杨凯，张桂菊，徐宝财

( 北京工商大学食品学院北京市食品风味化学重点实验室食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京100048)

摘要: 采用单因素试验结合正交试验的方法，研究了以表面活性剂水溶液为提取剂，提取肉苁蓉中总黄酮的工艺条件。结果表明，在质量分数为0． 2%的十二烷基硫酸钠( SDS) 水溶液为提取剂，料液比( g∶ mL) 为1∶ 20，提取温度为80 ℃，提取时间为1． 0 h 的条件下肉苁蓉黄酮的提取率可达7． 34%。

关键词: 表面活性剂; 肉苁蓉总黄酮; 辅助提取

肉苁蓉有极高的药用价值，具有补肾阳、益精血、润肠通便、抗疲劳、抗衰老、抗肿瘤和增强机体免疫力等作用，素有“沙漠人参”的美誉［1，2］。肉苁蓉中的化学成分主要包括苯乙醇苷类、黄酮类、环烯醚萜及其苷类、木脂素及其苷类、氨基酸类、糖类、挥发性成分及微量元素等，其中国内外学者对苯乙醇苷类化合物的研究较多［3］。黄酮类化合物具有重要的生物活性，如抗肿瘤、抗心血管疾病、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗病毒和免疫调节等作用［4，5］，而目前对肉苁蓉中黄酮类化合物的提取、分离及性能研究相对较少［6，7］。黄酮类化合物的提取方法主要为加热回流或索式提取法［8，9］，这些方法提取时间长、有机溶剂的用量大、能耗高。虽然也有新技术辅助其提取，如超声波技术［10］、微波技术［11］、闪式提取技术［12］和超临界流体技术［13］等，可以缩短其提取时间，但提取率并未有明显提高，而且仍然需要加入50% ～ 85% 的有机溶剂。表面活性剂具有双亲结构，能显著降低溶液的表面张力，增强溶剂对物料的润湿和渗透作用，对天然产物的有效成分具有增溶作用，因此，用表面活性剂来辅助提取肉苁蓉中的总黄酮可获得较好的提取率及提取效率［14 － 18］。更重要的是，在该提取过程中采用纯水介质，符合绿色、环保的要求。笔者采用单因素试验和正交试验分析的方法，研究表面活性剂辅助提取肉苁蓉中黄酮类化合物的工艺条件，以期为肉苁蓉资源的深度开发、合理利用提供技术支持。

1 实验部分

1. 1 主要试剂与仪器

肉苁蓉，特级品，产自新疆，市售; 乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、盐酸、三氯化铝等，均为分析纯，北京化学试剂厂; 芦丁对照品( 生产批号100080 －201408) ，纯度不小于92． 8%，中国食品药品检定研究院; 十二烷基苯磺酸钠( LAS ) ，十二烷基硫酸钠( SDS) ，十六烷基三甲基溴化铵( CTAB) ，聚氧乙烯月桂醚( Brij － 35) ，Tween 20，Tween 40，Tween 60，Tween80，Triton X － 100，双( 2 － 乙己基) 磺基丁二酸钠( AOT) ，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。UV － 3600 紫外可见红外光谱仪，岛津国际贸易( 上海) 有限公司; DF － 101S 集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司; SHZ － D( Ⅲ) 循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司; LT 电子天平，沈阳龙腾电子仪器有限公司; FW80 微型高速万能试样粉碎机，北京中兴伟业仪器有限公司;DZ － IBC真空干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司。

1. 2 肉苁蓉中总黄酮的提取方法

取干燥肉苁蓉，粉碎后过40 目筛，准确称取2 g，按一定比例加入表面活性剂水溶液，在一定温度下加热提取一定时间，待提取液冷却至室温后，过滤，滤液转移至100 mL 容量瓶中，用纯水定容至刻度后摇匀，放置待测。

1. 3 总黄酮的测定方法

1. 3. 1 芦丁标准曲线的绘制

精确称取干燥至恒重的芦丁标准品50 mg，用无水乙醇定容至50 mL，摇匀，得到质量浓度为1 g /L 的标准液。准确量取上述标准溶液0，0． 5，1. 0，1. 5，2. 0，2. 5和3. 0 mL 于10 mL 容量瓶中，各加入质量分数为5%

的NaNO2溶液0. 5 mL，摇匀，静置6 min; 然后加入质量分数为10% 的Al( NO3)3溶液0. 5 mL，摇匀，静置6 min; 再加入质量分数为4% 的NaOH 溶液4 mL，用体积分数为70%的乙醇溶液定容至10 mL，摇匀，静置10 ～ 15 min 后于510 nm 波长处测定吸光度。因使用的芦丁标准品纯度为92. 8%，对此进行校正，以校正后芦丁标准品溶液的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程y = 17. 934x －0． 008 1，Ｒ2 = 0. 999 7，结果表明芦丁的质量浓度在50 ～ 300 mg /L 范围内与吸光度具有良好的线性关系。

1. 3. 2 肉苁蓉中总黄酮的测定方法

精确移取1. 0 mL 肉苁蓉提取液于10 mL 容量瓶中，按照1. 3. 1 节的方法测定510 nm 波长处的吸光度，计算肉苁蓉中总黄酮的提取率。具体公式如下:

Y1 = C1 × V1 × V × 1 000× 100%

              m × V2

式中Y1为总黄酮提取率，%; C1为按照标准曲线由吸光度计算出的显色溶液的质量浓度，g /L; V1为显色时溶液的定容体积，mL; V2为显色时提取液的体积，mL; V 为提取液的总体积，mL; m 为称取样品的质量，g 。

1. 4 黄酮提取物的定性分析

在温度为60 ～ 65 ℃的条件下，将得到的总黄酮提取液用旋转蒸发仪减压浓缩。取少量减压浓缩后的肉苁蓉总黄酮提取物溶解于甲醇中，制备供试溶液后进行以下操作。盐酸－ 锌粉实验: 吸取1 mL 供试溶液于试管中，加入4 ～ 5 滴浓盐酸，再加入少许锌粉，观察颜色变化; 三氯化铝反应: 吸取1 mL 供试溶液于试管中，加入几滴质量分数为1% 的三氯化铝溶液，在日光灯和紫外光下观察颜色变化。将肉苁蓉总黄酮提取物用甲醇稀释，在190 ～400 nm进行紫外光谱扫描，并观察其特征吸收峰。

2 结果与讨论

2. 1 单因素试验

2. 1. 1 表面活性剂种类对提取率的影响以表面活性剂质量分数为0． 1% 的水溶液作为提取液，在料液比为1 ∶ 20 ( g ∶ mL，下同) ，提取温度为70 ℃和提取时间为1. 0 h 的条件下进行肉丛蓉中总黄酮的提取。选取的表面活性剂有阴离子型( SDS，LAS，AOT) 、阳离子型( CTAB) 和非离子型( Tween 20，Tween 40，Tween 60，Tween 80，Brij － 35，Triton X －100) 共10 种，以纯水介质中的总黄酮提取率为对照，实验结果见图1。从图1 可以看出，不同种类的表面活性剂对肉苁蓉中总黄酮的提取效果差异较大。阴离子表面活性剂的辅助提取效果较为理想( 除AOT) ，非离子表面活性剂其次，而阳离子表面活性剂CTAB 的提取率较低。其中阴离子表面活性剂SDS 效果最好，对肉苁蓉总黄酮的提取率可达5． 4%，因此选择SDS辅助提取肉苁蓉中的总黄酮。

2． 1． 2 表面活性剂用量对提取率的影响

在料液比为1∶ 20，温度为70 ℃提取1. 0 h 的条件下，考察SDS 的用量对肉苁蓉中总黄酮提取率的影响，结果如图2 所示。由图2 可知，随着表面活性剂质量分数的增大，总黄酮的提取率也随之增加，可能是由于溶液中形成的胶束增多，从而对肉苁蓉的润湿渗透作用和对总黄酮的增溶作用增大，而当SDS 质量分数大于0． 2%时，总黄酮的提取率明显减小，综合考虑选择SDS 的较优质量分数为0． 1% ～ 0． 2%。

2． 1． 3 料液比对提取率的影响

在SDS 的质量分数为0． 1%，温度为70 ℃ 提取1. 0 h 的条件下，考察料液比对肉苁蓉中总黄酮提取率的影响，结果如图3 所示。从图3 可以看出，当料液比为1∶ 20 ～ 1∶ 40 时料液比对肉苁蓉总黄酮的提取率影响不大，而当料液比为1∶ 40 后提取率降低。从减小成本并保证提取率的角度考虑，选择较优料液比为1∶ 20 ～ 1∶ 40。

2． 1． 4 提取温度对提取率的影响

在SDS 的质量分数为0． 1%，料液比为1∶ 20，提取时间为1. 0 h 的条件下，选择提取温度分别为40，50，60，70，80 和90 ℃，考察温度对肉苁蓉中总黄酮提取率的影响，结果如图4 所示。

从图4 可看出，随着温度的升高，总黄酮提取率逐渐增加，这可能是由于升高温度有利于促进介质传递，同时增加总黄酮的溶解度，而当温度进一步升高后提取率降低。从降低能耗和保证提取率的角度综合考虑，较优提取温度为60 ～ 80℃。

2． 1． 5 提取时间对提取率的影响

在SDS 的质量分数为0． 1%，料液比为1∶ 20，提取温度为70 ℃的条件下，考察提取时间对肉苁蓉总黄酮提取率的影响，结果见图5。从图5 可以看出，总黄酮提取率随提取时间的延长而增加，但1． 5 h 之后提取率增加缓慢，到2. 0 h 后基本不变。综合考虑后选择较优提取时间为1. 0 ～ 2. 0 h。

2． 2 正交试验优化肉苁蓉总黄酮提取工艺

根据单因素试验结果，选择SDS 的质量分数、料液比、提取温度和提取时间为考察重点，以肉苁蓉总黄酮提取率为考察指标，进行L9( 34 ) 正交试验，因素水平设置和试验结果分别见表1 和表2。由表2 分析可知，各因素对总黄酮提取率的影响次序为A ＞ C ＞ D ＞B，即表面活性剂的质量分数对提取率的影响最大，料液比对提取率的影响最小。在选取的各因素水平范围内，根据正交试验结果，得出肉苁蓉总黄酮的较优提取工艺为A3B1C3D2，即SDS 质量分数为0． 2%，料液比为1∶ 20，提取温度为80 ℃，提取时间为1． 0 h。

以优化后的工艺条件提取肉苁蓉中的总黄酮，共进行6 次重复试验，提取率分别为7. 33%，7. 35%，7. 30%，7. 34%，7. 36% 和7. 33%，平均提取率为7. 34%，相对标准偏差( ＲSD) 为0． 29%，说明此优化工艺条件波动范围很小，具有很好的稳定性。

2． 3 黄酮化合物的定性分析

盐酸－ 锌粉实验，是鉴定黄酮类化合物最常用的颜色反应，多数的黄酮、黄酮( 醇) 类化合物显红色或紫红色。实验加入锌粉后，溶液由黄色变为紫红色，反应呈阳性，初步鉴定为黄酮类化合物或黄酮( 醇) 类化合物。三氯化铝实验，鉴定酚羟基的存在，铝离子与酚羟基结合使溶液变为黄绿色，在紫外灯光下溶液有黄绿色荧光出现。实验加入三氯化铝溶液后，溶液颜色由黄色变为黄绿色，紫外光下出现黄绿色荧光，表明有酚羟基的存在，初步鉴定为黄酮( 醇) 类化合物。在SDS 的质量分数为0． 1%，料液比1∶ 20，提取温度80 ℃，提取时间1． 0 h 的条件下提取肉苁蓉中的总黄酮，提取物的紫外吸收光谱如图6 所示。大多数黄酮类化合物在甲醇中的紫外吸收光谱由2 个主要吸收带组成，带1 在300 ～ 400 nm 之间，是由B 环肉桂酰基系统的电子跃迁所引起; 带2 在200 ～ 285 nm之间，归属于A 环苯甲酰基系统电子跃迁引起的吸收［19］。由图6 可知，肉苁蓉总黄酮提取物在256 和357 nm 处有2 个明显的吸收峰，且吸收峰强度均较强，此为黄酮( 醇) 类化合物的典型特征。

3 结论

从肉苁蓉中提取总黄酮的优化工艺条件为: 以质量分数为0． 2% 的SDS 水溶液为提取剂，料液比( g∶ mL) 为1∶ 20，提取温度为80 ℃，提取时间为1． 0 h。在此条件下，肉苁蓉中总黄酮的平均提取率为7． 34%。

由图3 可知，牛毛水解物在290 ～ 320 和320 ～400 nm 2 个波段内吸光度曲线的积分值分别为8. 721 7和12. 760 2，UVA/UVB 比值为1. 46，说明牛毛水解物具有较好的抗UVA 作用，能有效防护紫外线中UVA 对皮肤的损伤［20］。结合抗UVB 测定结果可知，牛毛水解物具有较高的SPF 值和UVA/UVB 比值，可有效阻挡紫外线中UVA 和UVB 对皮肤的辐射损伤，具有较好的抗紫外线活性。

3 结论

牛毛水解物有较高的水解度( 15. 68%) ，分子量分布在1 800 ～ 22 000 Da 之间，富含半胱氨酸、谷氨酸、精氨酸、丝氨酸等多种活性氨基酸，具有较显著的吸湿、保湿能力及较好的抗紫外线活性。研究工作为牛毛资源在日化工业的高附加值转化利用提供了实验依据。

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