摘要:目的: 研究肉苁蓉配伍维生素C 对大鼠运动性肾缺血再灌注损伤的保护作用及机制。方法: 将6 周龄雄性Wistar 大鼠96 只为对象随机分为6 组: 对照组( C 组，12 只) 、一般训练组( M 组，12 只) 、过度训练组( OM 组，24 只) 、肉苁蓉+ 过度训练组( COM 组，16 只) 、维生素C+过度训练组( VCOM 组，16 只) 、肉苁蓉+ 维生素C + 过度训练组( CVCOM 组，16 只) ，进行56 d 的力竭游泳训练。COM 组、CVCOM 组采用专业灌胃器灌胃( ig) ，每天一次，剂量为6. 01g·kg － 1，ig 体积为5 mL·kg － 1 ; VCOM 组、CVCOM 组采用腹腔注射( ip) ，剂量为100 mg·kg － 1，每天一次，注射体积为0. 5 mL，其他各组ig 等量生理盐水。末次训练后24 h，进行血清尿素氮、血清肌酐等生化指标检测。结果: 1) 8 周的过度训练导致大鼠运动性肾缺血“再灌注”，肾组织超微结构被严重破坏、组织病理学发生明显改变，肾功能受到严重损坏。2) 血尿素氮和血清肌酐上升。OM 组( P ＜ 0. 01) 、COM 组( P ＜ 0. 01) 、VCOM 组( P ＜ 0. 01) 、CVCOM组( P ＜ 0. 05) 高于C 组; COM 组( P ＜ 0. 05) 、VCOM 组( P ＜ 0. 05) 、CVCOM 组( P ＜ 0. 01) 低于OM 组; COM 组( P ＜ 0. 05) ，CVCOM 组( P ＜ 0. 01) 低于VCOM 组。3、SOD 活性降低。OM 组( P ＜ 0. 01) 、COM 组( P ＜ 0. 01) 、VCOM 组( P ＜ 0. 01) 、CVCOM 组( P ＜ 0. 05) 低于C 组; COM组( P ＜ 0. 05) 、VCOM 组( P ＜ 0. 05) 、CVCOM 组( P ＜ 0. 01) 高于OM 组; COM 组( P ＜ 0. 05) ，CVCOM 组( P ＜ 0. 01) 高于VCOM 组。4、MDA 含量升高。OM 组( P ＜ 0. 01) 、COM 组( P ＜0. 01) 、VCOM 组( P ＜ 0. 01) 、CVCOM 组( P ＜ 0. 05) 高于C 组，COM 组( P ＜ 0. 05) 、VCOM 组( P＜ 0. 05) 、CVCOM 组( P ＜ 0. 01) 低于OM 组; COM 组( P ＜ 0. 05) ，CVCOM 组( P ＜ 0. 01) 低于VCOM 组。结论: 1) 过度训练造成了大鼠肾脏缺血再灌注损伤。2) 肉苁蓉和维生素C 均可以增强SOD 活性，清除氧自由基，减轻脂质过氧化作用，对运动性缺血再灌注肾脏具有保护作用。3. 肉苁蓉作用优于维生素C，二者配伍使用效果更好。

关键词:肉苁蓉; 维生素C; 运动性缺血再灌注

随着现代中医药理论的发展、现代药理学理论及现代生物技术的更新，更多的单剂或配伍组方应用于体育实践。中药以其多靶点、多途径作用且几乎不含违禁成分的特点日益显示出其独特的优势，在提高运动员身体机能及缓解疲劳方面取得了一定的成就。机体在稳定状态下，肾血流量可以通过自身调节机制来维持相对恒定。在剧烈运动时，肾血流在神经和体液因素的影响下发生改变。由于各器官血流量重新分配，使活动器官特别是肌肉的血流量增多，肾血流量急剧下降，并伴随运动过程的持续和强度递增表现的更加明显［1］。肾脏的这种不完全缺血状态形成了“运动性肾缺血”。运动停止后，肾血供应恢复形成运动性肾缺血后的“再灌注”［2］。缺血再灌注损伤过程中，自由基的产生异常增多起着重要作用。研究表明，肉苁蓉具有提高过氧化物岐化酶活性、降低脂质过氧化物的药理作用，可以清除体内过量生成的自由基对机体细胞的损伤［3］; 维生素C 作为体内重要的抗氧化剂，也可以有效地清除自由基［4］。本文研究肉苁蓉配伍维生素C 对大鼠缺血再灌注肾脏的影响，并探讨二者在缺血再灌注损伤中的作用及其机制，旨在为其临床应用提供理论依据。

1 材料

1. 1 动物

清洁级雄性Wistar 大鼠100 只，42 d 龄，平均体重( 201. 8 ± 14. 1) g，北京大学医学部实验动物科学部提供，许可证号SCXK( 京) 2006 － 0008。在整个试验过程中，实验室内温度保持在( 22 ± 2) ℃，相对湿度55%

～ 75%，光照时间随自然变化。所有试验大鼠均以基础饲料( 北京大学医学部实验动物科学部提供) 和蒸馏水常规饲养，自由饮食。实验时间为63 d，正式训练时间为56 d。

1. 2 实验用药肉苁蓉( Cistanche deserticolaY. C. Ma) ，产自内蒙，北京同仁堂药店购得，批号:120224536 并经天津中瑞药业有限公司高占友高级工程师鉴定。将干燥带鳞叶的肉苁蓉粉碎成粗粉，用10，6，6 倍量60%乙醇水浴提取3 次，每次2 h，合并提取液冷藏24 h，过滤，滤液减压回收乙醇，浓缩成浸膏( 相当于2. 0g 生药/g 浸膏) ，备用［3］。维生素C 注射液( 批号20120406) ，北京双鹤药业提供。

1. 3 试剂血清肌酐( serum creatinine，Scr) 采用Jaffe 苦味酸法测定，血尿素氮( blood urea nitrogen，BUN) 采用二乙酰－ 肟法测定，丙二醛( malondialdehyde，MDA) 采用比色法测定; 超氧化物歧化酶( superoxidedismutase，SOD) ，采用黄嘌呤氧化酶法测定，均采用南京建成生物工程研究所提供试剂盒，试剂盒编号20120511，并严格按照使用说明操作。

1. 4 仪器BS224S 型电子分析天平( 德国赛多利斯) 、光学显微镜( 日本OLYMPUS 公司) 、ALCYON300全自动生化分析仪( 美国雅培) 、756MC 型紫外－ 可见分光光度计( 上海精密仪器厂) 及GL － 20G 高速冷冻离心机( 上海安亭) 。

2 方法

2. 1 动物分组

实验大鼠适应性饲养4 d 后，以20 min /d 的运动量对其进行为期3 d 的筛选，淘汰个别不适应游泳训练者，将剩余大鼠以数字随机分组法分6 组: 对照组( C 组) 12 只，一般训练组( M 组) 12 只，过度训练组( OM 组) 24 只，肉苁蓉+ 过度训练组( COM 组) 16 只，维生素C + 过度训练组( VCOM 组) 16 只，肉苁蓉+ 维生素C + 过度训练组( CVCOM 组) 16 只进行56 d 的游泳训练。训练期间，COM 组、CVCOM 组采用专业灌胃器灌胃( ig) ，每天一次，剂量为6. 01 g /kg， ig 体积为5mL /kg; VCOM 组、CVCOM 组采用腹腔注射( ip) ，剂量为100 mg /kg ，每天一次，注射体积为0. 5 mL( 通过预实验获得最佳剂量) ，其他各组ig 等量生理盐水。

2. 2 实验方法

2. 2. 1 训练及测试方案

C 组常规饲养，不加任何干预，平时不运动。M 组进行中等强度游泳训练，正式游泳训练8 周。每周训练6 d，每天训练1 次，第一次下水游20 min，此后逐渐增加，至第1 周末时每天游60 min，第2 周末时加至每天游90 min，第3 周末时加至每天游120 min，此后5周均保持此运动量。其他各组前3 周训练安排同M组，第4 周起开始安排高强度训练。大鼠进行负重游泳，每次训练至力竭。力竭标准以大鼠下沉后10 s 不露出水面为度。第1 ～ 3 周负0. 5% 体重，第4 周负1%体重，第5 周负2%体重，每天训练1 次。第6 周每天上、下午各训练1 次，第7 ～ 8 周，每天上、下午、夜间各训练1 次，均负5% 体重。至第8 周末，C、M 组大鼠，均正常生长，无意外死亡发生。其他各组大鼠因尾部负重，疲劳衰竭不能恢复及训练意外死亡等原因，死亡率较高。OM 组、COM 组、VCOM 组、CVCOM 组分别剩余14、13、11、13 只。各组分别取10 只用于实验取材，其他随机剔除。

2. 2. 2 指标测定

各组大鼠于末次游泳训练24 h 后，乙醚适度麻醉，从颈总动脉处取血加入柠檬酸钠溶液抗凝，37℃水浴中30 min 后，4℃ 3 000 rpm 离心10 min，分离制备血清，置－ 20℃冰箱中保存待查。迅速取双肾，剔除筋膜，置于预冷的生理盐水中洗净血污，肉眼观察肾脏大小、色泽、质地。分离左肾，取肾上极组织0. 5 g，用1. 5 mL 生理盐水在1℃ 下以12 000 rpm 研磨制成10%肾组织匀浆; 10% 甲醛固定肾组织标本，石蜡包埋，制成4 um 厚切片，HE 染色，观察组织病理学变化。

2. 2. 3 肾脏病理变化评价

参照Pallers 标准［5］，在400 倍光镜下随机选5 个视野，每个视野选10 个肾小管评分。1) 肾小管明显扩张，细胞扁平为1 分; 2) 刷状缘损伤为1 分，脱落为2 分; 3) 细胞膜大泡1 分，细胞浆空泡1 分; 4) 间质水肿1 分; 5) 肾小管腔内有脱落的坏死细胞未形成管型或碎片为1 分，形成管型或碎片为2 分。肾小管评分由两名技术员双盲计算，取其平均值。

2. 3 数据统计

所有数据均用SPSS 12. 0 统计软件包进行处理，数据以平均数± 标准差( 珋x ± s) 表示，资料进行正态性检验; 多组计量资料采用one － way ANOVA，方差齐时采用LSD 法，方差不齐时采用Dunnett＇s T3 法。P ＜0. 05 有统计学意义。

3 结果

3. 1 运动及肉苁蓉、维生素C 对大鼠肾组织的病理改变Scr 和BUN 测定后取各组肾组织制作石蜡切片，进行HE 染色，光镜下观察组织形态学变化。光镜下静止对照组、一般训练组大鼠肾组织结构正常，无淤血、变性和水肿，肾小管管腔内无管型。过度训练组大鼠肾小球有淤血现象，小管上皮细胞水肿、空泡变性、管腔扩张，管腔中有少量的脱落绒毛和上皮细胞，以及各种管型。其他各组组织病理学改变较过度训练组轻，有轻微的小管上皮细胞水肿、空泡变性、管腔扩张现象，无蛋白管型和细胞管型。各组大鼠肾小管Paller ［5］评分，静止对照组、一般训练组组间无显著差异( P ＞ 0. 05 ) ，静止对照组明显低于其他组( P ＜0. 01) ，治疗组显著低于过度训练组大鼠( P ＜ 0. 05) ，且均未见肾小球明显病理改变。

3. 2 运动及肉苁蓉、维生素C 对大鼠血清BUN 和Scr的影响

由表2 可知，血尿素氮和血清肌酐各组较对照组明显上升，与OM 组相比COM 组、VCOM 组、CVCOM组明显下降( 分别为P ＜ 0. 05、P ＜ 0. 05、P ＜ 0. 01) ; 与VCOM 组相比，COM 组、CVCOM 组明显下降( 分别为

P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) 。

3. 3 运动及肉苁蓉、维生素C 对大鼠肾组织匀浆中SOD 活性和MDA 含量的影响

由表3 可知，SOD 活性各组较对照组明显降低，与OM 组相比COM 组、VCOM 组、CVCOM 组明显上升( 分别为P ＜ 0. 05、P ＜ 0. 05、P ＜ 0. 01) ; 与VCOM 组相比，COM 组、CVCOM 组明显上升( 分别为P ＜ 0. 05，P

＜ 0. 01) 。MDA 含量各组较对照组明显升高，与OM组相比COM 组、VCOM 组、CVCOM 组明显下降，( 分别为P ＜ 0. 05、P ＜ 0. 05、P ＜ 0. 01) ; 与VCOM 组相比，COM 组、CVCOM 组明显降低( 分别为P ＜ 0. 05、P ＜0. 01) 。

4 讨论

肾缺血再灌注( Ischemic reperfusion，I /Ｒ) 损伤是一个复杂的病理生理变化过程，其具体机制尚未完全阐明。但氧自由基( Oxygen free radicals，OFＲ) 在I /Ｒ发生、发展过程中起着至关重要的作用［6］。正常情况下，体内可产生少量自由基，但由于体内具有灭活自由基酶系统，自由基被迅速清除，不产生损伤作用。运动时由于I /Ｒ 使自由基产生增加，可引发膜脂质过氧化反应，导致膜的液态性、流动性及通透性改变，进而造成膜功能障碍，尤其是线粒体膜的破坏将影响细胞的代谢和机能，并干扰整个器官的生理功能。机体内存在清除自由基、减轻其危害的主要物质是抗氧化酶。SOD 是需氧生物体内数千种酶中以氧自由基为底物的唯一酶。其通过催化超氧阴离子形成过氧化氢而清除超氧阴离子，保护机体免受损伤，同时在一定范围内，自由基代谢增强时，SOD 会代偿性增加。因此SOD 活性的高低是机体抗氧化能力强弱的标志。MDA 是细胞脂质过氧化的一种主产物。组织线粒体MDA 含量是目前公认的衡量机体自由基代谢的敏感指标［7］。肌酐和尿素氮分别是肌肉和蛋白质的分解代谢产物，主要经血循环从肾脏排除体外，其血中的浓度取决于肾小球滤过能力，当肾脏实质受到损伤，肾小球滤过率降到临界点后，二者的浓度就会明显上升［8］。

实验结果显示，8 周的过度训练导致大鼠肾组织组织病理学发生明显改变; 血尿素氮、血清肌酐增高( 过度训练组( P ＜ 0. 01) 、肉苁蓉+ 过度训练组( P ＜0. 01) 、维生素C + 过度训练组( P ＜ 0. 01) 、肉苁蓉+维生素C + 过度训练组( P ＜ 0. 05) 高于静止对照组) ;SOD 活性降低( 过度训练组( P ＜ 0. 01) 、肉苁蓉+ 过度训练组( P ＜ 0. 01 ) 、维生素C + 过度训练组( P ＜0. 01) 、肉苁蓉+ 维生素C + 过度训练组( P ＜ 0. 05) 低于静止对照组) ; MDA 含量升高( 一般训练组( P ＜0. 05) 、过度训练组( P ＜ 0. 01) 、肉苁蓉+ 过度训练组( P ＜ 0. 01) 、维生素C + 过度训练组( P ＜ 0. 01) 、肉苁蓉+ 维生素C + 过度训练组( P ＜ 0. 05) 高于静止对照组) 。这说明过度训练已造成大鼠肾脏运动性缺血“再灌注”损伤，肾功能受到严重损坏。但肾组织组织病理学改变肉苁蓉+ 过度训练组、维生素C + 过度训练组、肉苁蓉+ 维生素C + 过度训练组( P ＜ 0. 05) 较过度训练组明显减轻。血尿素氮和血清肌酐含量肉苁蓉+ 过度训练组( P ＜ 0. 05) 、维生素C + 过度训练组( P ＜ 0. 05) 、肉苁蓉+ 维生素C + 过度训练组( P ＜0. 01) 低于过度训练组; SOD 活性，肉苁蓉+ 过度训练组( P ＜ 0. 05) 、维生素C + 过度训练组( P ＜ 0. 05) 、肉苁蓉+ 维生素C + 过度训练组( P ＜ 0. 01) 高于过度训练组; MDA 含量，肉苁蓉+ 过度训练组( P ＜ 0. 05) 、维生素C + 过度训练组( P ＜ 0. 05) 、肉苁蓉+ 维生素C +过度训练组( P ＜ 0. 01) 低于过度训练组。表明，肉苁

蓉及维生素C 可以有效清除自由基，减轻肾脏的缺血缺氧，抑制脂质过氧化作用，提高SOD 活性。有效减轻肾脏缺血再灌注损伤，起到保护作用。其机制可能为: 1) 肉苁蓉可以提高抗氧化酶活性，加快自由基的消除，同时所含的多种多酚类、苷类、黄酮类物质，对清除机体自由基、减轻自由基对线粒体膜和肌浆网膜造成损伤，以及减轻对酶蛋白的氧化损伤起到积极作用［3］。2) 维生素C 是重要的抗氧化维生素，作为强抗氧化剂可有效清除氧自由基、抑制凋亡级联的启动而减轻细胞、器官的缺血再灌注损伤［9］。此外，3个治疗组间比较，血尿素氮、血清肌酐、MDA 含量，肉苁蓉+过度训练组( P ＜ 0. 05) ，肉苁蓉+ 维生素C + 过度训练组( P ＜ 0. 01) 低于维生素C + 过度训练组; SOD 活性，肉苁蓉+ 过度训练组( P ＜ 0. 05) ，肉苁蓉+ 维生素C + 过度训练组( P ＜ 0. 01) 高于维生素C + 过度训练组。提示肉苁蓉对运动性肾脏缺血再灌注损伤的疗效可能优于维生素C; 而二者配伍使用可能更有利于缺血再灌注损伤肾脏的保护。综上所述，大负荷游泳训练造成了大鼠肾脏缺血再灌注的损伤，肉苁蓉和维生素C 均对肾脏缺血再灌注损伤具有明显保护作用，可能是通过增强超氧化物歧化酶活性，清除自由基，减轻脂质过氧化作用，进而改善肾脏功能。就疗效而言，二者配伍使用优于二者单独应用，而肉苁蓉又优于维生素C，但也可能和二者在应用中的剂量大小有关，其剂量和疗效之间的关系，还有待进一步研究。

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