党荣理，马永红＇，吴霞2，刘庆华

（1新疆军区卫生防疫大队，乌鲁木齐 830011；2．新疆药物研究所，乌鲁木齐 830000）

摘要 通过19个10碱基随机引物对新疆中药肉苁蓉（Cistanche）3个不同种进行PCR扩增，用人工栽培品种作为对照，共扩增出153个多态位点，建立了它们的基因组DNA指纹图谱。通过计算遗传相似性系数，建立UPGMA聚类图。

结果表明：不同之间存在一 定差异，但差异不大；人工栽培种与同一产地野生种之间基因图谱完全一致，具有相似的遗传特性。

关键词 肉苁蓉；RAPD；遗传多样性；新疆

中国分类号：S567  文献标识码：A  文章编号：1005-8915（2003）01-0048-03

肉苁蓉习称大芸，有补肾壮阳、益精、润燥、润肠通便之功效，常用于治疗男子阳痿、女子不孕、带下、血崩、腰膝冷痛和血枯便秘等症，为常用中药材（1。《中国药典》收载的中药肉苁蓉正品为列当科植物肉苁蓉（Cistanche deserticola Ma）干燥肉质茎，新疆还有2种即德赢vwin登录 （C．tubulosa）和盐生肉苁蓉（C.salsa），它们均可人药，具有相同的功效。对肉苁蓉的化学成分研究的比较多，但基因组DNA的RAPD分析还未见报道。作者通过3种肉苁蓉基因组DNA的RAPD分析，同时用人工裁培的德赢vwin登录 作为对照，探讨其种间及人工栽培种的遗传多样性。

RAPD技术自20世纪90年代产生以来，广泛应用于遗传图谱的构建、基因克隆、分子系统学及植物群体遗传结构等研究领域。由于RAPD分析是完全随机扩增，不需要对所研究物种的分子遗传学背景有所了解，因为可供选择的随机引物数十分巨大，所检测的位点在基因组中随机分布，可以较为客观地说明群体遗传多样性的水平（2）。

1 材料和方法

1.1 材料来源

研究材料均采自于新疆本地，具体见表1。

Tab 1 The origin of material

1.2 研究方法

1.2.1 基因组DNA提取 取同一物种的10-20株的新鲜肉质茎叶混合后，称取3g，液氮下粉碎处理提取基因组DNA，基因组DNA的提取方法采用高盐低pH值法。

1.2.2 引物选择 选取40个10碱基长度的寡核苷酸随机引物（购自上海生物工程公司），对4个DNA样品进行预扩增，从中筛选出重复性好、多态性高的19个引物（引物序列见表2），用于肉苁蓉样品基因组DNA的扩增。

1.2.3 PCR反应 PCR扩增反应在PE公司5700型定量PCR仪上进行，反应总体积为25pd。扩增体系为：10xPCR buffer 2.5 l（购自大连TaKaRa公司），25 mmol／L MgCl，2 ul，10 mmol／L dNTP 1μl，25ng／l模板DNA 1 pl，10 μmol／L引物1 pμl，5 U／pl TaqDNA聚合酶0.3μ（购自大连TaKaRa公司），ddH，O17.3d。扩增程序为：首先，95℃预变性2min，然后进行40个循环：94℃变性 40 sec，36℃退火60sec，72℃延伸120 sec，最后于72℃下延伸7min。

取10u回扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳，EB染色后，在Alpha Imager 2200 型凝胶成像系统上观察并保存结果。

Tab 2 The arbitray primers which producod polymorphic bands

1.2.4 数据处理 电泳图谱中的每一条带可记为1个位点，根据分子质量与标准对照根据反应产物在胶上的对应位置，计算扩增产物的分子质量大小，有带的记为1，无带的记为0，形成0／1矩阵，进行带数统计。计算遗传系数F（F＝2Nab／Na＋Sb）和遗传距离D（D＝1-F），利用UPCMA法进行聚类分析。

2 结果和分析

2.1 RAPD产物的多态性

在所采用的40条引物中，有19条引物在对肉苁蓉3个野生种和1个栽培种的DNA样品进行RAPD分析中得到良好的结果，图1列举了s28、8302条引物扩增产物的电泳图谱。通过分析发现19条引物共检测到190个条带，范围在200 bp～2500 bp之间，德赢vwin登录 最多，共计148个，盐生肉苁蓉最少，仅123个。在所有位点中多态性位点104个，占总位点的54.74％，平均每条引物扩增出5.47条多态位点。这说明肉苁蓉具有一定的遗传多样性。将产物多态性结果均用于分析，并分别将它们看作是不同的性状，即4个供试肉苁蓉有190个性状，其中104个性状呈多态性分布。

M.XDNA/Hind  Mader;1,C.sal:2.C.doiricla;3.C.tululos; 4. C.tubulona(culivated)

Fig 1 RAPD pradacts from templates of iur species in Citanche using primer a28 and.30

2.2 种间遗传关系分析

据F＝2Nab／Na＋Sb（Nab为它们两共同的带数，Na、Nb分别为它们两特有的带数）计算相似系数，遗传距离D为（1-F），列出遗传距离矩阵（表3）。并画出遗传关系聚类图（图2）

Tab3 Matrix of genetic distanoes

通过图2聚类分析结果表明，不同种之间有一定差异，但差异不大；人工栽培种与同一产地的野生种之间基因图谱完全一致，这说明同一产地肉苁蓉的遗传性比较稳定。

3讨论

在中医药长期医疗实践中，道地药材一直是评价药材品质的独特的综合性指标。本研究结果表明，用同一引物扩增，不同种间总有共同带，这是肉苁蓉属的特征带，但每一个种均有自己的独特带，这就是种间差异。同时，同一地方样品 RAPD基因图谱差异较小，不同地方样品图谱差异则较大。提示RAPD技术不仅能正确鉴别肉苁蓉不同种间群体，作为本属药用植物的分类鉴定的新手段，而且可为道地性评价提供分子水平的支持依据。

参考文献

[1] 果鹏飞，王分，出山武，等，内苁蓉类生药中苯乙醇贰类成分的RP-HPLC分析［J］．药学学技，1997.32（4）：294．

[2] 郭宝林，戴放，中药材DNA分子标记研究的技术问题I．RAPD实验技术和方法学论述［J］，中平码，2002.33（2）：178

[3] 王培训，黄丰，周联，等，植物中药材总DNA提取方法的比较［J］．中药新药-临床药理，1999,10（1）：18．