皋　聪 ,王传社  巫冠中  ,胡　梅1 ,屠鹏飞

( 1. 中国药科大学药理教研室,江苏南京　210009; 2. 北京大学中医药现代研究中心,北京　100083;

3. 北京大学基础医学院,北京　100083; 4. 北京大学药学院,北京　100083)

人口的老龄化已使寻找安全有效的防治老年痴呆症药物成为药物研究的热点。近年来,中医学使用以补肾益髓为主、兼补心脾的方法治疗老年痴呆症取得了较大的进展。肉苁蓉始载于《神农本草经》,具有补肾阳、益精血、润肠通便之功效,现广泛用于治疗老年性痴呆、阳痿、习惯性便秘等病症[ 1, 2]。研究表明其具有抗痴呆、抗氧化、抗缺氧、抗辐射、增强免疫功能等作用,主要成分为苯乙醇苷类[3～ 6 ]。苁蓉总苷是从管花肉苁蓉Cistanche tubulosa ( Sch renk) R.Wigh t 的干燥肉质茎中提取精制而成的,含苯乙醇苷类90. 7% ,其中含主要成分松果菊苷( echinacoside)44. 3% 。本实验研究苁蓉总苷对血管性痴呆大鼠学习记忆障碍以及正常大鼠血栓形成和血小板聚

集的影响,为其开发成为促智和防治老年性痴呆症的新药提供依据。

1　材料

1. 1　动物: SD大鼠, 雄性,体重470～ 570 g ,由上海西普马-必凯实验动物有限公司提供,合格证号:沪动合格字第152号。

1. 2　药物与试剂: 苁蓉总苷,德赢vwin登录 的提取物,含苯乙醇总苷90. 7%、松果菊苷44. 3% ,深褐色粉末,由北京大学中医药现代研究中心化学室提供,批号为980601。吡拉西坦片,宜兴制药厂生产,批号为980521。阿司匹林肠溶片,南京第二制药厂生产,批号为000402。各药用前以蒸馏水配制。肝素钠,中国医药(集团) 上海化学试剂公司产品, 批号为F000128。戊巴比妥钠,中国医药(集团)上海化学试剂公司进口分装,批号为971104。二磷酸腺苷二钠

( ADP) ,中科院上海生化所东风生化技术公司产品,批号为9305122,用前配成1 mg /mL储备液冰箱保存,用时以磷酸缓冲液稀释3倍。

1. 3　仪器: MG— 3 型Y 型电迷宫,张家港教学实验器械厂生产。SPA— 4多功能血小板聚集仪,上海科达测试仪器厂生产。

2　方法

2. 1　大鼠局灶性脑缺血-再灌注致血管性痴呆模型制备及检测

2. 1. 1　分组与给药: 将大鼠按体重随机分为6组,分别为假手术组、模型组、阳性对照组(吡拉西坦300 mg /kg ) 及苁蓉总苷高、中、低剂量( 200、100、50 mg /kg) 组。各组ig 给药, 0. 5 mL /100 g ,每日1次,假手术组和模型组给予等体积的蒸馏水,连续给药30 d。

2. 1. 2　模型的制备[7 ]: 于给药的第16天,大鼠以水合氯醛360 mg /kg ip麻醉。正中切开颈部皮肤,分离右侧颈部肌肉,游离颈总动脉和颈外动脉,结扎并剪断颈外动脉分支。分离颈内动脉,直至暴露翼腭突动脉。用动脉夹夹闭该侧颈总动脉,颈外动脉切口,将头端钝圆、直径0. 28 mm的碳素渔线从大鼠颈外动脉插入颈内动脉并进入颅内,直到有轻微阻力,这时大脑中动脉的所有血供被阻断。缺血40 min后将渔线抽出,结扎颈外动脉, 再通颈总动脉,消毒、缝

合, im 青霉素防止感染。假手术组只分离和结扎颈外动脉,不插渔线、不夹闭颈总动脉。

2. 1. 3　学习记忆测试[8 ]: 于手术后第7天,采用Y型电迷宫进行学习记忆训练和测试。实验在安静、暗环境下进行,将大鼠置于其中的一臂(固定的起步区) ,在灯光下适应2 min,然后给予电击。在左臂设灯光信号,为安全区,右臂有电流无灯光,为危险区。电击强度以大鼠受电击后能奔跑为准,电压为50～60 V。大鼠受电击后逃至安全区为正确,逃至危险区为错误,每次训练后在安全区停留30 s以巩固记忆。再次训练时在起步区灯光下休息10 s,反复10次,记录正确和错误次数,计算正确反应率。每次训练均在给药后1 h 进行,连续测定4 d。然后以左右臂交替为安全区再测定4 d,记录正确和错误次数,并计算正确反应率。正确反应率= 正确反应数/训练次数

2. 2　大鼠动-静脉旁路血栓形成及检测[8 ]: 将大鼠按体重随机分为5组,分别为模型组、阳性对照组(阿司匹林100 mg /kg )、苁蓉总苷高、中、低剂量( 200、100、50 mg /kg ) 组。各组ig 给药, 0. 5 mL /( 100 g ) ,模型组给等体积的蒸馏水,连续给药7 d。末次给药后, ip 戊巴比妥钠45 mg /kg 麻醉,仰卧位固定,分离右颈总动脉和左颈外静脉。将一根长7cm的4号手术丝线称质量后放入3段聚乙烯管的中段,使接触血液的丝线长6 cm,以50 U /mL的肝

素生理盐水充满整个聚乙烯管。将静脉端插入左颈外静脉后,从动脉端准确地注入50 U /kg 的肝素生理盐水抗凝,然后将动脉端插入右颈总动脉。给药后1 h 打开动静脉旁路,开放15 min 后中断血流,迅速取出丝线置称量纸上,用电子分析天平称湿质量,计算血栓抑制率。血栓抑制率= (模型组血栓质量- 给药组血栓质量) /模型组血栓质量× 100%

2. 3　大鼠血小板体外聚集的检测[8 ]: 将大鼠按体重随机分为5组,分别为正常对照组、阳性对照组(阿司匹林100 mg /kg ) 及苁蓉总苷给药组(剂量同上)。给药方法同2. 2项。末次给药前禁食12 h,于末次给药后1 h 从腹主动脉取血,以3. 8% 枸橼酸钠( 1∶ 9) 抗凝,轻轻混匀后,以1 000 r /min离心3min,吸出上层富含血小板血浆( PRP) ,余血继续在3 000 r /min 离心10 min, 上清为贫血小板血浆( PPP)。比浊管中加入200μL PRP,并以PPP调零点,预保温5 min 后加入50μL ADP溶液诱导血小板聚集,测定血小板聚集强度,计算血小板聚集抑制率。聚集抑制率= (正常组最大聚集率- 给药组最大聚集率) /正常组最大聚集率× 100%

2. 4　统计处理: 结果均以x± s表示,用组间比较的t 检验对数据进行统计处理。

3　结果

3. 1　对局灶性脑缺血-再灌注致血管性痴呆模型大鼠学习记忆功能的影响: 结果见表1。测试的前4 d各组平均正确反应率逐日提高,第4天各组平均正确反应率均达到90% 以上。前3 d苁蓉总苷各剂量组和阳性组的平均正确反应率均高于模型组,差异显著( P < 0. 05、0. 01) ,说明苁蓉总苷50、100、200mg /kg ig 给药能明显提高局灶性脑缺血-再灌注的血管性痴呆大鼠迷宫训练时的正确反应率,即苁蓉总苷对该模型所致的学习记忆功能障碍有明显的保

护作用。第4天各组的平均正确反应率无明显的差异,第5天以左右臂交替作为安全区后,各组的平均正确反应率均明显下降,但各组之间无明显差异。随后各组的平均正确反应率又逐步提高,但各组之间平均正确反应率亦无显著差异。表明苁蓉总苷只能使脑损伤大鼠学习记忆功能恢复到一定程度,且学习方式的改变不影响已获得的学习记忆能力。

3. 2　对大鼠动-静脉旁路血栓形成的影响: 结果见表2。与模型组比较,苁蓉总苷200、100 mg /kg ig 给药能明显抑制大鼠动-静脉旁路血栓形成,但其作用均明显弱于100 mg /kg 阿司匹林。苁蓉总苷50mg /kg 对大鼠动-静脉旁路血栓形成无影响。说明苁蓉总苷对整体动物动-静脉旁路血栓的形成有一定抑制作用。

3. 3　对ADP诱导的大鼠血小板体外聚集的影响:结果见表3。与正常组比较: 苁蓉总苷200、100、50mg /kg ig 给药均能明显抑制ADP诱导的大鼠体外血小板聚集,以200 mg /kg 组的抑制率最高,达到59. 48% 。

4　讨论

　　老年性痴呆一般可分为4种,即阿尔茨海默病( AD)、血管性痴呆( V D)、混合性痴呆(前两者并存) 及由全身性疾病引发的老年人痴呆。流行病学调查显示,西方国家AD 的发病率高于V D,而我国则不同,根据11个城市的普查, V D 的患病率高于AD[9 ]。V D系由脑血管因素导致脑组织损害所引起的痴呆综合征的总称。中医认为本病多属本虚标实,随着年龄的增加,机体肾中精气渐亏,髓海渐虚,脏腑功能渐衰,脏衰则致机体水液输布、气血运行失常,进而出现痰浊血瘀等病理产物堆积体内,痰瘀交阻而致脑络受损,气血无以渗灌,窍络升降不利,神机失统,记忆匮乏,发为痴呆。因此,本病的特点是因虚致实、虚实夹杂,肾虚是老年性痴呆发生发展的根本原因,痰浊停聚和脉络瘀阻后化毒为害,损伤脑络则是该病发病过程中的基本病理环节。肉苁蓉是传统的补益壮阳药,具有补肾填精及润肠作用,《本草经疏》称其为补精血、滋肾之要药,对肾虚所致倦怠、健忘、听力减退及遗尿等症状有较好的疗效。朱志明等对治疗老年性痴呆的46个复方的药物组成进行了分析,发现肉苁蓉是常用药物之一[1 ]。本实验中,大鼠在ig 给药的第16天,进行局灶性脑缺血-再灌注致V D模型制备,继续给药的第7天开始进行学习记忆的训练和测试。在测试的前3 d,模型组的平均正确反应率明显低于假手术组大鼠,说明脑缺血-再灌注损伤造成模型大鼠学习记忆功能障碍; 而苁蓉总苷各剂量组大鼠的平均正确反应率明显高于模型组,与假手术组大鼠的水平相当,说明肉苁蓉对V D大鼠的学习记忆障碍确有预防和治疗作用,苁蓉总苷为其抗痴呆的有效成分。VD 的发病原因及发病机制相当复杂,目前尚不十分清楚。近年研究表明, V D的危险因素包括与卒中有关和与卒中无关的因素,总结为高血压、心脏病、高血脂、糖尿病、血容积比容、教育水平、年龄、性别等,而其发病机制则与多发性梗死、重要部位的单个梗死、脑白质缺血等有关[10, 11 ]。本实验中, ig 给予苁蓉总苷7 d 的大鼠动-静脉旁路血栓湿质量明显低于模型组,即苁蓉总苷能明显抑制整体动物体内血栓形成; 结果还表明苁蓉总苷体内给药可明显抑制ADP诱导的大鼠体外血小板聚集。综合两个实验结果,可以发现苁蓉总苷预防和治疗V D的机制可能与抑制机体血小板聚集有关。

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