以绿原酸为内标用HPLC测定肉苁蓉愈伤

组织中松果菊苷的含量研究

                     朱咏华1，杜方麓，张胜

（1．湖南中医学院中药化学教研室，湖南 长沙410004：2．湖南中医学院2000级研究生班，湖南 长沙410007）

（摘要）目的减少在测定肉苁蓉愈伤组织中松果菊苷含量时对照品松果菊苷的用量研究。方法 以绿原酸为内标，用HPLC测定肉苁蓉愈伤组织中的松果菊苷的含量，结果研究测定的校正因子为2.3：肉苁蓉对绿原酸的相对保留值为1.973，测定了各种肉苁蓉愈伤组织中的松果菊苷的含量，结论该法操作简便，结果准确、可靠。

（关键词）绿原酸：高效液相色谱；肉苁蓉：松果菊苷

（中图分类号）R284.2 （文献标识码）A（文章编号）1000-5633（2003）03-0005-02

肉苁蓉［Cistanche sala（C-A-Mey）G-Bedk］具有补肾 阳，益精血，润畅通便之功能。其中的苯乙醇总苷为主要活性成分，其含量可作为判断质量的标准，通常以松果菊苷（echinacoside）为对照品，采用反相高效液相色谱或比色法测定，肉苁蓉来源稀少，国家明令禁止采挖，我们已通过组织培养手段诱导出肉苁蓉愈伤组织中，为减少确定愈伤组织中次生代谢产物（苯乙醇苷类，以松果菊苷为指标）含量时所需松果菊苷对照品的用量，我们以绿原酸（chlomgrnicarid）为内标，测定了不同培养基配方诱导不同部位产生的11 种愈伤组织（A，B、C、D、E、F、G、H、I、J、K）中的松果菊苷的含量，此法简单，重现性好，结果准确、可靠，更重要的是，绿原酸价格低康，为测定肉苁蓉中苯乙醇苷类成分的含量提供了一个新方法。

1 材料与方法

1.1 色谱条件

Pekin Elmer HPLC：785A紫外检测器：Series 200 四元梯度洗脱泵；Turbo EL 色谱工作站：HypenilODS2C1s4.6mmx200mm色谱柱；流动相：按表1所列线性梯度洗脱；波长；335mm：进样量；51L。

表1 色谱操作条件     (ml.)

1.2 操作方法

1.2.1 对照品溶液的制备 精密称取绿原酸（购自生物制品检定所）9.5mg，用10％的乙腈溶液溶解并定容于50ml容量瓶中，配成浓度为0.19mg／mL的溶液。分别称取松果菊苷（新疆医学院提供）4.8、5.2,7.0mg，用上述绿原酸溶液溶解并定容于10ml

容量瓶中。

1.2.2 供试品溶液的制备 精密称取肉苁蓉粉末（过80目）0.5g·加100ml．甲醇超声提取30min后，过滤，滤液蒸发至干，用上述绿原酸溶液溶解并定容于10ml．容量瓶，0.45m微孔滤膜过滤，即得。

1.2.3 标准曲线的测定 绿原酸回归曲线：Y=12901008X-42 418.7 r=0.9997

绿原酸在0.12～1.90g之间呈良好的线性关系。松果菊苷的标准曲线：Y=124 828 770.5X+2615 447.8 =0.999.6 

松果菊苷在0.65～3.90g之间呈良好的线性关系。

1.2.4 校正因子的测定 松果菊苷（C3sHsO2o）分子量：786；绿原酸（C1sHsOs）分子量：354；其分子量之比为2.22。取2个对照品混合溶液3份分别进样5L，测定，数据如表2。

表2 校正因子的测定

所得平均校正因子为2.30．与松果菊苷和绿原酸的分子量的比值2.2相近，与这个分子中均有咖啡酰共轭体系结构吻合。

1.2.5 相对保留值 在本梯度洗脱范围，经3次测定相对保留值为1.973，见表3．图1。

表3 松果菊苷对绿原酸相对保留值的测定

t/min

图1 对照品和内标的HPLC色谱图

1.2.6 重复性试验 精密称取K样品6份，按测定法操作，所得含量松果菊苷（％）见表4。

2 测定结果

取样品溶液A、B、C、D、E、F、J、H、I、J、K分别进样量为514，按上述方法测得含量分别为0.18％、

0.02%,3.80%、4.74%、3.87%、1.75%、2.66%、 0.56％、4.48％、2.34％、1.10％。样品K的测定如图2。

表4 重复性试验结果       (%)

图2 样品K的含量测定色谱图

3 讨论

肉苁蓉中的苯乙醇总苷为主要活性成分，而松果菊苷等苯乙醇苷类成分的分离精制比较难，价格昂贵且难于买到。绿原酸分布广泛，易于分离，价格低廉。以绿原酸为内标测定松果菊苷含量结果可靠，肉苁蓉中其他类似成分只要测出与绿原酸的关系（校正因子、相对保留值，分别为定量、定性指标），即可测定，减少对照品的用量。本法所采用的梯度洗脱程序，相对保留值稳定。测定不同培养基配方诱导不同部位产生的11种愈伤组织（A、B、C、D、E、F、G、H、1J、K）中的松果菊苷的含量结果表明，C、D、量较大。此法为进一步研究肉苁蓉愈伤组织培养条件打下基础。

参考文献：

［1］张思巨，刘 丽，张淑运，等·肉苁蓉药材质量标准的研究［J］．中国中药杂志，3000,25（6），359．

[2] 堵年生，叶银梅，胡君萍，硝酸铝一比色法测定肉苁蓉中苯乙醇贰的含量［J］·新疆医学院学报，1993.16（4）：308．

[3] 朱咏华，陈彩艳，唐前瑞，等，肉苁蓉不同外植体愈伤组织诱导比较［J］·中药材，2001.24（4）：242．