公司网址：www.www.wagawa.com
厂家服务热线：0903-6682528
全国服务热线：400-966-8288
公司地址：新疆和田洛浦县杭桂路232号
尹刚王贵林余万贵
（长江大学医学院湖北荆州434023）
【摘要】目的：研究大黄和肉苁蓉提取物对败血症休克模型大鼠急性肺损伤的影响探讨败血症休克治疗方法。方法：采用盲肠结扎穿孔术（ＣＬＰ）复制败血症休克模型大鼠通过大黄和肉苁蓉提取物灌胃观察其对败血症休克模型大鼠肺组织病理学、肺湿干重比、肺泡灌洗液中性粒细胞比例、蛋白含量及肺泡通透指数肺毛细血管通透性肺组织丙二醛（ＭＤＡ）、超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）、髓过氧化物酶（ＭＰＯ）的影响。结果：生理盐水组大鼠肺间质水肿肺泡腔内可见大量细胞浸润和血浆蛋白渗出肺血管内皮细胞损伤．肺湿干重比、肺泡灌洗液中中性粒细胞比咧蛋白含量及肺泡通透指数、肺毛细血管通透性、肺组织丙二醛（ＭＤＡ）、超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）、髓过氧化物酶（ＭＰＯ）均显著升高。大黄和肉苁蓉给药组上述指标较生理盐水组显著降低。结论：肉苁蓉及大黄对败血症休克模型大鼠急性肺损伤具有良好保护作用其机制可能是通过抑制中性粒细胞在肺组织的浸
润减少氧自由基对肺组织的损伤实现的。
【关键词】肉苁蓉；大黄；感染性休克模型大鼠；急性肺损伤
败血症休克是临床急危重症1／3患者死于急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征临床除采用大剂量抗生素和激素疗法外尚无其他有效治疗措施。国内学者开始把目光转向中医药有报道大黄有保护肺血管内皮细胞对内毒素诱导的急性肺损伤有明显的保护作用［1］肉苁蓉能抗膜酯质过氧化和减轻自由基造成的组织细胞损害［2］这些功能在败血症休克肺损伤中能发挥针对性治疗作用。
1 材料和方法
1．1 药物、试剂与仪器戊巴比妥钠（中国医药集团上海化学试剂公司批号008104）丙二醛（ＭＤＡ）试剂盒超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）试剂盒髓过氧化物酶（ＭＰＯ）试剂盒（南京建成生物工程研究所批号20080108）肉苁蓉（经长江大学医学院中医系潘丰满博士鉴定）水煎剂大黄（经潘丰满博士鉴定）水煎剂伊文思蓝。仪器：日立Ｈ一600型透射电镜721型分光光度计。
1．2 动物及分组健康雄性ＳＤ大鼠40只华中科技大学实验动物中心提供体重200～250ｇ质检号（ＴＪＩＡ一2008一Ｉ67）随机分为4组生理盐水组（8只）大黄组（8只）肉苁蓉（1ｇ／ｍＬ）组（12只）．肉苁蓉（3ｇ／ｍＬ）组（12只）。各组分别灌胃15ｄ。生理盐水5ｍｌ／ｋｇ·ｄ一大黄水煎剂1ｇ／ｋｇ·ｄ；肉苁蓉水煎剂1ｇ／ｋｇ·ｄ（含生药1ｇ／ｍＬ）；肉苁蓉水煎剂3ｇ／ｋｇ·ｄ（含生药3ｇ／ｍＬ）；盲肠结扎穿孔术法［3］：实验前2周大鼠饲养于实验室室22℃造模前12ｈ禁食水第15天晚8：00进行手术。戊巴比妥钠30ｍｇ／ｋｇ体重麻醉后常规消毒腹部皮肤正中切口长约3ｃｍ打开腹腔后小心分离盲肠避免损伤肠系膜血管寻找盲肠与小肠及大肠交界处然后1－0号丝线结扎盲肠2／3在结扎端盲肠用7号针头均匀穿刺6次．将盲肠还纳于腹腔关闭腹腔逐层缝合。术后将大鼠放回笼内保持呼吸道通畅给足饮水、饲料注意保暖。各组按前述剂量进行灌胃每日1次连续15ｄ。各组均于第16天灌胃后30ｍｉｎ采血取肺泡灌洗液。常规称取大鼠肺组3ｇ制备肺组织匀浆液．清洗分离肺组织表面血块、气管后．眼科剪剪碎肺组织按1：10加入匀浆液（蔗糖250ｍｍｏｌＮ一乙羟乙基哌嗪Ｎ2乙基磺酸（Ｈｅｐｅｓ）2ｍｍｏｌ乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）0．1ｍｍｏｌｐＨ7．4）机械匀浆至管中无肺组织块为止尽量缩短匀浆时间以免肺组织变性全部过程均在0～4℃的条件下进行。全部样本均在取样后于－20℃冰箱保存1周内行全部指标测定。
1．3 败血症休克模型大鼠肺组织学检查每组各取动物肺脏左叶少许经10％甲醛固定石蜡包埋切片ＨＥ染色后用普通光学显微镜观察并在此基础上再取肺组织制成1ｍｍ。大小用25％戊二醛溶液固定然后固定于四氧化锇液中乙醇、丙酮脱水经环氧树脂包埋制备超薄切片后行铀一铅双重染色用透射电镜观察。
1．4 大鼠肺组织湿／干重比、及肺泡灌洗液中细胞计数比、蛋白含量测定开胸取出肺脏左叶称湿重后置烤箱（80℃20ｈ）烤至衡重称干重计算湿／干重比。开胸后肺右叶取肺泡灌洗液在显微镜下计细胞总数和细胞分类数。考马氏亮蓝法测定蛋白含量计算肺通透指数（肺泡灌洗液蛋白／血浆蛋白）。
1．5 大鼠肺血管通透性（ＰＶＰ）变化按照Ｚｈｏｕ等的方法各组动物均在作盲肠结扎穿孔术同时股静脉注射伊文思（Ｅｖａｎｓ）蓝（50ｍｇ／ｋｇ）将动物开胸取出肺脏剪去周围组织将肺浸泡在甲酰胺溶液中甲酰胺用量按动物体重（20ｍｇ／100ｇ）置45～50℃温箱中温育72ｈ待组织中色素全部浸出取出组织离心取上清液用721型分光光度计620ｎｍ进行比色。根据标准曲线计算Ｅｖａｎｓ蓝含量来测定ＰＶＰ的变化。
1．6 大鼠肺组织丙二醛（ＭＤＡ）的测定采用硫代巴比妥酸（ＴＢＡ）法［4］测ＭＤＡ活性本法微量、快速、简便、准确。主要根据ＭＤＡ可以与ＴＢＡ结合生成红色产物在532ｎｍ处有最大吸收峰的原理。50ｍｌ待测标本加4ｍｌ1．67ｍｏｌ／Ｌ的硫酸0．5Ｍｌ10ｍｏｌ／Ｌ磷钨酸混匀3000ｒ／ｍｉｎ离心10ｍｉｎ沉淀再同上处理一次然后加1ｍｌ双蒸水1ｍｌＴＢＡ溶液95℃水浴60ｍｉｎ用5ｍｌ正丁醇提取四乙氧基丙烷作为标准品终浓度为1ｎｍｏｌ／Ｌ荧光分光光度计532ｎｍ处测定吸光值。
1．7 大鼠肺组织超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）的测定采用黄嘌呤氧化酶法测定ＳＯＤ活性。
1．8 大鼠肺组织髓过氧化物酶（ＭＰＯ）测定取肺组织于等渗盐水中尽量洗净残血．置于含0．5ｍＬ十六烷基三甲基溴化铵的磷酸缓冲液（ｐＨ6．0）中制成匀浆按试剂盒说明书操作。
1．9 统计学方法实验数据均以均数±标准差（﹣ｘ±ｓ）表
示ＳＰＳＳ软件进行单因素方差分析和相关分析。
2 结果
2．1 肉苁蓉和大黄提取物对败血症休克肺组织湿干重比及肺泡灌洗液中细胞计数比、蛋白含量的影响（见表1）。生理盐水组肺湿干重比显著高于肉苁蓉给药组肉苁蓉给药组肺泡灌洗液中细胞计数蛋白含量明显低于对照组且随着给药浓度增加呈现显著降低。
2．2 肉苁蓉和大黄提取物对大鼠肺组织形态学改生理盐水组肺脏体积明显增大。呈暗红色．表面可见不同程度充血水肿边缘部分大量肺梗死灶光镜下肺泡肺间质充血水肿。肺泡腔内大量弥漫性中性粒细胞浸润部分有脓肿形成可见不同程度的肺不张坏死代偿性肺气肿。血栓及类似透明膜形成。电镜下肺泡上皮细胞肿胀板层小体排空现象明显形成大空泡。毛细血管内皮细胞肿胀内皮细胞之间连续损伤细胞间隙增宽毛细血管及肺泡基底膜疏松、增宽不规则增厚厚薄不均。大黄和肉苁蓉给药组：肺脏呈浅红色表面轻度充血水肿未见明显肺梗死灶。光镜未见明显肺泡肺间质充血水肿中性粒细胞浸润和脓肿形成及肺不张代偿性肺气肿。透明膜形成。电镜肺泡上皮细胞肿胀不明显板层小体排空减轻形成空泡数量少毛细血管内皮细胞之间连接接近正常基底膜轻度疏松。不规则增厚。3ｇ／ｍＬ肉苁蓉组较1ｇ／ｍＬ肉苁蓉组肺组织形态学改变范围更小损伤程度更轻。
2．3 肉苁蓉和大黄提取物对大鼠肺通透指数（ＬＰＩ）和血管通透性（ＰＶＰ）的影响见表2。生理盐水组肺通透指数和血管通透性明显高于给药组肉苁蓉治疗组肺通透指数和血管通透性较对照组明显降低且有显著量效关系。
2．4 肉苁蓉和大黄对大鼠肺组织丙二醛（ＭＤＡ）、超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）、髓过氧化物酶（ＭＰＯ）活性的影响见表3。对照组肺组织中丙二醛含量显著高于治疗组而肉苁蓉给药组肺组织中超氧化物歧化酶活性和髓过氧化物酶活性显著增高。（与对照组比较Ｐ ＜0．01）。
3 讨论
大鼠在行盲肠结扎穿孔术后肺水含量和肺伊文思蓝渗出量明显增加说明肺毛细血管通透性明显增加肺组织形态学改变及中性粒细胞计数显大量中性粒细胞浸润肺充血水肿明显符合急性肺损伤的病理改变。可见采用盲肠结扎穿孔术可复制明显的败血症休克急性肺损伤模型。败血症休克急性肺损伤的主要病理生理机制是大量中性粒细胞在肺组织内聚集和活化与血管内皮细胞黏附的同时转移单电子的还原型辅酶氧化酶浓度增高而引起呼吸爆发产生大量氧自由基通过较强的氧化作用引起细胞膜和膜性结构的损害和功能障碍。大黄属攻下药具有泻下攻积、清热泻火、解毒活血祛瘀的功效现代医学研究证明其具有退热抗感染消炎并能排除肠道及体内多种有害物质等作用李春盛等研究表明大黄可通过抑制一氧化氮和一氧化氮合酶活性保护肺泡上皮和血管内皮。本实验中大黄组肺湿／干重比肺泡灌洗液中中性粒细胞计数伊文思蓝和蛋白渗出量显著低于生理盐水组证明大黄对肺泡上皮和血管内皮的良好保护作用同时大黄组肺组织匀浆液中丙二醛较生理盐水组降低超氧化物歧化酶活性升高。因此大黄可能通过减少中性粒细胞的聚集和渗出减轻膜酯质过氧化和自由基损害而保护肺组织。肉苁
蓉具有增强免疫功能抗衰老增强细胞核酸合成率等广泛的药理作用。实验结果表明肉苁蓉给药组肺系数、肺通透指数、肺泡灌洗液中性粒细胞比例、肺血管通透性均显著下降。肺组织丙二醛活性下降（Ｐ ＜0．01）超氧化物歧化酶显著上升（Ｐ ＜0．01）髓过氧化物酶活性下降。同时形态学观察发现肺组织损伤程度明显减轻中性粒细胞浸润减少且3ｇ／ｍＬ肉苁蓉给药组较1ｇ／ｍＬ肉苁蓉给药组肺损伤程度更轻存在良好的量效关系。提示肉苁蓉对肺损伤具有良好的保护作用。该实验结果为临床败血症休克急性肺损伤治疗提供了实验依据。展示了中医药在败血症休克肺损伤治疗中的良好前景。
参考文献
［1］ 李春盛桂培春何新华等．大黄对内毒素诱导急性肺损伤大鼠的保护作用［Ｊ］．基础医学临床200721（1）：65－68．
［2］ 李琳琳王晓雯王雪飞等．肉苁蓉总甙的抗脂质过氧化作用及抗辐射作用［Ｊ］．中国中药杂志200722（6）：364－367．
［3］ 金惠铭．盲肠结扎穿孔术后的败血症模型［Ｊ］．中国病理生理杂志19906（2）：126－127．
［4］ 汪谦朱晓峰赵西龙等．现代医学实验方法［Ｍ ］．北京：人民卫生出版社2007：508
公司：win德赢官方
地址：新疆和田洛浦县杭桂路232号
公司网址：www.www.wagawa.com
厂家服务热线：0903-6682528
全国服务热线：400-966-8288
