摘要：目的 观察松果菊苷对MPIP致小鼠帕金森病（PD）模型中对动物行为学和对黑质纹状体组织蛋白表达的影响在蛋白质水平探讨松果菊苷的多巴胺能神经元保护作用机制，方法 以MPIP损伤建立C37BL／6小鼠 D模型 通过自主活动实验和滚简实验观察动物行为学表现，用双向电泳、图像分析、质谱鉴定等蛋白质组学技术研究松果菊苷对MPTP致小鼠 D模型行为学的影响和黑质纹状体组织蛋白表达的变化，结果 ①经MPIP诱导，小鼠的自主活动次数，滚筒运动潜伏期均低于对照组（RK0.01）经松果菊苷（20m kg-1）预处理后，MPTP诱导小鼠的行为学表现明显改善（R0.01）②经过双向电泳及HDQUS软件分析，硝酸银染色 对照组、模型组和松果菊苷给药组分别分离出282个、269个和236个的蛋白质斑点，对一个稳定差异表达的斑点进行 MAIDLTOF质谱鉴定，数据库检索结果为胆绿素还原酶 B 结论 松果菊苷对 MPIT致小鼠 PD模型的行为学障碍具有改善作用，其神经保护作用机制可能与胆绿素还原酶 B水平降低有关。

关键词：松果菊苷；MPIR帕金森病；双向凝胶电泳 胆绿素还原酶 B

帕金森病（Pak hsons diease PD）是一种以选择性和进行性多巴胺能神经元变性和坏死为特征的神经退行性疾病。D患者因黑质纹状体神经递质多巴胺不足，形成特有的运动功能障碍。肉苁蓉（Heba Cisanhes）为常用的传统补益中药，具有补肾阳，益精血，润肠通便的功效。本实验室前期工作显示，其提取物苯乙醇总苷以及总苷成分中的松果菊苷（echinacosile）和类叶升麻苷均对多巴胺能神经元具有保护作用“，目前研究显示松果菊苷神经细胞保护作用可能与降低细胞内活性氧水平，抑制 Caspase-3的活性和维持线粒体膜电位的高能状态有关＂，Geng等！”研究发现肉苁蓉提取物苯乙醇总苷（其中含松果菊苷40％。类叶升麻苷10％，其它微量苯乙醇苷50％1对 MPIP锈导所致C57BL／6小鼠 PD模型的行为学改变，神经递质多巴胺降低及酪氨酸羟化酶的表达降低等均有改善作用，但其作用机制仍待进一步研究，因此，本实验应用以双向电泳技术和质谱技术为基础的蛋白质组学方法.探讨 MPIP致 C57BL／6小鼠 HD模型中松果菊苷对行为学障碍改善作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物 C57BL／6小鼠，含，体重 20～258由北京大学医学部试验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（京）2002-0001

12 药品 松果菊苷由北京大学医学部药学院天然药物学系屠鹏飞教授提供，从盐生肉苁蓉的乙醇提取物中分离纯化而成，纯度达到98％以上，

1.3 试剂 1甲基-4苯基-123 6四氢吡啶（MPIP）以及 CHAPS丙烯酰胺／甲叉双丙烯酰胺等，为 Sina公司产品。碘乙酰胺、二硫苏糖醇（DTT）为Merk公司产品。固相 IH梯度干胶条（H3-10 7cm）．尿素、两性电解质（BiaLF H3-10等其他双向电泳试剂均购自 BiaRad公司。

14 仪器 等电聚焦仪（Prosat EF SySm）垂直电泳系统（Proeane Il xicell.PDQues图像分析软件均为 BiaRad公司产品。XZ4型小鼠自主活动仪由中国医学科学院药物研究所研制，SD-2型小鼠滚筒仪由北京大学医学部实验仪器生产。

1.5 动物分组与给药 C57BL／6小鼠随机分为对照组．模型组以及松果菊苷给药组（20mg-kg＇）每组15只，松果菊苷给药组连续给药14 d于 d11开始 灌胃给药前 1 1模型组腹腔注射 MPIP30 mg·kg，对照组给予等体积生理盐水，连续4d最后1次给药后 1d进行行为学指标测试．4后处死，冰上操作，分别分离和摘取小鼠黑质和纹状体，-80℃保存。

16 行为学指标测定

161 -般行为学观察 观察小鼠在 MPIP造模后一般行为学表现！”。

1.62 自主活动实验 将小鼠放入 XZ4型小鼠自主活动仪自主活动箱中（高：13 直径：25每次同时测定 4只，每个活动箱1只1由记录仪自动记录小鼠活动，测定每只小鼠5m内活动次数＂，并采用 检验进行统计学分析。

1.63 浪筒实验 使用 SD22型小鼠滚筒仪测试小鼠的滚简行为表现！”，在测试前，预先进行训练，连续2d每天 2次，转速为12Fmir，训练时间120测试时设置转速25rmir，测试小鼠从滚筒开始旋转到离开滚筒的时间作为小鼠运动潜伏期 测试时间最长为605每只小鼠测 3次取平均值，采用 检验进行统计学分析。

17 差异蛋白表达鉴定

1 7.1 组织蛋白 样品提取与处理 0.38小鼠黑质和纹状体组织 加入1.5m含有蛋白酶抑制剂的裂解液（7mo）·1＇尿素，40mmol-L＇TrAHCI H7.4 65 nmol-'DIT20&L' CHAPS).40 有1h后超声匀浆，匀浆后的样品在4℃．15000·mir离心1b吸取上清液，最后，用2D ckarupki试剂盒（Amerhm公司）对提取液进行处理，样品用 BCA蛋白定量试剂盒（Peroe公司）进行蛋白定量后，均调整蛋白浓度为7L．加入4倍体积的上样缓冲液（8mo）＇U208-＇CHAPS50 mmo·C' DIT2 8·C' BALyE IH3-10 0.00281＇溴酚蓝 后上样。

17.2 双向电泳 双向电泳按文献”报道的方法稍加改进，取含蛋白质 100＃的样品，于50 V电压下主动水化 16 b水化结束之后，添加盐桥，升压程序依次为 250 V线性升压 30 min，500 V快速升压30 min 4 000 V线性升压3h4000 V快速升压至20 000 V．h，等电聚焦结束之后，进行胶条平衡，然后以100 V恒压进行分离胶浓度为125％（9.0 mx6.0 mx1.0mm）的十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳，以银染法”对凝胶进行染色。采用凝胶成像系统获取双向电泳图谱，以HDQues软件进行图像分析。

173 蛋白质鉴定和数据库检索 比较对照组、模型组以及松果菊苷给药组双向电泳图谱，确定差异蛋白，从胶上切下置于0.5ml的EPPendor管中，按文献［1的方法处理样品，MAIDVTOF质谱分析在美国 AB公司的 Vovger BiospecronetePM worl sntjo质谱仪上进行，采用反射模式，离子源加速电压为20 KV N激光波长 337 m脉冲3 呼质谱信号单次扫描累加 50次。用标准 Make峰作为外标校正质谱峰，正离子谱测定，获得肽质量指纹图谱，根据得到的信息，利用因特网上 Mascot seachn8ine检索 NCBn数据库（hp／／www matrjxscjenog com）寻找匹配的蛋白质，并查阅其生物学功能，检索条件：分子量，等电点未作限定，检索参数设置为允许±150 PPm的误差，允许 1处酶切位点漏切种属选择为小鼠。

2 结果

21 一般行为学 腹腔注射 MPIP（30 mg·kr＇）后约5mp与对照组相比，模型组小鼠的一般行为表现开始发生异常，出现竖毛，举尾，呼吸加快、肌张力减退，对外环境刺激敏感，牙颤等现象，约可持续2-3b 松果菊苷给药组（20mgkg＇）症状表现较轻，持续时间较短。

22 自主活动实验 实验结果显示。与对照组相比模型组活动次数明显减少（R＜0.01）与模型组相比，松果菊苷给药组活动次数明显增加（P＜0.01 F81).

23 滚筒实验 实验结果显示，与对照组相比模型组运动潜伏期明显缩短（P＜0.01）与模型组相比松果菊苷给药组滚筒运动潜伏期明显增加（P＜0.01 F82)

24 小鼠黑质纹状体组织蛋白双向电泳图谱比较对照组、模型组及松果菊苷给药组黑质纹状体组织蛋白的双向电泳图谱如F的所示，使用 PDQuest

FR1 The nm ber of m[movei nis p

Lpc@nape.counts wer desgay rotucel bF MPIP roment (6.1±23)when.compurdwih be comol grop(295 2±21 9) Howevg the rouein inmopr acwif was prvniol by edbacoile

Tle durjon of tne on the pmpr nd we smigang omrd I MPIP wm( 3.3±27)ommpand wgh be coml grup (52.2±5.6%buuthin deiawspewael W chhacosge pr.s

软件对3张 2-DE图谱进行比较分析，3者的蛋白斑点数分别为对照组282个、模型组 269个以及松果菊苷给药组236个，对照组与模型组斑点匹配率为71％，松果菊苷给药组与模型组斑点匹配率为67％，蛋白斑点主要集中在 Pls-9 MW8-100 ku的区域，对3个不同对照组小鼠黑质纹状体组织蛋白双向电泳图谱进行比较，选出了1个多次重复试验中变化差异有显著性的蛋白斑点，进行进一步的实验分析，该蛋白斑点以箭头标出（FE3）该蛋白在对照组和松果菊苷组表达量较少，而在模型组表达较高，F84显示了使用 HDQues软件对 3次实验中该差异蛋白相对含量检测值进行 检验统计学分析的结果。

ComDl(A)MPIP.eand(B)and chimcoe Pr.eament (C)mks vinatnol W sgwr sepygand mpgol ng pnsofbe rspee The poen Pdkaed IF be arrows echbind pbst d@camces in xpes sgn among the broe grospy The exmcn wer sepa miol b usink PG Kel (H3-10 7 m) n be Srt Pbae nd 12.5% Popacrinile gln be seoond Plase SDS.PVGE San Plel Porjn we no Kp meel

FiK4 Quan sntse change of te Pdkard Prorp(*±/n=3)

The repatpe abindance of be indicntal Poep was sEnifganty in cmard  MPP.rond up(427±32) omn pured wih he cotol g(117±71 bet bis hcrase was rejucnd n be ecinacose pr. 

25 质谱分析 对选出的差异蛋白进行 MAIDLKF分析，得到其肽质量指纹图谱（FB5）根据所得肽质量指纹图谱数据，通过 Mascot seach enghe检索 NCBP数据库，查询与之相匹配的蛋白，结果为胆绿素还原酶 B（bilverdin rejuctase B） MW22.297 kg P］6.49匹配肽段详见 F86

3 讨论

肉苁蓉是中医补益药物中的常用品种，属列当科肉苁蓉属植物 始载于《神农本草经》列为“上品”，具有补肾益精，润肠通便之功效，主治男子阳痿、女子不孕等证，近年来研究显示肉苁蓉及其所含的一些化学成分具有神经保护作用，对帕金森病及脑卒中等神经系统疾病防治显示出明显疗效，这使肉苁蓉及其有效成分研究成为了中医药研究领域的热点之一，松果菊苷是从肉苁蓉中分离，纯化的一种苯乙醇苷类化合物。目前的研究表明，它可能通过降低细胞内活性氧水平，抑制 Caspa3的活性和维持线粒体膜电位而发挥其神经细胞保护作用，为进一步研究该成分的神经保护作用，本实验以MPIT致小鼠多巴胺能神经元损伤为 PD模型，利用双向电泳技术以及质谱技术为基础的蛋白质组学方法，探讨松果菊苷在多巴胺能神经元损伤过程中保护作用的可能机制，寻找其在蛋白质整体表达水平上的作用靶点。为开发具有抗 PD作用的天然药物提供实验依据。

通过比较分析 3个不同处理组间黑质纹状体组织的蛋白表达图谱，找到了1个在多次重复试验中变化差异有显著性的蛋白斑点，这个蛋白可能与多巴胺能神经元损伤过程及松果菊苷的神经保护作用机制相关，我们对该斑点进行了质谱鉴定，并对质谱数据进行了数据库检索，结果表明这个蛋白斑点与胆绿素还原酶 B相匹配。

胆绿素还原酶 B作为一种丝氨酸苏氨酸激酶能够利用 NAD（P）H将亚铁血红蛋白（Fe PIDRQPorPhyrin K）在亚铁血红素加氧酶（heme oxygenmHO）系统作用下的产物胆绿素还原为胆红素场，目前还没有该蛋白与 PD或 PD动物模型有关的报道。然面，已有研究显示该酶的作用产物胆红素是一种抗氧化剂，可能作为生理上的抗毒剂而起作用1＂，实验结果显示，与对照组相比，胆绿素还原酶 B在模型组表达上调，而在松果菊苷给药组胆绿素还原酶 B表达上调的现象明显减轻，联系其抗氧化作用，我们推测，这可能与松果菊苷抗多巴胺能神经元氧化应激损伤有关。在MPIP致小鼠H模型中，MPIP在单胺氧化酶 B的作用下，变成离子形式的 1甲基4苯基吡啶（1-meth／14-Phenxridnin MPP1有研究显示 MPP可能通过线粒体途径或其他方式产生活性氧（reactive oxygenPcc ROS而介导神经毒性！”，这可能激发胆绿素还原酶 B的过量表达，使其具有抗氧化作用的产物胆红素产生量增加，发挥抗氧化作用，而松果菊苷给药后，可以减少胆绿素还原酶 B的过量表达提示松果菊苷在预防给药中，可能通过其抗氧化应激作用，减低了氧化应激导致的胆绿素还原酶 B升高的水平，保护多巴胺能神经元免受氧化应激损伤。然而，胆绿素还原酶 B与 PD发生之间的关系及松果菊苷的详细作用机制还有待于进一步研究。