木合布力·阿布力孜，毛新民，热娜·卡斯木，马淑燕，LeinhgeMukrB，G me SESP

（1新疆医科大学药学院，新疆 乌鲁本齐 830054 2法国南锡第一大学药物研究中心-NSERM

U525 Conte de Medianent法国 54000） 

摘要：目的 观察肉苁蓉总苷（Benem）cimmosiles GC在HL60细胞中的抗氧化生物活性，方法 CC从新疆盐生肉苁蓉中提取得到：利用HL-60细胞中的氧化系统，对GC的抗氧化活性进行测定研究，HL-60细胞中自由基诱发程度由探针物 DXHH-DA的氧化产物DCF的浓度来检测，银杏叶提取物 ECB761用作阳性对照物，结果 GC以025050L-和0758·1-浓度，对自由基的抑制率分别为58％．62％和6％。其抗氧化活性与BGB761类似，结论GC在HL-60细胞氧化系统中具有很强的抗自由基氧化活性

关键词：盐生肉苁蓉：肉苁蓉总苷（GC，HL60细胞抗氧化活性

肉苁蓉（Cistanh ly又名大芸，是传统中药。具有补中益气，补肾益精等功效。据文献报道肉苁蓉可增强机体免疫力、延缓衰老1”，肉苁蓉总苷（Beneral cpstanosides GC5是从肉苁蓉中提取的活性成分，其有效成分是苯乙醇总苷，现代药理研究表明，GC具有抗氧化、抗脂质过氧化作用，对结扎冠脉所致心肌缺血具有保护作用”，并能保护羟基（OH）引发的DNA氧化损伤＂。

近期GC对脑损伤的保护作用及老年痴呆症的防治功能等方面的实验研究成为热点。孟新珍等发现 GC对清醒小鼠脑缺血／再灌注损伤有保护作用，可以使脑组织丙二醛（MDA）含量降低和SDD活性提高，刘风霞等发现，GC可改进β-淀粉样肽和喹啉酸（QA）所致 Akheime病（AD）模型小鼠学习记忆水平，对β锭粉样肽和 QA造成的脑损伤有保护作用.Gm等＂报道，盐生肉苁蓉中提取的苯乙醇苷类总成分在（57小鼠体内对神经毒素 MPTH所致的脑神经损伤也有保护作用，有研究报道，脑内 ROS可能是 AD产生的原因之-1-m，但GC树人类 HL-60细胞内 ROS的影响尚未见文献报道。本研究采用人类 HI-60细胞为体外抗氧化实验模型，以银杏叶提取物标准品为阳性对照物2，观察 GC对 HL60细胞内 ROS的影响。

1 材料与方法

           1.1 主要试剂和仪器 GC：由新疆医科大学药学院植化教研室堵年生教授按日本文献［公开特许公报（A）昭632198627］方法，从北疆产盐生肉苁蓉中提取，主要成分为苯乙醇苷类；体外药理实验用药品试剂有 PMA（ Photomyrme ncentg DCHH- DA2：7＇-dihpad hidrofuosceh dincen购自 Sang Fance，银杏叶提取物标准品 EGB761（从干燥的银杏叶中提取得到）由 Beaupur Ipan公司提供（Pare Fmncg，GC和 HGB 761提取物用超纯水配制成108浓度的母液备用，DCHH-DA用乙醇稀释成浓度为30mmo C＇的溶液备用。IMA用 DMSO配制成1.6mm아 ＇浓度的溶液并在-20℃保存备用，FL600 Mcoppe Fporescence Ronder型荧光检测仪（BiTek Hhlnd Patk USY.

           1.2 细胞培养 人早幼粒细胞白血病 HL-60细胞株｜human prmyepeytk kukm Hl-60） cell ling 悬浮培养于含15％胎牛血清（SBna的 RIM11640介质（SBng和2mmo） ＇的谷氨酸盐（Si8mg的培养液（含100 U-mT＇青霉素和100mg-链霉素）中，37℃．5％ CQ条件下培养传代 实验用细胞处于对数生长期，初始密度为25x10cell-1-的HI-60细胞株在含有RIM11640介质和1.3％的DMSD（二甲亚砜 Sikng的75㎡培养盒里分化4细胞计数利用锥虫蓝（Topan blue）进行，在12孔板中以每孔 2x10cell放在含 RPMI1640介质，其中含有980＃IPBS和20＃lPMA（10μm和0.758L＇）的样品溶液进行处理并培养4b然后细胞通过离心分离，PBS洗涤。细胞球在冰浴里保存直至配制要检测自由基诱发情况的混合液和测定蛋白密度为止。

1.3 抗氧化活性测定

1.31 样品处理 GCs和 HGB761溶液分别稀释成3个不同浓度（0.25,0.50 8-＇和 0.758＇），分别置于总体积为200的96孔板容器内。其它成分按文献所述的方法依次放入反应板内，DCFH-DA用作探针物，具体试验方法同我们前期所发表论文。

1.32 自由基（ROS）活性和蛋白质密度的测定系统内 ROS诱发情况通过探针物 DCFH-DA被氧化成其强荧光产物 DCF（2,7＇-dkhbofucroscein）的定量方法来检测，即在孔板内精密加入20＃细胞悬浮液（被样品溶液处理过的25x10个细胞），20＃IDCHH-DA（40＃m-C＇）和缓冲液，37℃培养30 min 然后迅速用 FL600荧光检测仪分别在4851m的激发光和530m的发射光谱进行检测和定量，蛋白质密度用 LowD方法用胎牛血清白蛋白配制标准溶液并做标准曲线来测定，检测结果由Pmol DCF产生 minmg＇蛋白质来计算，并换算成剩余荧光强度（residua）vaue of fuorescence nansi 可来表示，即剩余荧光强度越小，对自由基的抑制活性就越强。

2 结果

HI60细胞用样品处理以后系统内 ROS变化结果在FB1中表示，GC在0.25 8·＇的浓度下，能抑制细胞内 MRO／HCD／HQ氧化系统所诱发的自由基浓度56％（以探针物 DCHI-DA被自由基氧化而产生的强荧光物质 DCF的剩余荧光浓度来表示，剩余荧光浓度为44％）。当GC的浓度提高到050和0.751＇时，它分别能抑制系统中自由基浓度为62％和67％（剩余荧光强度分别为38％和33％），抑制自由基活性强度与银杏叶提取物EGB761类似（在相同条件下，EGB761分别能抑制系统中自由基浓度为39％ 78％．81％）(MannWhiney tost FB1).

3 讨论

本实验中发现 GC在人类 HL60细胞中的氧化系统中，显示明显强的抗氧化作用，其自由基抑制活性强度与阳性对照组 HGb761类似（活性差异无统计学意义．P＞0.05，如FB1）．

由于 HL-60细胞中具有较强的 ROS系统，即MPO／HQ／HCD因此，H-60细胞现作为较新的一种体外实验模型，用于天然产物中具有抗氧化潜能物质的自由基清除能力测定，本研究利用已具有一定的防治 AI槽能的两种天然药物-银杏叶和肉苁蓉总苷提取物作为实验对象，初步观察了其在人类 Hl-60细胞中的抗自由基活性，结果表现 两种物质均具有抗 ROS作用，这可能是其抗Aheme病的机制之一，关于 GCs与此系统的作用机制和对整体动物体内 MRO氧化系统的影响有待今后进一步研究证实。

EGB761 HL-60 cellline,mon iored by resun]N 

参考文献：

11 张涛，柳朝阳，王建杰，等，肉苁蓉总苷对 D半乳糖所致衰老模型小鼠免疫功能的影响11，中国老年宇杂志，2004 24（5）441-214.ChnLoumGemj2004 24(5):441-2

李琳琳，王晓雯，毛新民，等，肉苁蓉总试的抗脂质过氧化作用和抗辐射作用11中国中药杂志，1997.23 364-2