢vwin登录 活性成分多糖，滕立平[7]等发现超声-微波协同有最佳提取效果,其次是微波、水浴和超声波。王国卫[8]等在研究肉苁蓉多糖体外抗氧化活性中发现肉苁蓉多糖对超氧阴离子自由基、羟自由基和单线态氧均有明显清除作用，在研究过程中进一步发现这种清除作用与多糖浓度呈正相关。1.2 提取肉苁蓉总黄酮肖星辉[9]等采用乙醇-盐双水相萃取法研究荒漠肉苁蓉总黄酮的萃取工艺，采用正交试验法对荒漠肉苁蓉总黄酮的提取工艺进行了优化，确定荒漠肉苁蓉总黄酮最佳提取工艺条件：料液比为1∶50（g/mL），提取溶剂为50%的乙醇溶液，提取时间为3.5h，提取温度为90℃，此条件下肉苁蓉中总黄酮平均得率可达到（13.04±0.06）%。徐常永[10]等利用吸附与解吸附的原理，通过静态吸附实验，采用大孔树脂分离纯化肉苁蓉总黄酮，又经动态吸附实验和正交试验得到较佳分离纯化工艺条件。研究发现，该工艺条件稳定性良好，分离纯化前后总黄酮的质量分数明显提高，适合工业化生产。1.3 提取肉苁蓉苯乙醇苷肉苁蓉具有提高免疫力、增强体力抗疲劳、提高记忆力及抗衰老等诸多药理功效，其主要活性成分为苯乙醇苷。以它为指标进行提取、纯化是对其进行化工研究的重点。吴涛[11]采用正交试验优化德赢vwin登录 苯乙醇苷的提取工艺并利用大孔吸附树脂技术对德赢vwin登录 提取物进行纯化。研究发现，料液比1:12，70%乙醇提取2次、每次1小时为最佳提取工艺，上样液浓度4mg/ml，吸附流速1ml/min、洗脱流速1ml/min，径高比为1:15为最佳纯化工艺。研究还发现，经大孔树脂纯化后，苯乙醇苷含量提高到75.8%，且提取纯化工艺合理、稳定，适合推广应用于实际化工生产。为提高肉苁蓉资源利用率，刘伯言[12]通过超声辅助提取、大孔吸附树脂纯化等方法，对肉苁蓉中苯乙醇苷进行分离纯化。对苯乙醇苷粗提物和纯化物的抗氧化活性进一步研究得知，纯化物表现明显的自由基清除能力和较强的还原力，低浓度的苯乙醇苷粗提物和纯化物都能减少对该细胞的损伤。2 肉苁蓉的清除作用肉苁蓉总苷能有效地清除自由基，保护OH-引起的DNA氧化损伤。罗齐军[13]等拿24只SD大鼠进行体外实验来研究肉苁蓉活性成分对大鼠大负荷训练导致的骨骼肌自由基氧化损伤的保护作用，发现肉苁蓉成分有一定的抗氧化作用，有利于剧烈运动导致机体组织大量积累的自由基的清除，防止阻止氧化损伤。王晓雯[14]等采用现代生物化学发光技术，检测发现肉苁蓉总苷对O2-，OH-，H2O2，1O2等自由基的清除作用，并通过Cu2+-Phen-H2O2-VitC-DNA发光体系研究发现肉苁蓉总苷具有对OH-引起的DNA氧化损伤的保护作用。这些研究都在一定程度上为运动训练提供了理论健康指导。亚硝酸盐具有防腐性，常在食品加工业被添加在香肠和腊肉中作为保色剂，与此同时也对人类健康造成了威胁。高剂量的亚硝酸盐会产生很大毒性，长期使用甚至会导致食道癌和胃癌。众多研究发现肉苁蓉对O2-，OH-，H2O2，1O2等自由基具有强清除作用，所以人们希望肉苁蓉能够用于工业上亚硝酸根的清除。目前关于荒漠肉苁蓉属植物体外消除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成的文献较少，林敏[15]等在研究肉苁蓉水浴浸提物与超声辅助浸提物在体外模拟胃液pH条件下清除亚硝酸根的最佳提取工艺时发现，肉苁蓉对亚硝酸根有很强的清除能力，并随着浓度的增加清除作用加强，且水浴提取物对亚硝酸根清除作用显著高于超声辅助浸提物。3 研究展望肉苁蓉提取液含有多种组成成分，包括VC、多酚、黄酮类化合物、多糖等。本文总结了一些文献中对肉苁蓉多糖、总黄酮和苯乙醇苷的提取方法，也对肉苁蓉的清除作用做了综述。肉苁蓉提取物作为医药化工原料，在医学界发挥着巨大作用，而以肉苁蓉为主原料的保健品也大有兴起之势，但其在临床方面的研究还不够深入。肉苁蓉在化工领域有着巨大的潜力，以期更多学者参与到肉苁蓉的深入研究中，为肉苁蓉相关化工产品的开发利用及提取工艺提供参考依据。参考文献：[1]许国青，王晓琴，文迪，等.列当科药用植物研究进展[J].中国民族医药杂志，2012，10（44）：35-38.[2]吴晓春，史颖.肉苁蓉的研究与临床应用[J].甘肃中医，2007，20（12）：49-51.[3]林玉娜，罗晓燕，刘莉治，等.血清和尿中亚硝酸盐含量的离子色谱测定法[J]. 职业与健康，2011，27（4）：356+481.[4]张丽芳，田洪涛，张玉兰，等.健康人体及保健品中乳酸菌和双歧杆菌的抗药性分析[J]. 中国食品学报，2009，9（6）：144－151.[5]曾海英，秦礼康，江萍.食源性乳酸菌外获抗药性的研究进展[J].食品科学，2004，25(12):189－192.[6]王晓琴，曹礼，朱艳萍.肉苁蓉多糖提取工艺及抑菌作用研究[J]安徽农业科学，2009，37（32）：15855-15856.[7]滕立平，慕龙，罗锋，等.德赢vwin登录 粗多糖提取方法及其清除二苯代苦味酰基自由基的效果[J]贵州农业科学，2011，39（1）：66～68.[8]王国卫，赵芳.新疆肉苁蓉多糖清除活性氧自由基[J].光谱实验室，2011，28（3）：1545-1548.[9]肖星辉，张向前，李桂芳，等.双水相萃取荒漠肉苁蓉总黄酮及其抗氧化活性[J]食品研究与开发，2017，38（16）：5-9.[10]徐常永，杨凯.大孔树脂分离纯化肉苁蓉总黄酮研究[J].中国当代医药2016，23（24）：130-134.[11]吴涛.德赢vwin登录 总苷的提取、纯化、指纹图谱及改善记忆力研究[D]新疆：新疆大学食品科学系，2010.[12]刘伯言.肉苁蓉苯乙醇苷的提取、纯化和抗氧化活性研究[D].北京，北京林业大学农产品加工及储藏工程系，2014.[13] 罗齐军，王燕山，黄凯乔. 肉苁蓉活性成分对大负荷训练大鼠骨骼肌氧化损伤的保护作用[J]湛江师范学院学报，2012，33（3）：132-135.[14]王晓雯，蒋晓燕，邬利娅·伊明，等.肉苁蓉总苷体外清除自由基及对OH-引发的DNA损伤的保护作用[J]中国药学杂志，2001，36（1）：29-32.[15]林敏，张鑫，吴冬青，等.肉苁蓉提取液对NO2-清除作用的体外实验研究[J].食品工业科技，2012，02（53）：126-133.

摘要目的：观察肉苁蓉水提物对大鼠骨质疏松性骨折愈合的影响并初步探索其作用机制。方法：将SPF级SD 雌性大鼠随机分成对照组、模型组、治疗组，按相关方法造模。骨折造模24h 后，对照组和模型组分别予以生理盐水灌胃，治疗组予肉苁蓉水提液灌胃，每日1 次，干预2 周、6 周后腹主动脉取血分离血清检测其中白介素-1β（IL-1β）与转化生长因子-β1（TGF-β1）水平，同时收取骨折标本，固定后行Micro-CT 扫描，测量ROI 骨痂骨体积分数（BV/TV）等相关参数，再经脱钙、脱水、包埋后制成蜡块待用。结果：骨质疏松造模6 周后，模型组与治疗组大鼠骨密度均低于对照组（P＜0.05），但治疗组与模型组间差异不明显，治疗组在干预2 周、6 周后骨密度虽然仍低于对照组，但明显高于模型组（P＜0.05）。Micro-CT 扫描显示治疗组BV/TV、Tb.Sp、Tb.N、Tb.Th、SMI 在干预后2 周、6 周均优于模型组，且对照组BV/TV、Tb.Sp、SMI 参数与治疗组差异不明显，而模型组2 时间点Micro-CT 参数均劣于对照组。干预2 周、6 周后，比较3 组血清IL-1β、TGF-β1 水平发现治疗组IL-1β 水平2 周时均低于其他两组，6 周时，虽然治疗组IL-1β 水平高于对照组，但仍明显低于模型组（P＜0.05）；TGF-β1 水平方面，治疗组在2 周、6 周时均高于模型组和对照组，且与对照组间差异无统计学意义。结论：依据骨密度、Micro-CT 扫描参数分析及血清IL-1β、TGF-β1 水平，发现肉苁蓉水提物可促进骨质疏松性骨折愈合，而其机制可能与其可抑制骨质疏松骨折后大鼠血清IL-1β 和促进TGF-β1 分泌，进而改善骨质疏松、促进骨折愈合有关。关键词骨质疏松性骨折肉苁蓉骨折愈合大鼠骨质疏松症是一种以骨密度降低与骨组织微细结构破坏，骨脆性增加的一种疾病，患者可在日常生活中受轻微外力下引起骨折，是临床常见病、多发病。且这一类骨折因患者多为老年人，常合并其他疾病，且骨折多为粉碎性，稳定性差，骨折愈合迟缓或不愈合时有发生，存在较高的致残率、致死率[1]。目前有关其治疗主要是通过手术、手法整复联合抗骨质疏松治疗，缺少骨质疏松骨折患者针对性治疗药物，而中药治疗骨质疏松历史悠久，疗效肯定，许多中药被证实既可改善骨质疏松同时还可促进骨折愈合。肉苁蓉属于常用补肾阳代表药，具有补益肝肾作用。中医学认为，肾主骨，骨折治法也多不离补肾益精，现代药理学发现肉苁蓉还具有一定雌激素样作用[2]。本研究拟通过骨密度测量、Micro-CT 和血清白介素-1β（IL-1β）、转化生长因子-β1（TGF-β1）水平观察并肉苁蓉水提物对大鼠骨质疏松性骨折愈合的影响并初步探索其内在机制。1 材料与方法1.1 实验动物与试剂器材：体重210～250gSPF 级雌性SD 大鼠52 只，饲养于浙江中医药大学动物实验中心。络合碘，杭州朗索医用消毒剂有限公司，批号20160720；青霉素，华北制药股份有限公司，批号F3117217；IL-1β 试剂盒（批号：20160715）、TGF-β1 试剂盒（批号：20160722）；双能X 线骨密度扫描仪，OSTEOCORE2；Micro-CT，Skyscan1176。1.2 肉苁蓉水提液提取：将碾碎肉苁蓉（浙江中医药大学药厂）10 倍超纯水浸泡0.5 小时，煎锅煎煮1.5 小时，重复提取2 次，混合药液旋蒸仪浓缩至浓度1.5g/ml，存放4℃冰箱备用。1.3 造模制备：分述如下。1.3.1 骨质疏松模型：大鼠造模前适应性饲养1 周后随机分成对照组、模型组、治疗组，分别16 只、18 只、18只，每组依2 周、6 周时间点各分成两小组，治疗组和模型组均1% 戊巴比妥钠麻醉（0.4ml/100g）后备皮、消毒、铺巾、切开皮肤后摘除大鼠双侧卵巢，对照组仅切开不摘除卵巢。1.3.2 骨折模型：骨质疏松造模后6 周后准备制备骨折模型，各组大鼠麻醉后行股骨中段骨密度测定，完成后取大鼠右侧股骨中段进行备皮、消毒、铺巾、切开，行股骨中段横行骨折造模[3]，并以1mm 克氏针固定，消毒缝合切口皮肤。1.4 药物干预：造模术后行股骨X 线检测，剔除模型制备失败大鼠，并在造模后肌注8 万单位青霉素预防感染。术后24h 治疗组开始予肉苁蓉水提物灌胃（浓度1.5g/ml，1g/kg，每日1 次），对照组与模型组则予同体积生理盐水灌胃。1.5 样本收取：干预后2 周、6 周后收取大鼠样本，各组大鼠1% 戊巴比妥钠麻醉后，腹主动脉取血5～10ml 制备血清，储存于-20℃冰箱备用。然后处死大鼠，收取股骨骨折样本，并置于10% 中性甲醛固定72 小时。1.6 检测指标：分述如下。1.6.1 骨密度：所有骨质疏松造模后大鼠，行骨折造模前均麻醉后行股骨中段骨密度测定。3 组大鼠在干预2周、6 周后收取样本，样本在固定72 小时后再次行骨密度测定。1.6.2 Micro-CT：样本固定72 小时后进行Micro-CT 扫描，以骨折端上下各200 张图片作为感兴趣区域(ROI)，扫描角度360° ，电流555uA、电压42kV，滤光片Al0.2mm，分辨率8.73μm，完成后进行骨痂三维图像重建与分析。检测参数如下：骨体积分数BV/TV、骨小梁模式因子(Tb.Pf)；结构模型指数(SMI)等[4]。1.6.3 血清IL-1β、TGF-β1 测定：从-20℃冰箱解冻各组大鼠血清，分别按照IL-1β 和TGF-β1 试剂盒说明书逐步进行检测。1.7 统计学方法：采用统计分析软件SPSS.19 进行处理。实验数据均用以均数±标准差（-x ±s）表示，3 组大鼠骨密度、Micro-CT 参数、IL-1β、TGF-β1 水平均采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验，检验水准为P＜0.05。2.2 Micro-CT 二维截面：矢状位二维截面选取各组各时间点股骨纵轴中心截面图片（见图1），水平面二维截面图则选取骨折线下第100 图片进行对比（图2），从图中可见各组骨痂随时间逐渐增多，但在骨折后6 周不同程度塑性；同时可见对照组骨痂体积大，6 周后骨痂皮质厚实并爬过骨折线，而模型组2 周时骨痂骨质较少，6周后骨痂皮质稀松，治疗组2 周时骨痂体积虽不大，但骨痂中骨质较模型组多，6 周后骨痂塑形较好且骨折线不明显。2.3 Micro-CT 三维重建：股骨中段骨折端骨痂三维重建见图3。从图3 可见各组骨折后2 周骨痂沿骨折线两端骨膜形成，但各组骨折线仍然清晰，模型组与治疗组尤为明显，而骨折6 周后对照组骨痂厚实，多以板状骨小梁为主，骨折线消失，而模型组骨质稀松，骨折线较模糊，但治疗组骨痂骨质较多，骨小梁规则且厚实，骨折线不明显。3 讨论近年来，中药淫羊藿、骨碎补及复方（青娥丸、六味地黄丸等）在临床实践中被证实可明显改善骨质疏松症候[1]，这类中药及复方多以补益肝肾为主，这与骨折中后期补肾续筋原则一致[5]。肉苁蓉始载于《神农本草经》，李时珍曰：“此物补而不峻，故有从容之义”，苁蓉味甘、咸，性温，具有补肾壮阳、填精补髓、养血润燥、悦色延年之功[6]。本研究中，干预2 周、6 周后治疗组骨密度均高于模型组（P＜0.05），Micro-CT 扫描BV/TV 参数显示治疗组在干预后两个时间点结果与骨密度测定结果一致，而BV/TV 是骨质疏松性骨折愈合评估的重要指标，直接反映骨痂骨质含量，这说明肉苁蓉可能具有促进成骨的作用，分析原因可能与肉苁蓉中有效成分具有上调BMP2作用有关[7]，而BMP2 为TGF-β 家族中成员之一。并且这一结果也被Micro-CT 扫描其他参数（Tb.Sp、Tb.N、Tb.Th、SMI）所印证，Tb.Sp、SMI 反映的是骨痂生物力学特性，治疗组中数值明显优于模型组，这也进一步提示肉苁蓉具有改善骨量丢失，促进成骨进而加快骨折愈合的作用。在血清IL-1β、TGF-β1 水平方面，干预2 周、6 周后发现治疗组IL-1β 水平2 周时均低于其他两组，在6周时，虽然治疗组IL-1β 水平高于对照组，但仍明显低于模型组（P＜0.05）；而治疗组TGF-β1 水平，在2 周、6周时均高于模型组和对照组，且与对照组间差异无统计学意义。而IL-1β 水平直接影响破骨细胞的分化与活性，其水平升高将会促进骨吸收，抑制成骨细胞增殖、分化，但TGF-β1 则与骨性干细胞增殖、分化、迁移密切相关，具有促进软骨和骨痂形成[2]，加快骨痂塑形的作用，这提示肉苁蓉改善骨量丢失，促进成骨，加快骨折愈合作用可能通过降低骨质疏松性骨折大鼠IL-1β 水平、抑制破骨细胞活性实现；此外可能还与肉苁蓉可升高骨折大鼠TGF-β1 水平，促进成骨分化与骨痂成熟塑形有关。综上所述，依据骨密度、Micro-CT 扫描参数分析及血清IL-1β、TGF-β1 水平，发现肉苁蓉水提物可改善骨丢失，促进骨质疏松性骨折愈合，而其机制可能与其可抑制骨质疏松骨折后大鼠血清IL-1β 分泌和促进TGF-β1 分泌，进而改善骨质疏松、促进骨折愈合有关。4 参考文献[1]马远征,王以朋,刘强,等. 中国老年骨质疏松症诊疗指南(2018)[J]. 中国骨质疏松杂志,2018,24(12)：1541-1567.[2]朱刚,孙海斌,徐刚,等. 肉苁蓉醇提物对去卵巢骨质疏松大鼠的治疗作用及其机制[J]. 吉林大学学报( 医学版),2018,44(1)：68-72.[3]Karvande A, Khedgikar V, Kushwaha P, et al. Heartwoodextract from Dalbergia sissoo promotes fracturehealing and its application in ovariectomy-inducedosteoporotic rats[J]. Journal of Pharmacy andPharmacology,2017,69(10)：1381-1397.[4]Kevin O'Neill, Christopher M S, Nicholas A M, etal. Micro-computed tomography assessment of the progressionof fracture healing in mice[J]. Bone, 2012,(6)：1357-1367.[5]姚新苗,史晓林,王健,等. 浙江省中医药防治原发性骨质疏松症分级诊疗专家共识(2017)[J]. 浙江中医杂志,2018,53(4)：237-241.[6]马猛,张志国,马晓辉. 单味及复方中药防治骨质疏松症的研究进展[J]. 中国医药导刊,2018,20(8)：477-481.[7]张跃全,郑丹红,许建峰,等. 荒漠肉苁蓉对快速老化骨质疏松小鼠BMP-2 蛋白表达的影响[J]. 宁夏医学杂志,2014,36(12)：1114-1116.