摘要:为深入研究肉苁蓉(Cistanche deserticola Ma． )活性部位体内作用的物质基础，应用高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(HPLC-Q-TOF MS)技术对肉苁蓉拟雌激素活性部位入血成分进行分析，并与空白血清、肉苁蓉拟雌激素活性部位和对照品之间的色谱图和质谱碎片信息进行对比，共鉴别出13 个化学成分，其中包括6 个药材原型:京尼平苷酸、红景天苷、肉苁蓉苷A、松果菊苷、毛蕊花糖苷，肉苁蓉苷D;7个代谢成分:3，4-二羟基苯乙醇苷、甲基化毛蕊花糖苷、乙酰化肉苁蓉苷G、3，4-二羟基苯乙醇、乙酰基管花苷B、肉苁蓉苷B 葡萄糖醛酸代谢物、甲基化3，4-二羟基苯乙醇苷。该方法可为进一步研究肉苁蓉药理活性和作用机理提供理论支持。

关键词:肉苁蓉;含药血清;拟雌激素活性;高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(HPLC-Q-TOF MS)

肉苁蓉(Cistanche deserticola Ma． ) 是一种寄生在沙漠树木( 如梭梭、红柳等) 根部的植物，作为一种滋补、强壮的名贵中药，具有滋补肾阳、调节免疫力、延缓衰老、抗辐射、保护中枢神经系统等多种药理功效，素有“沙漠人参”之称［1-2］。目前，国内外对肉苁蓉的活性研究大多局限于对药理活性的评价［3-9］，而其药效物质基础尚未阐明，这严重阻碍了肉苁蓉的合理开发和应用。中药成分复杂多样，以适当途径给药后，在体内经过吸收、代谢等过程，最终入血的成分才可能是中药的药效物质基础。这些有效成分可能是中药的原型或代谢产物，也可能是中药中各成分相互反应所形成的新成分，还可能是药物直接作用于机体生成的内源性生理活性物质。因此，这些入血成分能够代表中药及复方的药效物质基础。分析口服给药后能进入血液的成分及其代谢产物，寻找成分间的相互作用规律，可以为药效物质基础研究提供一定的依据。采用小鼠子宫增重法和MTT 比色法，对肉苁蓉拟雌激素活性部位及给药剂量进行筛选。前期实验结果表明，用肉苁蓉的乙醇(95% ) 提取物、每天30 g /kg 的剂量，灌胃给药后能使性未成熟小鼠的子宫系数显著增加，且其含药血清对MCF-7 细胞增殖的促进作用显著(P ＜ 0. 01) ，为肉苁蓉拟雌激素作用的活性部位［10］。本工作拟采用高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法(HPLC-Q-TOF MS) 分析鉴定大鼠灌服肉苁蓉拟雌激素活性部位后的入血成分和其原型成分及代谢产物，并对代谢途径进行推测，以期为肉苁蓉拟雌激素作用的药效物质基础研究提供依据。

1 实验部分

1. 1 仪器与试剂

Waters-600 型液相色谱仪:美国Waters 公司产品，配有四元梯度泵、自动进样器、真空脱气机、柱温箱、DAD 检测器、Empower 化学工作站;Agilent-1290 型6530 系列Q-TOF LC-MS 质谱联用仪:美国Agilent 公司产品;XW-80A 旋涡混合器:上海宇工机械有限公司产品;DK-80 电热恒温水浴锅:上海一恒科技有限公司产品;ALC-110. 4 分析天平:上海人和科学仪器有限公司产品;H66MC 超声震荡仪:美国Ohaus 科技有限公司产品。

肉苁蓉:购自三棵树药材市场，由哈尔滨商业大学张德连教授鉴定为Cistanche deserticolaMa． ;毛蕊花糖苷( 批号111530-200505)、松果菊苷( 批号111670-200503)、红景天苷( 批号110736-200628):均由中国药品生物制品检定所提供;乙烯雌酚:广州市汉普医药有限公司产品;甲醇、乙腈:均为HPLC 级，山东禹王试剂有限公司产品;其余试剂均为分析纯;实验用水:市售某品牌纯净水。雌性Wistar 大鼠:批号SCXK-(吉) 2003—2004，体重(220 ± 20) g，由长春国家生物产业基地实验动物中心提供。

1. 2 灌胃药液的制备

将肉苁蓉药材粗粉用95% 乙醇回流提取，依次以8 倍量溶剂提取150 min、6 倍量溶剂提取75 min、6 倍量溶剂再提取75 min，然后将3次提取液合并，减压浓缩，得到浸膏，保存于冰224 质 谱 学 报 第36卷箱中，备用。使用前，用蒸馏水配制成浓度约为1. 5 g /mL 的灌胃药液。1. 3 对照品溶液的制备精密量取适量的毛蕊花糖苷、红景天苷及松果菊苷，用甲醇充分溶解，配制成1 mL 混合对比液，3 种对照品各含0. 2 mg，将对照品溶液过0. 45 μm 滤膜，备用。

1. 4 含药血清及空白血清的制备含药血清的制备:称量雌性Wistar 大鼠体重，按每天1 mL /100 g 的剂量给药，分别给予大鼠蒸馏水和灌胃药液，灌胃分早晚两次，连续给药3 天，末次给药60 min 后，用10% 水合氯醛以2 mL /kg 腹腔注射麻醉，肝门静脉取血，充分凝血后，以3 000 r /min 离心10 min，上清液即为含药血清。空白血清的制备:每天以等体积的蒸馏水给大鼠灌胃，其他制备方法同含药血清。取2 mL 含药血清，加入5 倍量甲醇，于离心管中充分涡旋10 min，再以14 000 r /min 离心10 min，吸取上清液，挥干溶剂。用微量移液器精密加入0. 5 mL 甲醇，充分溶解残留物，经0. 22 μm 微孔滤膜过滤后，进行色谱分析。

1. 5 实验条件

1. 5. 1 色谱条件色谱柱:Waters SymmetryShieldTM ＲP18 柱(4. 6 mm × 250 mm × 5 μm);预柱:Nova-PakC18 Guard-PakTM;流速:0. 5 mL/min;进样量:10 μL;流动相:乙腈-0. 2%甲酸水溶液;梯度条件:0 ～35 min、5% ～34%乙腈，35 ～65 min、24%～26%乙腈;柱温:30 ℃;检测波长:254 nm。

1. 5. 2 质谱条件离子源:大气压电喷雾电离源(ESI);流速:0. 5 mL/min;雾化气压力:0. 2 MPa;干燥气流速:8. 0 L/min;干燥气温度:30 ℃;毛细管电压:3. 5 kV;鞘气流速:12. 0 L/min;鞘气温度:400 ℃。选择正负离子扫描方式，质量扫描范围m/z 100 ～3 000。

2 结果与讨论

2. 1 肉苁蓉拟雌激素活性部位含药血清化学成分HPLC-ESI-Q-TOF MS/MS 分析肉苁蓉拟雌激素活性部位大鼠含药血清样品通过ESI-MS 检测器进行定性分析，分别使用正离子模式和负离子模式进行扫描，结果示于图1。对比图1 中2 种扫描模式的一级质谱总离子流图，发现负离子模式下得到的总离子流特征性较强、灵敏度较高，故本实验选择负离子模式扫描。在负离子模式下，应用ESI-MS 检测器对肉苁蓉拟雌激素活性部位给药后的大鼠血清进行定性分析，通过对比分析空白血清与给药血清的一级扫描总离子流图，共标示出13 个分子离子峰，示于图2。通过分析含药血清与肉苁蓉体外药材，推测2、3、5、7、9、10 号峰为原型成分，1、4、6、8、11、12、13 号峰为代谢成分。根据各色谱峰在负离子模式下检出的分子离子峰，以及相应的特征碎片给出的相对分子质量，共标出13 个质谱峰;对照各标准品的紫外光谱-质谱信息，并参考文献报道的成分，鉴别出13个峰的化学成分，列于表1。其中包括6 个原型成分，分别为京尼平苷酸、红景天苷、肉苁蓉苷A、松果菊苷、毛蕊花糖苷、肉苁蓉苷D;7 个代谢成分，分别为3，4-二羟基苯乙醇苷、甲基化毛蕊花糖苷、乙酰化肉苁蓉苷G、3，4-二羟基苯乙醇、乙酰基管花苷B、肉苁蓉苷B 葡萄糖醛酸代谢物及甲基化-3，4 二羟基苯乙醇。在7 个代谢产物中，推测1 号峰(3，4-二羟基苯乙醇)、8 号峰(3，4-二羟基苯乙醇)、13 号峰(甲基化3，4-二羟基苯乙醇苷) 为肉苁蓉中苯乙醇苷类化合物水解的片段;4 号峰(甲基化毛蕊花糖苷) 为毛蕊花糖苷的代谢产物;6 号峰(乙酰化肉苁蓉苷G) 为肉苁蓉苷G 的代谢产物;11 号峰(乙酰基管花苷B)为管花苷B 的代谢产物;12 号峰(肉苁蓉苷B 葡萄糖醛酸代谢物)为肉苁蓉苷B 的代谢产物。

13 种成分解析如下:1 号峰(tＲ =13. 987 min)m/z 315 为［M － H］－ 峰，推测为母离子失去鼠李糖基，m/z 297 为［M － H － H2O］－ 峰，推测为3，4-二羟基苯乙醇苷;2 号峰(tＲ = 18. 407 min)m/z 373 为［M － H］－ 峰，m/z 211 为［M － H －glc］－ 峰，为母离子失去β-D-葡萄糖基(162 u)而得，推测为京尼平苷酸;3 号峰(tＲ = 24. 309 min)m/z 299，推测为红景天苷，与标准品对照一致;4 号峰(tＲ = 26. 787 min)m/z 637 为［M － H］－峰，m/z 475 为［M － H － caff］－ 峰，m/z 167 为［M－ H － caff － α-L-rhamnopyl － Glc］－ 峰，推测为甲基化毛蕊花糖苷;5 号峰( tＲ = 28. 569 min )m/z 799为［M － H］－ 峰，m/z 637 为［M － H －Caff］－ 峰，为母离子失去咖啡酰基(162 u)而得，推测为肉苁蓉苷A［11］;6 号峰(tＲ = 31. 759 min)m/z487 为［M －H］－ 峰，m/z 327 为母离子失去鼠李糖基，推测为乙酰化肉苁蓉苷G;7 号峰( tＲ =32. 028 min)m/z 785 为［M － H］－ 峰，为松果菊苷失去一个氢特征，推测为松果菊苷，与标准品对照一致;8 号峰(tＲ = 36. 104 min)m/z 153 为［M － H］－ 峰，m/z 123 为［M － H － CH3O］－ 峰，

推测为3，4-二羟基苯乙醇;9 号峰( tＲ = 39. 061min)m/z 623 为［M － H］－ 峰，为毛蕊花糖苷失去一个氢特征，推测为毛蕊花糖苷，与标准品对照一致;10 号峰(tＲ = 43. 117 min)m/z 651 为［M－H］－ 峰，m/z 459 为［M － H － Fr］－ 峰，为中性丢失反式阿魏酸所得，推测为肉苁蓉苷D［12］;11 号峰(tＲ =44. 974 min)m/z 707 为［M － H］－ 峰，m/z543 为［M －H － α-L-rhamnopyl －H2O］－ 峰，推测为乙酰化管花苷B;12 号峰(tＲ = 48. 961 min)m/z989 为［M －H］－ 峰，m/z 827 为［M －H － glc］－ 峰，m/z 651［M － H － glc － glucuronyl］－ 峰为在m/z827 基础上失去葡萄糖醛酸基，推测为肉苁蓉苷B葡萄糖醛酸代谢物;13 号峰(tＲ =57. 965 min)m/z329 为［M － H］－ 峰，m/z 137 为［M － H － glc －OCH3］－ 峰，推测为甲基化3，4-二羟基苯乙醇苷。

2. 2 讨论

本实验应用HPLC-Q-TOF MS 联用技术，在肉苁蓉拟雌激素活性部位给药后的血清中共标识了13 个主要色谱峰，这些可能是肉苁蓉发挥拟雌激素活性的体内直接作用物质，同时也体现了中药药效的产生是多成分相互协调、互补或制约的结果。通过解析13 个血中移行成分，证明了苯乙醇苷类是肉苁蓉的主要活性成分。在后续研究中，将建立相应的谱效关系进行药效相关性研究，以进一步明确药效物质基础，并建立多成分在体内不同时间点的量-时-效关系，从而揭示肉苁蓉的代谢途径和代谢方式。

3 结论

本实验采用HPLC-ESI-Q-TOF MS /MS 技术对肉苁蓉拟雌激素活性部位入血成分进行分析，共鉴别出13 个化学成分，这对阐明肉苁蓉拟雌激素活性成分的药效物质基础研究具有重要意义，也可为肉苁蓉的进一步研究及临床用药提供可靠依据。