摘　要: 建立良性前列腺增生大鼠模型,用不同剂量的阿克替苷灌胃4周,研究肉苁蓉的化学成分阿克替苷对前列腺增生大鼠前列腺细胞凋亡和超微结构的影响。结果表明: 模型组细胞凋亡率较低;高剂量阿克替苷处理后,大鼠前列腺细胞凋亡率明显高于模型组。超微结构显示阿克替苷较模型组细胞核完整,细胞核浓缩不明显,细胞核致密度增高,粗面内质网空泡减少。证明阿克替苷能促进细胞凋亡,对超微结构有明显的改善作用,因而抑制前列腺增生。

关键词: 阿克替苷; 大鼠; 前列腺增生; 细胞凋亡; 超微结构

前列腺增生( BPH)过程中细胞凋亡是目前较受关注的机制之一,其由基因编码所决定,并能够使细胞通过对特定信号的反应控制细胞程序性死亡。前列腺发育至成年大小后,通过细胞凋亡平均速率的平衡作用使前列腺细胞的增殖率维持在1% ～ 2% , 一旦这种平衡被打破则被认为是BPH的诱发原因。正常条件下,前列腺内的雌、雄激素水平及正常循环是存在于增殖与凋亡过程中的一种自我平衡状态。当增殖与凋亡失去平衡时,会导致腺体进一步生长和扩大,主要使上皮细胞间隔间发生膨胀[ 1 ]。本试验通过建立大鼠前列腺增生模型,观察并分析肉苁蓉化学成分之一阿克替苷(类叶升麻苷)对大鼠前列腺细胞凋亡及超微结构变化的影响,以评价阿克替苷抑制前列腺增生的效用,为开发利用中药肉苁蓉的新用途提供科学依据。

1　材料与方法

1. 1　试验动物

6～ 7周龄雄性SD大鼠50只,清洁级,体重80～ 100 g, 由扬州大学比较医学中心提供。

1. 2　试剂与药品

丙酸睾丸酮注射液由上海通用制药有限公司生产,规格25 mg· mL- 1 , 批号060708。PI染液由扬州大学测试中心提供。阿克替苷含量945 g· kg- 1 , 中国药科大学中药分析教研室制备。

1. 3　实验仪器

Philips Tecnai 12透射电子显微镜荷兰飞利浦公司生产; FACSAria型流式细胞仪为美国BD公司制造。

1. 4　分组与造模

按文献[3 ]方法去势后,大鼠背部皮下注射丙酸睾酮5 mg· ( kg· d)- 1 , 连续4周,建立前列腺增生模型。将模型大鼠随机分为模型组、模型十阿克替苷高剂量组、模型十阿克替苷中剂量组、模型十阿克替苷低剂量组,每组10只; 另取10只正常大鼠为对照组。

1. 5　给药方法

造模后1周,阿克替苷高、中、低剂量组分别按60、30、15 mg· ( kg· d) - 1灌胃给药。模型组、对照组灌胃等容积生理盐水,每天1次,连续4周,每周1次称量体重,根据体重调整给药剂量。

1. 5　样本采集与处理

1) 取材与制样: 末次给药后24 h , 称量空腹大鼠体重,用颈椎脱臼法处死大鼠,立即打开下腹部,剥离前列腺周围组织,游离前列腺,取部分前列腺于冰浴中用组织匀浆器匀浆,制备前列腺单细胞悬液,采用碘化丙啶一步法染色[4 ]; 另取部分前列腺组织固定于25 g· L- 1戊二醛中,制备超薄切片。

2) 制备单细胞悬液: 在无菌条件下,完整取出大鼠前列腺移入平皿中,用PBS冲洗前列腺组织表面的血液及血凝块,去除周围附带的脂肪及多余的纤维、胞膜,从同一大鼠前列腺取大小约0. 5 cm3 新鲜前列腺组织,剪碎,制备前列腺细胞悬液[5 ]。将前列腺组织块置于培养皿中,加入少量PBS; 冰浴锅中用眼科剪将组织剪碎,匀浆器研磨至混悬状,加入10 mL PBS, 吸管吸取组织匀浆,用0. 074 mm孔径尼龙网过滤到试管内, 1 500 r· min- 1离心3 min, 沉淀物再用PBS洗3次,每次以500 r· min- 1短时低速离心除去细胞碎片,以0. 037 mm孔径尼龙网过滤去细胞团块。细胞计数并调整细胞浓度为2× 109 个· L- 1。用1 mL PI染液染色, 4 ℃避光10 min。

3) 超薄切片制备: 超薄组织切片制备见文献[6]。

2. 1　阿克替苷对大鼠前列腺细胞凋亡的影响图1为流式细胞仪检测的凋亡波峰图,由此可见阿克替苷具有促凋亡作用。对细胞凋亡的结果统计分析表明,经高、中、低剂量阿克替苷分别处理后大鼠细胞凋亡率明显增加( 24. 7± 1. 85)% 、( 16. 1± 1. 04)% 、( 14. 5± 0. 68)% ,与正常组( 1. 1± 0. 06)% 、模型组( 9. 5± 0. 5)% 、阳性组( 9. 83± 0. 76)%比较差异均极显著( P < 0. 01) , 表明阿克替苷可诱导细胞凋亡,且作用明显强于阳性对照药前列康(图2)。

2. 2　阿克替苷对前列腺增生细胞超微结构的影响电镜观察显示: 正常大鼠前列腺可见细胞核完整,核仁明显,核染色质分布均匀; 粗面内质网大小一致,排列整齐, 无空泡化现象,上皮表面无指状微绒毛突起,未见线粒体肿胀现象,腔内分泌物少。模型组前列腺细胞的细胞核明显变形、皱缩,胞质丰富; 粗面内质网呈囊状高度扩张,明显空泡化,囊内充满高密度蛋白颗粒; 线粒体轻度肿胀(也有空泡) ,腔内有中等密度分泌物,有些细胞内可见致密圆形分泌颗粒。阿克替苷干预的大鼠,细胞核较模型组完整,细胞核略浓缩,核致密度增高,异染色质积聚,胞质有空泡,粗面内质网空泡减少; 低剂量阿克替苷组的细胞核轻度皱缩,不规则,胞质较丰富,粗面内质网减少(图3)。

讨论

应用FCM定量检测凋亡细胞简便、快速、客观,并可进行多参数检测,较深入地了解细胞凋亡的变化及其可能的调节机制。

细胞凋亡是多细胞有机体为调控机体发育、维护内环境稳定由基因编码决定的细胞程序性死亡过程。凋亡细胞有其独特的形态和生物学特征: 细胞核染色质固缩, DN A广泛降解断裂,细胞全面皱缩,细胞膜皱缩外突包裹细胞器(如线粒体、核糖体) ,细胞核片段形成特征性的凋亡小体,凋亡细胞不仅保留完整的细胞膜结构和功能,而且细胞器结构完整,这不同于细胞坏死。细胞凋亡的分子机制迄今尚未完全阐明,有研究[7 ]表明,在细胞凋亡中有多种基因参与了细胞凋亡的基因调控。BPH过程中细胞凋亡目前较受关注,其由基因编码决定,并能够使细胞通过对特定信号的反应控制细胞的死亡[1 ]。前列腺发育至成年大小后,通过细胞凋亡速率的平衡作用使前列腺细胞的增殖率维持在1% ～ 2% , 这种平衡的破坏一直被认为是BPH的起因[8 ]。正常条件下,前列腺内的雌激素与雄激素水平和正常循环是存在于增殖与凋亡过程中的一种自我平衡状态。当增殖与凋亡失平衡时,会导致腺体进一步生长和扩大,主要因上皮细胞间隔之间的膨胀所致[9 ]。这种平衡的中断可能源于雄激素水平或功能的改变;也可能起因于AR对DHT的刺激或者以DHT为媒介的生长因子水平的改变而产生的任何一种反应[2 ]。本研究经FCM检测细胞凋亡发现,与模型组比较,给予高剂量阿克替苷的大鼠前列腺细胞凋亡率明显增加。电镜结果显示,模型组大鼠前列腺细胞胞核变形,粗面内质网呈囊状高度扩张,囊内充满高密度蛋白颗粒, 空泡化明显;线粒体轻度肿胀,与相关研究[ 10-11 ]报道一致。

阿克替苷干预后大鼠前列腺增生程度显著减轻,高剂量组同时出现了凋亡的早期征象: 前列腺细胞胞核基本保持完整,内质网空泡明显减少。细胞核浓缩,核致密度增高,异染色质积聚,类似于大鼠去势后前列腺组织细胞的表征[12-13 ]。说明阿克替苷可诱导前列腺增生大鼠细胞凋亡,调节和恢复前列腺细胞凋亡与增殖的平衡,发挥抑制前列腺细胞增生作用。本研究及先前研究[ 14]结果表明,德赢vwin登录 化学成分阿克替苷抑制前列腺增生的作用可能与其促进细胞凋亡、减弱AR及TGF-UR1过表达有关,详细的作用机制尚有待于进一步深入研究。

参考文献:

[ 1]　Giacomo N, Anto nio G, Ra fa el B B, et al. Inflammation, apo pto sis, and BPH, what is the Evidence [ J]. EuropeanUrology Supplements, 2006( 5): 401-408.

[ 2]　Car son I C, Rittmaster R. The ro le of dihydro testoster one in benign prostatic hyperpla sia [ J]. Urology , 2003, 61:2-7.

[ 3]　徐淑云, 卞如濂, 陈　修. 药理实验方法学[M ]. 3版. 北京: 人民卫生出版社, 2002: 1552-1553.

[ 4 ]　翟琦巍, 季红斌, 严明达, 等. 利用tet-off 诱导表达系统研究Akt的功能[ J]. 科学通报, 2000, 45( 16): 1738-1741.

[ 5]　夏安周, 邢淑华, 朱学文, 等. 肾组织单细胞悬液制备方法的比较研究[ J]. 徐州医学院学报, 2004, 24( 1):50-53.

[ 6 ]　孙　云, 王德俊, 刘晓梅, 等. 实验性衰老小鼠肺超微结构的变化及肉苁蓉多糖的影响[ J]. 中国药理学通报,2002, 18( 1): 84-87.

[ 7]　刘庆猛, 路名芝. 良性前列腺增生细胞增殖和凋亡发病机制研究进展[ J]. 江西医学检验, 2005, 23( 2): 141-143.

[ 8 ]　Sharia t S F, Ashfaq R, Roehrborn C G, et al. Ex pression of surv ivin and a poptotic bioma rkers in benig n pro statich yper plasia [ J]. J Urol, 2005, 174: 2046-2050.

[ 9 ]　Unterg asser G, Madersbacher S, Berg er P. Benig n prosta tic hy perplasia: age-related tissue-r emodeling [ J ]. Ex pGero ntol, 2005, 40: 121-128.

[10]　郑　恒, 邵春丽, 钱家庆. 盐酸菲洛普对大鼠前列腺增生的抑制作用[ J]. 同济医科大学学报, 1999, 28( 3):227-229.

[ 11 ]　钟　伟, 邱曙东, 蒋三亮. 良性前列腺增生的形态学改变与ARmRN A表达差异[ J]. 西安医科大学学报, 1999,20( 2): 145-149.

[ 12 ]　牛远杰, 董克权, 白景文, 等. 去势后犬前列腺的动态病理学改变[ J]. 中华泌尿外科杂志, 1998, 19( 7): 429-433.

[ 13 ]　叶章群, 蓝儒竹, 周　盛, 等. 去势后大鼠腹叶前列腺显微结构的动态变化[ J]. 中华泌尿外科杂志, 2001,22( 8): 468-472.

[ 14 ]　孙卫东, 陈　飞, 孙　云. 阿克替苷对实验性前列腺增生模型的抑制作用[ J]. 扬州大学学报: 农业与生命科学版, 2008, 29( 3): 55-58.

[ 6]　黄　进, 钱源澄. 显示幽门螺杆菌Wa rthin-Star ry 浸银染色法的改进[ J]. 江苏医药, 1997, 23( 12): 885.

[ 7]　张强英, 余咏文, 黄惠清, 等. 儿童幽门螺杆菌感染与白细胞介素-8含量的关系[ J]. 中国当代儿童杂志, 2004,6( 4): 285-286.

[ 8]　Gulhan M, Canbakan S, Ah med K, et al. Helicobacter py lori in bro nchiectasis: a polymerase chain reactio n assay inbro nchoalv eo lar lav age fluid and br onchiectatic lung tissue [ J]. Archiv es o f M edical Research, 2007, 38 ( 3): 317-321.

[ 9 ]　Ishak R A H, Awad G A S, Mor tada N D, et a l. Prepara tion, in v itro and viv o ev aluatio n of stomach-specificm etronida zole-loaded algina te beads as local anti-Helicobacter pylori therapy [ J ]. Jo ur nal of Co nt rolled Relea se,2007, 119( 2): 207-214.

[ 10 ]　Rajinikanth P S, Balasubramaniam J, Mishra B. Dev elopment a nd ev aluatio n of a nov el floa ting in situ gellingsy stem of amox icillin fo r eradication o f Helicobacter py lori [ J]. Internatio nal Jo ur nal of Pharmaceutics, 2007,335( 1 /2): 114-122.

[ 11 ]　张绍兰, 杨致邦, 王小琴. 抗幽门螺杆菌黏附素HpaA卵黄抗体的制备[ J ]. 中国人畜共患病学报, 2006,22( 3): 265-267.

[ 12 ]　谢献胜, 刘　孟, 李建基, 等. 卵黄抗体对幽门螺杆菌感染沙土鼠的预防试验[ J]. 苏州大学学报: 医学版,2007, 27( 5): 715-717.