[摘要] 目的探讨德赢vwin登录 毛蕊花糖苷的大孔树脂纯化工艺方法。方法采用高效液相色谱法测定德赢vwin登录 中毛蕊花糖苷含量。利用3 种动力学方程对实验数据进行拟合，以Freundlich 和Langmuir 方程拟合不同温度下的等温吸附线，计算热力学参数；最后以单因素试验法考察大孔树脂纯化肉苁蓉毛蕊花糖苷工艺。结果选定D101 大孔树脂，纯化工艺条件为：上样液浓度为1.5 mg/mL，最大上样量为6 BV，上样速度为2 BV/h，依次用11 BV的纯化水，10 BV 的30%乙醇洗脱。经D101 树脂纯化后后的毛蕊花糖苷含量为25.1%。结论该工艺条件下D101 型大孔树脂纯化肉苁蓉毛蕊花糖苷工艺简便、稳定，能提高毛蕊花糖苷的含量。

[关键词] 德赢vwin登录 ；毛蕊花糖苷；大孔树脂；热力学；动力学

肉苁蓉是列当科植物肉苁蓉Cistanche deserticolaMa 或德赢vwin登录 Cistanche tubulosa （Schenk） Wight干燥肉质茎，具有补肾阳、益精血等功效。至今，已从肉苁蓉分离鉴定出苯乙醇苷类、环烯醚萜苷类、木质素类等近百种化合物[1]。毛蕊花糖苷是苯乙醇苷类主要药效成分之一，其抗衰老、提高记忆力、神经保护等药理作用已被证实[2-3]。课题组前期对其改善脑损伤、改善学习记忆障碍、抗氧化、保护神经细胞等方面也进行了研究[4-9]。本文对毛蕊花糖苷进行了热、动力学及分离纯化研究，为后期大规模分离纯化毛蕊花糖苷原料药的制备工艺提供数据支撑。

1 仪器、试剂与材料

1.1 仪器

日本岛津高效液相色谱仪：LC-20AB 泵，SPDM20A二极管阵列检测器，CBM-20A 系统控制器，CTO-20A 柱温箱，SIL-20A 自动进样器；BDS HypersilC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；SQP 电子天平（万分之一，赛多利斯科学仪器有限公司）；SHZ-ZA水浴恒温振荡器（上海梅香仪器有限公司）；UPS-1-40L优普系列超纯水器（ 乌鲁木齐洁新环保设备有限公司）。

1.2 试剂

毛蕊花糖苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111530-201512，96.7%）；95%乙醇（梅河口市阜康酒精有限公司）；甲醇（色谱纯）；甲酸（分析纯）；去离子水（自制）。

1.3 材料

德赢vwin登录 提取毛蕊花糖苷浸膏；层析柱；D101树脂（沧州宝恩吸附材料科技有限公司）；国产HP-20树脂（安徽三星科技有限公司）；三菱HP-20 树脂（北京英莱克科技有限公司）。

2 方法与结果

2.1 含量测定方法

2.1.1 色谱条件

流动相：甲醇-0.2%甲酸（40∶60）；色谱柱：C18色谱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1 mL/min；进样量：10 μL；柱温：35℃；检测波长：330 nm。

2.1.2 对照品储备溶液的制备

精密称取毛蕊花糖苷对照品21.2 mg，50%甲醇定容至10 mL 容量瓶中，摇匀，即得毛蕊花糖苷对照品储备液，备用。

2.1.3 线性关系考察

精密量取2 mL 毛蕊花糖苷对照品储备液于10 mL容量瓶中，以50%甲醇定容至刻度，得410 μg/mL 对照品溶液，逐级稀释分别得到205.00、102.50、51.25、25.63、12.81、6.41、3.20 μg/mL 对照品系列溶液。以峰面

积为纵坐标，溶液浓度为横坐标，进行线性回归，得回归方程Y = 21522X-4502.9，r = 1，线性范围为3.20～410 μg/mL，平均加样回收率为99.61%，RSD 为1.80%。

2.2 纯化工艺研究

2.2.1 供试品溶液的制备

取自制肉苁蓉毛蕊花糖苷浸膏90 g 用去离子水溶解定容至2000 mL，过滤，得到供试品溶液（1.5 mg/mL），HPLC 检测，采用外标一点法进行分析。

2.2.2 大孔树脂的预处理

将大孔树脂用95%乙醇浸泡24 h，再用去离子水洗至流出液无白色浑浊且无醇味，备用[10-12]。

2.2.3 大孔树脂型号的选择

取毛蕊花糖苷浸膏，配置成浓度为1 mg/mL 的药液。准确称取国产HP20、三菱HP-20、D101 大孔树脂2 g，加入40 mL 的药液，于恒温水浴锅振荡器中振摇24 h（25℃，85 r/min），测定吸附后溶液中毛蕊花糖苷含量，计算吸附率（X1）；将吸附后树脂用纯水洗至流出液无色，再用95%乙醇40 mL 进行解吸，得到解吸率（X2）。X1（%）=（C0-C1）/C0；X2（%）=（C1-C2）/C1；式中C0为溶液的初始浓度，mg/mL；C1为吸附后溶液的浓度；C2为解吸后溶液的浓度。国产HP-20 树脂与D101 树脂吸附及解吸性能均优于三菱HP-20 树脂。从经济等多方面考虑，选择D101 树脂进一步考察其对毛蕊花糖苷的吸附分离特性。见表1。

2.2.4 动力学研究

2.2.4.1 吸附动力学模型吸附过程主要分为3 个阶段：液膜扩散阶段、颗粒内扩散阶段、吸附反应阶段[13-14]，采用3 种模型进行拟合， 颗粒内扩散模型：Qt = kit0.5+C；准一级吸附动力学模型：ln（Qe-Qt） = k1t+lnQe；准二级吸附动力学模型：t/qt = 1/k2qe2+t/qe。式中：Qt为t时刻的吸附量；Qe 为吸附平衡时刻的吸附量，mg/g；ki为内扩散速率常数，mg/（g·min0.5）；k1为一级吸附速率常数，1/min；k2为二级吸附速率常数，g/（mg·min）；C为常数。

2.2.4.2 静态吸附动力学的考察取预处理后树脂10 g，加入100 mL，按“2.2.1”项下的德赢vwin登录 供试品溶液，在不同温度下（25、30、35、40℃）恒温水浴振荡24 h，每隔一段时间测定溶液中毛蕊花糖苷的含量并计算单位吸附量。随着吸附时间的延长，大孔树脂对肉苁蓉毛蕊花糖苷的吸附量随之增加。在初始阶段吸附量增长较快，吸附4.5 h 后，静态吸附基本达到平衡，最大吸附值为12.7096 mg/g。见图1。

2.2.4.3 大孔树脂吸附德赢vwin登录 毛蕊花糖苷动力学研究根据上述结果，吸附过程在4.5 h 内基本达到平衡，分别绘制0～4.5 h 内Qt与t0.5、ln（Qe-Qt）与t、t/qt与t 的拟合曲线图，见图2。其准二级吸附动力学拟合曲线的相关系数R2＞0.9998，D101 型大孔树脂吸附德赢vwin登录 毛蕊花糖苷的过程更符合准二级吸附动力学模型，该吸附过程的吸附速率受化学吸附机制的控制。见表2～3。

2.2.4.4 吸附反应活化能本研究选择准二级吸附动力学模型中的k2作为吸附反应速率，根据Arrhenius 方程：lnk = -Ea/（RT）+A，绘制lnk 对1/T 的拟合曲线：lnk =-5769.9/T+14.277，R2 = 0.9831， 求得活化能Ea =47.97 kJ/mol。

2.2.5 热力学研究

2.2.5.1 等温吸附曲线在不同温度下（25、30、35、40℃），对德赢vwin登录 中毛蕊花糖苷进行静态吸附实验，

取树脂10 g，共4 份，加入100 mL 不同浓度的德赢vwin登录 供试品溶液（含毛蕊花糖苷0.1、0.15、0.2、0.3 g），恒温水浴锅振荡24 h， 吸附平衡后计算平衡吸附量。不同温度下，D101 型大孔树脂对毛蕊花糖苷的等温吸附曲线。见图3。为进一步了解该吸附过程的吸附规律，分别用Freundlich（F）、Langmuir（L）方程对其进行拟合[15]。L 方程：Ce/Qe = 1/KQ0+Ce/Q0；F 方程：logQe =logk+1/nlogCe。式中：Ce为溶液的平衡浓度，mg/mL；Qe为平衡浓度为Ce时树脂的吸附量，mg/g；K，Q0为L 方程参数；k，n 为F 方程参数。R2 大于0.9932。见表4。

吸附熵变△S：△S = （△H-△G）/T。式中：R 为气体常数8.314 J/（mol·K）；T 为热力学温度；n 为吸附强度；k0为热力学方程参数。△H、△G 为负值。见表5。

2.2.6 最大上样量的考察

取德赢vwin登录 供试品溶液通过层析柱，每0.3 BV收集一次流出液，测定毛蕊花糖苷质量，以上样柱体积为横坐标，泄漏量为纵坐标，制作泄露曲线，考察树脂的最大上样量[16-18]。上样体积为6 BV 时，毛蕊花糖苷的泄漏量开始突增。见图4。

2.2.7 上样速度的考察

取供试品溶液6 BV，分别以流速1、2、3 BV/h 上样吸附。随着上样速度的增加，毛蕊花糖苷泄漏量越来越大，泄露率分别为0.04%、0.39%、1.04%，3 个流速泄露均较少，选择2 BV/h 流速进行上样。

2.2.8 水洗量的考察

上样后用去离子水以3 BV/h 的速度洗脱除去水溶性杂质及未吸附的毛蕊花糖苷，每1 BV 收集1 次水洗液，测定毛蕊花糖苷含量，在水洗体积至第8 BV时毛蕊花糖苷含量变化较小，但在此时水洗脱液中依旧有颜色，故继续洗脱至11 BV，毛蕊花糖苷含量基本不变且洗脱液澄清透明。

2.2.9 洗脱溶剂的考察

取水洗后柱子进行洗脱溶剂梯度洗脱，以10%乙醇-60%乙醇的顺序以3 BV/h 的速度洗脱，每个梯度洗脱3 BV，分别测定其毛蕊花糖苷含量，考察不同乙醇浓度对洗脱效果的影响，选择较优洗脱方法。30%乙醇洗脱液纯度最高。见表6。

2.2.10 洗脱剂用量

按“2.2.9”项下洗脱溶剂洗脱10 BV，每1 BV 接收1 次洗脱液并测定毛蕊花糖苷含量，当洗脱至第10 BV 时，毛蕊花糖苷含量较低为0.0702 mg/mL。

2.2.11 工艺验证

按上述优化的工艺，以D101 大孔树脂进行验证试验，获得的毛蕊花糖苷含量分别为25.10%、23.76%、24.24%，与原德赢vwin登录 提取物浸膏中毛蕊花糖苷含量为3.33%相比较，毛蕊花糖苷含量有明显提高。

3 讨论

本研究通过筛选，确定了使用D101 大孔树脂分离纯化毛蕊花糖苷的最佳工艺：上样液浓度为1.5 mg/mL，最大上样量为6 BV，上样速度为2BV/h，依次用11 BV的纯化水，10 BV 的30%乙醇进行洗脱。在动力学研究中可知该吸附过程为化学吸附，是由吸附剂与吸附质间的化学键作用力而引起的,吸附需要一定的活化能，有很强的选择性。△H 为负值，说明该吸附为放热过程，△G 为负值，表明反应为自发过程，该吸附可逆，△G 随着温度的升高而减小，说明升高温度不利于提高肉苁蓉毛蕊花糖苷的吸附量，△S 为负值，说明体系熵值减小；热力学研究中，D101树脂吸附等温线符合热力学方程。随着温度的升高，D101 对肉苁蓉毛蕊花糖苷的吸附量越低，适当地降低温度，有利于吸附进行。发现两种方程拟合效果都较好，说明该吸附过程为单分子吸附和多分子吸附共同作用，结合动力学结果，应是以单分子吸附为主的吸附过程。毛蕊花糖苷为肉苁蓉中主要药效成分之一，分离纯化毛蕊花糖苷有重要意义。以往研究多为对苯乙醇苷这一类物质的纯化研究，且纯度较高，而对毛蕊花糖苷的研究很少，故本文对其进行了纯化工艺研究[19-20]。本研究确定的工艺简便，能较好地纯化德赢vwin登录 毛蕊花糖苷，且D101 大孔树脂成本较低，可重复利用，适用于工业化生产。

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