［摘要］ 目的：研究大黄和肉苁蓉提取物对感染性休克模型大鼠急性肺损伤的影响，探讨感染性休克治疗方法。方法：采用盲肠结扎穿孔术（ CLP） 复制感染性休克模型大鼠，通过大黄和肉苁蓉提取物灌胃观察其对感染性休克模型大鼠肺组织病理学、肺湿干重比、肺泡灌洗液中性粒细胞比例、蛋白含量及肺泡通透指数，肺毛细血管通透性、肺组织丙二醛（ MDA） 、超氧化物歧化酶（ SOD） 、髓过氧化物酶（ MPO） 的影响。结果：生理盐水组大鼠肺间质水肿，肺泡腔内可见大量细胞浸润和血浆蛋白渗出，肺血管内皮细胞损伤，肺湿干重比、肺泡灌洗液中中性粒细胞比例、蛋白含量及肺泡通透指数、肺毛细血管通透性、肺组织丙二醛（ MDA） 、超氧化物歧化酶（ SOD） 、髓过氧化物酶（ MPO） 均显著升高。大黄和肉苁蓉给药组上述指标较生理盐水组显著降低。结论：肉苁蓉及大黄对感染性休克模型大鼠急性肺损伤具有良好保护作用，其机制可能是通过抑制中性粒细胞在肺组织的浸润，减少氧自由基对肺组织的损伤实现的。

［关键词］ 肉苁蓉；大黄；感染性休克模型大鼠；急性肺损伤

感染性休克是临床急危重症，1／3患者死于急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征，临床除采用大剂量抗生素和激素疗法外，尚无其他有效治疗措施。国内学者开始把目光转向中医药，有报道大黄有保护肺血管内皮细胞，对内毒素诱导的急性肺损伤有明显的保护作用［1］，肉苁蓉能抗膜酯质过氧化和减轻自由基造成的组织细胞损害［2］，这些功能在感染性休克肺损伤中能发挥针对性治疗作用。本实验观察了大黄和肉苁蓉对感染性休克模型大鼠急性肺损伤生物学指标的影响，为感染性休克肺损伤治疗提供有效探索。

1 材料和方法

1.1 药物、试剂与仪器 药物：戊巴比妥钠（ 中国医药集团上海化学试剂公司，批号001104） ，丙二醛（ MDA） 试剂盒，超氧化物歧化酶（ SOD） 试剂盒，髓过氧化物酶（ MPO） 试剂盒（ 南京建成生物工程研究所，批号20030108） ，肉苁蓉（ 经三峡大学医学院中医系汪均植博士鉴定） 水煎剂，大黄（ 经汪均植博士鉴定） 水煎剂，伊文思蓝。仪器：日立H-600型透射电镜，721型分光光度计。

1.2 动物及分组 健康雄性SD 大鼠40只，华中科技大学实验动物中心提供，体重200～250g，质检号（ TJLA-2003-167） ，随机分为4组，生理盐水组（8只） ，大黄组（8只） ，肉苁蓉（1g／ml） 组（12只） ，肉苁蓉（3g／ml） 组（12只） 。各组分别灌胃15d。生理盐水5ml／kg·d—1；大黄水煎剂1 g／kg · d—1；肉苁蓉水煎剂1g／kg·d—1 （ 含生药1 g／ml） ；肉苁蓉水煎剂3g／kg·d—1（ 含生药3g／ml） ；

2 造模方法

盲肠结扎穿孔术法［3］：实验前2周大鼠饲养于实验室，室温22℃，造模前12h 禁食水，第15天晚8：00进行手术，3％戊巴比妥钠30mg／kg 体重麻醉后，常规消毒腹部，皮肤正中切口，长约3cm，打开腹腔后小心分离盲肠，避免损伤肠系膜血管，寻找盲肠与小肠及大肠交界处，然后用1-0号丝线结扎盲肠2／3，在结扎端盲肠用7号针头均匀穿刺6次，将盲肠还纳于腹腔，关闭腹腔，逐层缝合。术后将大鼠放回笼内，保持呼吸道通畅，给足饮水、饲料，注意保暖。

3 实验方法

各组按前述剂量进行灌胃，日1次，连续15d。各组均于第16天灌胃后30min 采血，取肺泡灌洗液。常规称取大鼠肺组织3g 制备肺组织匀浆液，清洗分离肺组织表面血块、气管后，眼科剪剪碎肺组织，按1∶10加入匀浆液（ 蔗糖250mmol，N-乙羟乙基哌嗪N′2乙基磺酸（ Hepes）2mmol，乙二胺四乙酸（ EDTA）0.1mmol，pH 7.4） ，机械匀浆至管中无肺组织块为止，尽量缩短匀浆时间，以免肺组织变性，全部过程均在0～4℃的条件下进行。全部样本均在取样后于—20℃冰箱保存，1周内行全部指标测定。

4 指标测定

4.1 感染性休克模型大鼠肺组织学检查 每组各取动物肺脏左叶少许，经10％甲醛固定，石蜡包埋切片，HE 染色后，用普通光学显微镜观察，并在此基础上再取肺组织制成1mm3 大小，用25％戊二醛溶液固定，然后固定于1％四氧化锇液中，乙醇、丙酮脱水，经环氧树脂包埋，制备超薄切片后，行铀-铅双重染色，用透射电镜观察。

4.2 大鼠肺组织湿／干重比、及肺泡灌洗液中细胞计数比、蛋白含量测定 开胸取出肺脏左叶，称湿重后，置烤箱（80℃，20h） 烤至衡重，称干重，计算湿／干重比。开胸后肺右叶取肺泡灌洗液在显微镜下计细胞总数和细胞分类数。考马氏亮蓝法测定蛋白含量，计算肺通透指数（ 肺泡灌洗液蛋白／血浆蛋白，LPl） 。

4.3 大鼠肺血管通透性（ PVP） 变化 按照Zhou等［4］介绍的方法，各组动物均在作盲肠结扎穿孔术同时股静脉注射伊文思（ Evans） 蓝（50mg／kg） ，将动物开胸取出肺脏，剪去周围组织，将肺浸泡在甲酰胺溶液中，甲酰胺用量按动物体重（20mg／100g） 置45～50℃温箱中温育72h，待组织中色素全部浸出，取出组织，离心，取上清液，用721型分光光度计620nm 进行比色。根据标准曲线计算Evans 蓝含量来测定PVP 的变化。

4.4 大鼠肺组织丙二醛（ MDA） 的测定 采用硫代巴比妥酸（ TBA） 法［5］测定MDA 活性，本法微量、快速、简便、准确。主要根据MDA 可以与TBA 结合生成红色产物在532nm 处有最大吸收峰的原理。50ml待测标本加4ml1.67mol／L 的硫酸，0.5ml10％磷钨酸，混匀，3000r／min 离心10min，沉淀再同上处理一次，然后加1ml 双蒸水，1ml TBA 溶液，95℃水浴60min，用5ml 正丁醇提取，四乙氧基丙烷作为标准品，终浓度为1nmol／L，荧光分光光度计532nm 处测定吸光值。

4.5 大鼠肺组织超氧化物歧化酶（ SOD） 的测定采用黄嘌呤氧化酶法［6］测定SOD 活性。

4.6 大鼠肺组织髓过氧化物酶（ MPO） 测定 取肺组织于等渗盐水中尽量洗净残血，置于含0.5％十六烷基三甲基溴化铵的磷酸缓冲液（ pH 6.0） 中制成5％的匀浆，按试剂盒说明书操作。

5 统计学方法

实验数据均以均数±标准差（ x ± s ） 表示，SPSS 软件进行单因素方差分析和相关分析。

6 实验结果

6.1 肉苁蓉和大黄提取物对感染性休克肺组织湿／干重比、及肺泡灌洗液中细胞计数比、蛋白含量的影响 见表1。

6.2 肉苁蓉和大黄提取物对大鼠肺组织形态学改变的影响

生理盐水组：肺脏体积明显增大，呈暗红色，表面可见不同程度充血水肿，边缘部分大量肺梗死灶。光镜下肺泡，肺间质充血水肿，肺泡腔内大量弥漫性中性粒细胞浸润，部分有脓肿形成，可见不同程度的肺不张，坏死，代偿性肺气肿，血栓及类似透明膜形成。电镜下肺泡上皮细胞肿胀，板层小体排空现象明显，形成大空泡，毛细血管内皮细胞肿胀，内皮细胞之间连续损伤，细胞间隙增宽，毛细血管及肺泡基底膜疏松、增宽，不规则增厚，厚薄不均。大黄和肉苁蓉给药组：肺脏呈浅红色，表面轻度充血水肿，未见明显肺梗死灶。光镜未见明显肺泡，肺间质充血水肿，中性粒细胞浸润和脓肿形成及肺不张，代偿性肺气肿，透明膜形成。电镜肺泡上皮细胞肿胀不明显，板层小体排空减轻，形成空泡数量少，体积小，毛细血管内皮细胞之间连接接近正常，

基底膜轻度疏松，不规则增厚。3g／ml 肉苁蓉组较1g／ml肉苁蓉组肺组织形态学改变范围更小，损伤程度更轻。

6.3 肉苁蓉和大黄提取物对大鼠肺通透指数（ LPI） 和血管通透性（ PVP） 的影响 见表2。

6.4 肉苁蓉和大黄对大鼠肺组织丙二醛（ MDA） 、超氧化物歧化酶（ SOD） 、髓过氧化物酶（ MPO） 活性的影响 见表3。

7 讨论

大鼠在行盲肠结扎穿孔术后，肺水含量和肺伊文思蓝渗出量明显增加，说明肺毛细血管通透性明显增加，肺组织形态学改变及中性粒细胞计数显示大量中性粒细胞浸润，肺充血水肿明显，符合急性肺损伤的病理改变。可见采用盲肠结扎穿孔术可复制明显的感染性休克急性肺损伤模型。感染性休克急性肺损伤的主要病理生理机制是大量中性粒细胞在肺组织内聚集和活化，与血管内皮细胞黏附的同时，转移单电子的还原型辅酶Ⅱ氧化酶浓度增高而引起

呼吸爆发，产生大量氧自由基，通过较强的氧化作用引起细胞膜和膜性结构的损害和功能障碍［7］。大黄属攻下药，具有泻下攻积、清热泻火、解毒活血祛瘀的功效，现代医学研究证明其具有退热，抗感染消炎，并能排除肠道及体内多种有害物质等作用［8］，李春盛等研究表明大黄可通过抑制一氧化氮和一氧化氮合酶活性保护肺泡上皮和血管内皮［1］。本实验中大黄组肺湿／干重比，肺泡灌洗液中中性粒细胞计数，伊文思蓝和蛋白渗出量显著低于生理盐水组，证明大黄对肺泡上皮和血管内皮的良好保护作用，同时大黄组肺组织匀浆液中丙二醛较生理盐水组降低，超氧化物歧化酶活性升高。因此，大黄可能通过减少中性粒细胞的聚集和渗出，减轻膜酯质过氧化和自由基损害而保护肺组织。肉苁蓉具有增强免疫功能，抗衰老，增强细胞核酸合成率等广泛的药理作用［9］。实验结果表明，肉苁蓉给药组肺系数、肺通透指数、肺泡灌洗液中性粒细胞比例、肺血管通透性均显著下降，肺组织丙二醛活性下降（ P ＜0.01） ，超氧化物歧化酶显著上升（ P＜0.01） ，髓过氧化物酶活性下降。同时形态学观察发现肺组织损伤程度明显减轻，中性粒细胞浸润减少，且3g／ml 肉苁蓉给药组较1g／ml 肉苁蓉给药组肺损伤程度更轻，存在良好的量效关系。提示肉苁蓉对肺损伤具有良好的保护作用。该实验结果为临床感染性休克急性肺损伤治疗提供了实验依据，展示了中医药在感染性休克肺损伤治疗中的良好前景。

［参考文献］

［1］ 李春盛，桂培春，何新华，等.大黄对内毒素诱导急性肺损伤大鼠的保护作用［J］.基础医学与临床，2001，21（1） ：65～68.

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［5］ 汪谦，朱晓峰，赵西龙，等.现代医学实验方法［M］.北京：人民卫生出版社，1997.508～510.

［6］ 张秀明，李健斋，魏明竟，等.现代临床生化检验学［M］.北京：人民军医出版社，2001.896～899.

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［8］ 高晓山，陈馥馨.为了全人类健康用好大黄，首届国际大黄学术探讨会论文述要［J］.中国中西医结合杂志，1990，（10） ：754～757.

［9］ 周志锦.肉苁蓉研究进展［J］.中医药信息，1995，16（5） ：28～30.