摘要: 目的: 研究德赢vwin登录 苯乙醇苷对巨噬细胞的激活作用，并筛选获得一个复方，研究其对正常小鼠的增强免疫力作用。方法: 通过巨噬细胞激活实验，考察德赢vwin登录 苯乙醇苷提取物对巨噬细胞ＲAW264.7 吞噬活性和TNF－α、IL－6 等分泌的影响; 研究当归、黄芪提取物的配伍对苯乙醇苷提取物的巨噬细胞激活作用的影响; 据此制备复方片剂，通过ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验、迟发型变态反应试验、抗体生成细胞检测、小鼠碳廓清试验和小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验，评价其对正常小鼠的免疫调节作用。结果: 75、100、125 g /L 苯乙醇苷提取物均能提高ＲAW264.7 细胞吞噬活性，以及NO、iNOS、TNF－α、IL－6 水平，其中以100 g /L 苯乙醇苷提取物效果最佳( P ＜ 0.01) ; 并且，当归、黄芪提取物对苯乙醇苷提取物的巨噬细胞激活功能具有极显著的促进作用( P ＜ 0.01) ; 以此为依据制备的复方片剂，0.4、1.2 g /kg·bw/d 组可显著促进淋巴细胞增殖( P ＜ 0.05) 、1.2 g /kg·bw/d 组可显著促进细胞免疫反应( P ＜ 0.05) ，0.4 g /kg·bw/d 组可显著促进抗体生成( P ＜ 0.05) ，1.2 g /kg·bw/d 组可显著提高小鼠碳廓清能力和巨噬细胞吞噬能力( P ＜ 0.05) 。结论: 苯乙醇苷提取物可通过诱导iNOS 表达，刺激巨噬细胞合成NO，同时刺激巨噬细胞释放TNF－α 和IL－6，激活巨噬细胞的免疫调节功能; 以其与当归、黄芪提取物制备的复方片剂，可通过调节细胞免疫、单核－巨噬细胞功能而发挥对正常小鼠的增强免疫力作用，并对体液免疫有积极影响。

关键词: 德赢vwin登录 ，苯乙醇苷，当归，黄芪，巨噬细胞激活，增强免疫力

列当科植物德赢vwin登录 ( Cistanche tubulosa( Schrenk) Wight) 是《中国药典》收载的肉苁蓉品种之一［1］，主产于新疆南疆地区，是著名的补益中药，“主五劳七伤，补中，除茎中寒热痛，养五脏，强阴，益精气，多子，妇人症瘕，久服轻身”。现代药理学研究表明，肉苁蓉具有抗疲劳［2－3］、抗衰老［4］、保护神经［5］、增强免疫力［6］、润肠通便［7］等多种生物活性，在保健食品开发方面具有独特的优势。苯乙醇苷和多糖被认为是肉苁蓉中的主要活性成分，其中，多糖的调节免疫活性已得到较多研究证实，它可通过免疫球蛋白受体Fcγ 依赖的吞噬作用、TNF－α NF－ κB 通路、糖酵解/糖原异生以及三羧酸循环和呼吸电子运输等实现对巨噬细胞ＲAW264.7的激活作用［8－10］，并可能通过促进细胞内钙释放促进小鼠胸腺淋巴细胞的增殖，通过促进IL－2 分泌提高正常小鼠的脾指数［10－11］。松果菊苷、毛蕊花糖苷等为代表的苯乙醇苷是肉苁蓉发挥药理活性的核心物质基础，但在调节免疫方面的研究则较少。文献报道，肉苁蓉苯乙醇苷能明显增加小鼠血中Mφ 的吞噬能力及免疫器官的重量［12］，松果菊苷为主要成分的肉苁蓉提取物可通过免疫调节等作用拮抗结肠炎，毛蕊花糖苷对免疫器官、免疫细胞和免疫因子均有明显的调节作用，对D－氨基半乳糖和脂多糖致肝功能衰竭小鼠的细胞凋亡和炎症反应也都有明显的抑制作用［6，13－14］，说明肉苁蓉中的苯乙醇苷类同样是很有潜力的免疫调节剂。

本文首先研究了德赢vwin登录 苯乙醇苷对巨噬细胞的激活作用，其次，基于传统中医药理论将其与当归、黄芪配伍，通过细胞实验证明3 者对巨噬细胞激活的协同作用，并以此为依据制备复方片剂，通过动物实验考察复方片剂对正常小鼠的细胞免疫、体液免疫、单核－巨噬细胞功能的调节作用，以期为德赢vwin登录 苯乙醇苷在调节免疫产品方面的应用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

Hank’s 液、ＲPMI1640 培养液、DMEM 培养基、MTT、PBS 购自武汉普诺赛生命科技有限公司;DNFB 购自吴江市青云精细化工厂; SＲBC、豚鼠血清购自广州蕊特生物科技有限公司; ConA、大肠杆菌脂多糖( LPS) 购自美国Sigma 公司; NO 试剂盒、iNOS 试剂盒购自南京建成生物工程研究所;ELISA 试剂盒( Mouse TNF－α、Mouse IL－6) 购自武汉艾美捷科技有限公司; 巨噬细胞ＲAW264.7 购自中国医学科学院细胞中心; SPF 级CI /F1 代健康雌性小鼠( 生产许可证号SCXK( 沪) 2013－0016) 购自上海西普尔－ 必凯实验动物有限公司; 德赢vwin登录 购自和田秋永霞德赢vwin登录 有限责任公司; 当归、黄芪购自新疆九州通医药有限公司。JA2003 电子天平上海上天精密仪器有限公司; JJ－100 电子天平美国双杰公司; SG－603 生物安全柜美国Baker 公司; Varioskan LUX 多功能酶标仪Thermo Fisher Scientific 公司; QP80 二氧化碳培养箱山东博科科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 各提取物及复方片剂的制备德赢vwin登录 苯乙醇苷提取物: 德赢vwin登录 以75% 乙醇溶液提取2次，浓缩干燥，即得( 松果菊苷+ 毛蕊花糖苷: 21.3%，总苷: 41%) ; 当归提取物: 当归以水提取2 次，浓缩后80%醇沉，浓缩干燥，即得( 阿魏酸: 0.3%) ; 黄芪提取物: 黄芪以水提取2 次，浓缩后70% 醇沉，干燥沉淀，即得( 多糖: 32.3%) 。复方片剂: 德赢vwin登录 苯乙醇苷提取物、当归提取物、黄芪提取物按15∶ 18∶ 12 的比例，辅以10% 微晶纤维素、9% 羧甲基淀粉钠、1% 硬脂酸镁混合均匀，湿法制粒、压片( 0.6 g /片) ，即得。

1.2.2 苯乙醇苷提取物的巨噬细胞激活作用

1.2.2.1 对ＲAW264.7 细胞吞噬活性的影响取对数生长期ＲAW264.7 细胞，胰酶消化后调整细胞数至5 × 106 个/mL，接种于48 孔板( 100 μL /孔) ，37 ℃，5% CO2条件下培养，待细胞贴壁后，PBS 清洗。分别加入DMEM 培养基( 空白对照组) 、LPS( 20 mg /L)和样品( 苯乙醇苷提取物25、50、75、100、125 g /L) 培养24 h，弃上清，加0.075%中性红溶液( 100 μL/孔) ，继续培养1 h，弃上清，PBS 清洗2～3 遍，加细胞裂解液

( 100 μL /孔) ，4℃ 下放置2 h，酶标仪测定吸光度( 540 nm) ，计算相对细胞吞噬活性。相对细胞吞噬活性( %) = 处理组吸光度/空白对照组吸光度×100。

1.2.2.2 对ＲAW264.7 细胞NO、iNOS、TNF－ α、IL－6的影响按上述方法培养ＲAW264.7 细胞，分别加入DMEM 培养基( 空白对照组) 、LPS( 20 mg /L) 和样品( 苯乙醇苷提取物25、50、75、100、125 g /L) 培养24 h收集上清液，根据试剂盒说明测定NO、iNOS，Elisa 法测定TNF－α、IL－6 含量。

1.2.3 苯乙醇苷提取物及其与当归和黄芪提取物的组合物对巨噬细胞激活的作用比较

1.2.3.1 对ＲAW264.7 细胞吞噬活性的影响以苯乙醇苷提取物和当归提取物按15∶ 18 的比例混合得到组合物B，以苯乙醇苷提取物、当归提取物和黄芪提取物以15∶ 18∶ 12 的比例混合得到组合物C( 组合物配比依据《中国药典》中各药材的推荐服用量［1］和各提取物的得率折算) 。参照“1.2.2.1”方法，对比苯乙醇苷提取物( A) 、组合物B 和C( 50、75 g /L) 对ＲAW264.7 细胞吞噬活性的影响。

1.2.3.2 对ＲAW264.7 细胞NO 释放量的影响参照“1.2.2.2”方法，对比苯乙醇苷提取物( A) 、组合物B和C( 50、75 g /L) 对ＲAW264.7 细胞产生NO 的影响。

1.2.4 复方片剂对正常小鼠的免疫力的影响参考文献［15］的操作研究复方片剂对正常小鼠淋巴细胞等的影响。

1.2.4.1 分组及处理SPF 级CI /F1 代健康雌性小鼠200 只，体重19.0～21.7 g，随机分五大组，每大组40 只，Ⅰ组进行ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验，Ⅱ组进行耳肿胀试验，Ⅲ组进行抗体生成细胞检测，Ⅳ组进行小鼠碳廓清试验，Ⅴ组进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验。每大组分别设复方片剂低、中、高剂量组0.2、0.4、1.2 g /kg·bw/d( 分别相当于受试样品人体推荐摄入量的5 倍、10 倍、30 倍; 折算人体推荐摄入量，各药材服用量均小于《中国药典》规定的用药量) 和空白对照组，灌胃体积0.1 mL/10 g·bw，空白对照组给予等体积蒸馏水，1次/d，连续灌胃30 d。

1.2.4.2 ConA 诱导的小鼠淋巴细胞转化试验灌胃30 d 后，处死小鼠，无菌取脾，制细胞悬液，用ＲPMI1640 培养液调整细胞浓度为3 × 106 个/mL。将细胞悬液分两孔加入24 孔培养板，每孔1 mL，一孔加75 μL ConA 液( 100 μg /mL) ，另一孔作对照，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养72 h。培养结束后，用酶标仪按MTT 法在570 nm 测定OD 值。淋巴细胞增殖能力= 加ConA 孔的OD 值－不加ConA 孔的OD 值。

1.2.4.3 迟发型变态反应灌胃30 d 后，每鼠腹部剃毛( 3 cm × 3 cm) ，以10 mg /mL DNFB 溶液50 μL均匀涂抹致敏。5 d 后以10 mg /mL DNFB 溶液10 μL均匀涂抹于小鼠右耳( 两面) 攻击，攻击24 h后处死小鼠，分别以打孔器取左右耳片( d = 8 mm) ，称重。耳重差( mg) = 右耳重( mg) －左耳重( mg) 。

1.2.4.4 抗体生成细胞检测灌胃30 d 后，每鼠腹腔注射0.2 mL 2%( v /v) SＲBC 悬液免疫，4d 后处死小鼠，取脾，制细胞悬液，按Jerne 改良玻片法检测溶血空斑数。溶血空斑数= 溶血空斑计数× 320。

1.2.4.5 小鼠碳廓清试验灌胃30 d 后，每鼠尾静脉注入4 倍稀释的印度墨汁( 0.1 mL /10 g·bw) ，注入后2 min 及10 min 时分别从眼内眦静脉丛取血20 μL，加入2 mL 0.1% Na2CO3溶液中，用酶标仪在600 nm 处测OD 值，并取胸腺、肝、脾称重，计算胸腺/体比、脾/体比和吞噬指数a。K = ( lgOD1－ lgOD2) / ( t2－ t1) ，a = 体重/ ( 肝重+ 脾重) × K1 /3。

1.2.4.6 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验试验前4 d 给每鼠腹腔注射2% 压积羊血红细胞0.2 mL。处死小鼠，腹腔注射加小牛血清的Hank’s液( 4 mL /只) ，轻轻按揉腹部20 次，然后将腹壁剪开一个小口，吸取腹腔洗液2 mL 于试管内。吸取0.5 mL腹腔洗液加入盛有0.5 mL 1% 鸡血红细胞悬液的试管内，混匀。取混合液加入玻片琼脂圈内，37 ℃孵育15～20 min。孵育后将未贴壁细胞洗掉，固定，Giemsa 染色，洗片，晾干，显微镜计数，计算吞噬率和吞噬指数。吞噬百分率( %) = 吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的吞噬细胞数× 100，吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数。

1.3 数据分析

数据均以珋x ± s 表示，用SPSS 软件对各实验原始数据进行方差分析。以P ＜ 0.01 作为非极显著性差异，P ＜ 0.05 作为显著性差异。

2 结果与分析

2.1 苯乙醇苷提取物的巨噬细胞激活作用

2.1.1 苯乙醇苷提取物对ＲAW264.7 细胞吞噬活性的影响本实验首先研究了25、50、75、100、125 g /L苯乙醇苷提取物对ＲAW264.7 细胞吞噬活性的影响。结果表明，LPS 组细胞吞噬活性相比空白对照组具有极显著差异( P ＜ 0.01) ， 75、100 g /L 组样品可极显著提高细胞吞噬活性( P ＜ 0.01) ，125 g /L 组可显著增强细胞吞噬活性( P ＜ 0.05) ，提示苯乙醇苷提取物具有激活巨噬细胞的作用，见图1。

2.1.2 苯乙醇苷提取物对ＲAW264.7 细胞NO、iNOS、TNF－α 和IL－6 释放的影响为了进一步明确苯乙醇苷提取物对巨噬细胞的激活作用，分别检测了巨噬细胞经不同浓度样品刺激后，细胞上清液中NO、iNOS、TNF－ α 和IL － 6 的含量。结果表明，LPS 组NO、iNOS、TNF－α 和IL－6 相比空白对照组均具有极显著差异( P ＜ 0.01) ， 75、100、125 g /L 苯乙醇苷提取物组均能改善ＲAW264.7 细胞NO 生成量、iNOS 活性和TNF－α 分泌水平，50、75、100、125 g /L 苯乙醇苷提取物组还能提高ＲAW264.7 细胞IL－6 分泌水平，其中，100、125 g /L 组样品的作用具有极显著差异( P ＜ 0.01) ，这也提示苯乙醇苷提取物可能通过促进巨噬细胞表达TNF－ α、IL－6 从而激活免疫吞噬功能，见图2～ 图5。

2.2 苯乙醇苷提取物及其与当归和黄芪提取物的组合物对巨噬细胞激活作用的比较通过对比苯乙醇苷提取物A、苯乙醇苷提取物:当归提取物( 15∶ 18) 的组合物B、苯乙醇苷提取物:当归提取物: 当归提取物( 15∶ 18∶ 22) 的组合物C 对

巨噬细胞吞噬活性和NO 释放的影响，考察3 者是否具有协同增效的作用，为下一步复方片剂的制备提供依据。结果表明，LPS 组细胞吞噬活性和NO 释放量相比空白对照组均具有极显著差异( P ＜ 0.01) ，A、B 仅有高剂量组能提高巨噬细胞吞噬活性和NO 释放量( P ＜ 0.05) ，而以3 种提取物共同制备的组合物C 低、高剂量组均能提高巨噬细胞吞噬活性和NO 释放量，并且，C 高剂量组对巨噬细胞吞噬活性和NO分泌的影响具有极显著差异( P ＜ 0.01) ，即苯乙醇苷提取物、当归提取物、黄芪提取物在激活巨噬细胞方面具有协同作用，故以组合物C 的配比为依据制备复方片剂继续考察其对正常小鼠的免疫调节活性，见图6～图7。

2.3 复方片剂对正常小鼠的免疫调节活性为了进一步证明苯乙醇苷提取物、当归提取物和黄芪提取物配伍在增强免疫力方面的实际效果，通过动物实验，综合考察以3 者制备的复方片剂对正常小鼠细胞免疫、体液免疫、单核－ 巨噬细胞功能和NK 细胞活性的影响。

2.3.1 ConA 诱导的小鼠淋巴细胞转化试验淋巴细胞的增殖和分化是机体免疫反应中的重要阶段，淋巴细胞受到抗原或者促有丝分裂原刺激时增殖能力的大小，可以反映机体的免疫功能状态［16］。0.4、1.2 g /kg·bw /d 组小鼠淋巴细胞中加ConA 孔与不加ConA 孔的OD 值差值显著高于空白对照组( P ＜ 0.05) ，说明样品可以增强ConA 诱导的淋巴细胞增殖能力，即其可以促进机体的免疫反应，见表1。

2.3.2 迟发型变态反应1.2 g /kg·bw /d 组小鼠耳壳增重显著高于空白对照组( P ＜ 0.05) ，说明抗原攻击局部引起了炎症反应导致的肿胀［17－18］，并且样品可以增强这一作用，即样品能够增强DNFB 诱发的迟发型变态反应，综合“2.3.1”结果，可以判定样品能够促进小鼠的细胞免疫功能，见表2。

2.3.3 抗体生成细胞检测抗原特异性抗体的产生可以裂解抗原致敏后的绵羊红细胞，从而在抗体形成细胞周围形成溶血空斑。0.4 g /kg·bw /d 组小鼠溶血空斑数显著高于空白对照组( P ＜ 0.05) ，说明样品可以促进抗体生成，即其对小鼠特异性体液免疫有积极影响，见表3。

2.3.4 小鼠碳廓清试验单核巨噬细胞系统能够快速吞噬廓清异体颗粒和某些可溶性异物，并可迅速清除自体产生的某些有害物质，是机体最重要的防御系统［19］。1.2 g /kg·bw /d 组小鼠碳廓清吞噬指数a显著高于空白对照组( P ＜ 0.05) ，表明样品可以提高小鼠碳廓清能力，增强单核－ 巨噬细胞系统吞噬功能，并且，“2.2”结果也显示混合物在体外可以激活巨噬细胞，提高其吞噬活性，说明样品可以增强机体的非特异性免疫功能［20］，见表4。

2.3.5 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验鸡红细胞对于小鼠是一种较强的抗原，其与小鼠腹腔巨噬细胞共孵育一定时间后，会被吞噬，吞噬百分率和吞噬指数可以反映小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力［21］。1.2 g /kg·bw /d 组吞噬百分率及吞噬指数均显著高于空白对照组( P ＜ 0.05) ，表明样品可以提高巨噬细胞的吞噬能力，综合“2.3.4”结果可以判定样品可以通过影响正常小鼠单核－ 巨噬细胞系统的吞噬功能发挥增强免疫力的作用，见表5。

3 结论

巨噬细胞在机体内不仅起呈递抗原的作用，还可通过非特异性吞噬病原微生物和肿瘤细胞等维持机体稳态，在宿主防御系统中占重要地位［22］。NO 是杀伤病原微生物和肿瘤细胞的主要物质，激活的巨噬细胞可以合成大量NO，从而杀伤微生物、寄生虫和肿瘤细胞［22］。iNOS 则是其合成的关键酶之一，当巨噬细胞被激活时会大量表达iNOS，进而诱发机体产生NO，可发挥防御作用［22］。TNF－α 和IL－6 则是巨噬细胞分泌的2 种主要炎性因子，不仅参与机体免疫应答反应，而且对机体的免疫反应有重要调节作用［23］。因此，本实验选择这些指标研究德赢vwin登录 苯乙醇苷的巨噬细胞激活作用，并考察其与当归和黄芪提取物的协同作用。结果表明，75、100、125 g /L的德赢vwin登录 苯乙醇苷提取物可显著提高细胞对中性红的吞噬能力，说明其可提高机体的非特异性免疫，并且可能是通过诱导iNOS 表达提高刺激巨噬细胞合成NO，同时刺激巨噬细胞释放TNF－ α和IL－6，激活细胞免疫吞噬功能。此外，当归提取物、黄芪提取物可明显提升苯乙醇苷提取物对巨噬细胞的激活作用，即三者在巨噬细胞激活方面具有协同增效作用。

肉苁蓉补肾气、益精血［24］，当归补血活血［25］，黄芪补诸虚不足、益元气、壮脾胃［26］，三者合用，平补阴阳，调养五脏，温而不燥，补而不腻，性味平和，无阴阳偏盛之弊，全方共奏补肾填精养血活血之功效，因

而能够发挥增强机体免疫力的功效。动物实验也证明，以3 者作为原料制备的复方片剂，可以提高正常小鼠淋巴细胞增殖能力、促进抗原攻击下的迟发型变态反应、提高小鼠体内碳颗粒被清除的速率、巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力和脾细胞抗体生成能力，但是，对溶血素水平、NK 细胞活性没有积极影响( 数据未列出) 。根据《保健食品检验与评价技术规范》之标准［15］，受试样品在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核－巨噬细胞功能、NK 细胞活性4 个方面任2个方面结果为阳性，即具有增强免疫力功能。因此，可以判定本复方片剂具有增强免疫力功能，且主要是通过调节正常小鼠细胞免疫、单核－巨噬细胞功能发挥增强免疫力作用的。