齐晓岚＇，肖海涛，肖 雁＇，郝小燕，官志忠”

（1．贵阳医学院分子生物学重点实验室，贵州贵阳 550004；

    2．贵阳医学院药学院·贵州 贵阳 550004;

    3．贵阳医学院病理学教研室，贵州 贵阳 550004）

摘要：目的 研究肉苁蓉活性成分松果菊苷及异麦角留苷对神经母细胞瘤（SH-SY5Y）细胞神经型尼古丁受体表达的影响及其对抗β淀粉样蛋白（Aβ）神经毒性作用机制，以了解其神经保护作用机制，方法 比色法测定细胞 MTT还原率筛选松果菊苷及异麦角留苷安全浓度范围，并用Aβ-ss处理细胞后，测定 MTT还原率，蛋白质印迹法（Western blot）测定尼古丁受体α3．a7蛋白表达的变化，结果 松果菊苷及异麦角甾苷能提高细胞a3及a7 神经型尼古丁受体亚单位蛋白质表达水平，呈剂量依赖关系：并能对抗Aβs-g引起的a3和a7受体亚单位蛋白质水平降低，减弱AB2-w引起的细胞损伤，结论 松果菊苷及异麦角甾苷可能通过上调神经型尼古丁受体亚单位蛋白来发挥神经保护作用，在阿尔茨海默氏病的治疗中可能起到一定作用。

关键词：松果菊苷；异麦角甾苷；尼古丁受体；β-淀粉样蛋白： SH-SY5Y细胞：DOI标识：dai：10.3969／j．issn．1008-0805.2011.07.006

       中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1008-0805（2011）07-1561-03

阿尔茨海默氏病（Alheimer＇s dsease，简称 AD）是一种主要在老年期发生的以进行性痴呆为主要特征的神经元退行性变疾病，其主要临床表现为进行性认知功能障码，记忆力衰退、性格和行为改变等［0.2］。病理学上以脑细胞内神经原纤维缠结及细胞外老年斑形成为主要特征，老年斑的主要成分为β-淀粉样蛋白（β-amyloid peptide，Aβ），是一种神经毒性物质，可以引起神经元的损伤和死亡，是AD发病过程中的个重要因素，能促进AD的发生和发展。

尼古丁乙酰胆碱受体（Nicotinie acetylcholine receptor. nAChR 或称尼古丁受体）与学习和记忆等认知功能密切相关，并具有明显的神经保护作用。在较早的一些研究中就发现，AD患者大脑皮层尼古丁受体出现持续和严重的丢失，大脑皮层nAChR 缺失与AD患者认知障码有显著的相关性。

由于AD的发病机制复杂，目前尚无有确切疗效的治疗药物。中医药在延缓衰老以及防治痴呆等相关疾病方面有着丰富的理论和实践经验，具有潜在的优势和广阔的发展前景。肉苁蓉作为一种著名的补益药，在延缓衰老，增强机体免疫功能、激活超氧化物歧化酶活性和降低体内脂褐素堆积方面都有着重要的作用，有“沙漠人参”之美誉，其主要活性成分为苯乙醇苷类化合物回，其中松果菊苷（echinaroside，ECH）及异麦角晶苷（isnacte-oside，CAS）是肉苁蓉总苷的主要成分，本研究用ABg-m处理来源于人脑的神经母细胞瘤（SH-SY5Y）细胞作为研究对象，以研究ECH及CAS神经保护作用机制。

1 材料

肉苁蓉来源于新疆的德赢vwin登录 Ciatanch tubulasa（Schenk.）R.Wight.D-MEM 培养液购自 Gibon Invitrogrn 公司 （英国）；源于人脑的神经母细胞瘤细胞株（SH-SYSY 细胞）购于Geman Callection of Microorganisms and Cell Culture 公司（德 国）：羊抗a3．a7及鼠抗-肌动蛋白（β-actin）多克隆抗体及HRP标记的抗羊及抗鼠二抗购自 Santa Cru Biodechnology le（美国）。聚乙烯二氟（PVDF）展、ECL.-Plus发光试剂、高效显影胶片购自 Amerhum公司：其它化学试剂均购自 Sigma公司。

2 方法

2.1 松果菊苷及异麦角甾苷的提取 取肉苁蓉粗粉3kg，用10倍量的水提取3次，2h／次，合并煎煮液，滤过，滤液浓缩至相对密度约为1.1（70-80℃）的浸膏，在搅拌下加入乙醇，醇沉质量分数为70％，沉淀24h，取上清液，滤过。滤液回收乙醇并浓缩至相对密度约1.2（70-80℃）的浸膏乙醇。取浸膏加水分散，用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇分别萃取。回收溶媒得石油醚萃取物（ASP），醋酸乙酯萃取物（ASE），正丁醇萃取物（ASB），余下水层回收溶媒后得水部分（ASW）。

正丁醇萃取物（ASE）上Sephadex LH-20，用氯仿-甲醇（1：1）洗脱，薄层点板跟踪，合并12-15流份，经微品纤维素柱层析，用醋酸乙酯：甲醇：水（30：1：0.5→1：1：0.5）洗脱·低温减压回收溶剂得异麦角甾苷粗提物；经HPLC半制备分离〖Wa-ters 2475，Sun FireM-C，10μm，10mmx150 mm柱）；柱温：室 理细胞后，可减弱AB-w对细胞的毒性作用。AB组与松果菊苷温：检测波长：335 mm；流动相：43％甲醇：流速：2.00ml／min］得到化合物异麦角甾苷（27mg）。松果菊苷（8mg）。

2.2 细胞培养，β-淀粉样肽及肉苁蓉的处理 先用含15％胎牛血清的 DMEM 培养液培养SH-SY5Y细胞，待细胞生长稳定后，改用不含血清的 DMEM 培养液继续培养，培养箱中含5％CO2＋温度为37℃。在SH-SY5Y细胞中加入10 μmol／L的Aβs-5＊培养48h。为观察松果菊苷及异麦角甾苷对ABs-m毒性作用的影响，先分别加入80 μmol／L松果菊苷及异麦角甾苷培养24h后·再加入Aβs-s培养48h。每一实验组均设3个复孔，重复3次实验。

2.3 3-4,5-二甲基噻唑-2.5-二酚四唑澳化物3-（4,5-dimethylbiaaol-2-yl)-2,5-dipbeayletraaolium bromide,MTT] 测定 为筛选松果菊苷及异麦角甾苷的安全浓度，选择0.5.10，20.40,80,160,200.300 μmol／L浓度处理SH-SY5Y细胞后24h 后测定 MTT还原率，以检测其对细胞是否具有毒性作用及其安全浓度范围。

2.4 细胞分组诱导及相应的药物干预 ①正常对照组：不经药物处理，培养期为48h。②Aβ处理组：在培养的细胞中加入10μmol／L．Aβs-w，培养时间为48h（Aβs-s用PBS溶解后，37℃孵有72h）。③单纯化合物单体理组：加入20.40,80.160 μmol／LECH及CAS 培养48h。加入80 μmol／LECH及CAS培养24,48及72h。④化合物单体和Aβ处理组：先加入80 μmol／LECH及CAS预培养24h后，再按照Aβ处理组方法进行处理。

2.5 药物处理后MTT还原率测定 向96孔细胞培养板中，加入一定数量（约1x10＃／孔）待检测细胞，分组药物处理细胞后测定MTT水平。

2.6 尼古丁受体亚单位蛋白表达测定 参照Guan等的方法进行提取细胞膜蛋白及用蛋白印迹（Western blotting）方法检测尼古丁受体亚单位a3、a7亚单位蛋白水平。以Bandscan软件分析结果时以β-actin 蛋白条带作为内参照，计算a3、a7蛋白条带与β-actin蛋白条带像素灰度的百分比值作为a3．a7基因蛋白质表达的相对水平比。

2.7 统计学分析 每组所得结果用±＊表示，结果用SPSS12.0统计软件进行单因素方差分析。P＜0.05或P＜0.01表示差异有显著性或高度显著性意义。

3 结果

3.1 松果菊苷及异麦角區苷安全浓度筛查 见表1．松果菊苷及异麦角甾苷的浓度等于或大于200 μmol／L时，SH-SYSY神经细胞MTT还原率出现降低，表明样品浓度等于或大于200μmal／L时明显降低细胞增殖能力，具有一定的细胞毒性作用在0-160μmol／L范围时细胞MTT还原率无明显变化，表明该浓度对细胞毒性作用较小。因此选择此浓度范围研究药物选用浓度。

大量研究已经证明在AD脑组织中老年斑的主要成分 Aβ是由其前体蛋白（APP）经β-和γ-分泌酶水解后形成的，具有一定的神经毒性作用，近来也有研究表明，AB的损伤作用是AD发生发展的首要因素，其损伤机制之一是通过增强氧化应反应和释放自由基产物，从而引起神经元受损。本研究Aβs-s处理来源于人类的SH-SYSY神经细胞，模拟AD患者内神经细胞的病理过程，以此作为肉苁蓉主要成分松果菊苷及麦角留苷体外研究的类 AD细胞模型。研究结果显示，与对照相比，AB2s-3s处理组SH-SY5Y神经细胞的 MTT还原率明显低，进一步证实ABs-8可引起神经细胞的损伤。松果菊苷及异麦角留苷预处理的SH-SY5Y神经细胞能够对抗Aβs-3s引起MTT 还原率降低，进一步表明松果菊苷及异麦角甾苷具有Aβs.s引起的神经细胞毒性的作用。

神经型尼古丁受体是神经系统中一类非第二信使介导性经递质结合的离子通道，与学习和记忆关系密切，是一类明确自具有神经保护功能的受体，其减少与AD的发生有关。AD病脑内神经型尼古丁受体-配体结合率降低，其亚基的蛋白表达平也降低回，目前寻找可上调nAChR受体表达且副作用小的物是治疗 AD药物研究的方向之一。在SH-SY5Y 神经细胞中3和β7是主要的尼古丁受体亚类，本研究中，通过测定a3a7 nAChR 蛋白水平发现，Aβs．w能够明显降低a3．a7亚单位白的表达。松果菊苷及异麦角甾苷能够明显地上调a3和nAChR 蛋白的表达水平，且能对抗Aβs-w所导致a3．a7亚单蛋白的表达降低。这样的作用说明在治疗 AD 药物的选择中苁蓉可能具有重要的作用。

综上所述，松果菊苷及异麦角甾苷具有上调a3．a7 nACh蛋白表达的作用；可对抗AB引起的 nAChR表达降低；松果菊及异麦角甾苷在细胞整体水平有抗Aβ的神经细胞毒性作用，作用机制可能与其刺激 nAChR表达有关，肉苁蓉可能在AD中药治疗中发挥重要作用。