摘要：目的考察德赢vwin登录 复方制剂对小鼠细胞免疫和体液免疫的作用。方法SPF 级昆明种雌性小鼠200 只分5 大组，每组分低、中、高（0.067、0.133、0.400 g/kg·bw）和对照4 个剂量组，连续给药30 天，分别进行迟发型变态反应试验、淋巴细胞转化试验、抗体生成细胞检测、血清溶血素测定、小鼠碳廓清试验、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验、NK 细胞活性试验，测定相关免疫学指标。结果0.133、0.400g/kg·bw 剂量组能增加小鼠迟发型变态反应能力、NK 细胞活性、抗体生成细胞数，0.400g/kg·bw 剂量组能显著提高小鼠血清半数溶血值（P＜0.05），各剂量组对小鼠体重、脾脏/ 体重比值、胸腺/体重比值、单核- 巨噬细胞碳廓清能力、淋巴细胞转化能力及腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力均无明显影响（P＞0.05）。结论德赢vwin登录 复方制剂对小鼠具有增强免疫力功能。

关键词：德赢vwin登录 ；复方制剂；增强免疫力

德赢vwin登录 Cistanche tubulosa （Schrenk）Wight 主产于新疆南疆地区，2005 年被中国药典收载，具有补肾阳、益精血等功效[1]。现代药理研究表明，德赢vwin登录 具有壮阳、抗衰老、增强记忆力、通便、抗疲劳等多种作用[2-5]。德赢vwin登录 复方制剂主要以德赢vwin登录 为主要原料，每克制剂中相当于含有德赢vwin登录 原药材4.05g。本实验以不同剂量的德赢vwin登录 复方制剂灌胃小鼠30 天，通过测定小鼠相关生化指标，研究德赢vwin登录 复方制剂对增强小鼠免疫力作用的影响。

1 材料和试剂

1.1 样品德赢vwin登录 复方制剂由新疆维吾尔自治区中药民族药研究所提供，人体口服推荐剂量为每日0.8g，以每人60kg 体重计算，折合剂量0.013 3g/kg·bw。

1.2 实验动物与分组SPF 级昆明种雄性小鼠200只，体重为18～22g，由长沙市天勤生物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号为SCXK（湘）2009-0012，饲料由同一单位提供。每组40 只小鼠为一组，共五大组。免疫Ⅰ组，进行碳廓清试验；免疫Ⅱ组，进行ConA 诱导的小鼠淋巴细胞转换实验、NK细胞的活性测定；免疫Ⅲ组，进行脏提比值测定、半数溶血值（HC50）的测定和抗体生产细胞数的测定；免疫Ⅳ组，进行迟发型变态反应实验；免疫Ⅴ组，进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验。每大组40只小鼠按体重随机分为4 小组，即对照组和低、中、高剂量组。

1.3 剂量选择及样品处理据人体口服推荐量，设低、中、高剂量组分别为0.067g/kg·bw、0.133g/kg·bw、0.400g/kg·bw （分别相当于人体推荐剂量的5、10、30 倍），灌胃体积0.2mL/10g·bw，对照组给予等体积蒸馏水，连续灌胃30 天。试验时，分别取德赢vwin登录 复方制剂0.67g、1.33g、4.00g 加蒸馏水定容至200mL，按0.2mL/10g·bw 体积给小鼠灌胃，每天1 次，连续灌胃30 天。对照组灌胃予以等体积的蒸馏水。

1.4 主要仪器与试剂动物台秤、分析天平、CO2培养箱、离心机、722 分光光度计、恒温水浴箱、酶标仪、显微镜、细胞计数器等。

2 试验方法

2.1 样品对脏器/体重比值的影响称重后处死小鼠，取出脾脏和胸腺，称重后计算脏/体比值。

2.2 样品对细胞免疫功能的影响

2.2.1 迟发型变态反应（DTH）（足跖增厚法） 小鼠腹腔注射2%（v/v）SRBC（0.2 mL 每鼠）致敏后4 天，测量左后足跖部厚度，然后在测量部位皮下注射20%（v/v）SRBC（20 μL 每鼠），于注射后24h 测量左后足跖部厚度，同一部位测量3 次，取平均值。以攻击前后足跖厚度差值（足跖肿胀度）来表示DTH 的程度。

2.2.2 ConA 诱导的小鼠淋巴细胞转化实验（MTT法） 无菌取脾，分离单个脾细胞，用RPMI 1 640培养液调整细胞浓度为3×106 个/mL。用酶标仪按MTT 法以570nm 测定光密度值（OD 值）。淋巴细胞增值能力用加ConA 孔的OD 值减去不加ConA 孔的OD 值表示。

2.3 样品对体液免疫功能的影响

2.3.1 抗体生成细胞检测（Jerne 改良玻片法）每鼠腹腔注射0.2mL2%（v/v）绵羊红细胞（SRBC）悬液。4 天后处死小鼠，取脾，制成脾细胞悬液。按Jerne 改良玻片法进行抗体生成细胞测定，用溶血空斑数/106 脾细胞表示抗体生成细胞数。

2.3.2 半数溶血值（HC50） 的测定每鼠腹腔注射0.2mL 2%SRBC 进行免疫。4 天后摘除眼球取血，离心、收集血清。用SA 缓冲液将血清稀释200 倍，按检验方法测定样品管及SRBC 半数溶血时的OD值，溶血素的量以半数溶血值（HC50）表示。

2.4 样品对单核—巨噬细胞功能的影响

2.4.1 小鼠碳廓清试验小鼠尾静脉注射4 倍稀释的印度墨汁（0.1mL/10g·bw），注入后2min 和10min 分别从内眦静脉丛取血20μL，加至2mL0.1%Na2CO3 溶液中，摇匀。以0.1%Na2CO3 溶液作空白对照，在600nm 波长处比色测定OD 值。将小鼠处死，取肝、脾称重，计算吞噬指数a。

2.4.2 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验（半体内法） 小鼠腹腔注射20%（v/v） 鸡红细胞悬液1mL，间隔30min，颈椎脱臼处死，取腹腔巨噬细胞洗液1mL 制片，置37℃孵箱温育30min。孵毕，取出玻片于生理盐水中漂洗后晾干，以甲醇∶丙酮（1∶1）固定，4%（v/v）Giemsa-磷酸缓冲液染色，用蒸馏水漂洗晾干。油镜下每片计数100 个巨噬细胞，计算吞噬率和吞噬指数。

2.5 样品对NK 细胞活性的影响受试小鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾，制成脾细胞悬液2×107 个/mL此为效应细胞，取传代后24h 生长良好的YAC-1细胞用RPMI 1 640 完全培养液调整细胞浓度为4×105 个/mL 此为靶细胞；取靶细胞和效应细胞各100μL（效靶比50∶1），加入U 型96 孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和2.5%Triton 各100μL；上述各项均设3 个平行孔，于37℃，5%CO2 培养箱中

培养4h，然后将96 孔培养板以1 500r/min 离心5min，每孔吸取上清100μL 置平底96 孔培养板中，同时加入LDH 基质液100μL，根据室温反应3-10min，每孔加入1mol/L 的HCl30μL，在酶标仪490nm 处测定光密度（OD），计算NK 细胞活性。

2.6 数据处理用SPSS11.0 软件进行数据转化和统计分析。分析时，先对数据进行方差齐性检验，若方差齐，采用单因素方差分析进行总体比较，发现差异再用Dunnett 法进行多个剂量组与一个对照组均数间的两两比较。若方差不齐，则对原始数据进行适当的变量转换，满足方差齐性检验后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到方差齐，则改用秩和检验进行统计，发现总体比较有差异，则采用不要求方差齐性的Tamhane’sT2 检验进

行两两比较。

3 结果

3.1 对小鼠免疫器官脏器/体重比值的影响各剂量组对小鼠免疫器官脏器/体重比值无显著影响（P>0.05）。

3.2 对小鼠细胞免疫功能的影响中、高剂量组对小鼠迟发型变态反应（DTH）能力与对照组比较显著提高（P<0.05），各剂量组队小鼠淋巴细胞转化能力无显著影响（P>0.05），见表1。

3.3 对小鼠体液免疫功能的影响中、高剂量组对小鼠抗体生产细胞数与对照组比较显著提高（P<0.05），高剂量组小鼠半数溶血值（HC50）与对照组比较显著提高（P<0.05）。

3.4 对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响各剂量对小鼠碳廓清能力无显著影响（P＞0.05）。对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力无显著影响（P＞0.05）。

3.5 对小鼠NK 细胞活性的影响中、高剂量组小鼠NK 细胞活性与对照组比较显著提高（P＜0.05）。

4 讨论

4.1 本实验根据《保健食品检验与评价技术规范》[6]，在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核—巨噬细胞功能、NK 细胞活性4 个方面任2 个方面结果阳性，可判定该受试样品具有增加免疫力作用。

4.2 在本实验条件下，经口灌胃给予小鼠0.067、0.133、0.400 剂量的德赢vwin登录 复方制剂30 天，与对照组比较0.133、0.400 剂量能显著提高小鼠迟发型变态反应能力、NK 细胞活性、抗体生产细胞数，0.400 剂量能显著提高小鼠血清半数溶血值（P<0.05），各剂量对小鼠胸腺/体重比值、脾脏/体重比值、单核—巨噬细胞碳廓清能力、淋巴细胞转化能力及巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力均无显著影响（P>0.05），提示德赢vwin登录 复方制剂具有增强免疫力功能。

参考文献：

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010 年版一部[S].北京:化学工业出版社，2010：124-126.

[2] 侯志华,常国文.肉苁蓉的药理学研究进展[J].中国民族医药杂志，2003，9（4）:3-4.

[3] 李勇，熊元君，贾晓光，等.德赢vwin登录 粉对高盐饲养大鼠血压、红细胞膜流动性及全血黏度的影响[J].天然产物研究与开发，2009，21：220-222.

[4] 吴波，顾少菊，傅玉梅，等.肉苁蓉和德赢vwin登录 通便与补肾壮阳药理作用的研究[J].中医药学刊，2003,21（4）：539-540.

[5] 卿德刚，张娟，倪慧.德赢vwin登录 复方制剂缓解体力疲劳功能研究[J].新疆中医药，2011，29（2）：37-39.

[6] 中华人民共和国卫生部. 保健食品检验与评价技术规范[S].2003:22-35.