摘要　目的:优选复方肉苁蓉补肾颗粒药材最佳提取纯化工艺。方法:采用正交试验法, 以提取液中松果菊苷、毛蕊花糖苷的含量以及总固体得率为指标, 综合评分优选药材的提取与纯化工艺。结果:药材较优的提取工艺为加水7倍, 提取3次, 每次1.5 h, 纯化工艺是将药液浓缩至密度1.05( 60 ℃ ) 、调整醇沉浓度为50%, 醇沉后静置24 h, 滤过, 回收乙醇即可。结论:优选的提取纯化工艺各活性部位提取率高, 操作简便, 适用于生产。

关键词　复方肉苁蓉补肾颗粒;正交试验法;提取纯化工艺

复方肉苁蓉补肾颗粒处方是由部颁标准中药成方制剂20册中的苁蓉补肾丸组方而来, 具有补肾壮阳的功效, 临床上用于肾虚腰痛、阳痿遗精等, 具有疗效可靠、不良反应少、无须联合用药的优点。苁蓉补肾丸处方中含有12味中药材, 制剂工艺简单, 全部药材粉碎未经提取, 水泛丸法制丸。制成的水泛丸规格为每10粒重0.5 g, 而每次服药9 g, 不仅服药量大, 病人依从性差, 而且质量难以控制。本实验以最大限度地提取药材中的有效成分为原则, 并结合大生产的实际条件, 根据处方中有效成分的理化性质和药理作用, 以提取液中的松果菊苷、毛蕊花糖苷含量以及总固体得率为指标, 采用正交试验法, 进行复方肉苁蓉补肾颗粒中药材提取与纯化工艺的研究, 以减小剂量、创新剂型、提高临床疗效、改善病人服药依从性, 为生产提供依据。

1　仪器与材料

WATERS2695/2996 型高效液相色谱仪( 美国) 。所有药材均购自广州市致信药业有限公司。松果菊苷、毛蕊花糖苷对照品(中国药品生物制品检定所, 批号依次为111670-200503、111530-200706) 。甲醇、乙腈为色谱纯, 其他试剂为分析纯。

2　方法与结果

2.1　含量测定

2.1.1　色谱条件〔1〕:色谱柱:KromasilC18 ( 250 mm×4.6 mm, 5 μm) ;流动相:乙腈-甲醇-1%醋酸溶液=12∶18∶70;流速:1.0 mL/min;检测波长:334 nm;柱温:30℃;进样量:10 μL。在该色谱条件下, 供试品中松果菊苷、毛蕊花糖苷峰能达到基线分离, 理论塔板数按松果菊苷峰计应不低于4 000。

2.1.2　线性关系考察:精密称取松果菊苷、毛蕊花糖苷对照品置20 mL棕色量瓶中, 加流动相溶解, 并稀释至刻度, 配制成浓度分别为0.138、0.102 mg/mL的对照品溶液。精密吸取上述对照品溶液5、7、10、15、20、25 μL注入液相色谱仪, 按“2.1.1”项下色谱条件测定峰面积, 以峰面积对数为纵坐标, 进样量( μg)为横坐标进行线性回归, 得松果菊苷的回归方程为Y=121 170.54X-14 202.9( r=0.9997), 线性范围0.690 ～ 3.45 μg, 结果表明在此范围内松果菊苷进样量与峰面积呈良好的线性关系;毛蕊花糖苷的回归方程为Y=183 142.54X-16 572.4 ( r=0.9998) , 线性范围0.510 ～ 2.55 μg, 结果表明在此范围内毛蕊花糖苷进样量与峰面积呈良好的线性关系。

2.1.3　供试品溶液的制备〔1〕:按处方量称取药材提取, 提取液浓缩定容至1 000 mL容量瓶中。精密移取提取液1 mL置蒸发皿中, 蒸干, 残渣加流动相超声溶解, 定容至5 mL容量瓶中, 作为供试品溶液。2.1.4　空白溶液的制备:按处方量称取除肉苁蓉外的其余药材进行提取, 按“ 2.1.3”项下制备空白对照溶液。

2.1.5　含量测定:照2010年版中国药典一部附录高效液相色谱法测定。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL, 注入液相色谱仪, 测定, 即得。

2.2　正交试验

2.2.1　正交试验设计:根据处方药物中活性成分的理化性质、处方的功能主治以及剂型特点要求, 以提取液中松果菊苷、毛蕊花糖苷含量和总固体得率为指标, 采用正交试验法, 优选处方中药材的提取工艺条件。根据预试验结果, 选取影响提取效果的因素和水平, 试验方案见表1。

2.2.2　样品溶液的制备:按处方量称取药材, 按L9 ( 34 )正交表安排依照各条件分别回流提取、滤过,并浓缩定容到1 000 mL, 放置备用。

2.2.3　总固体得率及主要成分的含量测定:精密量取各提取液100 mL置已恒重的蒸发皿内, 水浴蒸干, 置105 ℃烘箱中, 干燥3 h, 取出置干燥器中冷却0.5 h, 称重, 置105 ℃烘箱中, 干燥1 h至恒重, 计算总固体得率。

2.2.4　含量测定:按“ 2.1”项下方法测定供试品溶液中松果菊苷、毛蕊花糖苷的含量。

2.2.5　结果分析:正交试验结果及极差分析见表2, 方差分析见表3。

　由方差分析可知, A、B、C3个因素对提取效果均有显著影响, 由直观分析结果和比较各因素的极差值可以看出, 影响提取效果的因素顺序为C>A>B, 较优的提取工艺是A2B3 C3, 即加水量为7倍量,提取3次, 每次1.5 h。因试验的数据表明B、C两因素的水平值都落在极值上, 为考察水平值更大时对提取效果的影响, 故进行提取时间和提取次数的比较验证试验。

2.2.6　比较验证实验:按处方量称取肉苁蓉等药材, 加7倍水按表4 方法提取, 滤过, 定容至1 000mL, 备用。照“ 2.1.3”项下方法操作, 测定各提取液中松果菊苷、毛蕊花糖苷的含量和总固体得率, 结果见表4。

　由表4可知, 在其他两个因素不变的情况下, 采用提取时间是1.5 与2.0 h提取, 总固体得率分别为21.49%和21.56%, 松果菊苷含量是0.42%、0.45%, 毛蕊花糖苷含量分别是0.39%、0.39%, 提取时间对三者得率没有显著差异;提取时间同为1.5 h, 提取次数为3次和4次时, 总固体得率分别为21.49%和21.38%, 松果菊苷含量是0.42%、0.44%, 毛蕊花糖苷含量分别是0.39%、0.40%, 提取次数对三者得率亦没有显著差异。综合考虑到生产成本、提取效率, 确定药材的提取工艺条件为A2B3 C3, 即加水7倍量, 提取3次, 每次1.5 h。

2.3　纯化工艺　药材水提液中含有较多的淀粉、黏液质等无效成分, 使有效成分含量相对较低, 须进一步精制, 在保证制剂疗效、操作简单、无需特殊设备、工期短、降低成本、提高经济效益的基础上, 拟采用乙醇沉淀法除去这些水溶性杂质。通过测定药液精制前后松果菊苷、毛蕊花糖苷的含量和总固体得率, 优选醇沉工艺条件。放大5倍处方比例称取药材, 加水7倍量, 提取3次, 每次1.5 h, 合并提取液, 滤过, 滤液定容至5 000 mL, 作为样品溶液。精密吸取样品溶液500mL, 分别按表5醇沉条件操作, 醇沉后静置24 h, 滤过, 滤液定容至500 mL, 得醇沉后溶液。测定精制前后成分含量结果如表5。

表5综合评分结果可看出, 当药液浓缩至相对密度1.05( 60℃) 、调整醇沉浓度为50%时, 综合评分最高, 是80.6 分。药液浓缩相对密度是1.10( 60 ℃)时, 总固体得率、松果菊苷含量均较原药液损失较多。故醇沉条件是将药液浓缩至相对密度1.05( 60 ℃) 、调整醇沉浓度为50%, 醇沉后静置24h, 滤过, 回收乙醇即可。

3 　讨论

3.1　提取工艺的评论指标应是提取有效成分质和量的代表, 也是提取物临床作用性质和强度的代表,对于有效成分或有效部位明确的药材来说, 评价指标较好选择, 有效成分可直接测其量, 有效部位中的主要有效成分也与疗效有直接量效关系。肉苁蓉是处方中的君药, 松果菊苷、毛蕊花糖苷都是肉苁蓉里的活性成分, 本实验参考有关文献〔2, 3〕, 采用高效液相色谱法对提取液中的松果菊苷、毛蕊花糖苷进行定量, 方法简单方便, 准确可靠, 为考察制剂的提取工艺、质量标准建立了可行的定量方法。提取液里的总固体是制剂发挥疗效的物质基础, 故本文也将其作为考察提取工艺优劣的一个指标。

3.2　本实验以最大限度地提取药材中的有效成分, 避免有效成分的分解流失和无效成分的溶出为原则, 通过系统的研究复方肉苁蓉补肾颗粒中药材的提取工艺, 可为复方肉苁蓉补肾颗粒提供一种生产周期短、生产成本较低、操作简便, 且无需增加企业设备投资的工艺参考。

参考文献

[ 1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[ S] .一部.北京:中国医药科技出版社, 2010:126.

[ 2] 康爱荣, 黄毅, 闫秋娟, 等.高效液相色谱法测定复方肉苁蓉口服液松果菊苷与毛蕊花糖苷含量[ J] .医药导报, 2009, 28( 2) :231-232.

[ 3] 张思巨, 刘丽, 于江泳, 等.HPLC同时测定肉苁蓉药材中松果菊苷与毛蕊花糖苷含量[ J] .中国药学杂志,2004, 39( 10) :740-741.