摘要:目的　研究苯乙醇苷类化合物在狗胃肠道内的代谢规律。探讨中药有效部位体内转化的研究方法。方法　用反相HPLC, 对ig 苯乙醇总苷的狗粪便中的化合物进行分离, 并以含量最高的3 个化合物为标准, 比较不同时间胃肠容物及粪便中的含量。结果　从粪便中分离得到4 个苯乙醇苷类化合物, 分别为松果菊苷( echinacoside, I) 、类叶升麻苷( acteoside, II) 、异类叶升麻苷( isoacteoside, III) 和2′-乙酰基类叶升麻苷( 2′-acetylacteoside, IV) ;经HPLC分析发现, 各成分在胃及小肠运行期间相对比例未发生明显变化, 但在粪便中变化很大, 其中松果菊苷由总苷中的48.0%降低到16.0 %, 而类叶升麻苷由11.0%升高为34.7%。结论　苯乙醇苷类成分的代谢主要发生在大肠, 其中松果菊苷经脱糖反应转化成类叶升麻苷。

关键词:苯乙醇总苷;药物代谢;松果菊苷;类叶升麻苷;高效液相色谱法

肉苁蓉( Herba cistanches) 为传统补肾、壮阳药物, 其使用频率名列补肾阳药物之首。大量研究[ 1 -4] 表明, 其主要有效成分为苯乙醇苷类化合物。本研究室在多年的研究基础上采用现代提取分离手段, 研究出德赢vwin登录 Cistanche tubulosa(Schenk) R.Wig ht 的有效部位苯乙醇总苷的制备工艺, 使苯乙醇苷含量达到90 %以上, 其中松果菊苷高达48 %, 类叶升麻苷11 %, 并已将其开发成为二类新药。

　　近年来, 随着临床药理学、临床药学和生物医学的不断发展, 以及现代分析分离技术的应用, 使洞察药物在体内的运行过程成为可能, 也成为新药从科研到临床的必要环节, 在此基础上发展出一门新兴的边缘学科体内药物学, 即对药物在生物体内的吸收、分布、代谢、排泄过程进行系统研究, 了解药物在体内的吸收变化和消除规律, 从而正确评价药物的安全性与有效性[ 5] 。

　　本文对苯乙醇总苷在狗胃肠道内的生物转化进行初步研究, 探讨苯乙醇苷类成分在胃肠道内的代谢规律。对苯乙醇苷类成分体内代谢的研究国内外尚未见报道。本研究采用制备型高效液相色谱法( prep-HPLC) 对粪便中几个含量较高的苯乙醇苷类化合物进行了分离鉴定, 并利用HPLC 对不同时间胃、肠容物及粪便中所含的3 个主要成分进行了相对含量的测定。结果表明苯乙醇苷类成分的代谢主要发生在大肠, 其中含量最高的松果菊苷经脱糖反应转化为类叶升麻苷。本研究可为中药有效部位体内代谢转化的方法学研究提供参考。

实验部分

　　仪器　高效液相色谱仪( 包括Waters 600 泵,Waters 2487 双波长紫外检测器;Waters 510 泵,Waters 996 光电二级管阵列检测器, Millennium2010 系统工作站) 为美国Waters 液相色谱公司产品, ChromStationtm 数据处理系统( 美国Sage 公司) 。

　　材料　动物:德国产纯种Beagle 犬8 只( 体重10 kg 左右) ;药品:德赢vwin登录 苯乙醇总苷( phenylethanoid glycosides, PhGs) ( 本室自制) ;松果菊苷( echinacoside) 和类叶升麻苷( acteoside) 对照品( 自制) ;葡聚糖凝胶LH-20 ( Sephadex LH-20,Pharmacia 公司) ;试剂:分析纯甲醇( 北京化工厂) ,色谱纯甲醇( 天津西华特种试剂厂) , 色谱纯乙腈( Fisher Chemicals 公司) , 重蒸水( 自制) 。

　　色谱条件　色谱柱:Waters Spherisorb ODS 柱( 4.6 mm ×250 mm, 5 μm) , Phenomenex kromasilC18柱( 10 mm ×250 mm, 5 μm) ;分析型HPLC 的流动相:乙腈-1 %冰乙酸( 17∶83, V/V) ;柱温:室温;流速:1 mL·min

-1 ;检测波长:254 nm, 331 nm( 双波长检测) ;灵敏度:1.000 AUFS 。

　　样品处理　禁食24 h 的狗6 只, 1 只作空白, 其余5 只po 苯乙醇总苷, 剂量3 g·kg-1体重, 分别在0.75, 4, 7 和16 h 宰杀后取胃肠空物及24 h 内粪便作为样品( 见表1) 。样品以甲醇为溶剂进行匀浆、离心后取上清液, 浓缩至干, 取少量样品加甲醇溶解。以HPLC 的峰面积作100 %为基准进行相对含量的测定。给药组粪便样品经以上步骤处理后, 除少许留做分析测定, 其余样品先后经Sephadex LH-20 柱色谱分离( 洗脱剂分别为甲醇, 70 %甲醇, 30 %

甲醇和水) , 并以聚酰胺T LC 检测, 合并三氯化铁显色阳性的组分浓缩后作下一步分离。最后使用制备型HPLC 进行纯化, 流动相采用不同浓度的乙腈。

结果

　　从给药组粪便中分离得到4 个苯乙醇苷类成分, 以核磁共振氢谱和碳谱鉴定, 并与标准品的谱图对照。其结构分别为:松果菊苷( echinacoside, I) 、类叶升麻苷( acteoside, II) 、2′-乙酰基类叶升麻苷( 2′-acety lacteoside, III ) 、异类叶升麻苷( isoacteoside, IV) , 其结构式见图1 。

利用分析型HPLC, 对上述样品中含量较高的3个主要成分即松果菊苷、类叶升麻苷及1 个未知物进行相对含量的测定。胃、肠及便中成分比例变化见图2 和图3 ;胃肠道成分及便中成分变化的HPLC图见图4 和图5 。

讨论

　　中药有效成分的药物代谢研究已有大量报道。随着中药现代化的发展, 复方及中药有效部位的体内药物学研究正在引起药物学家的普遍重视, 但由于成分复杂, 这一方向的研究仍处于探索中。本实验以主要成分的积分值作对照, 得出作为肉苁蓉有效部位的苯乙醇总苷在胃肠道中的运行趋势及主要成分的转化规律。

　　HPLC 在体内药物学研究中的应用日益广泛。苯乙醇苷类成分极性较大, 有很强的紫外吸收, 尤其适用于反相高效液相色谱法( RP-HPLC) 。为排除样品中内源性杂质的干扰, 采用光电二级管阵列检测器, 通过比较样品各组分的保留时间及紫外图谱,对目标峰进行定性分析。此外, 为减少样品中其它峰的干扰, 采用目标峰峰面积的对比来进行相对含量的测定。

　　从图2 -5 可见苯乙醇总苷( PhGs) 在胃肠道内的运行趋势和变化规律。PhGs 在胃中停留0.75 h后主要成分的比例基本未变化, 这是由于在正常胃排空时间内苷键未受到胃液中胃酸及胃蛋白酶的影响。这种状态保持到总苷从胃运行到小肠, 因此在7 h 内肠容物中3 种成分的含量基本没有改变。给药4 h 后胃中药物已大部分排出, 残余的总苷因长期受胃环境的影响, 苷键发生一定程度的水解, 各成分的相对含量发生改变, 其中松果菊苷由原药中含量是类叶升麻苷的4 倍多降至与之相近的水平。在16 h 后的小肠内容物中仅仅检识出极微量的有关成分, 比例未有明显变化。经过近20 h 后胃肠道内的转运, 药物及其代谢物随粪便排出体外, 其中松果菊苷的相对含量大大降低, 仅有16.0 %, 而类叶升麻苷含量高达34.7 %。药物的吸收主要发生在小肠内, 且小分子、低极性的化合物易于吸收。因此比较而言, 类叶升麻苷较松果菊苷更易吸收。而粪便中类叶升麻苷相对含量的急剧增加以及松果菊苷的大大降低, 充分说明松果菊苷在大肠中发生了变化,即在大肠内微生物酶的影响发生水解反应, 脱去一分子葡萄糖转化为类叶升麻苷( 如图6 所示) 。

　综上所述, 推测苯乙醇总苷在胃及小肠运行过程中未受明显影响, 其代谢主要发生在大肠内, 松果菊苷经酶作用转化为类叶升麻苷。在大肠中, 由于厌氧菌的主导地位, 尤以还原反应及水解反应为主。本实验的结果验证了有效成分在胃肠道内的代谢特点即为小分子化和低极性化。进一步的研究还在进行中。

REFERENCES:

[ 1] Sato T, Kozima S, Kobay ashi K, et al .Studies on thepharmacology o f Cistanchis Herba [ J] . YakugakuZasshi, 1985, 105( 12) :1131 -1141 .

[ 2] He W, Zong GZ, Wu GL, et al .Initial studies onandrogenic-like function of active compositions inCistanchis Herba [ J] .China J Chin Mater Med ( inChinese) , 1996, 21( 9) :564-565 .

[ 3] Jimenez C, Riguera R. Phenylethanoid glycosides inplants:structure and bio logical activity [ J] .Nat ProdRep, 1994, 11( 6) :591-606 .

[ 4] Cometa S, Tomassini I , Nicoletti M .Phenylethanoidg lycosides:distribution and pharmacological activity [ J] .Fitoterapia, 1993, 64( 3) :195-217 .

[ 5] Zeng JZ.Impo rtance and sig nificance of Biopharmaceuticanalysis [ A] .Zeng JZ.Biopharmaceutic Analysis [ M] .Beijing: China Medical Science and TechnologyPublishing House, 1990 .3 -11 .