摘要：目的建立HPLC 法测定肉苁蓉水提液中松果菊苷的含量。方法采用HPLC 法测定松果菊苷的含量，色谱柱为Inertsil ODS-SP C18 柱；流动相为乙腈（A）-0.4%磷酸溶液（B），梯度洗脱；检测波长为333 nm；柱温

为30 ℃；流速为1.0 mL·min-1；进样量为10 μL。结果松果菊苷在44.939 7 ~ 539.276 4 μg·mL-1 的浓度范围内线性关系良好（r = 0.999 8）；加样回收率为94.59% ~ 105.31%（RSD = 2.93%，n = 9）；3 批肉苁蓉水提液中松果菊苷的平均含量分别为15.527、7.347、12.267 mg·g-1。结论所建立的HPLC 法准确、重复性好、简单易行，适用于肉苁蓉水提液中松果菊苷的含量测定。

关键词：高效液相色谱法；肉苁蓉水提液；松果菊苷；含量测定

肉苁蓉为临床常用的一种补益中药，有“沙漠人参”的美誉。《中国药典》2015 年版收载的肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉Cistanche deserticola Y. C. Ma 或德赢vwin登录 Cistanche tubulosa（Schenk）Wight 的干燥带鱗叶的肉质茎。其性温，味甘、咸，归肾、大肠经，具有补肾阳、益精血、润肠通便的功效。《神农本草经》谓之可“补中，养五脏，强阴养精气”。肉苁蓉主要含有苯乙醇苷类、环烯醚萜及其苷类、木脂素及其苷类、多糖类、酯类化合物和生物碱等。苯乙醇苷类化合物是肉苁蓉的主要活性成分，其中松果菊苷和毛蕊花糖苷是《中国药典》对肉苁蓉进行鉴别和含量测定的指标性成分。药理研究[4]表明，肉苁蓉具有润肠通便、保肝、抗骨质疏松、抗氧化、抗衰老、抗疲劳等多种药理作用。肉苁蓉水提液能促进大鼠成骨细胞骨形态发生蛋白2 基因，以及去卵巢小鼠血清中抗酒石酸酸性磷酸酶、骨钙素和骨髓中Smad1、Smad5 基因，转化生长因子-β等的表达，有抗骨质疏松的作用[5-6]。松果菊苷能促进成骨细胞的增殖以及促进体外培养的骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化[7-9]。近年，肉苁蓉醇提物及其复方制剂中松果菊苷和毛蕊花糖苷含量测定的研究报道较多[10-12]，但肉苁蓉水提液中指标性成分含量测定的相关报道少见。本研究采用高效液相色谱法（HPLC）测定肉苁蓉水提液中松果菊苷的含量。

1 材料

1.1 仪器LC-20AT 高效液相色谱仪、SPD-20A 检测器、SIL-20A 自动进样器、CTO-10ASvp 柱温箱、LC solution 液相色谱工作站，日本岛津公司；MES125P-OCE-DU 电子分析天平，德国Sartorius 公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水式多用真空泵，河南省予华仪器有限公司；RC2B SO25 旋转蒸发仪冷却循环系统、RV 10 D S96 旋转蒸发仪，德国IKA 公司；DK-S26电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；UPR系列超纯水机，四川优普超纯科技有限公司。

1.2 药材与试剂肉苁蓉药材，购自广州岭南中药饮片有限公司， 批号： 1801001、1806001、181001。经广州中医药大学第三附属医院涂兴明主任中药师鉴定为列当科植物肉苁蓉Cistanche deserticola Y. C.Ma 的干燥带鳞叶的肉质茎，样本存放在广州中医药大学第三附属医院药检室；松果菊苷对照品，含量89.7%，中国食品药品检定研究院，批号：111670-201706；乙腈为色谱纯（德国默克公司）；甲醇、磷酸为分析纯（天津市富宇精细化工有限公司）；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 肉苁蓉水提液的制备取肉苁蓉药材粗粉，加入10 倍量蒸馏水，加热回流提取2 次，每次1 h，过滤，合并滤液，滤液用旋转蒸发仪浓缩至含生药量为0.100 g·mL-1，4 ℃保存备用。

2.2 色谱条件与系统适用性色谱柱：Inertsil ODSSPC18 柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.4%磷酸溶液（B），梯度洗脱：0 ~ 5 min，17%A；5 ~ 25 min，20% A；25 ~ 30 min，17% A；检测

波长：333 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL。在该色谱条件下，松果菊苷与相邻组分峰之间的分离度大于1.5，理论塔板数以松果菊苷峰计应不低于4 000。色谱图见图1。

图1 松果菊苷对照品（A）和肉苁蓉水提液（B）的HPLC 图

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液称取松果菊苷对照品适量，精密称定，置于10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解，制成每毫升含松果菊苷898.794 μg 的对照品溶液，4 ℃保存备用。

2.3.2 供试品溶液精密量取2.0 mL 肉苁蓉水提液，水浴蒸干，加甲醇溶解，定容至10 mL 容量瓶中，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.4 线性关系考察精密量取2.3.1 项下的对照品溶液0.25、0.50、1.00、2.00、2.50、3.00 mL 置于5 mL容量瓶中， 加甲醇定容， 摇匀， 得梯度浓度为44.939 7、89.879 4、179.758 8、359.517 6、449.397 0、539.276 4 μg·mL-1 的对照品溶液，0.22 μm 微孔滤膜过滤。按2.2 项下色谱条件进行测定，记录峰面积。以对照品质量浓度为横坐标（X，μg·mL-1），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得回归方程：Y=13 185.0X-32 273.0，r = 0.999 8。结果表明，松果菊苷在44.939 7 ~ 539.276 4 μg·mL-1 的浓度范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验取539.276 4 μg·mL- 1 对照品溶液，按2.2 项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果松果菊苷峰面积的RSD 为1.81%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验精密量取2.0 mL 肉苁蓉水提液，水浴蒸干，加甲醇溶解，定容至10 mL 容量瓶中，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜过滤，按2.2 项下色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24 h 进样测定，记录峰面积。结果松果菊苷峰面积的RSD 为1.16%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.7 重复性试验精密量取2.0 mL 肉苁蓉水提液6 份，按2.3.2 项下方法平行制备6 份供试品溶液，按2.2 项下色谱条件，分别进样测定，记录峰面积。结果松果菊苷质量浓度的RSD 为1.28%，表明方法的重复性良好。

2.8 加样回收率试验精密量取1.0 mL 肉苁蓉水提液9 份，分别加入0.8、1.0、1.2 mL 的对照品溶液（1.552 mg·mL-1），水浴蒸干，加甲醇溶解，定容至10 mL 容量瓶中；摇匀，0.22 μm 微孔滤膜过滤，制得高、中、低浓度的供试品溶液，每个浓度平行制备3 份，按2.2 项下色谱条件进行测定，记录峰面积并计算加样回收率。结果见表1。

2.9 样品含量测定精密量取2.0 mL 肉苁蓉水提液各3 份，水浴蒸干，加甲醇溶解，定容至10 mL 容量瓶中，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜过滤，按2.2 项下色谱条件进行测定，记录峰面积，计算松果菊苷的

含量。结果见表2。

3 讨论

3.1 供试品制备方法肉苁蓉水提液中含有苯乙醇苷类、多糖类等多种化学成分，对待测成分产生一定的干扰。本研究考察了50%甲醇和甲醇两种不同浓度的溶剂。结果表明，以50%甲醇为溶剂的供试品色谱图中松果菊苷与相邻组分峰的分离效果较差；以甲醇作为溶剂，松果菊苷峰的分离度较好，且无其他杂质峰干扰。故选用甲醇作为供试品溶液的溶剂。以甲醇为溶剂，肉苁蓉水提液水浴蒸干，采用甲醇溶解定容摇匀和甲醇超声（10 min）溶解两种处理方法。结果显示，两种方法无明显差异。因甲醇溶解定容摇匀操作简便，故选用此方法制备供试品溶液。

3.2 流动相的选择本研究参考2015 年版《中国药典（一部）》[2]肉苁蓉药材项下含量测定的流动相（甲醇-0.1%甲酸）进行测定，结果发现，松果菊苷峰展宽且出现前沿现象，可能与流动相洗脱能力弱有关；参考相关文献[12-13]，以乙腈-0.5%醋酸为流动相，但松果菊苷峰形较差，且出现拖尾现象，考虑为流动相pH 值的问题，最终以乙腈-0.4%磷酸为流动相，结果理论塔板数以松果菊苷峰计大于4 000，松果菊苷与相邻组分峰之间的分离度大于1.5，峰形对称，无杂质峰干扰，基线稳定。因此，本研究松果菊苷含量测定采用乙腈-0.4%磷酸为色谱流动相。本研究采用HPLC 法测定肉苁蓉水提液中松果菊苷的含量，该方法操作简单，结果准确，重复性好，适用于肉苁蓉水提液中松果菊苷的含量测定，可作为肉苁蓉水提液的质量控制方法。本研究仅测定了肉苁蓉水提液中松果菊苷的含量，后续拟对肉苁蓉复方汤剂中松果菊苷的含量进行测定，以探讨各种因素对松果菊苷含量的影响，为含肉苁蓉的汤剂的质量控制提供参考。

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