［摘要］ 探究德赢vwin登录 醇提取物( CTEE) 对缺氧/缺糖再灌注( OGD/Ｒ) 所致的PC12 细胞损伤的抑制作用及潜在机制。实验以OGD/Ｒ 诱导PC12 细胞作为损伤模型，通过MTT 法检测细胞存活率、通过AO/EB 与Hoechst 33258 染色法考察细胞凋亡、通过JC-1 染色法考察线粒体膜电位变化、通过MitoSOX 染色法考察线粒体氧化应激反应，通过Western blot 法考察凋亡相关蛋白( PAＲP， cleaved PAＲP， caspase-3， cleavd caspase-3，Bax，Bcl-2) 的表达，研究了CTEE( 12. 5， 25， 50 mg·L－1 ) 对神经细胞的保护作用。结果显示，CTEE 可以有效保护OGD/Ｒ 诱导的PC12 细胞损伤，并提高PC12 细胞存活率，AO/EB 与Hoechst 33258染色法显示CTEE 可以有效抑制细胞凋亡。此外， JC-1 与MitoSOX 染色法显示CTEE 可显著降低细胞中线粒体的氧化应激及线粒体膜电位的失调，且呈剂量依赖性。同时，CTEE 可明显抑制线粒体凋亡信号通路中关键蛋白caspase-3 和PAＲP 的激活，且明显抑制Bax 的升高和Bcl-2 的下调。以上结果表明，德赢vwin登录 醇提取物对OGD/Ｒ 所致的PC12 细胞损伤具有较好的保护作用，其潜在机制可能是通过抑制线粒体氧化应激及相关凋亡信号通路实现的。

［关键词］ 神经损伤; 缺氧/缺糖再灌注; 德赢vwin登录 ; 醇提取物; 线粒体通路

缺血性脑中风( ischemic stroke) 是现代社会威胁老年群体的重要致死性疾病，也是当前药物研发的热点领域［1-2］。脑是人体中对氧需求量最高的器官，因此脑缺血常常对脑组织造成十分严重的损伤，并引发脑死亡甚至危及生命。现代研究发现，缺血性脑中风最主要的特点是缺氧状态所诱发的神经细胞内的氧化应激反应，该过程中生成的氧自由基会损伤神经细胞内的线粒体，增加线粒体膜通透性，进而激活下游凋亡信号通路，诱导神经细胞凋亡［3-4］。此外，由于线粒体是合成细胞能量的源头，其功能受损必然会影响到神经细胞功能的发挥，并引起脑功能损伤。因此，以线粒体为靶向的神经保护剂的研发是治疗缺血性脑中风的一个关键方向［5-6］。德赢vwin登录 Cistanche tubulosa ( Schenk ) Ｒ．Wight 是传统中药之一，具有补肾阳、益精血、润肠通便的药理功效。现代药理学研究发现，德赢vwin登录 具有抗氧化、抗衰老、抗凋亡、抗辐射和改善学习记忆等作用［7-9］，特别是对于脑缺血再灌注有很好的保护作用，相关药品苁蓉总苷胶囊主要在临床上用于治疗轻中度血管性痴呆并得到广泛应用［10］。但是关于德赢vwin登录 治疗脑缺血和发挥神经保护的分子药理机制目前还尚不清楚，亟待揭示。因此，本研究旨在探讨德赢vwin登录 醇提取物对缺氧/缺糖再灌注所致的神经细胞损伤的保护作用，特别是探究了德赢vwin登录 发挥神经细胞保护作用的线粒体调控机制，最终为缺血性脑中风的创新药物研发提供全新候选药物及干预策略。

1 材料

PC12 细胞系购自中国医学科学院细胞中心。德赢vwin登录 95%乙醇提取物由北京大学中医药现代研究中心制备; AO/EB 双染色试剂盒( CA1140)购自北京索莱宝科技有限公司; Hoechst 33258 染色液( C0021) 购自北京索莱宝科技有限公司; 线粒体膜电位染色试剂盒( JC-1) ( C0026) 购自南京碧云天生物技术公司; 结晶紫染色液( DZ0056) 购自北京雷根( Leagene) 生物技术有限公司; MitoSOX 染色试剂盒( S0033) 购自南京碧云天生物技术公司; DMEM 培养基( CM15019) 购自北京中科迈晨( Macgene) 科技有限公司; 胎牛血清购自PAN-Biotech 上海斯信生物科技有限公司( 德国) ; 溴化噻唑蓝四氮唑( MTT) ( Amresco0793) 购自北京中科科奥公司; 蛋白抗体购自CellSignaling Technology 公司( 美国) ; Tanon-5200 Multi凝胶成像分体系统购自上海天能; Sunrise-Basic 酶标仪购自TECAN 公司( 美国) ; 倒置荧光显微镜( IX73)购自OLYMPUS 公司( 日本) 。

2 方法

2. 1 细胞培养与处理PC12 细胞系用高糖DMEM培养基( 含10%胎牛血清，100 U·L－1 青霉素，100μg·L－1链霉素) 进行传代培养，每2 天传代1 次。将细胞分为空白对照组，缺氧/缺糖再灌注损伤组和不同浓度药物处理组( 12. 5，25，50 mg·L－1 ) 。用1 体积的DMEM 培养液正常培养细胞，构建缺氧/缺糖再灌注损伤模型时，用1 /2 体积的Earle' s溶液替换原DMEM 培养液，并将其置于缺氧盒中孵育4 h。造成缺氧/缺糖损伤后，往1 /2 体积的Earle's溶液中加入3 /2 体积的DMEM 培养液，实现缺氧/缺糖再灌注损伤。

2. 2 MTT 法检测细胞存活率PC12 细胞以1×104个/孔接种于96 孔板，模型组诱导缺氧/缺糖再灌注损伤，药物处理组按照上述浓度处理细胞。缺氧后复氧24 h，弃去上清液，并加0. 5 g·L－1MTT 染色，温箱孵育2 h; 加入DMSO 后，酶标仪检测吸光度( A570 nm) 。

2. 3 结晶紫染色分析PC12 细胞以5×104 个/孔接种于24 孔板，模型组诱导缺氧/缺糖再灌注损伤，药物处理组按照上述浓度处理细胞。缺氧后复氧24 h，加入4%多聚甲醛固定10 min; 将多聚甲醛吸走，加入PBS 清洗，清洗3 次; 弃去PBS，加入结晶紫染液，染10 min; 将染液吸走，加入PBS 清洗，清洗3次，用倒置显微镜( ×10) 观察细胞形态。

2. 4 AO/EB 染色分析PC12 细胞以5×104 个/孔接种于24 孔板，模型组诱导缺氧/缺糖再灌注损伤，药物处理组按照上述浓度处理细胞。缺氧后复氧24 h，加入PBS 清洗，清洗3 次; 弃去PBS，加入200 μL AO/EB( 100 μL AO 和100 μL EB 等体积混合) 染液，避光，染色2 min; 将染液吸走，加入PBS 清洗，清洗3 次，用荧光显微镜观察( ×200) 细胞核形态。

2. 5 Hoechst 33258 染色分析PC12 细胞以5×104个/孔接种于24 孔板，模型组诱导缺氧/缺糖再灌注损伤，药物处理组按照上述浓度处理细胞。缺氧后复氧24 h。加入4%多聚甲醛固定30 min; 将多聚甲醛吸走，加入PBS 清洗3 次; 弃去PBS，加入Hoechst33258 染液染色30 min; 将染液吸走，加入PBS 清洗3 次，每次5 min。用荧光显微镜( 激发波长352 nm，发射波长461 nm) 观察( ×200) 细胞核形态。

2. 6 JC-1 染色分析PC12 细胞以5×104 个/孔接种于24 孔板，模型组诱导缺氧/缺糖再灌注损伤，药物处理组按照上述浓度处理细胞。缺氧后复氧24h，按试剂盒要求将母液配置成工作液，加入工作液，避光，染色30 min; 将工作液吸走，加入PBS 清洗，清洗3 次，用荧光显微镜( 激发波长514 nm，发射波长529 nm) 观察( ×200) 细胞线粒体形态。

2. 7 MitoSOX 染色分析PC12 细胞以5×104 个/孔接种于24 孔板，模型组诱导缺氧/缺糖再灌注损伤，药物处理组按照上述浓度处理细胞。缺氧后复氧24 h，加入PBS 清洗3 次; 弃去PBS，按试剂盒要求将母液配置成工作液，加入工作液，避光，染色20min; 将工作液吸走，加入PBS 清洗3 次，用荧光显微镜( 激发波长488 nm，发射波长525 nm) 观察( ×200) 细胞线粒体形态。

2. 8 蛋白免疫印记( Western blot) 分析PC12 细胞经药物处理后，用ＲIPA 裂解液( 含蛋白酶抑制剂) 裂解细胞，得到细胞总蛋白提取液。总蛋白经过定量后，用6%～ 12% SDS-PAGE 分离，湿法转移至PVDF膜上。脱脂奶粉封闭PVDF 膜后加入一抗，室温孵育2 h，充分洗涤后加入二抗，室温孵育1 h。最后加ECL 显色试剂并在凝胶成像系统上拍照。

2. 9 统计学分析所有数据用x－ ± s 表示，采用GraphPad Prism 5 统计学软件进行t 检验和单因素方差分析，P＜0. 05 认为有统计学意义。

3 结果

3. 1 德赢vwin登录 醇提取物保护缺氧/缺糖再灌注所致神经细胞的存活缺氧/缺糖再灌注损伤显著诱导神经细胞存活率降低，而加入德赢vwin登录 醇提取物后，有效逆转了这一过程，在12. 5，25，50 mg·L－13 个剂量下，德赢vwin登录 醇提取物对神经细胞的存活率具有显著提升作用，表明在此实验条件下，德赢vwin登录 醇提取物具有较好的抗缺氧/缺糖再灌注所致神经细胞损伤作用; 而德赢vwin登录 醇提取物在相同剂量条件下对神经细胞存活无明显毒性( 图1) 。此外，从结晶紫染色结果看，德赢vwin登录 醇提取物可以显著保护缺氧/缺糖再灌注所致神经细胞形态学变化，维持细胞正常的形态( 图1) ，这与细胞存活率的研究结果存在一致性。

3. 2 德赢vwin登录 醇提取物抑制缺氧/缺糖再灌注所致神经细胞的凋亡AO/EB 染色分析发现，缺氧/缺糖再灌注损伤显著诱导神经细胞凋亡的发生( 红色荧光表示) ; 与损伤组相比，德赢vwin登录 醇提取物显著抑制了神经细胞凋亡的产生，且具有剂量依赖性( 图2) 。Hoechst 33258 染色分析表明缺氧/缺糖再灌注损伤诱导的神经细胞凋亡( 细胞核致密浓染) 被德赢vwin登录 醇提取物显著逆转( 图2) 。由此可见，德赢vwin登录 醇提取物具有较好的神经保护和抗凋亡作用。

3. 3 德赢vwin登录 醇提取物抑制缺氧/缺糖再灌注所致神经细胞线粒体损伤线粒体损伤在脑缺血所致的神经凋亡中扮演重要角色。缺氧/缺糖再灌注可引起神经细胞线粒体膜的显著去极化( 绿色荧光) ，而德赢vwin登录 醇提取物处理后的细胞中，绿色荧光显著降低，提示德赢vwin登录 醇提取物可较好的稳定神经细胞线粒体的膜电位( 图3) 。此外，实验采用荧光染料MitoSOX 来特异性标记线粒体内的活性氧自由基( ＲOS) ，结果发现缺氧/缺糖再灌注可引起线

粒体内ＲOS 水平显著升高，而德赢vwin登录 醇提取物处理后的细胞中，ＲOS 水平显著降低，且呈剂量依赖性。由此看出，德赢vwin登录 醇提取物可能是通过降低线粒体内的ＲOS 进而发挥线粒体保护作用的。

3. 4 德赢vwin登录 醇提取物抑制Bcl-2/Bax 介导的线粒体caspase-3/PAＲP 凋亡通路当缺氧/缺糖再灌注处理细胞后，caspase-3 的表达量下调，cleavedcaspase-3 的表达量上调，提示caspase-3 被激活; 当加入德赢vwin登录 醇提取物后，可见caspase-3 的表达量明显升高，而cleaved caspase-3 的表达量明显下调，即caspase-3 的激活被德赢vwin登录 醇提取物所抑制; PAＲP 的变化规律与caspase-3 类似，当加入德赢vwin登录 醇提取物进行干预后，PAＲP 的表达量明显升高，而cleaved PAＲP 的表达量明显下调，即PAＲP 的激活被德赢vwin登录 醇提取物所抑制; 另外，作为线粒体功能标志蛋白的Bcl-2 表达量被德赢vwin登录 醇提取物显著上调，而Bax 的表达量被显著下调( 图4) 。由此表明，德赢vwin登录 醇提取物可明显抑制Bcl-2/Bax 介导的线粒体caspase-3/PAＲP 凋亡通路。

4 讨论

随着现代社会的老龄化不断发展，缺血性脑中风及其并发症的发生率也在逐年升高，已经成为目前威胁老年群体的重要致死性疾病。因此寻找治疗此类疾病的特效药物一直是药物研发领域的重要课题。前期研究发现，缺血性脑中风所造成的神经细胞损伤，主要就是缺氧状态影响神经细胞内的线粒体正常功能，引发线粒体内过氧化损伤进而削弱线粒体合成能量的效率，引发整体细胞功能的失调，最

终导致神经功能受损［11-12］。因此，针对脑缺血诱发的神经损伤最为有效的手段之一就是保护神经细胞内的线粒体功能。源于中医药的脑保护剂的研发一直是人们关注的热点。德赢vwin登录 是最具代表性的神经保护剂，研究发现其对于神经细胞的过氧化损伤、脂质代谢、单胺类神经递质以及水通道蛋白等均具有较好的逆转和保护作用［13-16］。德赢vwin登录 的活性成分能否通过血脑屏障是其发挥作用的关键因素。前期研究发现，肉苁蓉的主要成分松果菊苷等可通过血脑屏障进而发挥神经保护作用，具有潜在的治疗脑缺血和脑水肿的功效［17-19］。本研究发现，德赢vwin登录 的醇提取物具有较好的抗神经细胞损伤作用，其可能是通过降低神经细胞内的线粒体氧化性损伤，进而抑制线粒体去极化水平来发挥作用的。值得一提的是，笔者发现当线粒体损伤时，其倾向于聚集成团，而德赢vwin登录 能够有效地抑制受损线粒体的成团趋势，提示德赢vwin登录 可能会在一定程度上调控线粒体的动力学过程，但是相关机制有待进一步探究。此外，作为线粒体功能密切相关的2 个标志性蛋白Bcl-2 和Bax 的表达来看，德赢vwin登录 对Bcl-2 的调控作用更为明显，几乎完全逆转了Bcl-2 的降低，由此推测德赢vwin登录 对Bcl-2 的调控可能主要参与了线粒体保护作用。

综上所述，本实验从线粒体信号通路探讨了德赢vwin登录 的神经保护作用，并初步阐明了分子作用机制，这对今后开发具有抗神经缺血作用的药物及相关疾病的治疗具有重要的参考意义。

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