目的，观察中药肉苁蓉含药血清对PC12细胞同亡的影响 方法 采用1甲基4＋苯基毗啶离子（Fmrily）4plenybyriliniam MPP＊）建立PC12细胞减亡模型应用血清药理学方法 结合光镜荧光染色核形分析，透射电镜，流式细胞位等检测，研究中药免血清对PCI2细胞同亡的保护作用。结果：含1／2和2信等效剂量组中药免血清Gg剂量为肉苁蓉生药L63.2和6.4／kg）处理的PC12细胞经MPP＊作用后两亡率分别为16.0％，10.2％和2.8％与空白组（18．6％）相比差异显著（P＜0.05），结论：肉苁客具有拮抗MPP＋导致的细胞测亡作用。

引言

帕金森病（Parkinson disaes PD）的发病机制为黑质多巴胺能神经元损害和缺失，细胞凋亡可能为其重要原因，我们应用流式细胞术（FACS）、透射电镜。荧光染色的核形分析等方法对中药肉苁蓉含药血清和神经毒素1-甲基-4-苯基吡啶离子（1-methyl-4-phenylpyridiniom，MPP＊）处理的PC12细胞进行检 测，以探索肉苁蓉对神经元的保护作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料 PC12细胞购自日本生命科学基金会：KP-M11640培养液，小牛血清，鼠尾胶原购自Gibco公司；MPP＇.Anmesin V-FITC.PL.PBS.细胞培养瓶及培养 板购自Sigma公司；中药肉苁蓉购自西安市饮片厂；新西兰大耳白兔（维，体质量2.5～3kg）由学校动物中心提供：Hancht33342购自碧云天公司；多聚甲醛为国产分析纯：LD4-2型离心机（北京医用离心机厂）仪器荧光显微镜（Lda公司），例置是微镜（Olympss公司）JEM-2000EX 型透射电镜（日本），CO2恒温孵箱（Hrrar-HERAordL 德国）Cadter EPICS 流式细胞仪（B-ck-man Codter公司，美国。

1.2 方法 PC12细胞生长于RPM11640细胞培养基，其中含体积分数为100 mL／L小牛血清，细胞培养瓶及培养板使用前均用0.2g／L．鼠尾胶原覆壁。培养细胞置于37℃，50mL／LCO2培养箱中，3d换液，待单层培养细胞将要融合时，用1.25g／L胰蛋白酶消化，传代培养，当传代细胞进入对数生长期即可加药，根据家免的体质量，按体表面积折算动物的等效剂量，中药肉苁蓉制备为冻干粉，用时以蒸馏水稀释，动物给药采用每日2次，给药3d的方法（中国实验方剂学杂志199844：13-15x于最后1次ig后11颈动脉放血，4℃过夜，2500 ／min离心25 min分离血清．56℃，30 min 灭活，经0.22Pm滤膜抽滤除菌，-20℃保存，同等条件下，分别制备空白家兔对照血清，1／21和2倍签效剂量血清，实验分为5

组：A 组为空白兔血清组，B组为2倍等效剂量血清＋MPP＊组（灌胃剂量为肉苁蓉生药6.4g／kg）．C组为等效剂量血清＋MPP＊组（灌胃剂量为肉苁蓉生药3.2g／kg），D组为半等效剂量血清＋MPP＊组（ig剂量为肉苁蓉生药1.6g／kg），E组为空白兔血清＋MPP＋组，传代培养12h以后在倒置显微镜下观察细胞即将汇合前加药，各组血清含量均为10％培养3d后，加入MPP＋，终浓度为200／mml／L置37℃50 mL／LCO2培养箱培养24h后检查。

1.2.1 PC12细胞荧光染色观察 特Harchs33342加入培养的PC12细胞中，终浓度为10mg／L 37℃孵育30min．40g／L多聚甲醛和培养液以3混合，使多聚甲醛的终浓度为10g／L．固定5～10 min 后，弃去上清用PBS洗涤，于荧光显微镜下观察。

1.2.2 造射电镜观察 药物处理24h后，将细胞收集井移至离心管中，1500 t／min 4离心5 min 再用10 mmol／L PBS洗涤2次，1500 ／min 4℃离心5min，弃上清，沿管壁缓缓加入25mL／L戊二醛4℃固定21．用直头滴管剥离细胞团块，PBS洗涤3次每次5min 钱酸4℃后固定1b后梯度丙酮脱水，环氧树脂浸透和包埋，用LKB-2188 型超薄切片机切片.醋酸一柠檬酸铅染色透射电镜观察并照相。

1.2.3 流式细胞仅检测 MPP＊作用24b用1.25g／L胰蛋白酶消化贴壁的PC12细胞取10f个．PBS洗2次，加入490＃L结合缓冲液，充分混匀细胞，加入SPL Annexin V-FITC和10PL溶解的PI于细胞 悬浮液中，轻轻混匀，将试管置于4℃，避光孵育10min．上流式细胞仪检测，每组设4个复孔。

统计学处理：数据用又士，表示。多组间的比较采用 Kruskal-Wallis检验，两两比较采用Mauruhit-mry 检验，以P＜0.05为有显著差异。

2 结果

2.1 PC12细胞荧光显微镜观察 正常生长的PC12细胞经 Hoech33342染色后均可发出均匀的荧光在凋亡的细胞核内可见浓染致密的颗粒块状荧光和点状白色荧光。正常组大部分细胞的胞核中呈现较为均匀的兰色荧光，隐约可见点状凝聚的点状荧光其凝聚的点状荧光较MPP＋对照组细胞弱，正常生长的细胞经Hoechst染色后显示均匀的蓝色荧光，胞核形态规则（Fig IA），经MPP＊作用后细胞核染色质出现浓缩状态，或高度凝聚呈不规则点状荧光，或边缘化：晚期细胞核裂成碎块（Fig 1B）．等效剂量和2倍等效剂量的肉苁蓉含药血清＋MPP＋组细胞基本

国1 PC12细胞Harchu33342 染色核形分析

2.2 投射电镜观察 正常培养的PC12细胞，核染色质均匀 核膜清楚完整，胞质线粒体丰富，细胞器完整（Fig 2A）．MPP＊作用后，PC12细胞变化明显，细胞膜完整，表面微绒毛消失，胞质浓缩染色质固缩，断裂，高度凝聚，并边集于核膜内面，呈凋亡的特征，以早，中期凋亡细胞为主（Fig 2B．C）．含有肉苁蓉血清各组码亡细胞明显减少，细胞核染色质分布均匀，核膜清楚完整，细胞器完整，接近Fig 2A所示细胞。

2.3 流式细胞仪检测结果 在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷酯酰丝氨酸（PS）迁移至细胞膜外侧，各组细胞祠亡率分别为（2.3±0.11）％（2.8±0.21）％（10.2±0.60）％，（16.0±0.87）％和 （18.6±0.67）％．经秩和检验分析B．C．D组与E组相比P＜0.05．含有中药血清与空白血清组相比差别

3 讨论

MPP＋的神经毒性是多成分作用的复杂过程，其中包括阻码线粹体和突触囊泡多巴胺的置换产生的细胞码亡以及内源性多巴胺的神经毒作用导致细胞凋亡有关！性观察MPP＋对黑须多巴胺细胞系 SN4741两亡的过程中，存在着Cmpas-1 和Caspas-3的激活”．1Pmo／L的MPP＋作用于肾上腺神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系数天后可以引起凋亡相关 Bel-2蛋白表达增加“，肉苁蓉为列当科肉苁蓉属（Cis-unche）植物的干燥带鳞叶的肉质茎，治疗老年痴某，PD等有较好的疗效，肉苁蓉总苷能有效地清除各种活性氧自由基能保护OH＇引发的DNA氧化Sheng 等研究证实内苁蓉提取物tubuloside B可以减弱MPP＊诱导的细胞毒性，削弱细胞内活性氧的积家，对MPP＊诱导的凋亡和氯化应激有对抗的作用。我们观察到肉苁蓉具有拮抗MPP＊诱导的PC12细胞的两亡的作用，而且随者剂量的增加对PC12细胞的保护作用增加。

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