中药肉苁蓉抗肿瘤的研究

肉苁蓉最早载于《神农本草经》，归肾经，味甘、咸，性温，其药性温和，补而不峻，具有温肾填精、润肠、抗氧化、提高免疫力的功能，为滋补上品[27]。现代研究发现， 肉苁蓉所含的成分有苯苷类（主要）、多糖类、环烯醚萜、木脂素等 120 余种化合物[28]， 随着对其有效成分及作用机制不断的挖掘，发现其不仅有保肝、抗氧化、提高免疫力、延缓衰老、抗病毒、降糖、抗凝等作用外，还具有抗肿瘤活性，在肿瘤化疗中具有增效减毒的作用[29-30]。

本研究发现药物干预后各组细胞凋亡率增加，且与肉苁蓉灌胃浓度呈正相关（P＜ 0.01），说明肉苁蓉可通过促进骨肉瘤细胞凋亡起到抗肿瘤作用，与本研究结果一致， Jinyu Li 等[31]通过体内试验发现肉苁蓉苯乙醇苷（CTPG）可通过诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞提高黑色素瘤荷瘤小鼠生存期，发现 CTPG 可上调小鼠 BAX 并下调 BCL-2 的表达，从而提高了肿瘤小鼠的存活率。就肉苁蓉抗肿瘤的研究，张洪泉等[32]早在 1988 年报道了肉苁蓉水提物具有改善小鼠免疫能力及提高腹腔吞噬细胞能力，同时能够激发小鼠的免疫功能器官如胸腺的发育。后续研究发现，肉苁蓉多糖能通过增小鼠组织内端粒酶活性改善衰老和免疫功能[33]，此研究结果与谢岚等[34]的报道一致，且发现肉苁蓉多糖具有抗氧化、改善脾虚、促进造血等功能。此外，张涛等[35]研究发现肉苁蓉有效成分总苷类化合物可提高 D-半乳糖衰老小鼠模型的免疫能力。另外，张洪泉等[36]首次报道了肉苁蓉多糖的抗肿瘤作用，发现其通过促进自然杀伤细胞（NKC）及白介素-2（IL-2） 的活性增强小鼠 Lewis 肺癌和小鼠 S180 肉瘤的抑制率。胡琼等的研究表明[37]，肉苁蓉苯乙醇总苷（CPhGs）可增强脾脏指数、降低肝脏指数(P 均<0.01)，提高荷瘤小鼠的免疫功能，同时，CPhGs 可降低 H22 荷瘤小鼠甲胎蛋白及TNF-α的含量、升高 IL-2 活性， 具有良好的抗肝癌作用。由此可见，肉苁蓉有效成分多糖、苯乙醇苷及苯乙醇总苷有明确的抗肿瘤作用。此外，有研究称[38]，肉苁蓉可对增强化疗荷瘤小鼠的造血和免疫功能，其能改善化疗药物 5-氟尿嘧啶所致的造血功能低下，同时还可提高胸腺和脾脏指数及NK 细胞活性。同时研究发现[12]肉苁蓉与环磷酰胺联应合用可增强环磷酰胺的抗肿瘤效果，同时减轻环磷酰胺引起的免疫功能缺陷与骨髓抑制，起到了增效减毒作用。由此可见，肉苁蓉有效成分具有明确的抗肿瘤作用，主要可通过增强自身免疫能力、诱导癌细胞的凋亡来实现的。

化疗在 OS 治疗中的应用

OS 最常见于儿童及青少年，病死率较高，易复发、转移，最长见于生长活跃的四肢长骨干骺端[1]。近年来，在新辅助化疗联合手术治疗的理念下 OS 患者 5 年生存率提升至约 70%[3]。过去的理念认为截肢是 OS 患者的主要治疗办法，在新辅助化疗应用于OS 的保肢手术理念后大大的提高了 OS 患者 5 年生存率以及无事件生存率（EFS），术前及术后的化疗在一定程度上决定了 OS 患者保肢手术中的成功率，旨在最大范围切除肿瘤、减少术后复发。其主要的作用可概括为三点[39-40]：①杀灭肿瘤细胞，缩小瘤体， 使肿瘤边界明确，最大程度的有利于手术完整切除；②杀灭远端微小转移病灶及跳跃灶肿瘤细胞，降低术后远端转移几率；③化疗可激活某些抑癌基因及降低 OS 组织恶性分子的表达。因此，在综合 OS 患者耐受化疗药物副反应的前提下，OS 治疗成败的关键点即化疗的有效性与外科手术的完整切除率。目前，OS 临床一线化疗方案有四种，主要应用于肺转移的 OS 患者。有研究发现针对无转移可外科手术切除的 OS 患者，四药联合方案（甲氨蝶呤、顺铂、多柔比星、异环磷酰胺）6 年 EFS 为 70%[41]。易生辉[42] 对新辅助化疗联合保肢术与单纯术后化疗在 OS 的治疗中的价值做了分析，发现新辅助化疗下的保肢术能明显改善患者的肢体残疾的确定，且在提升患者总体生存率中有明确的应用价值。Yu D 等[43]为了探讨 MAP 化疗方案在 OS 治疗中的价值，回顾性收集了 115 例 OS 患者的资料，通过分析患者 3 年、5 年无进展生存期（PFS）及总的生存率，发现MAP（甲氨蝶呤、阿霉素和顺铂）方案是 OS 化疗的首选方案。此外，OS 的远期疗效尚与化疗后组织病理学坏死率有关，Bacci 等[44]评估了 881 例无转移 OS 的患者中新辅助化疗术后肿瘤组织病理学反应率与 5 年 PFS 的关系，发现坏死率越高，5  年 PFS 越长， 此结论与 Bernthal 等[45]的研究结果一致。总之，肿瘤细胞的化疗敏感性或肿瘤组织病理学高坏死率对 OS 患者预后及生存期有着重要的临床意义，有效的化疗方案是 OS 保肢手术的有效保障，肿瘤组织对化疗药物的敏感性在一定程度上决定了 OS 治疗的有效性， 如何保障化疗药物在 OS 治疗中的高敏感性是目前亟待解决的问题。

介导骨肉瘤化疗耐药产生的机制

尽管化疗药物的应用为 OS 患者的整体生存带来了革命性的改变，但耐药性的产生成为了近年来 OS 治疗成败的一大挑战。其通常与 MDR 机制关系密切，MDR 的产生使得肿瘤细胞免受化疗药物攻击，是影响 OS 患者化疗效果的关键因素，该过程的产生是一个多阶段、多因素协调下的复杂过程。ABC 跨膜转运系统调控着多种肿瘤的耐药进程，本研究选取其成员蛋白 P-gp、MRP1 两个最常见的耐药介导蛋白为研究靶点。

 ABC 跨膜蛋白介导的肿瘤细胞耐药

ABC 跨膜转运系统功能异常与化疗药物的耐药性产生有着密切的关联，目前发现有 48 个成员，研究较多的有 P-gp、MRP1、BCRP [8-9]。P-gp 被认为是目前肿瘤细胞产生耐药性的主要介导蛋白，当脂溶性的抗肿瘤药物进入细胞内后，高表达的 P-gp 会通过跨膜通道将药物泵出胞外[46]，使胞内抗肿瘤药物如甲氨蝶呤等无法达到有效作用浓度，进而产生化疗抵抗现象。MRP 与 P-gp 相似，都具有“泵药”功能，且依赖能量作为催化剂将将细胞内药物排出，此外，MRP 还可识别并排除谷胱苷肽(GSH)与抗肿瘤药所反应产生的底物，从而导致肿瘤细胞耐药[47]。BCRP 除介导着化疗药物的耐药外，同时还参与着肿瘤细胞的靶向治疗耐药、激素治疗不敏感、放疗抵抗等有关，其主要的底物是长春新碱等[48]。

  酶系统介导的相关耐药

多种酶参与介导着肿瘤细胞化疗耐药的产生过程，如谷胱甘肽 S 转移酶(GST)、拓朴异构酶 II(TOPO Ⅱ)、蛋白激酶 C(PKC)等均可通过自身功能发挥介导肿瘤细胞耐药的作用[47]。GST 是具有氧化性质的酶，可直接作用于脂质过氧化物而降低其细胞毒性作用， 同时，GST 可催化烷化剂、铂类抗肿瘤药物与 GSH 形成复合底物，使药物失活，从而发生介导肿瘤细胞的耐药作用[49]；TOPO Ⅱ在 DNA 复制、转录、断裂和再连接过程中发挥重要功能，其主要通过干扰基因复制及表达而杀死肿瘤细胞，当 TOPO Ⅱ基因位点发生突变或 TOPO Ⅱ出现高度磷酸化均可导致化疗药物的低敏感性[50]；PKC 可加速MRP1 和 P-gp 的磷酸化介导肿瘤细胞的耐药 。

 DNA 损伤修复介导的肿瘤耐药

OS 化疗药物顺铂、环磷酰胺可通过损伤肿瘤细胞 DNA 发挥抗肿瘤作用，然而该过程可激活细胞周期调控点，通过暂时的细胞周期停滞并进行 DNA 自我修复来逃避药物对自身的损害[51]，目前公认的 DNA 损伤修复机制主要包括：①DNA 碱基切除的修复；

②DNA 错配修复；③DNA 双键断裂的修复；④DNA 核苷酸切除修复[52]。上述四种途径的异常增强均可导致化疗药物的减效或失效，即肿瘤细胞对化疗药物的产生耐药。多种分子、基因通过参与上述途径调控肿瘤细胞耐药，如 DNA 修复蛋白 Rad51 通过修复DNA 双键断裂从而导致耐药[53]，脱嘌呤（AP）/核酸内切酶(APE1)、N-甲基嘌呤-DNA糖基化酶(MPG)可通过修复碱基切除使肿瘤细胞产生耐药性[54]。

自噬介导的耐药

自噬受多种自噬基因调控，也称Ⅱ型程序性死亡，有研究发现抑制或激活肿瘤细胞自噬可以促进肿瘤细胞凋亡，显著增强化疗效果[55]。自噬通过介导细胞因子 mTOR、H MGB、Beclin-1、miRNA 等辅助清除受损的蛋白质和细胞器从而促进肿瘤的生长，有研究表明，当化疗药物作用于肿瘤细胞时，自噬介导的相关因子可抵抗肿瘤细胞凋亡，降低细胞毒性作用从而导致细胞耐药[56]。

总之，骨肉瘤化疗耐药性的产生主要由 ABC 转运蛋白为主的跨膜蛋白家族、介导细胞解毒的酶系统、自噬、DNA 损伤修复介导，此外还与某些 miRNA、信号通路及细胞微环境相关。

 反义寡聚核苷酸逆转技术

针对 OS 耐药性产生的机制，目前逆转 OS 耐药性的手段主要有三大类：基因疗法、曾敏化疗法及中医药疗法。

逆转肿瘤耐药的基因疗法主要有反义寡聚脱氧核糖核苷酸（ASODN）逆转、RNA

干扰技术逆转及核酶技术逆转。ASODN逆转技术主要是通过ASODN与靶向 RNA 互补结合，从而干扰mRNA的翻译。Lo YL等[57]设计了MDR1基因的过反义寡聚核苷酸，选用脂质体当作载体，结果发现合用后比单独用阿霉素具更好的治疗作用，可以较好的逆转结肠癌细胞对阿霉素的耐药性。饶耀剑等[58]通过survivin 修饰反义寡聚核苷酸，通过转染MG-63细胞后，PCR 检测survivin mRNA的表达，发现survivin ASODN能够提高其对化疗药物的敏感性。目前，RNA干扰技术主要是通过抑制MDR1基因及P-gp的表达来逆转耐药的。核酶技术逆转可针对性的切断靶基因的mRNA，较成熟的观点是切断MD R基因的mRNA，从而实现逆转耐药[59]。

 增敏化疗逆转剂

增敏化疗法主要是针对耐药产生的机制如膜转运蛋白的异常表达、酶系统异常表达及 DNA 损伤修复等为靶点逆转耐药。ABC 膜转系统中参与化疗耐药产生的蛋白主要有P-gp，主要由 MDR1 基因编码。维拉帕米与环孢素是经典的 P-gp 抑制剂，可竞争性与P-gp 结合达到逆转的目的，但临床报道心脏毒副反应较大[60]。第二代主要为钙通道阻滞剂，代表药物如维拉帕米的衍生物右旋维拉帕米、右尼古地平、伐司朴达和比立考达等， 可以与外排药物竞争并结合 P-gp，相对增加胞内的药物浓度，达到增敏化疗的作用，其药效剂毒性小且更具靶标性，但可能降低其他联合抗肿瘤药物的活性[61]。第三代药物较第一、二代药物具有更好的逆转作用，代表药物如环丙基二苯并环庚烷类、苯甲酰亚胺衍生物等。

 酶系统抑制剂

此类逆转剂主要是通过降低 GST、PKC、TOPII 等酶的活性起到逆转耐药的作用。如逆转 MDR 制剂依他尼酸可以抑制 GST 酶的活性，丁硫氨酸亚砜胺可抑制 GSH 活性， 逆转耐药。TOPII 抑制剂按其机制可分为 TopII 催化抑制剂及 TopoII 毒剂，目前常用药物有阿霉素为代表的蒽环类、TAS-103 为代表的喹诺酮类、吡啶类衍生物等[62]，因该类前体化合物大多溶解性低、特异性差、毒性较大，化疗患者本身免疫力差，因此临床治疗效果欠佳。PKC 抑制剂主要有 Enzastaurin、苔藓虫素、米哚妥林等[63]，具有良好的逆转耐药及增敏化疗的作用。Michaelis 等[64]研究发现 Enzastaurin 浓度在 0.3125μM 下可直接干扰 DMR1 介导的药物转运，进一步抑制 BCRP 介导的药物转运，进而逆转耐药。

Mohanty 等[65]研究发现苔藓虫素可通过下调 PKC 增敏顺铂化疗效果。此外还有 DNA

修复酶的抑制剂如链脲霉素、阿非迪霉素等。

 中医药逆转

近年来，中医药在肿瘤逆转化疗耐药及增敏化疗中取得良好的疗效。有研究表明[66]， 中药可能通过调控P-gp的表达、抑制MRP1表达、促进耐药细胞的凋亡以及Ca2+通道阻 滞作用等方式逆转肿瘤的化疗耐药，其中抑制P-gp的表达是目前中药及有效成分逆转化疗耐药的主要研究点。Shan Su等[67]发现牛蒡子提取物木脂素类化合物可通过抑制P-gp 的表达逆转人白血病CEM/ADR 5000细胞及结肠癌Caco-2细胞的耐药性。Xue GM[68]研究发现半枝莲提取物二萜类化合物也可通过下调P-gp的表达来抑制乳腺癌细胞对阿霉 素的耐药性。此外，中药苦豆子提取物黄铜类化合物、丹参有效成分隐丹参酮和二氢丹参酮、蛇床子素、姜黄素、槲皮素、三七总皂苷等[69-70]均可通过下调P-gp的表达逆转肿瘤细胞的化疗耐药性。陈英玉等[71]研究发现大黄素可下调MRP1、TOPOⅡ，增加胞内抗癌药物的蓄积，从而逆转HL-60/ADR细胞的多药耐药。朱聪等[72]研究表明龙葵碱在体外水平下调MRP1的表达，有效逆转人白血病K562/ADR细胞的多药耐药性。陆勤等[73]最 新研究发现人参皂苷Rh2能通过促凋亡作用有效逆转阿霉素对肝癌HepG2细胞的多药耐药性。人参皂甙Rb1有着与钙离子通道抑制剂类似的作用，Sadava等[74]发现人参皂甙Rb 1能够增强癌细胞对长春新碱的化疗敏感性，作用与钙通道阻滞剂维拉帕米类似。此外，某些中药及提取物可通过多种途径协同完成逆转耐药的作用，如苦参碱可通过抑制PI3 K/AKT信号途径降低P-gp、MRP1蛋白的表达，从而增加化疗药物对乳腺癌耐药细胞的化疗敏感性[75]。

研究发现许多中药及提取物可有效逆转OS细胞的耐药性，其作用机制主要与抑制A BC跨膜转运系统相关膜蛋白（P-gp、MDR、BCRP）的表达、增加细胞毒性作用有关。马张稳等[76]研究发现川芎嗪对OS细胞具有细胞毒性作用，可显著抑制细胞MDR1的表 达，从而提高OS细胞化疗药物敏感性。Lu Y等[77]研究发现粉防己提取物粉防己碱可通过抑制NF-κB途径的机制抑制P-gp的过度表达逆转人骨肉瘤U-2OS细胞对紫杉醇的耐药性。肖扬等[78]研究发现中药提取物姜黄素可有效逆转人骨肉瘤U-2OS/ADM细胞对阿霉素的耐药性。李秋萍等[79]发现五味子乙素能够抑制OS耐药细胞的MDR1基因的转录， 增强药物对细胞的毒性作用，具有强大的逆转耐药的效果。总之，多种中药单体可逆转OS细胞的多药耐药，但目前研究主要集中于体外研究，体内试验研究较少，需进一步完善。

  P 糖蛋白与骨肉瘤

 P-gp 与肿瘤的关系

P-gp是有MDR编码的分子量为170kDa的蛋白质，约包含1276-1280个氨基酸，依赖A TP产生的能量发挥其功能[80]。P-gp与转运毒物及药物等的解毒功能有关，在正常人体肝脏、肾脏、结肠、睾丸、胎盘等组织中均有表达。通常参与P-gp编码的基因包含MDR1 和MDR2两种，但编码参与药物转运相关的P-gp的基因只有MDR1及亚型，MDR2编码的P-gp主要参与转运磷脂及激素[81]。

P-gp 与多种肿瘤细胞的多药耐药性的产生有关，肿瘤细胞膜表面高表达的 P-gp 能抑制抗肿瘤药物的吸收并促其外排（如蒽环类、紫杉醇、长春碱、依托泊苷），导致肿瘤细胞对抗肿瘤药的低度敏感性。综合现有研究，P-gp 参与化疗耐药途径的机制有 3 种[82]：①药物与 P-gp 直接结合并排除胞外；②抗肿瘤药与 P-gp 在脂质分子层结合，从而化疗药未进入胞内便被排出；③部分抗肿瘤药最终进入肿瘤细胞内，P-gp 会将其泵入胞质内膜腔，其出胞作用将其排出细胞。此外，P-gp 除还可通过各种方式参与肿瘤细胞的凋亡、增殖、迁移、及促进肿瘤细胞上皮间质转化等。Sugawara[83]报道在肾上腺肿瘤、胰岛素肿瘤、肺癌、胃癌、乳腺癌、肾细胞癌、膀胱癌组织中 P-gp 均存在高表达，与肿瘤的恶性组织学行为呈正相关。Leonard 等[84]报道了在结肠癌、肾癌、白血病和乳腺癌等恶性肿瘤化疗后肿瘤的进展与 P-gp 表达呈正相关。杨力[85]研究发现 P-gp 在 OS 组织中呈阳性表达，可作为判断 OS 性质及评估其预后的指标。因此，多种肿瘤组织内存在 P-gp 的异常表达，与肿瘤组织的恶性程度及抗肿瘤药物的敏感性密切相关。

 P53 蛋白在 OS 化疗耐药中的作用

P53 蛋白与多种细胞的分化、凋亡、DNA 损伤修复及各类生物学功能相关，对细胞的增值分化起到负向调控的作用 [86]。本研究在 MTX 诱导耐药过程中持续以肉苁蓉含药血清干预，空白组耐药后，通过 WB 法检测发现，肉苁蓉含药血清各组 P53 蛋白表达均下调（P＜0.05），高剂量组下调最明显（<em