杜娟12，陈 虹2”，姜勇，屠鹏飞

（1石河子大学药学院，新疆 石河子 832002

2省部共建教育部新疆特种植物药资源重点实验室，新疆石河子 832002

3．北京大学药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室，北京 (161001

摘要：目的观察松果菊苷（BCH）对大鼠脑缺血损伤海马区神经细胞凋亡的影响，方法雄性SD大凰，随机分为假手术组、模型组、川芎嗪组、ECH大剂量组、ECH小剂量组。采用大民大脑中动脉线栓法（MCAO）建立局灶性脑缺血损伤模型，各组造模后24h处死取脑，应用HE染色法观察脑组织病理改变，脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口 末端标记（TUNEL）法观察大鼠脑缺血后海马区神经细胞凋亡，结果脑缺血后海马区神经细胞正常组织结构消失、胞核碎裂、溶解坏死等形态学改变，亡神经细胞数量明显增加与模型组比较，川芎嗪组，ECH大剂量组和BCH小剂量组海马区凋亡神经细胞表达数量均有不同程度的减少，结论 ECH对脑缺血大民脑组织具有保护作用，其机制可能与抗细胞凋亡作用有关。

关键词：松果莉苷；脑缺血 细胞凋亡

中图分类号：R285.5 文献标识码：B 文章编号：1008-0805（2010）06-1324-02

近年来脑缺血损伤与神经元死亡的关系受到广泛关注，而细胞凋亡是神经元死亡的主要方式研究发现在缺血损伤，兴奋毒性引起的脑损伤中，神经元凋亡明显增加，脑损伤中神经元的凋亡及其发生机制现成为广泛研究的重点。本文采用大鼠脑缺血模型，观察松果菊苷（Echinacoside ECH）对脑缺血损伤的保护作用。

1 材料与方法

11 药品与试剂 ECH由北京大学药学院居鹏飞教授惠赠（纯度95％以上）注射用盐酸川芎嗪（哈尔滨三联药业有限公司）红四氯唑（中国华东师范大学化工厂）水合氯醛（天津市福晨化学试剂厂）多聚甲醛（天津市化学试剂研究所）细胞亡试剂盒（购自 Prom（ga公司），市售鱼线（直径0 26mm），

L2 动物分组及模型制备 雄性 SD大鼠共 50只，体质量 250-300 购自新疆实验动物研究中心（合格证号：2009-00531随机分为5组：①假手术组，生理盐水1m｝kg1·d1x74②模型组：生理盐水1mk kg-1·d1x74③脑缺血＋阳性药物对

13 神经功能缺失体征评分 按文献［2）的5分制法进行评分。0分：无神经损伤症状：1分；不能完全伸展对侧前爪2分；向对侧转圈：3分；向对侧倾倒：4分；不能自发行走，意识丧失。1-3分为造模成功动物，0分．4分或死亡刷除，再随机补充。

14 TTC染色 动物麻醉，取脑-20℃冰箱中速冻 20m冠状位每隔2mmm切片（5片）。切片置于2％TC液中，避光放入37℃水浴锅中孵育30mp4％多聚甲醛固定保存。

15 HE染色 动物手术后 24h按文献操作甲，麻醉，打开胸腔暴露心脏，灌注针插入心尖并剪开右心耳，经左心室插入升主动脉快速生理盐水灌注至肝脏变白，再持续灌注4％多聚甲醛 30mp至大鼠四肢僵硬，完毕后取脑干上述固定液中4℃固定 48b常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明、浸蜡、包埋制成石蜡切块，在视交叉前后1mm范围切片，连续冠状切片，切片厚5μm HE染色后光镜下观察。

16 细胞凋亡 采用 TUNEII＃法，按细胞凋亡原位检测试剂盒说明书标记凋亡细胞，具体步骤如下：脑组织切片常规石蜡脱水滴加 TUNEL．反应合物，37C孵育60mp滴加转化剂-POD（辣根过氧化酶标记）室温放置15m期间用磷酸缓冲液

本实验，证实 ECH对脑缺血大队具有较好的保护作用，缺血预处理后可明显减轻细胞凋亡数量。

PBS冲洗样本 3次，再滴加 100＃的12-二甲基苯胺（DAB）底 用，且随 EXH给药剂量的增加细胞凋亡数量进一步减少，通过物溶液，室温孵育5～20m镜下出现浅棕色背景时，终止反应苏木素复染，脱水透明，中性树胶封片，光镜下观察并拍照。

2 结果

21 脑片 TIC染色 缺血后缺血侧鼠脑肿胀，有明显的梗死灶形成。TIC染色显示正常脑组织呈红色，梗死灶脑组织呈苍白色。所有评分在1～3分大鼠的脑片经 TC染色后均有苍白色梗死灶出现（图1）表明模型的制作是成功的。

A正常组 B模型组 C利可楼组 DECH高剂量组图2 大脑皮层 HE染色

图1 大脑 TTO染色

22 HE染色 假手术组可见神经细胞形态完整，排列紧密，胞核完整，核仁清晰，胞周围间隙无水肿，模型组神经细胞肿胀，多数细胞核固缩，核仁欠清晰。缺血中心区神经细胞正常组织结构消失，胞核碎裂，溶解等坏色形志学改变，坏死灶边缘可见炎性细胞浸润：与模型组比较，川芎嗪组。EXH高.低剂量组神经元细胞数量均有增多，坏死灶周围胶质细胞增生，其中，川芎嗪组合EXH高剂量组肿胀的神经细胞明显减少，胞浆丰富，排列整齐。间质细胞增生，可见形态接近正常的神经元细胞（图2）

23 细胞凋亡 TUNEL染色光学显微镜下观察（图3），阳性染色位于细胞胞核，呈棕黄色，正常细胞染色位于胞核，呈蓝色。①假手术组偶见细胞着棕色细胞结构尚好②模型组出现最为显著的神经元凋亡表现为整个细胞皱缩，体积缩小核固编；③与假手术组相比模型组海马区细胞高亡数量明显增加④与模型组比较，川芎嗪组，ECH大剂量组和ECH小剂量组海马区码亡神经细胞表达数量均有不同程度的减少。

A正常组 B模型组 C利可楼组 DECH高剂量组图2 大脑皮层 HE染色

实验结果表明，假手术可见散在分布少量的凋亡细胞，表明正常神经细胞存在细胞凋亡，各组药物均显示明显抑制细胞凋亡的作用，与模型组比较具有显著差异，不同剂量的EXH給药均能明显减轻脑缺血后神经细胞凋亡，具有不同程度的脑保护作

3 讨论

细胞码亡是指在一定的生理或病理条件下，细胞启动自身基因调控机制，引起细胞自杀性死亡，其形态学特征为：细胞皱缩不能与周围细胞接触，胞浆浓缩，胞体出现泡状。胞核裂解成凋亡小体可被周围临近细胞吞噬，大量资料证明，脑缺血后脑损伤的病理变化为缺血中心区以坏死为主，半暗带区以凋亡为主，坏死是不可逆的死亡过程，而凋亡是可逆的过程，所以在缺血损伤中神经元凋亡扮演了重要角色，对凋亡机制的研究具有重要意义，目前国内外的研究均认为缺血后神经细胞凋亡主要是通过Casp依赖途径和非Cwpaw依赖途径实现的，其中Caspac-3和AF分别是这两种途径中的起作用的关键物质，凋亡诱导因子（AF）是近年来发现的一种码亡效应分子，正常情况下，AIF是一种定位于细胞线粒体膜间隙中的黄素蛋白，当有凋亡信号刺激时AF分子从线粒体释放到细胞浆，再通过其核定位信号转位到细胞核中，直接引起染色体凝集和 DNA呈大片段（～50 kb）断通

ECH是苯乙醇苷类化合物，为德赢vwin登录 中的主要有效成分，近年研究表明，ECH具有抗 SH-SYSY神经元凋亡11＊，抗衰老門，改善学习记忆！”等神经保护作用，有研究表明，ECH可有效减少自由基的生成，抑制氧化应激反应的发生，进而产生明显的抗氧化作用，对神经元码亡具有预防作用！＂，本实验通过采用大鼠大脑中动脉梗塞模型，观察到 ECH预处理后，脑缺血大鼠码亡细胞明显减少，初步闸明了 ECH对脑缺血大鼠神经元的保护作用，为抗脑缺血药物的实验研究和临床应用研究提供了新的证据。