杨瑞瑞1 乔蓉霞1

杜宏伟2 李卓敏2

( 1. 陕西省食品药品检验所，西安，710061；2. 西安正大制药有限公司，西安，710043)

摘要：目的 完善补脑丸质量标准。 方法 采用薄层色谱鉴别补脑丸中的当归、枸杞子、肉苁蓉、酸枣仁，采用RP- ELSD-HPLC 测定酸枣仁中酸枣仁皂苷A 的含量。结果 在薄层色谱中分别检出当归、枸杞子、肉苁蓉、酸枣仁，斑点清晰，重现性好。RP- ELSD-HPLC 得到酸枣仁皂苷A 的线性范围在0.498μg～24.9μg 之间，γ=0.999；平均回收率为95.47%，RSD 为6.35%(n=6)。结论 定性定量方法简便、专属、准确，提高了补脑丸药品的控制标准。

关键词：薄层色谱法；酸枣仁皂苷A；高效液相色谱法

补脑丸［1］收载于《卫生部药品标准中药成方制剂第十册》，是由酸枣仁、当归、 枸杞子、 肉苁蓉、五味子等多味中药组成的复方制剂，具有滋补精血，健脑益智，安神镇惊，化痰熄风。临床上用于治疗迷惑健忘，记忆减退，头晕耳鸣，心烦失眠，心悸不宁，癫痫头痛，神烦胸闷等。原质量标准中只有当归、五味子等几味药的显微特征鉴别，为了更好的控制该制剂的内在质量，对本品分别用薄层色谱法和高效液相色谱法进行了定性定量研究。

1 仪器、试剂与试药

Waters -Alliance 2695-2487(YY01520041103)高效液相色谱仪，蒸发光散射检测器 (Alltech ELSD 2000)，色谱柱：kromasil C18 柱(5μm，250×4.6mm)；乙腈为色谱纯，水为高纯水，其它试剂均为分析纯。酸枣仁皂苷A 对照品（批号为110734－200509）、酸枣仁皂苷B 对照品（批号为1110814－200506）、枸杞子对照药材（批号121072－0301）、松果菊苷对照品（批号为111670－200401，中检所提供）、当归对照药材 (批号120927-200310)均由中国药品生物制品检定所提供。补脑丸样品及实验用阴性样品均由西安正大制药有限公司提供。

2 定性鉴别

2.1 当归的鉴别

2.1.1 对照药材溶液的制备 取当归对照药材1g，加乙醚20m1，超声处理10分钟，滤过，滤液挥干，残渣加乙醇2ml 使溶解，作为对照药材溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取本品适量，除去包衣，研细，取1g，加乙醚20m1，超声处理10 分钟，滤过，滤液挥干，残渣加乙醇2ml 使溶解，作为供试品溶液。

2.1.3 阴性样品溶液的制备 取不含当归的阴性样品1g，按“2.1.2”项下方法进行制备，作为阴性样品溶液。

2.1.4 薄层色谱鉴别 吸取对照药材溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G 薄层板上，以正己烷－乙酸乙酯(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。

供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰。见图1。

2.2 肉苁蓉的鉴别

2.2.1 对照品溶液的制备 取松果菊苷对照品，加甲醇制成每1ml 含0.5mg 的溶液，作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品适量，除去包衣，研细，取1g，加甲醇20ml，超声处理15 分钟，滤过，滤液浓缩至近干，残渣加甲醇2ml 使溶解，作为供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 取不含肉苁蓉的阴性样品1g，按“2.2.2”项下方法进行制备，作为阴性样品溶液。

2.2.4 薄层色谱鉴别 吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各1μl ，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲醇－醋酸－水(2∶1∶7)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰。见图2。

2.3 枸杞子的鉴别

2.3.1 对照药材溶液的制备 另取枸杞子对照药材0.5g，加水50ml，加热煮沸15 分钟，放冷，滤过，滤液用乙酸乙酯25ml 振摇提取，提取液浓缩至约1ml，作为对照药材溶液

2.3.2 供试品溶液的制备 取本品适量，除去包衣，研细，取5g，加水50ml，加热煮沸15 分钟，放冷，滤过，滤液用乙酸乙酯25ml 振摇提取，提取液浓缩至约1ml，作为供试品溶液。

2.3.3 阴性样品溶液的制备 取不含枸杞子的阴性样品5g，按“2.3.2”项下方法进行制备，作为阴性样品溶液。

2.3.4 薄层色谱鉴别 吸取对药材溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G 薄层板上，以甲苯－乙酸乙酯－甲酸(10∶5∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。阴性样品无干扰。见图3。

2.4 酸枣仁的鉴别

2.4.1 对照品溶液的制备 取酸枣仁皂苷A 和酸枣仁皂苷B 对照品适量，加甲醇分别制成每1ml 含0.5mg 的溶液，作为对照品溶液。

2.4.2 供试品溶液的制备 取【含量测定】项下的供试品溶液作为供试品溶液。

2.4.3 阴性样品溶液的制备 取不含酸枣仁的阴性样品5g，按“2.4.2”项下方法进行制备，作为阴性样品溶液。

2.4.4 薄层色谱鉴别 吸取酸枣仁皂苷A 对照品溶液与酸枣仁皂苷B 对照品溶液各5μl，供试品溶液、阴性样品溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶 G薄层板上，以正丁醇－冰醋酸－水（4∶1∶5）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。喷以2%香草醛硫酸溶液，在100℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性样品无干扰。见图3。

3 RP-HPLC 测定补脑丸中酸枣仁皂苷含量

3.1 色谱条件

色谱柱： Kromasil 色谱柱(C18，5μm，250×4.6mm)；柱温：30℃； 流动相： 乙腈—水 (33：67) ；流速: 1.0ml/min ；气流:2.5 ml/min ；漂移管温度：110℃。

3.2 对照品溶液的制备 精密称取酸枣仁皂苷A 对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.2mg 的溶液。

3.3 供试品溶液的制备 取本品适量，除去包衣，研细，精密称取5g，置于索氏提取器中，加乙醚适量回流提取3 小时，醚液弃去。药渣挥尽残醚，再加甲醇适量回流提取5 小时。甲醇提取液置水浴上蒸干，残渣加水20ml，分数次定量转移到分液漏斗中。用水饱和的正丁醇提取5 次，每次15ml。合并正丁醇提取液，用正丁醇饱和的氨水（取40ml 浓氨溶液加水稀释到100ml，再用正丁醇饱和。分取下层液）洗涤2 次，每次50ml，洗液弃去，再用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次50ml，正丁醇提取液置水浴上蒸干。残渣加甲醇溶解，定量转移至5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

3.4 阴性样品溶液的制备 取不含酸枣仁的阴性样品，按“3.3”项下的制备方法，同法制成阴性样品溶液。

3.5 方法学考察

3.5.1 线性范围考察 精密称取酸枣仁皂苷A 对照品12.45mg，置25ml 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即浓度为0.498mg/ml，按上述色谱条件，分别进样1μl、2μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl、30μl、40μl、50μl，记录色谱图，计算峰面积，以峰面积的对数值与进样量的对数值进行回归，求得回归方程为：Y=1.4102X+5.7014,R=0.999,表明酸枣仁皂苷A 在0.498μg～24.9μg 之间线性良好。

3.5.2 精密度考察 取按“3.3”制备的样品溶液，重复进样6 次，按“3.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，计算相对标准偏差为4.01%。表明仪器精密度良好。

3.5.3 稳定性考察 取按“3.3”制备的样品溶液，24 小时内分别进样5 次，记录峰面积，计算相对标准偏差为4.80%。表明样品溶液在24 小时内基本稳定。

3.5.4 重复性考察 精密取同一批次样品6 份，分别按“3.3”项下的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按“3.1”项下色谱条件进行测定，计算其相对标准偏差为5.33%。

3.5.5 加样回收率试验 精密称取重复性试验样品细粉共6 份，每份2.5g，分别精密加入酸枣仁皂苷A 对照品溶液(0.4265mg/ml)1ml，挥干，按“3.3”项下的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按“3.1”项下色谱条件进行测定，结果见表1

3.6 样品含量测定

收集到的13 批样品，分别按按“3.3”项下的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按“3.1”项下色谱条件进行测定，结果见表2。

4 讨论

4.1 补脑丸中的酸枣仁［2］具有养心安神的功效，其中所含的酸枣仁皂苷A 及B为有效成分之一。酸枣仁皂苷A 及B 的含量测定方法以前多采用薄层扫描法［3］，近来有采用高效液相色谱法测定。本实验在查阅有关资料［4］［5］后，对补脑丸主要药味酸枣仁中的酸枣仁皂苷A 用高效液相色谱法进行了测定，结果表明，该方法简便、准确、重现性好，可有效地控制其质量。

4.2 在预试验中，对样品供试品溶液制备中的取样量、提取溶剂、提取时间、除杂溶剂及用量等进行了多因素考察，以乙醚脱脂、甲醇提取、正丁醇萃取、氨溶液除杂质为较优条件。对于色谱条件也进行了优化，比较了甲醇-水系统和乙腈-水系统，以乙腈－水（33∶67）为优；由于用的是空气源，所以气流速为2.5ml/min，漂移管温度为110℃。

4.3 薄层色谱鉴别中当归、枸杞子用对照药材作对照，均能得到满意的层析结果；肉苁蓉因有二种，薄层色谱不完全一致，选用松果菊苷和毛蕊花糖苷作对照，样品中在与毛蕊花糖苷斑点相同位置有干扰，故只选松果菊苷作对照；酸枣仁皂苷B 在含量测定中量较小，未作为控制指标，增加在薄层色谱鉴别中。

参考文献：

［1］《卫生部药品标准中药成方制剂第十册》

［2］《中国药典2005 年版一部》

［3］尹清茹，张永玲.薄层扫描法测定咽炎丸中酸枣仁皂苷的含量. 中国药业，1999,8(8)：34～35

［4］钟东会，雷根虎，郭五保等. RP-HPL 测定酸枣仁中的酸枣仁皂苷A 的含量. 中成药，2004, 26 (11)：963～964

［5］李会军，李萍. 高效液相色谱法蒸发光散射检测器测定酸枣仁皂苷A 及B 的含量. 药物分析杂志，2000,20(2)：82～84